S0107 总SOD活性检测试剂盒_NBT法_[1]

总SOD活性检测试剂盒( NBT法)

产品简介：

碧云天的总SOD活性检测试剂盒(NBT法)(Total Superoxide Dismutase Assay Kit with NBT)是一种基于NBT的显色反应，通过比色来检测细胞、组织或其它样品中SOD即超氧化物歧化酶活性的试剂盒。

超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase, SOD)能催化超氧化物阴离子发生岐化作用，生成过氧化氢(H2O2)和氧气(O2)，是生物体内一种重要的抗氧化酶。

本试剂盒采用经典的氮蓝四唑(NBT)显色法。通过黄嘌呤(Xanthine)及黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase)反应系统产生超氧阴离子(O2-.)，将氮蓝四唑还原为蓝色的甲臜(formazan)，后者在560nm处有强吸收。而SOD可清除超氧阴离子，从而抑制了甲臜的形成。反应液蓝色愈深，说明超氧化物岐化酶活性愈低，反之则酶活性愈高。据此通过比色分析就可以计算出超氧化物岐化酶活性水平。本试剂盒的检测原理图如下:

基于黄嘌呤氧化酶藕联反应体系和NBT的SOD酶活力检测原理图。XO：xanthine oxidase。

本试剂盒可以检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、全血、红细胞裂解产物、血清等生物样品中的SOD活性。一个试剂盒共可以进行100次检测。

保存条件：

-20℃保存，半年有效。S0107-2 NBT溶液需避光保存。

注意事项：

样本-70℃可保存1个月。需注意反复冻融会导致部分SOD失活。

抗氧化物会对本试剂盒的检测产生干扰，例如0.1mM ascorbic acid，5mM GSH都会使测定出来的吸光度上升约10%。此时尽管样品没有颜色，如果设置了使用说明中的空白对照3，就可以消除样品中的抗氧化物的干扰。

酶溶液可能会有少量沉淀，属正常现象，请混匀后使用。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：

1.样品的准备：

a.细胞样品的准备：收集细胞，用4℃PBS或生理盐水洗涤1-2遍。沉淀用碧云天的Western及IP细胞裂解液(P0013)裂解，

或用其他适当的裂解液裂解，或进行匀浆。对于裂解液或匀浆液，4℃离心取上清作为待测样品。裂解或匀浆宜在冰浴或4℃进行操作。

b.组织样品的准备：动物组织用生理盐水(0.9% NaCl，含有0.16mg/ml肝素钠)灌流清除血液后获取组织样品。取适量的

组织样品，加入碧云天的Western及IP细胞裂解液(P0013)或其他适当溶液进行匀浆。对于匀浆产物，4℃离心取上清作为待测样品。裂解或匀浆宜在冰浴或4℃进行操作。

c.红细胞或血浆样品的准备：用抗凝管收集血液，颠倒混匀。4℃600g离心10分钟，移取上清至另一新的1ml离心管

中，适量生理盐水稀释后即可作为血浆样本进行检测。红细胞样品可同细胞样品的准备，可以用碧云天的Western及IP 细胞裂解液(P0013)或其他适当的裂解液裂解。

d.上述样品准备完毕后可以用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋

白浓度。通常10-20微克蛋白的细胞或组织裂解液或匀浆液样品其中的SOD平均活力约1个活力单位左右。每种样品准备20-100微克蛋白量通常已经足够用于后续检测。

e.根据蛋白浓度和预计的蛋白使用量，用本试剂盒提供的稀释液适当稀释样品。裂解好的样品通常至少需要加入等体积

的稀释液进行稀释。准备好的样品如果当日测定，可以冰浴保存，如果当天不能完成测定，可以-70℃冻存，但建议尽量当天完成测定。

2.试剂盒的准备工作：

a.NBT工作液的配制：按照每1.8毫升SOD检测缓冲液中加入50微升NBT的比例进行配制(用SOD检测缓冲液将NBT稀释

约36倍)，混匀后即为NBT工作液。可以根据实验需要配制适当量的NBT工作液，配制好的NBT工作液4℃可以保存1-2天，但建议尽量现配现用。

b.酶工作液的配制：先把试剂盒中的酶溶液轻轻混匀，并轻轻离心沉淀酶溶液至管底。按照每200微升稀释液中加入10

微升酶溶液的比例进行配制(用稀释液将酶溶液稀释约20倍)，混匀后即为酶工作液。可以根据实验需要配制适当量的酶工作液，配制好的酶工作液4℃可保存1-2周，但建议尽量现配现用。

注意：由于酶溶液的用量比较少且易沉降，必须注意充分混匀。

c. (可选做)SOD标准品准备：需自备SOD标准品，用本试剂盒提供的稀释液将SOD标准品稀释至如下系列浓度：

100U/ml，50U/ml，20U/ml, 10U/ml， 5U/ml，1U/ml，0.1U/ml，0.01U/ml，0.001U/ml。在随后的检测中可以各取20微升，参考样品进行检测。说明：本试剂盒对于SOD的检测并不需要SOD作为标准品，但可以使用SOD标准品作为阳性对照或作为对SOD活性定量的参考。

3.样品测定：

a. 参考下表使用96孔板设置样品孔和各种空白对照孔。参考下表依次加入待测样品和其他各种溶液。加入酶工作液后充

分混匀。注意：加入酶工作液后反应即会开始，可以在低温操作或用排枪操作以减小各孔间因为加入酶工作液的时间

空白对照3。

**由于不同溶液可能对最终的吸光度读数产生影响，待测样品处于什么样的溶液中，对照溶液也应该使用什么溶液。

例如，样品在PBS中，则需使用PBS作为对照溶液；再如，样品在PBS和稀释液的1:1混合液中，则需使用PBS和稀释液的1:1混合液作为对照溶液；再如，样品在RIPA裂解液和稀释液的1:2混合液中，则需使用RIPA裂解液和稀释液的1:2混合液作为对照溶液。

b. 37℃孵育20分钟。(说明：孵育20分钟至30分钟检测出来的SOD活力无显著差异)

c. 在560nm测定吸光度。可以使用大于650nm的波长作为参考波长进行双波长测定。

4.样品中总SOD活力的计算：

a. 抑制百分率的计算：

参考如下计算公式计算抑制百分率：

抑制百分率＝ [(A空白对照1－A空白对照2)－(A样品－A空白对照3)] / (A空白对照1－A空白对照2) × 100%

如果没有设置空白对照3，则可以把计算公式简化为：

抑制百分率＝ (A空白对照1－A样品) / (A空白对照1－A空白对照2) × 100%

如果计算出来的抑制百分率小于30%或大于70%，则通常需要把该样品重新测定。尽量使样品的抑制百分率在30-70%范围内。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需适当稀释样品；如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度比较高的待测样品。

b.SOD酶活力单位的定义：在上述黄嘌呤氧化酶藕联反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD酶活力定义为

一个酶活力单位。

c.SOD酶活力的计算：

参考上图A和B，SOD的酶活力和抑制百分率呈非线性的关系，而1/SOD酶活力和1/抑制百分率成线性关系。由此得出SOD酶活力的计算公式如下：

待测样品中SOD酶活力单位＝检测体系中SOD酶活力单位＝抑制百分率 / (1－抑制百分率) units

例如，当抑制百分率为50%时，待测样品中SOD酶活力单位＝50% / (1－50%)units＝1 unit；当抑制百分率为60%时，待测样品中SOD酶活力单位＝60% / (1－60%)units＝1.5 units。

d. 如果样品为细胞或组织的裂解液或匀浆液，可以根据样品的蛋白浓度和稀释倍数，将SOD活力单位换算为U/g或U/mg

蛋白。如果样品为红细胞抽提液，可以根据血红蛋白含量，可换算为U/克血红蛋白或U/毫克血红蛋白。

附1：SOD酶活力计算的参考方案：可以先使用本试剂盒绘制SOD标准品的抑制百分率曲线，然后根据样品检测到的抑制百分率对比标准品的抑制百分率曲线计算出样品中的SOD酶活力单位。本方案仅供参考，使用本试剂盒时不必使用本方案进行检测和计算。

附2： SOD酶活力的动力学检测：如果条件许可，使用本试剂盒时也可以使用动力学方法检测SOD的酶活力。通常在步骤

3.a.后可以37℃孵育同时在560nm连续测定吸光度20分钟。根据20分钟内的吸光度变化的斜率计算出抑制百分率：

抑制百分率＝ [(斜率空白对照1－斜率空白对照2)－(斜率样品－斜率空白对照3)] / (斜率空白对照1－斜率空白对照2) × 100%

其余的计算方法同上述非动力学的计算方法。动力学方法的检测和计算更加精确一些，但检测起来相对要麻烦一些。

使用本试剂盒通常使用非动力学方法即可。

SOD(超氧化物歧化酶)活性测定

SOD(超氧化物歧化酶)活性测定 氮蓝四唑法 一、原理 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD)普遍存在动、植物的体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下面的反应： o 2.-+H O 2 22+O H ＋ 反应产物H 2O 2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性的大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易被氧化而产生超氧阴离子，超氧阴离子可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大吸收。而SOD 可清除超氧阴离子，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶的活性愈低，反之酶的活性俞高。据此可计算出酶活性的大小。 二、材料、仪器设备及试剂 (一)材料 植物器官(花瓣、叶片等) (二)仪器设备 冰箱、低温高速离心机、微量加样器 (1mL 、20μL 、100μL)、移液管、精密电子天平、UV-752型紫外分光光度计、试管、研钵、剪刀、镊子、荧光灯(反应试管处照度为4000Lux 或Lx) (三)试剂 (1) 0.05mol/L 磷酸缓冲液(PH7.8)。 (2) 130mmol/L 甲硫氨酸(Met)溶液：称1.9399gMet 用磷酸缓冲液定溶至100mL 。 (3)750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定溶至100mL ，避光保存。 (4)100μmol/LEDTA -Na 2溶液：称取0.03721g EDTA-Na 2，用磷酸缓冲液定溶1000mL 。 (5)20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g 核黄素用蒸馏水定溶到1000mL ，避光保存。 三、试验步骤 (一)酶液的提取 (1)称取植物材料(去叶脉)0.2g ，加1ml 预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲

邻苯三酚自氧化法简易操作图解-测量SOD活性方法

连苯三酚自氧化法测定·O2-自由基的清除能力简介（适用于：SOD及各种抗氧化剂） 文献来源 [1] Xican Li. Improved Pyrogallol Autoxidation Method: A Reliable and Cheap Superoxide-scavenging Assay Suitable for All Antioxidants. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60:6418-6424. 操作图解 具体方法 1 溶液配制 1.1 Tris溶液（0.1mol/L）：1.21 gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W. 121.1）+100 mL蒸馏水。 1.2 HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1 mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6 mL。 1.3 Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/L Na2EDTA） 40 mL0.1 mol/L Tris溶液+ x mL0.1 mol/L HCl溶液+15.2 mg Na2EDTA，混合，稀释到80 mL。用pH 计测量，pH应为7.4。用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天) 。（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。 1.4 60 mmol/L连苯三酚溶液（溶于1 mmol/L盐酸中） 取0.1mol/L HCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2 mL，得1 mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。再往里加连苯三酚14.6 mg (M。W.126.1 )，即得。（当天有效,以上为1个样品的用量）。 2 测试液 2.1连苯三酚溶液：取2950μL Tris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。（空白参比：Tris-HCl 缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。此时的ΔA为ΔA0。 3.2 样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μL Tris-HCl缓冲液，再加50μL 连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。（空白参比：Tris-HCl缓冲液） ΔA＝A325nm,300s - A325nm,30s。此时的ΔA为ΔA样。 3 计算公式

SOD测定方法

酶液提取:称取鲜叶样品。0.5g于预冷的研钵中，加lml0.05mol/1 pH7.0磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。将提取液于10000转/分冷冻离心20分钟，上清液用于测定SOD, POD, CAT活力测定及丙二醛含量测定。 SOD： 测定SOD活性的试剂配制及用量: ①磷酸缓冲液(PH7.8) 0.05moI/L 3.1m1，空白为3.2m1; ②EDTA-Na 2 1mg/m1 0.2mL; ③L一甲硫氨酸20mg/mL 0.2m1; ④核黄素0.1 mg/ml，吸取上清液0.2m1; ⑤NBT lmg/ml 0.2m1; ⑥提取酶液0.1ml，空白不加酶液。 反应总体积为4m1, 第1组、4000Lx光照30min，遮黑布终止反应(用光照培养箱，灯管全部打开即可)。 第2组、黑暗处理30 min。 置560nm处测定光密度。SOD活性单位以抑制NBT光化还原50%作为一个酶活性单位(u)，按以下公式计算SOD活性: 式中，Ack为照光管的吸光度值;AE为遮光管的吸光度值:V为样品液总体积((ml);Vt为测定时样品用量(ml); W为样品鲜重。 POD： 在试管中依次加入 4m1 0.3%愈创木酚(0.02mo1/1 pH6磷酸缓冲液配置)、 50ul酶液、 50 ul0.3%H 20 2， 摇匀，立即计时，1分钟后在470nm波长下比色，每1分钟记录一次吸光度值，连续记录5分钟。以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(U)，按下式计算过氧化物酶活性:

式中:d A470为反应时间内吸光度的变化:Vt为提取液总体积(ml); W为样品鲜重(g); Vs为测定时取用酶液体积(ml); t为反应时间(min) 。 CAT 取酶提取液50 u 1， 加入3m1 0.05 mol/1 pH7.0磷酸缓冲液， 再加入0.3%H 2O 2 200 u1， 迅速摇匀，立即计时，1分钟后在UV-754分光光度计的240nm波长下比色，每1分钟记录一次吸光度值，连续记录5分钟。以每分钟内A240下降0.01为1个酶活性单位(U)，按下式计算过氧化氢酶活性: 式中:△A 240 为反应时间内吸光度的变化;Vt为提取液总体积(ml):w为样品鲜重(g); Vs为测定时取用酶液体积(ml); t为反应时间(min) MDA 取上清液1.5m1， 加入2.5m10.5%的硫代巴比妥酸(TBA)(用10%三氯乙酸配制)。 混合物于100℃沸水浴中加热20min，迅速冷却，于10000转/分离心20分钟，分别测定上清液在450, 532nm及600nm处的吸光度值。按以下公式计MDA浓度C( u mol/1)和含量(nmollgFW): C(u mol/1)=6.45 X (A532-A600)-0.56 X A450

抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法

抗氧化酶 S O D P O D C A T活性测 定方法 集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法 酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液 （pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。 一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制 （1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)： A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na 2HPO 4 ·12H 2 O（分子量 358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH 2PO 4 ·2H 2 O（分子量 156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na 2HPO 4 ) 228.75ml，B母液(NaH 2PO 4 ) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。 参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。 （2）130mM甲硫氨酸溶液：取1.9399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。 （3）100μM EDTA-Na 2溶液：取0.03721gEDTA-Na 2 用磷酸缓冲液定 容至1000ml。 （4）20μM核黄素溶液：取0.0753g核黄素用蒸馏水液定容至1000ml，避光保存。 （5）750uM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.06133g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。 2、酶活性测定 （1）取10ml试管（要求透明度好）

SOD酶活性测定方法

SOD酶活性测定 所需药品： （1）0.1mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液： A液：0.1mol/l磷酸氢二钠液 B液：0.1mol/l磷酸二氢钠液 1毫升B+10.76毫升A （2）0.026mol/l蛋氨酸液（Met）：现用现配 称取0.3879克蛋氨酸，用1号液定容至100毫升。 （3）75*10-5mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）液：现用现配 称取0.1533克NBT，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至250毫升。 （4）1umol/lEDTA-2钠和2*10-5mol/l核黄素混合液 （5）0.05mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液 （6）石英砂 实验步骤： 1.酶液制备：称取0.5克鲜叶，放入研钵中，加入3毫升5号液和少量石英砂，于冰浴中研成匀浆。然后用5号液定容至8毫升，于0～4℃、13000g时离心15分钟，上清液即为酶提取液。酶液可在低于0℃下的环境中保存。 2.按下表加入试剂： 试剂摇匀后，迅速遮光处理1号杯，其余杯在25℃、光强为4000勒克司的条件下照光处理15分钟，然后立即遮光。接着在560nm下，以1号杯作为空白测定其余杯中溶液的光密度。假定2、3号杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率为100%，然后按下式分别计算其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率。 M/N=100/X M——2、3号杯中溶液的光密度的平均值 N——其余杯中溶液的光密度值 X——其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率 然后以酶液量为横坐标，以其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率（X）为纵坐标制作曲线，根据线性好的曲线所得出的函数关系计算抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量，以该酶液量作为1个酶活单位。 结果计算：SOD活力按下式计算： A=V*1000*60/（B*W*T）

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法79498

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法 一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制 （1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)： A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。 参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。 （2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取 2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。 （3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。 （4）60μＭ核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。 （5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。 酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中， 加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。 2、酶活性测定 （1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液 5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀； （2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中 （3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min； 同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光 后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。 （4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。

植物组织中SOD活性、MDA含量的测定方法

植物组织中SOD活性的测定超氧物歧化酶（SOD）是需氧生物中普遍存在的一种含金属酶。它与过氧化物酶、过氧化氢酶等酶协同作用防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞系统的伤害；SOD可以催化氧自由基的歧化反应，生成过氧化氢、过氧化氢又可以被过氧化氢酶转化成无害的分子氧和水。 【原理】 依据SOD抑制NBT在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧的条件下极易再氧化而产生02-，02- 可将NBT还原为蓝色的甲，后者在560 nm 处有最大吸收。而SOD作为氧自由基的清除剂可抑制此反应。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性越低，反正酶活性越高。一个酶活单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50%）时所需的酶量。 【仪器与用具】 离心机；分光光度计；进样器；紫光灯（4000 Lx）；15 mm×150 mm试管；黑色硬质套。 【试剂】 ①0.05mol/L 磷酸缓冲液PBS（pH=7.8） 提取介质50mmol/L PBS（pH=7.8）内含1% 聚乙烯吡咯烷酮 ② 130mmol/L 甲硫氨酸溶液：称1.9397g Met，用PBS 7.8 进行溶解 并定容至100ml；

③ 750umol/L NBT：称0.06132g NBT，用PBS 7.8进行溶解并定容至 100ml，避光保存； ④20umol/核黄素溶液：称0.0075g核黄素，用蒸馏水溶解定容至 1000ml，避光保存，现用现配； ⑤ 100umol/L的EDTA-Na2溶液：称0.0372g EDTA-Na2 ，用PBS 7.8 定容至1000ml。 【方法】 1.酶液提取 称取植物叶片0.2g（去叶脉）于预冷的研钵中，加1ml预冷的提取介质在冰浴下研磨成匀浆，加入提取介质冲洗研钵，并使最终体积为2ml，于4℃、10000r/min离心15min，上清液即为SOD粗提液。 2.显示反应 取透明度好、质地相同的15mm×150mm试管4支，2支为测定，2支为对照，按下表加入试剂。混匀后，给1支对照管罩上比试管稍长的双层黑色硬质套遮光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应20-30min，反应温度控制在25-35℃ 【计算】

SOD酶活性测定

SOD酶活测定方法 （一）氮蓝四唑法 1. 方法提要 在电子供体如甲硫氨酸存在下，核黄素受光激发，与电子供体反应被还原。在氧气中，还原的核黄素与氧化反应产生，将无色（或微黄）的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性僭，SOD 通过催化歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色形成。按抑制蓝色特形成的50%为一酶活单位。酶活力越高，抑制50%蓝色形成所需酶量越少。 2. 仪器 荧光灯管。 离心机。 分光光度计。 pH计。 3. 试剂 （1）磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），甲硫氨酸（Met），氮蓝四唑（NBT），核黄素，乙二胺四乙酸（EDTA），以上试剂均为分析纯级；所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。 （2）pH7.8, 5.0×10-2mol/L的K2HPO4- KH2PO4缓冲液（于冰箱中保存）。 4. 测定步骤 （1）酶液的制备：称取5~10g样品，加预先在冰箱中放置的上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液，缓冲液的量为所用样品的10倍以上，在4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min离心20min，取上清液用于酶活测定。 （2）酶反应酬体系液的制备：取上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液30ml，依次溶入Met，NBT，核黄素与EDTA，使它们的浓度分别为 1.3×10-2mol/L, 6.3×10-5mol/L, 1.3×10-6mol/L与1×10-4mol/L，放冰箱中避光保存。 （3）测酶活在暗光下，取上述酶反应体系液3mL，移入试管中，试管放在一反应小室中，反应小室壁上贴锡箔纸，应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。向每支试管加入25~30μL酶液。在25~30℃下用光强4000lx的荧光灯管（可用15W荧光灯）进行光照，15~20min后，出现颜色变化。停止光照。在560nm波长下比色测量透光度。用未加酶液的反应体系做对照。 5. 结果计算 以抑制蓝色形成的50%为一个酶活单位。按下式计算： 式中s——样品照光后的透光度； a——未加酶之反应液照光后透光度； b——未加酶之反应液照光前透光度； n——酶液稀释倍数。 样品酶活单位表示：SOD酶活单位（U）/g干重（g鲜重或g蛋白）。 6. 注释 （1）进行照光操作时，应注意所用试管的直径与管壁厚度基本一致。 （2）进行比色测定时，应用未加核黄素的酶反应体系液作空白。 （二）连苯三酚自氧化法 1. 方法提要 连苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出，生成带色的中间产物。在自氧化过程的初始阶段，黄色中间物的积累在滞后30~45s后就与时间成线性关系。中间产物在420nm处

SOD活性测定

SOD活性测定： SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。阻止中间物的积累而测定其酶活性。 1、试剂及仪器 (1)邻苯三酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。 (2)UV－754紫外分光光度计。 2、测定方法： (1)邻苯三酚自氧化速度的测定。 在25度、45ml`50mmol/L、PH值8.3、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在0.0700d/mm 左右。 (2)SOD或粗酶抽提液活性测定： 测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。 0.0700－A325mm/min ----------------------------------------＊100％度 0.70 样液稀释倍数样液稀释倍数 酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊---------------- 50％样液体积 3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算： SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。

蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。 4、比活(u/mg蛋白)的计算： 单位活力(u/ml) 总活力 比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白 蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白 超氧化物歧化酶的活性测定 超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。离子(O2-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2-)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。 按金属辅基成分的不同可分成3种类型。最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。 [原理] SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利

植物组织SOD活性测定

植物组织SOD 活性测定 一、实验目的 1、了解还原法测定抗氧化酶活性的原理与方法。 2、熟悉植物叶片ROS 清除机制。 二、实验原理 植物在受到光、温度、干旱、盐、碱等胁迫时会产生活性氧和自由基，而活性氧和自由基会抑制植物生长、损伤细胞结构和功能、使膜脂过氧化、破坏生物大分子的结构功能等。植物本身也会抵抗这种逆境，其自身的酶系统和非酶系统会产生相应的物质以清除活性氧和自由基，酶系统：超氧化物歧化酶（SOD ），超氧化物酶（POD ），过氧化氢酶（CAT ），抗坏血酸过氧化物酶（APX ）；非酶系统：维生素系列（Vce ），谷胱甘肽（GSH ）。 核黄素在照光条件下会将氧气还原为超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基与NBT 作用会产生蓝色的甲?，而SOD 会抑制超氧阴离子自由基与NBT 的反应。 三、材料 未处理的小麦叶片；0℃处理小麦叶片3-5min 。 四、试验步骤 1、酶液提取：称量小麦叶片（ck 、0℃）各0.5g ，预冷研钵，加2ml 预冷提取介质（磷酸缓冲液），冰态研匀浆，介质冲洗研钵2-3次，定容10ml 。取5ml ，两管平衡（0.01g ），对角线放置，4℃离心10min ，取上清液（粗酶液）。 2、显色反应 取4支专用试管，按下表加入 试剂 1（As1） 2（As2） 3（照光） 4（不照光，调零） buffer 1.5 1.5 1.5 1.5 O H O H O O H O H O H OH O H O O POD CAT SOD 2222 2222 2222??→←+??→?→→→????→??-

met 0.3 0.3 0.3 0.3 NBT 0.3 0.3 0.3 0.3 EDTA-Na 2 0.3 0.3 0.3 0.3 20uml 核黄素 0.3 0.3 0.3 0.3 粗酶液 0.1 0.1 0 0 ddH 2O 0.5 0.5 0.6 0.6 混匀后4号罩黑布，其它各管在4000lux 光下反应20min （25-30℃）根据酶活调整反应时间，反应结束后遮黑布终止反应，4号作空白调零，560nm 测吸光值。 五、计算 酶活性（U*g -1 fw*h -1 ）= 六、结果与分析 1、结果 未处理的小麦叶片SOD 酶活为949.57U*g -1 fw*h -1 ； 0℃处理5min 的小麦叶片SOD 酶活为907.83U*g -1 fw*h -1 。 2、分析 植物的抗寒性与活性氧代谢关系密切，低温胁迫下植物体内会产生大量的H 2O 2,O 2-等活性氧自由基，这些活性氧会导致膜脂过氧化，进而造成膜系统的氧化损伤。而植物内存在一系列酶促和非酶促的抗氧化剂以清除活性氧自由基，保护植物细胞免受活性氧的损伤，维持膜系统的稳定性，以增强植株的抗寒力。SOD 是主要的活性氧清除酶系，它催化O 2-转化为 t a fw A V A A S ***5.0*60**)(00

SOD活性测定

超氧化物歧化酶（SOD）活力测定 植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O 2 .－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等 是酶促防御系统的重要保护酶。抗坏血酸（V C ）、V E 和还原型谷胱甘肽（GSH） 等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平 和O 2.－、H 2 O 2 、OH. 和O 2 等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。 自1968年发现SOD后，立刻引起科学界的高度重视，近40年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD也有了产品。二十世纪80年代后期，我国关于SOD的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。 超氧自由基（O 2 .－）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生 物细胞中的超氧自由基（O 2.－），生成H 2 O 2 和O 2 。H 2 O 2 由过氧化氢酶（CAT）催化 生成H 2O和O 2 ，从而减少自由基对有机体的毒害。 一、目的 学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。 二、原理 SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：Mn－SOD和Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反应：

SOD 测定方法

SOD 氮蓝四唑（NBT）法测定超氧物歧化酶（SOD）活力 一、原理 超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD 可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料；水稻或小麦叶片 （二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。 （三）试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4. 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA －Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。 三、实验步骤 1. 酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。 2. 显色反应 取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液 1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。 3. SOD活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。 四、结果计算 已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD 活性。SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt) 上式中，SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）W样鲜重（g）蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重。

SOD活性测定

超氧化物歧化酶（SOD活力测定 植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（C2 ）、羟自由基（0H）、过氧自由基（ROD、烷氧自由基（RO等。植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD、 过氧化氢酶（CAT、过氧化物酶（POD和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD等是酶促防御系统的重要保护酶。抗坏血酸（V C）、V E和还原型谷胱甘肽（GSH 等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。SOD CAT等活性氧清除剂的含量水平和OT、HLQ、OH 和Q等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。 自1968年发现SOE后，立刻引起科学界的高度重视，近40年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD也有了产品。二十世纪80年代后期，我国关于SOD勺研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。 超氧自由基（OT ）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。超 氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase ），简称SOD能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（Q ），生成HQ和Q。HQ由过氧化氢酶（CAT催化生成H2O和Q，从而减少自由基对有机体的毒害。 、目的 学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT光化还原法测定SOD活力的方法和原理, 并了解SOD的作用特性。 二、原理 SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的*SOD Mn n SOC和—SOD

SOD_CAT及POD活性的测定

测定方法 一．SOD，CAT及POD活性的测定 分别取0.4ｇ材料于预冷的研钵中，加入8 ml预冷的50 mmol-1磷酸缓冲液（pH 7.8）（先加2ml, 在冰浴下研磨成匀浆后，将匀浆转入10ml离心管，再用6ml冲洗），10000 rpm离心15 min，取上清液定容至10ml后于4℃保存。上清液用于可溶性蛋白质含量、SOD活性及POD活性的测定。 SOD活性测定 1.显色反应取5mL指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按表47–1加入各溶液。混匀后，给1支对照管照上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应20-30 min(要求各管照光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，使酶活性高低适当调整反应时间)。 当样品数量较大时，可在临用前根据用量将表47–1中各试剂(酶液和核黄素除外)按比例混合后一次加入2.65mL，然后依次加入核黄素和酶液，使终浓度不变。 3.SOD活性测定 至反应结束后，用黑布罩盖上试管，终止反应。以遮光的对照管作为空白，分别在560nm 下测定各管的OD值，计算SOD活性。 3.<结果计算> 已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD

活性。SOD总活性[u/g(FW)]= 式中：SOD总活性以酶单位每克鲜重表示。 比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。 ACK ——照光对照管的吸光度。 AE ——样品管的吸光度。 VT ——样品液总体积，mL。 V1 ——测定时样品用量，mL。 W——样品鲜重，g。 蛋白质含量单位为mg/g。 愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性 1.取两支试管，洗涤后甩干水分。 试剂管号（对照）测定管 0.05mol/L PH 5.5的磷酸缓冲液 2.9ml 2.9 ml 2%双氧水溶液0 ml 1.0 ml 0.05mol/L愈创木酚溶液 1.0 ml 1.0 ml 蒸馏水 3.0 ml 2.0 ml 总体积7.0 ml 7.0 ml 将上述各管立即放入预先调好37 ℃的水浴锅中保温5min以上（酶促反应），向对照管中加入0.1 ml酶液，混匀，在λ470 nm处调零，再向测定管中加入0.1 ml酶液，并且立即计时，混匀后进行比色测定，3分钟时立即读取吸光度。（也可以每分钟读取一次，3分钟内吸光度变化值ΔA ） 2.结果计算 以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min · g （鲜重） ] 表示之。也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单 位（ u ）表示。 按下式计算酶的相对活性 △A470 ×酶提取液总量（ml）酶活性（△A470·g－1Fw·min－1）= ——————————————————— 样品鲜重（g）×测定时酶液用量（ml）

邻苯三酚自氧化法测定sod活性及含量

邻苯三酚自氧化法测定sod活性及含量 一、实验原理: 邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min 的范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过测定光 吸收即可求出SOD的酶活性。 二、实验试剂： 大宝sod蜜、冷丙酮、磷酸缓冲液（PH7.8，0.05mol/L)、氯仿-乙醇混合液、邻苯三酚、浓盐酸、天平、石英砂、研钵、冷冻离心机、50mL离心管 8个、紫外-可见分光光度计、250mL三角瓶8个、玻璃棒8根、试剂瓶250mL 3个、500mL 3个、250mL烧杯16个、试管带胶塞80根、移液管各5根 这个液体貌似是不能研磨的，而且本身就是酶，正常的生物体内的酶不都是可溶的？研磨是为了破碎细胞的。我觉得应该是通过加水——打碎胶体，把抗氧化剂全都搞到水中（这个拜托查下）——分液——乙醇-氯仿沉淀（用来鉴别是带Mn还是CuZn）（不知道会不会有另外两种抗氧化剂干扰）——透析（去离子电泳用） 乙醇-氯仿的浓度比 酶的保存问题：测一下大宝pH应该可以作为参考，但是这个酶种类太多了，要点就是pH至少不能小于6，关于最适合pH是否也要测量？还是说我们是为了测量大宝里面SOD的活性所以就按照大宝的pH保存。 还有一个小小的想法就是。这部分是1次做完还是两次做完？

EDTA二钠：几乎不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值约为5.3。用于络合金属离子和分离金属。干扰物，但是没有氧化性 三、实验步骤： （1）SOD提取： 取大宝sod蜜加入15mL的PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。(留出1mL备用，准确量取剩余上清液体积，记录) （2）除杂蛋白： 提取液加入1/4体积的氯仿-乙醇混合液搅拌10min，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。（取1mL粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积） （3）SOD酶的沉淀分离： 剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得到SOD酶沉淀。将沉淀先加2mL磷酸缓冲液，溶解后再加3mL混匀。6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。取1mL备用，其余量取体积。 （4）粗酶液活性测定： 提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，具体步骤如下。 加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓盐酸停止反应，420nm测吸光值。

sod活性测定

实验材料与方法 1主要试剂的配制 1．0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)： A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。 2．130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。3．750μmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。 4．100μmol/LEDTA-Na2溶液：称取0.003721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml。 5．20 μmol/L核黄素溶液：称取0.00753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。 6. K2Cr2O7溶液的配制：M（K2Cr2O7）×所要配制的浓度/2M（Cr） 7. 5%双氧水溶液：取30%的双氧水溶液25mL于200mL量筒中，加蒸馏水至150mL。现用现配。 8. NaHS溶液的配制：精确称取0.056gNaHS，少量水溶解并使用容量瓶定容到100ml，定容后的溶液即为10mmol/L的H2S母液，在每次实验前现用现配，并使用蒸馏水稀释成实验所需的浓度。 2 生理指标的测定 (1)酶活性测定的方法和原理 方法：本实验采用氮蓝四唑（NBT）光化还原法 原理：：氮蓝四唑在蛋氨酸和核黄素存在条件下，照光后发生光化还原反应而生成蓝色甲腙，蓝色甲腙在560nm处有最大光吸收。SOD能抑制NBT的光化

SOD的活性测定

SOD活力测定（NBT还原法） 植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。抗坏血酸（VC）、VE和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2－、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。 超氧自由基（O2.－）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2。H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。 一、原理 超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2-，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2-，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 二、试剂 （一）试剂 （1）0.2 mol/L pH7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液： A液（0.2 mol/L NaH2PO4溶液）：准确称取NaH2PO4·2H2O （MW=156.01）15.715g 于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入500mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。 B液（0.2 mol/L Na2HPO4溶液）：准确称取Na2HPO4·12H2O（MW=358.14）71.63g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1000mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。 取上述A液34mL与B液366mL充分混匀后即为0.2mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液。4℃冰箱中保存备用。 （2）0.05 mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液 取0.2 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液250mL，移入1000 mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。 （3）130mmol/L 蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液 准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.9699g于小烧杯中，用少量0.05 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入50mL容量瓶中并用0.05 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。【溶于水，3.3g/100ml 25℃，不溶于有机溶剂】4℃保存可用1～2d. （4）750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.03066g NBT用磷酸缓冲液定容至50ml，避光4℃