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胰蛋白酶抗原修复液

简介：

组织在制作过程中，由于化学试剂的作用封闭了抗原，又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲，致使在免疫组化的染色过程中不能将其显示出来，为了解决上述的问题，利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程称为抗原修复。柠檬酸盐、EDTA或Tris等缓冲液在热的条件下可以使被福尔马林屏蔽的抗原重新暴露出来，同时又不会对抗原表位造成破坏，从而提高抗原的检出率，降低背景染色，提高诊断的准确率。

在热诱导抗原修复法出现之前，胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶等酶类的诱导的表位修复是最常用的方法。Leagene 胃蛋白酶抗原修复液能暴露石蜡切片等样品中的抗原表位，从而大大改善免疫染色效果。通常石蜡切片都需进行抗原修复处理，而冰冻切片可以不进行抗原修复处理，抗原修复可以提高石蜡切片的免疫染色效果，亦可以不同程度的提高冰冻切片的染色效果。当冰冻切片免疫染色效果不理想时，可考虑进行抗原修复。按照每个片子需要10ml抗原修复液(1×)计算，100ml抗原修复液可以用于10个样本的抗原修复。

组成：

自备材料：

1、系列乙醇

2、双蒸水或去离子水

3、加热设备

4、免疫染色洗涤液

操作步骤（仅供参考）：

(一)石蜡切片

1、脱蜡至水

①二甲苯3次，每次3～5min。

②无水乙醇脱水2次，每次3～5min。

③95%的乙醇，3～5min。编号

名称

IH0310 Storage 胰蛋白酶抗原修复液100ml -20℃使用说明书1份

④90%的乙醇，3～5min。

⑤80%的乙醇，3～5min。

⑥70%的乙醇，3～5min。

⑦蒸馏水冲洗2次，每次3～5min。

2、抗原修复：将切片浸泡在胰蛋白酶抗原修复液中，孵育10～25min。

3、免疫染色洗涤液或自来水洗涤1～2次，每次3～5min，彻底漂洗干净。

4、进行后续的免疫染色步骤。

(二)冰冻切片：

1、免疫染色洗涤液或自来水洗涤切片5min。

2、抗原修复：将切片浸泡在胰蛋白酶抗原修复液中，孵育10～25min。

3、免疫染色洗涤液或自来水洗涤1～2次，每次3～5min，彻底漂洗干净。

4、进行后续的免疫染色步骤。

(三)其它样品：

其它样品参考石蜡切片或冰冻切片进行操作。

注意事项：

1、胰蛋白酶抗原修复液恢复至室温后再使用，但应避免反复冻融。

2、浸泡在胰蛋白酶抗原修复液中，最佳孵育时间需根据不同的样品和目的蛋白自行摸索。

3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：12个月有效。

免疫荧光操作步骤及注意事项

免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。紫外光激发荧光物质放射荧光示意图免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。基本实验步骤：

免疫荧光操作步骤及注意事项

免疫荧光操作步骤及注意事项免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。紫外光激发荧光物质放射荧光示意图免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。

由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好

免疫荧光检测

免疫荧光技术（检测抗核抗体（ANA）的实验方案）荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂，用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定。荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测，称为流式荧光免疫技术。荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定等。本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(ANA)为例进行实习。抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNA、可提取的核抗原(ENA)和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。抗核抗体实验原理以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如Hep-2)作抗原片，将病人血清加到抗原片上。如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。试剂与器材 1．抗原片现多用商品试剂。如需自行制备，方法如下： (1)肝印片制备：取4-8周龄小鼠，断颈杀死后，剖腹取肝。将肝脏剪成平面块，用生理盐水洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上留下薄层肝细胞。冷风吹干，乙醇固定，冰箱可保存1周。

(2)Hep-2细胞抗原片制备：Hep-2细胞是建株的人喉癌上皮细胞。经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片，用洗涤洗去培养基。干燥后，用无水乙醇固定。 (3)肝切片制备：取小鼠肝组织作冰冻切片，厚4μl。-30℃保存备用。 2．异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IgG抗体(FITC-抗人IgG抗体)有商品供应，临用时按效价稀释。 3．L PBS 4．缓冲甘油取甘油9份加PBS 1份。 5.待测血清、阳性和阴性对照血清临床标本筛选获得。 6．器材荧光显微镜、孵箱、有盖湿盒、染色缸、吸管、试管等操作方法 1．准备：检查加样板，生物载片恢复室温，标记。 2．稀释：PBS-Tween缓冲液稀释血清，设阴阳性对照。 3．加样：加样板放于泡沫塑料板上，加25μl稀释后血清，至加样板的每一反应区，避免气泡。加完所有标本后开始温育。 4．温育：将生物薄片盖于加样板的凹槽里，反应开始，室温温育30分钟。 5．冲洗：用烧杯盛PBS-Tween缓冲液流水冲洗生物薄片，然后立即将其浸入盛有PBS-Tween缓冲液的小杯中至少1分钟。不必混摇。 6．加样：滴加20μl荧光素标记的抗人球蛋白（结合物）至一洁净加样板的反应区，完全加完方可继续温育。荧光素标记的抗人球蛋白用前需混匀并以PBS-Tween缓冲液稀释。

免疫荧光技术

免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。一、基本原理：免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。二、应用范围：其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。三、基本实验步骤：

1、细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 2、固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5min. 3、通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5min. 4、封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. 5、一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. 6、二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 7、封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。四、注意事项： 1、染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。 2、荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。

免疫荧光抗体检测技术

实验七免疫荧光抗体检测技术一、目的要求通过本实验，了解和掌握直接免疫荧光和间接免疫荧光染色的原理和方法，并能应用于疾病的诊断和抗原抗体的分析。二、实验原理用化学或物理的方法将荧光素标记到抗体或抗原上，这种标记荧光素的抗体或抗原仍然能与相应抗原或抗体发生特异性结合。通过已知的荧光抗体或抗原，检测样本中相应的抗原或抗体，从而进行疾病的诊断和对抗原抗体的分析。间接免疫荧光试验三、实验材料感染鸡马立克病病毒（MDV）的细胞培养物，抗MDV特异性单克隆抗体BA4;丙酮-乙醇（6:4，V/V）固定液，盖玻片，FITC标记的抗小鼠IgG荧光抗体，0.01mol/L PBS(pH 7.2)，蒸馏水，载玻片（洁净无油）；1000ml 烧杯，磁棒，磁力搅拌器，200μL移液器，吸水纸，镊子等。四、实验方法 1.细胞片的制备与固定将消毒并处理过的盖玻片放于细胞培养瓶（皿）中，按常规操作，制备鸡胚成纤维细胞，并培养于细胞培养瓶（皿）中，待细胞生长成单层后，接种CVI988/Rispens疫苗株。48—72h后，直接收获盖片，用PBS洗涤1次，再以-20℃预冷的丙酮-乙醇（6:4，V/V）固定液固定5min，空气干燥，置密封容器于-20℃保存备用。如用96孔或24孔细胞培养板培养的细胞，可弃去培养液，用PBS洗涤1次，然后固定，固定方法同上。 2.抗体染色 ⑴将接种并固定的MDV病毒的盖玻片，用PBS洗涤1次，置架上。取未接种MD病毒的盖玻片，同上用PBS洗涤1次，置架上，作为阴性对照。盖玻片上滴加10μL—20μL工作浓度的单克隆抗体，96孔细胞培养板加入50μL/孔工作浓度的单克隆抗体。37℃水浴孵育30—45min。 ⑵盖玻片在PBS（Ph7.4,0.01mol/L）中用磁力搅拌器洗涤5—10min，如用96孔细胞培养板检测，则加入PBS 200μL/孔，洗涤3—4次。 ⑶取出盖片置架上，滴加工作浓度的荧光抗体（FITC标记的抗小鼠IgG的抗体）。37℃孵

免疫荧光技术常见问题汇总

免疫荧光技术常见问题汇总 1、问：用免疫荧光方法做组织切片和培养细胞内的蛋白，两者操作过程有哪些不同？参考见解：只是固定方法不同。细胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一样的。 2、问：近期要做免疫荧光双标，不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤及其注意事项？参考见解：经验是：（1）选取一抗时要来源于两种不同的动物，用来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，比如donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。（2）两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。（3）阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。（4）封闭血清与二抗来源动物一致，用的是10%的正常donkey血清。（5）其余步骤同一般免疫荧光单标操作。 3、问：本人拟做Brdu标记神经干细胞免疫荧光，二抗为FITC标记，想请教各位大侠：（1）抗体分装和荧光显微镜观察时是否一定要在暗室中进行？（2）封片时是否用甘油缓冲液即可，还是用甘油和0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液等量混合封片？（3）免疫酶染色中的3%过氧化氢及2N盐酸是否还需要用？参考见解：（1）你的二抗是用FITC标记的，为避免荧光分解，分装及荧光显微镜观察时均要避光；（2）封片最好用甘油加0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液，后者能使玻片透明；（3）关于免疫酶染色，如果是用过氧化物酶做标记，就必须用3%H2O2以去除内源性过氧化物酶；2N盐酸需要使用，目的是使DNA变性，让Brdu抗体能够充分地与已经掺入的Brdu结合。

免疫荧光抗体技术

免疫荧光抗体技术摘要：免疫荧光抗体技术是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。其中，最常用的是以荧光素标记抗体或抗抗体，用于检测相应的抗原或抗体。本文主要对他们的原理、特点的介绍，并对其前景进行了探讨。关键字：免疫荧光抗体技术研究进展 Abstact Immunofluorescence antibody technology refers to an antigen or antibody labeled with fluorescein, then observed by fluorescence microscopy and fluorescence analysis in tracing the corresponding antigen or antibody . The most commonly used is labeled with fluorescein antibody or antibody, used to detect the corresponding antigen or antibody 。This paper mainly introduces the principle, characteristics of them, and their prospects were discussed . Key words immuno ，Immunofluorescence， research progress 1.免疫荧光抗体标记技术

荧光抗体技术示意图免疫荧光标记技术（immunofluorescence technique）是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位，检测出抗原或抗体。免疫荧光标记技术始创于20世纪40年[1]代初，1942年Coons等首次报道用异氰酸荧光素标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。当时由于异氰酸荧光素标记物的性能较差，未能推广使用。直至1958年Riggs等合成了性能较为优良的异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）。Marshall等又对荧光抗体标记的方法进行了改进，从而使免疫荧光技术逐渐推广应用。荧光抗体技术在临床检验上已用作细菌、病毒和寄生虫的检验及自身免疫病的诊断等。在细菌学检验中主要用于菌种的鉴定。标本材料可以是培养物、感染组织、病人分泌排泄物等。本法较其他鉴定细菌的血清学方法速度快、操作简单、敏感性高，但在细菌实验诊断中，一般只能作为一种补充手段使用，而不能代替常规诊断。荧光抗体染色法对脑膜炎奈氏菌、痢疾志贺菌、霍乱弧菌、布氏杆菌和炭疽杆菌等的实验诊断有较好效果。荧光间接染色法测定血清中的抗体，可用于流行病学调查和临床回顾诊断。免疫荧光用于梅毒螺旋体抗体的检测是梅毒特异性诊断常用方法之一。免疫荧光技术在病毒学检验中有重要意义，因为普通光学显微镜看不到病毒，用荧光抗体染色法可检出病毒及其繁殖情况。在寄生虫感染诊断中，间接荧光抗体染色法有非常广泛的应用。间接免疫荧光试验（ifat）是当前公认的最有效的检测疟疾抗体的方法。常用抗原为疟疾患者血液中红内期裂殖体抗原。ifat对肠外阿米巴、尤其是阿米巴肝脓肿也有很高的诊断价值，所用抗原是阿米巴培养物悬液或提取的可溶性抗原。 1.1原理：荧光素在10叫的超低浓度时，仍可被专门的短波光源激发，在荧光显微镜下可观察到荧光。荧光抗体标记技术就是将抗原抗体反应的特异性、荧光检测的高敏感性、以及显微镜技术的精确性3者相结合的一种免疫检测技术。 2.2荧光素：是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光

免疫荧光技术

免疫荧光技术荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。国外生产的TDM用试剂盒，有相当一部分即属于此类，并且还有专供TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。有关荧光的基本知识一、荧光现象（一）荧光的产生一此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。（二）荧光效率荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。选择激发光波长量接近于荧光分子的最大吸收峰波长，且测定光波量接近于最大发射光波峰时，得到的荧光强度也最大。（三）荧光的猝灭

免疫荧光技术

免疫荧光技术免疫荧光技术（immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术。始创于40年代初，1942年coons等多次报道用异氰酸荧光素标记抗体。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。免疫荧光技术包括荧光抗体技术和荧光抗原技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。一、实验的基本原理免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。二、实验方法 1、直接法这是荧光抗体技术最简单和基本的方法。滴加荧光抗体于待检标本片上，经反应和洗涤后在荧光显微镜下观察。标本中如有相应抗原存在，即与荧光抗体特异结合，在镜下可见有荧光的抗原抗体复合物。此法的优点是简单、特异。但其缺点是检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体，且敏感性低于间接法。图一、直接免疫荧光法原理示意图 2、间接法根据抗球蛋白试验的原理，用荧光素标记抗球蛋白抗体(简称标记抗抗体)

的方法。检测过程分为两步：第一次，将待测抗体(第一抗体)加在含有已知抗原的标本片上作用一定时间，洗去未结合的抗体。第二，滴加标记抗抗体。如果第一步中的抗原抗体已发生结合，此时加入的标记抗抗体就和已固定在抗原上的抗体(一抗)分子结合，形成抗原-抗体-标记抗抗体复合物，并显示特异荧光。此法的优点是敏感性高于直接法，而且无需制备一种荧光素标记的抗球蛋白抗体，就可用于检测同种动物的多种抗原抗体系统。亦可用荧光素标记葡萄球菌a蛋白。代替标记抗球蛋白抗体用于间接法荧光染色，且不受第一抗体来源的种属限制，但敏感性低于标记抗抗体法。间接法有时易产生非特异性荧光，为其缺点。此法常用于各种自身抗体的检测。如果第一抗体为已知，间接法也可用于鉴定未知抗原。图二、间接免疫荧光法原理示意图由于免疫球蛋白有种属特异性，因此标记的抗球蛋白抗体必须用第一抗体同种的动物血清球蛋白免疫其他动物来制备。细胞抗原特异性抗体 FITC FITC标记的第二抗体 FITC 间接染色法的优点是既能检查未知抗原，也能检查未知抗体；用一种标记的抗球蛋白抗体，能与在种属上相同的所有动物的抗体结合，检查各种未知抗原或抗体，敏感性高。缺点是：由于参加反应的因素较多，受干扰的可能性也较大，

免疫荧光介绍[参照材料]

免疫荧光介绍免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。一、基本原理及特点：免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。国外生产的TDM用试剂盒，有相当一部分即属于此类，并且还有专供TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。新发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合

荧光抗体技术

第二节荧光抗体技术一、荧光抗体的制备（一）抗体的荧光素标记用于标记的抗体，要求是高特异性和高亲和力的。所用抗血清中不应含有针对标本中正常组织的抗体。一般需经纯化提取igg后再作标记。作为标记的荧光素应符合以下要求：①应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。②荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。⑤标记方法简单、安全无毒。⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。常用的标记蛋白质的方法有搅拌法和透析法两种。以fitc标记为例，搅拌标记法为：先将待标记的蛋白质溶液用0.5ml/lph9.0的碳酸盐缓冲液平衡，随后在磁力搅拌下逐滴加入fitc溶液，在室温持续搅拌4～6h 后，离心，上清即为标记物。此法适用于标记体积较大，蛋白含量较高的抗体溶液。优点是标记时间短，荧光素用量少。但本法的影响因素多，若操作不当会引起较台强的非特异性荧光染色。透析法适用于标记样品量少，蛋白含量低的抗体溶液。此法标记比较均匀，非特异染色也较低。方法为：先将待标记的蛋白质溶液装入透析袋中，置于含fitc的0.01mol/lph9.4碳酸盐缓冲液中反应过夜，以后再对pbs透析法去除游离色素。低速离心，取上清。标记完成后，还应对标记抗体进一步纯化以去除未结合的游离荧光素和过多结合荧光素的抗体。纯化方法可采用透析法或层析分离法。（二）荧光抗体的鉴定

荧光抗体在使用前应加以鉴定。鉴定指标记包括效价及荧光素与蛋白质的结合比率。抗体效价可以用琼脂双扩散法进行滴定，效价大于1:16者较为理想。荧光素与蛋白质结合比率（f/p）的测定和计算的基本方法是：将制备的荧光抗体稀释至a2801≈1.0，分别测读a280（蛋白质特异吸收峰）和标记荧光素的特异吸收峰，按公式计算。按公式计算。 f/p值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越少。一般用于固定标本的荧光抗体以f/p＝1.5为宜，用于活细胞染色的以f/p＝2.4为宜。抗体工作浓度的确定方法类似elisa间接法中酶标抗体的滴定。将荧光抗体自1:4～1:256倍比稀释，对切片标本作荧光抗体染色。以能清晰显示特异荧光、且非特异染色弱的最高稀释度为荧光抗体工作浓度。荧光抗体的保存应注意防止抗体失活和防止荧光猝灭。最好小量分装，－20℃冻存，这样就可放置3～4年。在4℃中一般也可存放1～2年。二、免疫荧光显微技术免疫荧显微技术的基本原理是：使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面的抗原进行反应，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光。（一）标本的制作