生化实验基本原理及技术
生物化學實習
1
緒論
(一) 原理
1. 光依據其波長來分類：
(1) 200nm~400nm 短波屬於紫外光 (2) 400nm~700nm 可見光波長 (3) 700nm~900nm 長波屬於近紅外光
2. 光通過溶液時，特定波長的光被吸收，眼睛察覺到的是沒有被吸收的波長。
核黃素會吸收450nm 的光，紅光與黃光會通過溶液而被肉眼所見。
第一單元 生化實驗基本原理及技術
2
圖1-1光譜儀
光譜儀可用來鑑定及定量純或不純的溶液中所含有的特定化合物，主要原理是基於兩個物理定律：1.柏朗定律；2.比爾定律 。
1. 柏朗定律：每單位厚度溶液其吸收入射光的比率為定值，被溶液吸收的入射光量與入射光強度無關。被每單位厚度溶液吸收的入射光比率為定值，每一單位厚度溶液若吸收10%的光，則光經過每一單位厚度溶液時，其強度即減少10%。
I ＝I 0 ? e -αι
I ：穿透光強度 I 0：入射光強度 α ：溶液吸光係數 ι：光路徑長度
柏朗定律中以對數為底轉換公式，將吸光係數α轉換成比例常數K
→ log 10 I 0 / I ＝K ι
log 10 I 0 / I ＝ 吸光值(absorbance ；A)
或光密度值(optical density ；
OD)
生物化學實習
3
2. 比爾定律：光經過吸光物質所產生的吸光值，與溶液中每單位面積所含的吸光物質數目成比例。
比爾定律描述比例常數K 與待測吸光溶液中溶質的濃度有關。
K ＝εc ε：消光指數 c ：吸光物質濃度 I ＝ I 0? 10-εc ι
log 10 I 0 / I ＝ A ＝log 1010εc ι＝ εc ι
當ι（光路徑長度）＝1 cm 時
log 10 I 0 / I ＝ A ＝log 1010εc ＝ εc
特定溶質在特定波長下，消光係數ε為一常數。因此，當吸光物質的濃度變成兩倍，於相同的光路徑下，被吸收的光量也會變成兩倍。
圖1-2 22 μM 溶於0.1M 磷酸鈉，pH 7.06，1公分 光路徑(light path)的條件下測定
波長
吸
光
值
第一單元 生化實驗基本原理及技術
4
(二) 光譜儀的應用
1. 呈色反應：如果分子沒有吸光性，可將此分子與其他分子反應，產生具吸光性的有色化合物。
2. 色度定量法： (1) 呈色劑必須過量。
(2) 必須在吸光值與該化合物濃度呈現線性下，得出標準曲線，亦即該化合物
濃度之改變必須與吸光值改變成正比。
(3) 色度定量法之最大誤差來源：通常發生在化合物高濃度時，由於其產生數
據為非線性反應所致。應該將未反應之未知溶液重新稀釋後再做一次，切勿直接稀釋已呈色之反應溶液。
(三) 呈色定量：線性反應之標準曲線
圖1-3呈色定量反應的標準曲線
(四) 光譜儀的構造與性質 1. 光源 (Light Source) (1) 鎢絲燈：
340~900 nm
生物化學實習
5
(2) 氫-氘燈：200~360 nm
2. 波長選擇器 (Wavelength Selector) (1) 單色光純度越高，其靈敏度也越高。
(2) 濾光片 (absorption filters)：能夠將高於及低於特定波長的光遮蔽住。 (3) 較為先進的光譜儀會使用稜鏡 (prism) 或繞射柵欄來產生單色光以克服
濾片的缺點。
(4) 狹縫 (slit)：光的路徑中置放一對調節板行成狹縫調整入射光的強度。 (5) 樣品管或比色槽 (sample tubes or cuvettes)：盛裝樣品與空白對照組溶劑的
容器必須是相同的。
(五) 光伏特電池或測光光電管-偵測系統中穿透光
1. 光伏特電池：硒的電子流其靈敏度很低，且對小於270 nm 及大於700 nm 的波長不敏感。
2. 真空電光管：有兩個電極維持一個電位差，當入射的輻射光投至陰極引起電子的反射(光電效應)，電子會在陽極(正極)被收集，光電流可立即被放大偵測。
3. 光電倍增管(photomultiplier tube ，PMT) ：是一般光電管的衍生物。有數個中間電極(倍增電極，dynodes) 。
(一) 基本原理：利用分子經過多孔性介質時會有不同移動速度而將其分離的實驗
技術稱為層析法。層析法基本原理為利用各種物質對吸附用的靜相（stationary phase ；固體材料或基質）和流過靜相的動相（mobile phase ；緩衝溶液或溶劑）有不同的親和力而將其分離。
第一單元 生化實驗基本原理及技術
6
(二) 基礎理論：分配係數及相對移動速度，分離的過程中，分子會被固體材料（靜
相）所吸附，需要先定出該分子對靜相及（或）動相的親和力。
圖1-4管柱層析系統
1. 分配係數（partition coefficient ；α）：表示一個物質對靜相的親和力。分配係數數值介於0與1之間。分配係數α值越大表示該成分對靜相的親和力越大。
數學公式：
被靜相吸附的分子數 α＝
在靜相與在動相的分子總數
生物化學實習
7
2. 相對移動速度：表示分子對動相之親和力，其定義為：分子與動相通過固體材料的相對移動速度。
R f ＝1-α
3. 解析度 (Resolution;R) 最大化是任何層析想要達成之目標。
圖1-5層析解析度
第一單元 生化實驗基本原理及技術
8
(三) 層析法動相：等梯度流析 vs.梯度動相流析 1. 等梯度流析方式(isocratic)：全程動相特性相同。
2. 梯度動相流析(gradient)：過程中連續改變動相的離子強度、pH 值、配位體濃度或者是有機溶劑雨水溶液的比例。
(四) 層析的種類
常用的層析的種類包括：膠體過濾或分子篩、離子交換層析法、疏水性作用層析法、親和性層析法、分配層析法、高效能（高壓）液相層析法。 1. 膠體過濾法(Gel Filtration) 或分子篩(Size Exclusion)
(1) 原理：基於特定大小的分子是否有能力進入具有許多孔洞的固體材料或介
質，通常使用等濃度的動相。 (2) 膠體過濾層析過程
圖1-6膠體過濾層析過程
(3) 膠體過濾層析結果
生物化學實習
9
圖1-7 膠體過濾層析結果
2. 離子交換層析法(Ion Exchange Chromatography)
(1) 原理：利用分子表面帶的電荷對帶電的靜相或固體材料有不同的靜電吸引
力來分離物質。 (2) 種類：
A. 陽離子交換法(cation ion-exchanger)：靜相帶有負電荷，對溶液帶有正電的分子（陽離子）具有親和性。最常使用的陽離子交換樹脂是CM 纖維素。
B. 陰離子交換法(anion ion-exchanger)：最常使用的陰離子交換樹脂是
DEAE 纖維素。
C. 緩衝溶液：離子交換層析中選擇適合的緩衝溶液，所用的緩衝溶液需能以儘量低的濃度，在所欲使用的pH 值下，提供足夠的緩衝能力，以免影響溶液的離子強度。在其pK a 處會有最大的緩衝能力。
第一單元 生化實驗基本原理及技術
10
3. 疏水性作用層析法(Hydrophobic Interaction)
(1) 原理：用來增進蛋白質與疏水性吸附劑結合的動相條件剛好與增進離子交
換樹脂相反：低pH 值和高離子強度。
(2) 高離子強度會消弱蛋白質與吸附劑的靜電作用力，卻會增進疏水性交互作
用。
(3) 高離子強度會比低pH 值更為重要，在高離子強度的狀況下，含有極大疏
水性的蛋白質只要以C 4管柱就可以吸附，含有較小疏水性的蛋白質則需要C 8或C 10管柱才能吸附。
(4) 要將蛋白質析出，要破壞蛋白質分子與吸附劑之間的疏水性交互作用，只
要降低動相的離子強度就可以輕易地將其流析。
4. 親和性層析法(Affinity Chromatography)
親和性層析法是發展最迅速的層析法，獲得最大產率及最大純度。 (1) 種類：
A. 受質親和性層析法：酵素、配位體。
B. 染料配位體層析法： Cibacron Blue 會和酵母菌中的兩種酵素有極大的親和性；丙酮酸激(p y r u v a t e k i n a s e )和磷酸果醣
激
(phosphofructokinase)。
C. 免疫親和性層析法：抗原-抗體交互作用之解離常數（K d ）範圍為10-8
至10-10M ，而最高可達到10-12M ，使用單株抗體來進行免疫親和性層析的效果最好。
D. 固定化金屬離子親和性層析法 (IMAC)：以二價金屬陽離(Zn 2+
, Fe 2+
, Ni 2+
, Cu 2+
)純化表面含有組胺酸(histidine)的蛋白質，最後以下列三種方式之
生物化學實習
11
一將藉由組胺酸與樹脂結合的蛋白質流析出來： (a) 降低動相的pH 值
(b) 添加比在IMAC 樹脂上還強的金屬崁合劑（例如：EDTA ） (c) 增加動相中與蛋白質競爭金屬鍵結之物質的濃度(例如：咪唑
imidazole)或組胺酸(histidine)。
5. 分配層析法( Partition Chromatography)
通常是應用在定性分析方面（而非應用在製備方面），分配層析法係使用薄板形式來進行層析，其靜相通常是塗抹在玻璃板（硬式）或聚酯膠片（軟式）上的吸附薄層。
(1) 分配層析法靜相/動相分類：
A. 正相(normal-phase)分配層析法，靜相帶有極性，而展開用的動相則不帶帶有極性。
B. 逆相(reverse-phase)分配層析法，靜相不帶有極性，而展開用的動相則帶有極性。
(2) 展開樣品的動相溶液：
A. 有機溶液－乙醇(alcohol)、t-戊醇(t-amyl alcohol)、乙(acetonitrile)、甲
醇(Methanol)。
B. 水性溶劑－醋酸(acetic acid)。 (3) 樣品用相對移動速度(R f )來表示：
樣品移動的距離（cm ）
溶劑前緣移動的距離（cm ）
R f
第一單元 生化實驗基本原理及技術
12
A.
R f 數值越大表示樣品對該動相溶劑有越大的親和性。
B. 分配層析法已經成功地運用在分析蛋白質、荷爾蒙、胺基酸、胺醣類、碳水化合物、核酸、抗生素、脂肪酸、殺蟲劑核一些藥物及代謝的中間產物。
(4) 分配層析法種類
A. 使用濾紙當作靜相：濾紙都是由多聚醣所組成的，所以濾紙層析法最常使用在正相模式，及非極性溶液當作動相來展開。
B. 將分子氣化後，再利用其對固體吸附劑的親和性不同來分分子，此方法又稱「氣相層析」(Gas Chromatography)，氣化的樣品送至線圈處的通常是惰性氣體，如氮氣、氦氣、氬氣等。
6. 高效能（高壓）液相層析法(High-Performance （Pressure ）Liquid Chromatography)（HPLC ）
(1) 原理：動相流速由HPLC 管柱材質之強度或堅硬度來決定，管柱半徑減少
和長度增加都會增加靜相的壓力，在流速固定1 mL/min 狀況下，長度相同的管柱，口徑20 mm 壓力會比口徑5 mm 的管柱少。目前HPLC 管柱可承受的流速範圍可高至100 mL/min 或低到0.5 mL/min 。
(2)
HPLC 缺點： a.價格問題；b.要確定樣品和動相溶劑中沒有會阻礙管柱的微
粒分子；c.動相溶劑必須先去除空氣，避免在系統中產生氣泡而降低所用的梯度的再現性及完整性；d. HPLC 的流析管柱較小，只能容納有限的樣品。 (3) 發展：層析技術朝具有高容量，大孔洞尺寸的固體支撐物而能在高流速（低
壓力）下維持良好解析度的方向發展：例如：快速蛋白質液相層析系統（fast
生物化學實習
13
protein liquid chromatography ；FPLC ）或是低壓液相層析系統（low pressure liquid chromatography ；LPLC ）。
圖1-8以氣相層析分析脂質中脂肪酸組成
第一單元 生化實驗基本原理及技術
14
圖1-9氣相層析分析脂肪酸組成之結果以面積積分表示
生物化學實習
15
圖1-10電泳設備
(一) 基本原理：電泳是指帶電荷的分子在一被施予電場溶液中移動的過程。 1. 電泳分離原理
給予的電壓 × 分子上的淨電值
分子的摩擦力
2. 分子的移動力會隨所給予的電壓值之增加及分子上淨電值之增加而增加，分子大小和形狀造成分子的摩擦力增加時反而會降低分子的移動力 。
3. 分子的移動力定義為分子的移動速率。多數電泳系統採用相等及固定的電壓穿過所有電泳介質的橫切面來進行電泳分離，這些電場被定義為每公分的伏特數。
4. 歐姆定律：V ＝I x R
電壓=V ；電流=I ；電阻
=R
分子移動力＝
第一單元 生化實驗基本原理及技術
16
電泳設備特性和緩衝液成分決定電泳系統的電阻 →相同之電泳設緩衝液時，R 為定值
→經常以電流（mA ）用來界定電泳分離所需的電壓值。
5. 系統電阻決定電泳期間所產生的熱量，所以在電泳時固體基質需提供冷卻裝置控制產生的熱量，使電泳設備保持恆溫，否則不均勻受熱會使分析樣品出現“微笑”的條帶。
6. 電泳系統中固定電壓或固定電流，因此分子的移動力就決定於分子的淨電荷和摩擦力。
7. 兩個相等大小的胺基酸遵照分子的淨電荷不同而分離。
8. 分子大小和分子形狀將決定分子於電泳期間的摩擦力。淨電荷相等則按照分子大小的因素向負極（－）前進。
9. 固相介質提供大分子較明顯的移動障礙時（瓊脂醣和聚丙烯醯胺為兩個最常用的系統），分子的大小將是決定移動力的主因。
10. SDS-PAGE 膠片電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)可決定蛋白質次單元的分子量及DNA 定序。
(二) 分類：通常根據電泳系統中，有無利用固相支撐性介質(medium)或基質(matrix)
來移動帶電荷的分子而分類：1.溶液式電泳系統；2.帶狀電泳。
(三) 溶液式電泳系統
1. 在不含固相支撐性介質的水相緩衝液中進行
2. 系統因帶電荷分子擴散現象而導致樣品混合並造成解析度的損失，因此必須採用一些方法來安定電泳槽內的水溶液。
生物化學實習
17
例如：使用非離子性的溶質，以蔗糖或甘油來形成不同的密度層，使物質因擴散作用而又混合的現象減到最小，通常只有在製備型規模才用得到。 (四) 帶狀電泳
1. 其固相支撐物含離子性水溶液，而樣品則以點(spots)或條帶(bands)狀注入於固相支撐物上。
2. 帶狀電泳系列的例子：濾紙電泳(Paper Electrophoresis)、醋酸纖維素條電泳(Cellulose Strip Electrophoresis)、硝酸纖維素條電泳(Nitrocellulose Electrophoresis)和膠片電泳(Gel Electrophoresis)，屬於典型分析型而非製備型規模。
(五) 生化常用的各種電泳 1. 濾紙電泳
2. 毛細管電泳(Capillary Electrophoresis)
3. 膠體電泳：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺體電泳(Sodium-Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)(SDS-PAGE)、等電點聚焦電泳(Isoelectric Focusing)、瓊脂醣膠體電泳(Agarose Gel Electrophoresis)。
1. 濾紙電泳
(1) 常用於分析及分離小分子，而不適於分析大分子（例如：蛋白質） (2) 濾紙電泳系統通電後會因電流所產生的電阻都會產生熱量，這就是濾紙電
泳施行高難度的最大源由。現在的濾紙電泳系統已移至冷房或冷凍內操作。
第一單元 生化實驗基本原理及技術
18
2. 毛細管電泳
(1) 毛細管電泳所分析的樣品，通常是在一長約50~100 cm ，內徑約25~100 μm
的毛細管中進行，因此所需的樣品量很少（nL 即可）。 (2) 毛細管內充滿緩衝液，通電後利用緩衝液形成一鹽橋。 (3) 電泳時用的電壓值約在20~30 kV 之間。
(4) 毛細管電泳的好處，在於提供了一個解析度高、快速且敏感度高的微量樣
品分析方法，但此方法不適用於製備級方法。
(5) 新式的核酸定序儀，便以毛細管電泳為基礎來分離核酸。
3. 膠體電泳：以聚合的膠體介質為固相支撐，在水相緩衝液系統中分離分子，膠體電泳優點包括1比濾紙電泳能容納更大量的樣品，並且可成為製備級的大分子分離系統；2可改變膠體濃度以適應不同的用途，在低介質濃度時，讓大分子在移動時不會受到太多的摩擦力。而高介質濃度時，對分子產生較大的摩擦力，造成分子篩（molecular sieving ）的效果。因此，大分子於此系統中的移動 距離實際上取決於它的分子量。常用的膠體固相支撐物：1瓊脂醣膠體（agarose gel ），應用在分離核酸、脂蛋白或其他大分子上；2聚丙烯醯胺膠體（polyacrylamide gel ），膠體電泳系統中最有用且用途最廣的試劑，在蛋白質、核酸的分析上具有極佳的解析能力。
(1) 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺體電泳(Sodium-Dodecyl Sulfate-
Polyacrylamide Gel Electrophoresis ；SDS-PAGE)
常被用來測定所製備的蛋白質樣品中蛋白質鏈或蛋白質次單元鏈數目及分子量大小。
A. SDS-PAGE 電泳常用的試劑如下：
生物化學實習
19
a. 由丙烯醯胺 (acrylamide)單元體與交叉鏈結劑(cross-linker) N,N’-亞甲基-雙-丙烯醯胺( N,N’-methylene-bis-acrylamide)聚合而成。
b. (acrylamide)單元體與交叉鏈結劑(cross-linker)在水溶液中很穩定，可以化學試劑或光化學自由基試劑引發其聚合作用，最常用試劑為過硫酸胺(ammonium persulfate (APS))自由基起始劑及N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)反應催化劑。
c. 降低丙烯醯胺單元體與（或）交叉鏈結劑N,N’-亞甲基-雙-丙烯醯胺的含量，可產生孔洞較大的膠體；需要孔洞較小的膠體時則提高兩者的量。
d. 利用電泳分離化合物所需的膠體洞孔大小視化合物本身之間大小的差異性而定。例如，欲分離二個分別為8,000 Da 及6,000 Da 的小蛋白質分子，需要使用小孔洞的膠體進行分析（約15~20 ﹪丙烯醯胺），大蛋白質分子，而應使用孔洞較大的膠體（約7.5~10﹪丙烯醯胺）。 B. 步驟
a. 以過量可溶性的硫醇(thiol)(如β-mercaptoEthanol)及SDS 處理蛋白質。
b. 硫醇還原所有存在胜鏈內或胜鏈間的雙硫鏈（-S-S-）。
c. SDS 會結合到蛋白質的所有區域，且破壞分子間之非共價鍵，使樣品中的蛋白質變性成為未摺疊且具有高陰離子性的多胜 鏈。
d. 膠體內含過量的SDS ，使蛋白質在電泳過程中，維持其變性的狀態，因此，所有多胜鏈（平均每２個胺基酸帶一個SDS 分子），其電荷/質量的比值幾乎一樣，不同的蛋白質於膠體內移動所遇到的摩擦力，即為決定其移動力的主因，由於分子遇到的摩擦力決定於膠體基質的
第一單元 生化實驗基本原理及技術
20
孔洞大小，所以通過的孔洞越細時，分子較大的蛋白質會比小的蛋白
質遇到的阻力更大，因此越大的蛋白質移動越慢。
C.
SDS-PAGE 使用兩種不同的緩衝液/聚烯醯胺膠體組成，以上下連接的方式，連成一個單一的平板（slab ）膠體。上層膠體為焦集膠體（stacking gel ），而下層膠體為分離膠體（running 或resolving gel ）。 a.焦集膠體：低濃度的丙烯醯胺。
(a) 混合蛋白質樣品與樣品緩衝溶液（內含30﹪甘油、SDS 和硫醇），注
入樣品凹槽（well ）中，將兩個分開的溶液槽(含甘胺酸緩衝液, pH8.3)之間施予壓力，使電壓(約3~4V/cm 2）經由膠體傳送。
(b) 電荷數越多的樣品其移動力越大；分子越大的樣品則會產生數大的摩
擦力而降低移動力。
(c) 帶負電荷的蛋白質在焦集膠體的移動速率，比氯離子群慢，比不帶電
的甘胺酸快，因此，在焦集膠體和分離膠體之間的界面當中，蛋白質被擠壓成為一高濃度的細條帶。
b. 分離膠體：高濃度的pH8.8緩衝液和高濃度的丙烯醯胺（孔洞變小）。 (a) 甘胺酸進入分離膠體時，高pH 值會使其帶更大的負電荷，會很快的
超越蛋白質。
(b) 孔洞變小明顯增加蛋白質的摩擦力，使膠體中所有蛋白質得移動速度
都依據分子大小。
c. 檢測SDS-PAGE 分離的蛋白質
(a)
Coomassie Brilliant Blue R-250：含醋酸、甲醇和染色劑Coomassie blue
R-250水溶液的混和溶液。
i. 染色：將膠體置於染色液中，醋酸和甲醇 “固定”膠體內的蛋白質，
2015高级生物化学及实验技术试题答案
高级动物生化试题 问答题： 1. 简述非编码RNA（non-coding RNA）的种类、结构特点及其主要功能。 非编码RNA的种类结构和功能 1tRNA转运RNA（transfer RNA，tRNA） 结构特征之一是含有较多的修饰成分，核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发现的。修饰成分在tRNA分子中的分布是有规律的，但其功能不清楚。5’末端具有G（大部分）或C。3’末端都以ACC的顺序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。有一个胸腺嘧啶环。tRNA具有三叶草型二级结构以及“L”型三级结构，tRNA 的不同种类及数量可对蛋白质合成效率进行调节。tRNA负责特异性读取mRNA中包含的遗传信息，并将信息转化成相应氨基酸后连接到多肽链中。 tRNA为每个密码子翻译成氨基酸提供了结合体，同时还准确地将所需氨基酸运送到核糖体上。鉴于tRNA在蛋白质合成中的关键作用，又把tRNA称作第二遗传密码。tRNA还具有其他一些特异功能，例如，在没有核糖体或其他核酸分子参与下，携带氨基酸转移至专一的受体分子，以合成细胞膜或细胞壁组分；作为反转录酶引物参与DNA合成；作为某些酶的抑制剂等。有的氨酰-tRNA还能调节氨基酸的生物合成。 2rRNA核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA） 核糖体RNA是细胞中最为丰富的RNA，在活跃分裂的细菌细胞中占80%以上。
他们是核糖体的组分，并直接参与核糖体中蛋白质的合成。核糖体是rRNA 提供了一个核糖体内部的“脚手架”，蛋白质可附着在上面。这种解释很直接很形象，但是低估了rRNA在蛋白质合成中的主动作用。较后续的研究表明，rRNA并非仅仅起到物理支架作用，多种多样的rRNA可起到识别、选择tRNA以及催化肽键形成等多种主动作用。例如：核糖体的功能就是,按照mRNA的指令将氨基酸合成多肽链。而这主要依靠核糖体识别tRNA 并催化肽键形成而实现。可以说核糖体是一个大的核酶( ribozyme)。而核糖体的催化功能主要是由rRNA来完成的,蛋白质并没有直接参与。 3 tmRNA tmRNA主要包括12个螺旋结构和4个“假结”结构，同时还包括一 个可译框架序列的单链RNA结构。tmRNA中H1由5’端和3’端两个末端形成，与tRNA的氨基酸受体臂相似。H1和H2的5’部分之间有一个由10-13nt 形成的环，类似tRNA中的二氢尿嘧啶环，称为“D”环。H3和H4，H6和H7，H8和H9，H10和H11之间分别形成Pk1，pK2，pK3，pK4。H4和H5之间则由一段包含编码标记肽ORF的单链RNA连接。H12由5个碱基对和7nt 形成的环组成，类似tRNA中的TΨC臂和TΨC环，称为“T”环。tmRNA 结构按照功能进行划分可分为tRNA类似域（TLD）和mRNA类似域（MLD），TLD主要包括H1,H2,H12,“D”环和“T”环，MDL则包括ORF和H5，这两部分分别具有类似tRNA和mRNA的功能。tmRNA是一类普遍存在于各种细菌及细胞器（如叶绿体，线粒体）中的稳定小分子RNA。它具有mRNA分子和tRNA分子的双重功能，它在一种特殊的翻译模式——反式翻译模式中发挥重要作用。同时，它与基因的表达调控以及细胞周期的调控等生命过程密切相关，是细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的重要分子之一。识别翻译或读码有误的核糖体，也识别那些延迟停转的核糖体，介导这些有问
动科、蜂学《动物生物化学实验》复习题
《动物生物化学实验》复习题 一.填空题 1、生物化学实验的常用技术包括、、等。 2、牛奶中的主要蛋白质是，其占牛奶蛋白质总量的，其在pH值为的缓冲液中容易沉淀。 3、将制备酪蛋白时所得乳清，徐徐加热。即出现沉淀。此为乳清中的 和。 4、Folin-酚试剂由和组成。 5、福林酚法测定蛋白质含量时，样品蛋白质含量的适宜范围为ug/mL。 6、酶促反应速度最大时的环境温度称为，能使酶活性降低或丧失的物质称为，而对淀粉酶起此作用的物质是。 7、酶促反应速度最大时的pH称为，能使酶活性从无到有或使酶活性增加的物质称为，而对淀粉酶起此作用的物质是。 8、淀粉酶具有高度的性，催化蔗糖水解。 9、。DNA主要存在于，在细胞中，它与结合形成。 10、脱氧核糖核蛋白体在mol/L的NaLl溶液中溶解度小，在mol/L的NaLl溶液中溶解度大。 11、SDS-PAGE根据凝胶的形状特点包括和两种体系。 12、不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的分辨率，是因为电泳时会产生三大效应，即，和电荷效应。 13、层析系统由互不相溶的两相：和组成。二．是非题 （）1、酪蛋白在稀碱溶液中易溶解。 （）2、酪蛋白是一种不含硫的蛋白质。 （）3、Folin-酚法是一种光谱技术，主要仪器是可见光分光光度计。 （）4、Folin-酚法测定蛋白质含量时，样品应进行适当稀释。 （）5、Folin-酚法是测定蛋白质含量的常用方法。 （）6、Folin-酚法应该用同种蛋白质做对照。 （）7、做温度对淀粉酶活性影响时，沸水浴中试管取出后即可直接加入碘液观察结果。（）8、NaCl中Na+1是唾液淀粉酶的激活剂。 （）9、CuSO4中Cu2+是唾液淀粉酶的抑制剂剂。
八种常用生化实验步骤
实验一基因的PCR扩增技术 一、实验目的与原理简介 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。 常规PCR反用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。二、复性。降低温度使DNA单链分子同引物结合。温度为55℃，时间1min。三、延深。升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。 PCR反应包含的七种基本成分： 1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg. 2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。 3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关。 4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。 5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。 6）一价阳离子：标准PCR缓冲液内含有50mmol/L的KCl，它对扩增大于500bp长度的DNA是有益的。 7）模板DNA：含有靶序列的模板DNA可以以单链或双链形式加入到PCR混合液中，闭环DNA的及增效率略低于线性DNA。 学习PCR反应的基本原理和基本技术。 了解引物设计的一般要求。 二、材料和试剂 10Х扩增缓冲液 4种dNTP贮存液（20mmol/L，PH 8.0） Tap DNA 聚合酶 5端引物（20μmol/L）及3端引物（20μmol/L） 模板DNA 琼脂糖凝胶 PCR仪（Bio-Rad公司）移液枪（0.5-10μL 5-50μL）枪头微量移液管 一、实验操作 1）按照以下次序，将各成分加到微量离子管内混合： 10Х扩增缓冲液2.5μl M g2+1.5μl 5端引物1μl
生化实验基本原理及技术
生物化學實習 1 緒論 (一) 原理 1. 光依據其波長來分類： (1) 200nm~400nm 短波屬於紫外光 (2) 400nm~700nm 可見光波長 (3) 700nm~900nm 長波屬於近紅外光 2. 光通過溶液時，特定波長的光被吸收，眼睛察覺到的是沒有被吸收的波長。 核黃素會吸收450nm 的光，紅光與黃光會通過溶液而被肉眼所見。
第一單元 生化實驗基本原理及技術 2 圖1-1光譜儀 光譜儀可用來鑑定及定量純或不純的溶液中所含有的特定化合物，主要原理是基於兩個物理定律：1.柏朗定律；2.比爾定律 。 1. 柏朗定律：每單位厚度溶液其吸收入射光的比率為定值，被溶液吸收的入射光量與入射光強度無關。被每單位厚度溶液吸收的入射光比率為定值，每一單位厚度溶液若吸收10%的光，則光經過每一單位厚度溶液時，其強度即減少10%。 I ＝I 0 ? e -αι I ：穿透光強度 I 0：入射光強度 α ：溶液吸光係數 ι：光路徑長度 柏朗定律中以對數為底轉換公式，將吸光係數α轉換成比例常數K → log 10 I 0 / I ＝K ι log 10 I 0 / I ＝ 吸光值(absorbance ；A) 或光密度值(optical density ； OD)
生物化學實習 3 2. 比爾定律：光經過吸光物質所產生的吸光值，與溶液中每單位面積所含的吸光物質數目成比例。 比爾定律描述比例常數K 與待測吸光溶液中溶質的濃度有關。 K ＝εc ε：消光指數 c ：吸光物質濃度 I ＝ I 0? 10-εc ι log 10 I 0 / I ＝ A ＝log 1010εc ι＝ εc ι 當ι（光路徑長度）＝1 cm 時 log 10 I 0 / I ＝ A ＝log 1010εc ＝ εc 特定溶質在特定波長下，消光係數ε為一常數。因此，當吸光物質的濃度變成兩倍，於相同的光路徑下，被吸收的光量也會變成兩倍。 圖1-2 22 μM 溶於0.1M 磷酸鈉，pH 7.06，1公分 光路徑(light path)的條件下測定 波長 吸 光 值
动物生物化学(1)
动物生物化学复习题 1、天然蛋白质氨基酸的结构要点？ 答：在与羧基相连的α－碳原子上都有一个氨基，称为α－氨基酸。α—碳原子不是手性碳原子的是哪个氨基酸？ 答：甘氨酸 具有紫外吸收特性的氨基酸有哪些？ 答：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸 吸收波长是多少？ 答：280nm 核酸的紫外吸收波长是多少？ 答：260nm 2、全酶包括哪几部分？ 答：酶蛋白与辅助因子 辅基与辅酶的异同点？ 答：与酶蛋白结合梳松，用透析、超滤等方法可将其与酶蛋白分开者称为辅酶；与酶蛋白结合紧密，不能用透析发分离的称为辅基。 正常情况下，大脑获得能量的主要途径是什么？ 答：葡萄糖的有氧氧化 糖酵解是在细胞的是在细胞的哪个部位进行的？
答：细胞的胞液中 3、糖异生的概念和意义？ 答： 概念：由非糖物质转变为葡萄糖或糖原的过程。 意义：由非糖物质合成糖以保持血糖浓度的相对恒定；有利于乳酸的利用；可协助氨基酸代谢。 生糖氨基酸、丙酮酸、乳酸、乙酰COA哪个不能异生成糖? 答：乙酰COA 4、什么是呼吸链？ 答：又称电子传递链,是指底物上的氢原子被脱氢酶激活后经过一系列的中间传递体，最后传递给被激活的氧分子而生成水的全部体系。各种细胞色素在呼吸链中传递电子的顺序? 答：B-C1-C-AA3-O2 两条呼吸链的磷氧比分别是多少？ 答：NADH呼吸链：P/O~2.5（接近于3） FADH2呼吸链：P/O~1.5（接近于2） 氰化物中毒是由于抑制了哪种细胞色素? 答：Cytaa3（细胞色素氧化酶） 5、为了使长链脂酰基从胞浆转运到线粒体内进行脂肪酸的β-氧 化，所需要的载体是什么？ 答：肉碱
6、氨基酸脱下的氨基通常以哪种化合物的形式暂存和运输？答：谷氨酰胺 参与尿素循环的非蛋白氨基酸有哪几种？ 答：瓜氨酸和鸟氨酸 7、RNA 和 DNA 彻底水解后的产物有哪些不同？ 答：DNA彻底水解产物:磷酸，脱氧脱氧核糖，鸟嘌呤，腺嘌呤， 胞嘧啶，胸腺嘧啶。 RNA彻底水解产物:磷酸，核糖核酸，鸟嘌呤，腺嘌呤，尿嘧啶，胸腺嘧啶 双链DNA 解链温度的增加，提示其中碱基含量高的是哪几种碱基？答：C和G（胞嘧啶和鸟嘌呤） 8、蛋白质一级结构的概念? 答：蛋白质的一级结构是指多肽链上氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸序列。 维系蛋白质一级结构的化学键主要是什么键？ 答：肽键 9、蛋白质变性后可出现哪些变化？ 答：破坏次级键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。如：溶解度降低，易形成沉淀析出，结晶能力丧失，分子形状改变，酶失去活力，激素蛋白失去原来的生理功能。
动物生物化学 期末复习资料 超准
生化复习资料 考试： 名：10个（三、四） 选：10个（不含1、6、11、12） 3章重点维生素的载体、作用，嘌呤、嘧啶合成区别，核糖作用，一碳基团载体，ACP，载体蛋白，乙酰辅酶A缩化酶，生物素 填：20空（1、2、8） 简答：3个（1、6、7、8） 简述：3个（9、10、11、12） 血糖来源和去路，葡萄糖6-磷酸的交叉途径 实验与计算：（1、7） 一、名词解释 1、肽键：是一分子氨基酸的羧基与另一分子氨基酸的氨基脱水缩合而成的酰胺键（-CO-NH-），称为肽键。是蛋白质结构中的主要化学键（主键） 2、盐析： 3、酶的活性中心：在一级结构上可能相距甚远，甚至位于不同肽链上的基团，通过肽链的盘绕、折叠而在空间构象上相互靠近，形成的具有一定的构象，直接参与酶促反应的区域。又称酶活性部位 4、米氏常数：是反应最大速度一半时所对应的底物浓度,即当v = 1/2Vm时，Km = S 意义：Ｋm越大，说明E和S之间的亲和力越小，ES复合物越不稳定。米氏常数Km对于酶是特征性的。每一种酶对于它的一种底物只有一个米氏常数。 5、氧化磷酸化：是在电子传递过程中进行偶联磷酸化，又叫做电子传递水平的磷酸化。 6、底物水平磷酸化：是直接由底物分子中的高能键转变成A TP末端高能磷酸键叫做底物水平的磷酸化。 7、呼吸链：线粒体能将代谢物脱下的成对氢原子(2H)通过多种酶和辅酶的链锁反应体系逐步传递,最后与激活的氧结合为水,由于该过程利用氧气与细胞呼吸有关,所以将这一传递体系叫做呼吸链。 8、生物氧化：糖类、脂肪和蛋白质等有机化合物在生物体内经过一系列的氧化分解，生成CO2和水释放能量的总过程叫做生物氧化。 9、葡萄糖异生作用：由非糖前体物质合成葡萄糖的过程。 10、戊糖磷酸通路：指机体某些组织以6-磷酸葡萄糖为起始物在6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化下形成6-磷酸葡萄糖酸进而代谢生成磷酸戊糖为中间代谢物的过程。 11、激素敏感激酶： 12、酮体：脂肪酸在肝脏中氧化分解所生成的乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮三种中间代谢产物，统称为酮体。 13、饲料蛋白质的互补作用：把原来营养价值较低的不同的蛋白质饲料混合使用，可能提高其营养价值和利用率。 14、氮平衡：是反映动物摄入氮和排除氮之间的关系以衡量机体蛋白质代谢概况的指标。 15、从头合成途径：利用氨基酸等作为原料合成 16、补救合成途径：利用体内游离的碱基或核苷合成
动物生物化学实验教学改革的研究
动物生物化学实验教学改革的研究 摘要：依据高校教育改革的深入和创新素质教育的全面推进，针对动物生物化学实验教学实际情况，进行了改革探索研究。主要通过大学生研究训练计划（SRP）项目和毕业论文于实验教学中的实施，使之互相影响并促进动物生物化学实验教学改革，其旨是发挥实验教学的作用，提高学生创新和实践能力，为国家培养合格人才。 关键词：动物生物化学实验教学 SRP 毕业论文改革 《动物生物化学》实验课程是动物医学和动物科学专业的重要基础课，既具有基础性，又具有前沿性，是研究生命活动变化规律的学科，对验证和巩固动物生物化学理论知识，掌握动物机体内发生的生物化学机制并且运用动物生物化学实验原理和方法来诊断、治疗和预防疾病等都有非常重要的作用，目前的动物生物化学实验教学模式只是注重理论课程内容的复证，同时也在响应国家要求培养适应创新型高水平创新人才的号召，进行动物生物化学实验的优化组合，更新替换陈旧实验内容，对本科生开放一些实验室，虽然起到了一定的作用，但还是不能满足于学生主动性和创造性的全面发挥。因此，本实验室针对动物生物化学实验课程进行
了更深层次的改革探索，首先将动物生物化学实验教学从以前的理论教学中分离出来成为一门独立的32学时的实验课程，对以前的实验项目进行大幅度删减，替换一些重复的和与学生创新性结合不紧密的实验项目，增加了适应学生创新和实践思维发展的综合设计性的大实验，同时把大学生训练计划（SRP）项目和学生毕业论文纳入到实验教学中，使两者相互促进提高并融为一体，影响且促进实验教学进行相应改革，一方面可以满足理论课程需求并且使之提高，另一方面也提高了低年级农科类本科学生的专业兴趣及创新和动手能力，对学生今后走向工作岗位，胜任相关工作与独立开展科学研究都具有非常重要的作用。基于此，本文就动物生物化学实验课程的教学改革实践进行了探索性的分析。 一、加强大学生训练计划（SRP）项目于实验课中实施，促进实验教学改革 为提高学生创新和实践的能力，使SRP项目融入实验教学课堂，首先使大学生实践训练计划（SRP）项目的内容与实验课进行有机结合，通过SRP项目的实施推动动物生物化学实验课程教学发生相应调整改革，大学生训练计划（SRP）项目的启动实施要求动物生物化学实验课程进行相应的改革从以下几方面陈述。 首先，改变以前课前教师为主体，准备好实验所需的试剂、器材和实验所需要的设备，然后在学生动手做实验前，
动物生物化学
《动物生物化学》 教学大纲 学时：54学时理论学分：4.5学分 适用对象：动物科学、动物医学二年级学生 先修课程：动物学、化学（有机化学、无机化学、分析化学） 考核要求：平时20%（小测、实验）、期中考试（20%）、期末考试（60%） 使用教材及主要参考书： 《生物化学》（第二版），天津农学院主编，中国农业出版社，2002年4月 王镜岩主编，《生物化学》（第三版上下册），高等教育出版社，2002年9月 黄锡泰、于自然主编（第二版），〈现代生物化学〉，化学工业出版社，2005年7月 周顺伍，《动物生物化学》（第三版），中国农业出版社，1999年十月 本课程是农业院校动物医学、动物科学本科专业以及相关专业的一门重要专业基础课。动物生物化学是研究动物生命的化学，是研究生物分子、特别是生物大分子相互作用、相互影响以表现生命活动现象原理的科学。通过本课程的学习，不仅使学生了解生命现象的基本知识和生命运活动的基本规律，而且可以掌握与动物生理学、动物饲养学、动物遗传学、动物育种学、药理学临床诊断学等专业基础课以及后续专业课程相关的必备基本理论和技能。并初步有在今后学习中运用和解决问题的能力。 一、教学的基本任务 根据本课程特点，在教学过程中，教师一定要把基本概念，基本理论讲解的清楚、易懂，对重点章节要讲深、讲透，并注重各章节的相互联系。通过学习，使学生不仅能掌握生命活动的基本规律，而且能对物质的代谢途径、关键步骤、关键环节有深刻的认识，并且对物质的代谢又有相互关系的整体概念。从而培养学生具有一定的分析和解决问题的能力。通过实验教学培养学生具备初步的科学研究能力。 章节课程内容学时 第一章绪论 1 第二章第三章第四章第五章第六章第七章第八章第九章第十章蛋白质的结构与功能 酶 糖类代谢 生物氧化 脂类代谢 含氮小分子的代谢 核酸的结构 核酸的生物学功能 生物膜和动物激素的信号调节 8 6 6 4 5 8 5 5 6 二、课程内容与要求 绪论 （一）教学目的 通过本章的学习要掌握生物化学的基本概念、研究内容及生物化学与动物医学和动物科学的关系，了解生物化学的发展史。 （二）教学内容 1.生物化学的概念； 2.生物化学的发展； 3.生物化学与畜牧和兽医 第二章蛋白质的结构与功能 （一）教学目的
生化实验五大技术
生化实验五大技术 一.分光光度技术 1.定义:根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光语。而建立起来的一种定t 、定性分析的技术。 2.基本原理:（图1-1光吸收示意） 透光度T=It/lo 吸光度A=lg(lo/ I1) 朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLc K 为吸光率，L 为溶液厚度(em), c 为溶液浓度 (mol/L)] 摩尔吸光系数日ε:1摩尔浓度的溶液在厚度为 I.cm 的吸光度。 c=A/ε 3. 定量分析: (1)标准曲线(工作曲线)法 (2) 对比法元-KCLCx (3)计算法: e=A/ε (4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀) (5) 多组分湖合物测定 4.技术分类 分子吸收法&原子吸收法:
可见光(400-760 nm) &紫外光(200~ 40m) &红外光(大于760 nm)分光光度法； 5.应用方向 有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法 二电脉技术 1.定义:带电荷的供试品在情性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电 极方向按各自的速度进行脉动。使组分分离成族窄的区带，用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。 2.基本原理: 球形质点的迁移率与所带电成正比，与其半径及介质粘度成反比。v=Q/6xrη 3.影响电泳迁移率的因素: 电场强度电场强度大，带电质点的迁移率加速 溶液的PH值: 溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移幸越大 溶液的离子强度:电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低 电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗 4:技术分类: 自由电泳(无支持体) 区带电泳(有支持体):法纸电泳(常压及高压)，博层电泳(薄膜及薄板).凝波电泳(琼脂，琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶)等 5. 电泳分析常用方法及其特点: 小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳 ⑴醋酸纤维素薄膜电泳 ①这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小，消除纸电沫中出现的“拖尾”现象 ②分离理应快，电泳时间短 ③样品用最少: ④经过冰最酸乙醉溶液或其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保 ------别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测(胰岛素、游菌酶、胎儿甲种球
生化试验技术
生化试验技术 绪论 1．生物体内某一组份，大致可分为五个基本阶段： (1)确定制备物研究目的及建立相应的分析鉴定方法。 (2)制备物物理化学性质稳定性的预备试验。(3)材料处理及抽提方法的选择。 (4)分离纯化方法的摸索。(5)获得制备物以后，均一性的测定。 2 1 2 (1)呈色法；(2)色谱法；(3)光谱法；(4)电泳法；(5)核磁共振波谱法。 (6)其他:如电子显微镜观察。 理化测定方法的最大优点是实验操作简便快速，能及时指导分离制备工作。 3 3．好的分析鉴定方法必须满足以下要求: 1）特异性和专一性强；2）重现性好；3）准确度大；4）灵敏度高；5）手续简便。4．制备物的理化性质及稳定性的预试验是对一个未知物质分离制备实验设计的基础。5．材料的处理： 1）选材：（1）工业生产：材料来源丰富、含量高、成本低； （2）未知物质：只要达到实验目的即可。 2）预处理：保证材料的纯净； 3）组织破碎方法：（1）机械法：组织捣碎机，匀浆器，研钵和研磨、压榨机 （2）物理法：(1)反复冻融法(2)急热骤冷法： (3)超声波处理（3）化学及生物化学法：(1)自溶法(2)酶解法(3)表面活性剂处理⑷溶胀法6．使生物活性物质保持活性，主要措施常有如下几点： 1）采用缓冲液。2）加入保护剂。3）抑制水解酶的破坏 4）一些特殊的措施：引起生物大分子变性的因素，如紫外线、强烈搅拌、过酸过碱、高温、冻结等均应避免，有的还要求提取时无氧等。 第一章 1．蛋白质纯化从原理上分可有哪几种方法？ 1）溶解度不同：如盐析、有机溶剂分级沉淀法； 2）分配系数不同：如分配层析法3）吸附性不同：如吸附层析法； 4）在电场中运动速度不同：如电泳法5）沉降系数或密度不同：如离心法； 6）分子量不同：如凝胶过滤层析法、SDS－PAGE法； 7）生物学特性不同：如亲和层析法； 2．蛋白质分离提取的一般步骤及注意事项？ 蛋白质的分离提取的一般步骤为：一般来说，蛋白质的制备包括以下过程：
生物化学实验报告
实验一糖类的性质实验 （一）糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 （一）α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100 mL，贮于棕色瓶内。用前配制。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 1％淀粉溶液100 mL ％糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、％糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。倾斜试管，小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL，慢慢立起试管，切勿摇动。 观察记录各管颜色。 （二）间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 塞氏试剂：％间苯二酚－盐酸溶液1000 mL，称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000 mL。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 4、实验操作
动物生物化学试验-动物医学实践教育中心
《动物生物化学实验》教学大纲 一、基本信息 二、教学目标及任务 《动物生物化学》是为高等农业院校动物医学、动物药学、动物科学和水产养殖等专业本专科开设的重要的专业基础课，也是一门重要的实验性课程。通过本课程的系统学习和实验，使学生掌握动物生化实验的基本知识,基本理论和基本实验技能,掌握熟悉常用生化仪器的原理和使用方法,了解有关电泳，色谱，制备，透析等基本的生化实验手段,培养理论联系实际的学风和动手能力。 三、学时分配 教学课时分配
四、实验内容及教学要求 实验一：蛋白质的沉淀反应和两性反应，蛋白质透析脱盐。 本实验重点、难点：生化实验常用的仪器的使用；理解蛋白质的一般理化性质；盐析、透析的概念。 本实验教学要求：教育学生对生化实验的认识；了解生化实验常用的仪器及使用方法；理解蛋白质的沉淀、两性反应及透析脱盐的原理；掌握蛋白质盐析和透析等操作技术。 实验二：蛋白质的定量分析------双缩脲法测定蛋白质浓度；分光光度计的使用和注意事项；Excel软件制作标准曲线。 本实验重点、难点：分光光度法测定蛋白质的浓度的原理；标准曲线的制作。
本实验教学要求：了解蛋白质含量测定的原理和方法；掌握分光光度法的原理及分光光度计的使用方法和注意事项；用标准曲线法准确测定未知样品中蛋白质的含量；学习使用Excel软件制作标准曲线。 实验三：动物心脏、肝脏中琥珀酸脱氢酶的制备和活性鉴定*；动物血清和组织匀浆液的制备；附：玻璃匀浆器、离心机的使用。 本实验重点、难点：制备血清和组织匀浆液；观察琥珀酸脱氢酶竞争性抑制的基本原理；玻璃匀浆器、离心机的正确使用。 本实验教学要求：了解琥珀酸脱氢酶竞争性抑制的实验原理；掌握动物血清和组织匀浆液的制备，匀浆器、离心机的使用等方法。 实验四：电泳的概念和一般原理；醋酸薄膜电泳分离血清蛋白；电泳分离条带的扫描及软件分析*。 本实验重点、难点：电泳的概念和一般原理；电泳分析动物血清中各种蛋白组分。 本实验教学要求：了解电泳的概念和一般原理；掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作技术和操作要点；学会用电脑软件分析动物血清中各种蛋白组分 实验五：盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白*。 本实验重点、难点：盘状不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术和操作要点 本实验教学要求：了解聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和优点；掌握盘状不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术和操作要点；比较醋酸纤维薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白的异同和优缺点。 实验六：层析的概念、分类和机理；分子筛凝胶过滤分离血红蛋白和核黄素#。 本实验重点、难点：层析的概念、分类。凝胶层析的一般原理；凝胶过滤柱层析分离血红蛋白和核黄素的方法和操作要点。 本实验教学要求：了解层析的概念、分类和机理；理解凝胶层析分离大、小分子物质的一般原理；掌握凝胶过滤柱层析分离血红蛋白和核黄素的方法和操作要点。 实验七：动物肝脏DNA的提取及纯度鉴定*；低温离心机、紫外分光度计的使用及注意事项。 本实验重点、难点：DNA的分离纯化的原理及意义；低温离心机、紫外分光度计的正确使用。 本实验教学要求：了解DNA提取的原理及意义；掌握DNA的分离纯化的方法。学习紫外吸收法确定其含量和纯度的方法；掌握二苯胺法鉴定DNA的方法。
生物化学实验思考题
生物化学实验思考题
————————————————————————————————作者: ————————————————————————————————日期:
生物化学实验考试试题
细胞破碎 1 常用的细胞破碎的方法有哪些？ 机械法：研磨，高速捣碎机;物理法:反复冻溶,超声波破碎，压榨法；化学与生物化学法:自溶，溶胀法，酶解法，有机溶剂处理。 2 有机溶剂法破碎细胞原理，常用的有机溶剂有哪些? 有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳。比如笨、甲苯、氯仿、二甲苯及高级醇等 ３酶法破碎细胞原理:酶分解作用 4反复冻融法破碎细胞原理：通过反复将细胞放在低温下突然冷却和室温下融化达到破壁作用 层析技术 1.什么叫层析技术？ 层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别（分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等),使各组分以不同程度分布在两个相，其中一个是固定相，另一个是流动相,从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。 2、按层析过程的机理，层析法分哪几类？按操作形式不同又分哪三类? 根据分离的原理不同分类,层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。 按操作形式不同又分层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。 3.指出常用层析技术的应用范围。 凝胶层析法:⑴脱盐;⑵用于分离提纯；⑶测定高分子物质的分子量;⑷高分子溶液的浓缩离子交换层析法：主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子 高效液相层析法:⑴液-固吸附层析；⑵液-液分配层析；⑶离子交换层析 ４.ＳeｐhadｅxG-１0０凝胶柱层析分离蛋白质原理是什么? 大小不同的分子经过的路线长短不同而达到分离作用。 ５．用SeｐhａdeｘG2５脱盐时蛋白质和盐哪个先出峰?蛋白质 6．相对分子量为8万和1０万的蛋白质能否在SephadｅxＧ－７5柱中分开？为什么？不能,分子量差距太小。 7．将分子量分别为a(9０000）、b(45０0０）、c（１10 000)的三种蛋白质混合溶液进行凝胶过滤层析,正常情况下,将它们按被洗脱下来的先后排序。ｃ、ａ、ｂ 8.离子交换层析与凝胶过滤哪种分辨率高?离子交换层析较高。 9.如果样品中只有Ala和His(Ala pI=6．0，Ｈis pＩ＝7.6)，在ｐH4条件下，这两种氨基酸那一种与CM(阳离子交换剂)结合的紧密?如果用pH4-7的洗脱液梯度洗脱，那种氨基酸先洗脱出来？Aｌa 10. 柱层析时湿装柱的注意事项有哪些？ 用水灌注、不能有气泡。 11.说说离子交换层析中洗脱液的选择原则
生化试验基本技术
第二章生化实验基本技术 第一节离心分离技术 离心是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离的最常用的方法之一，也是生化实验室中常用的分离、纯化的方法。尤其是超速冷冻离心已经成为研究生物大分子实验室中的常用技术方法。离心机(centrifuge)是实施离心技术的装置。离心机的种类很多，按照使用目的，可分为两类，即制备型离心机和分析型离心机。前者主要用于分离生物材料，每次分离样品的容量比较大，后者则主要用于研究纯品大分子物质，包括某些颗粒体如核蛋白体等物质的性质，每次分析的样品容量很小，根据待测物质在离心场中的行为(可用离心机中的光学系统连续地监测)，能推断其纯度、形状和相对分子质量等性质。这两类离心机由于用途不同，故其主要结构也有差异。 一、离心原理 离心技术的主要原理就是将样品放入离心机转头的离心管内，离心机驱动时，样品液就随离心管做匀速圆周运动，于是就产生了一个向外的离心力。由于不同颗粒的质量、密度、大小及形状等彼此各不相同，在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不相同，由此便可以得到相互间的分离。 (一)离心力和相对离心力 离心力的单位为g，即重力加速度(980.6cm/S2)，离心力的大小可根据离心时的旋转速度V(r/min 每分钟转数，revolution per minute)和物体离旋转轴中心的距离r(cm)按下式计算：g=r×V2×1.118×10或按下式计算所需的转速：()r 89445 =。 ? V／ g 离心技术是根据微小颗粒物质在离心场中的行为建立并发展起来的。离心机的转头能够以稳定的角速度做圆周运动，从而产生一个强大的辐射向外的离心力场，它赋予处于其中的任何物体一个离心加速度，使之受到一个外向的离心力，其定义为： F = mω2r 式中：F为离心力的强度；m为沉降颗粒的有效质量；ω为离心转子转动的角速度，其单位为rad/s；r为离心半径(cm)，即转子中心轴到沉降颗粒之间的
临床生物化学实验原理、方法及检测介绍
临床生物化学实验原理、分析方法及检测技术 中国中医研究院广安门医院临床检测中心 生物化学实验——是把化学(分析技术)和生物化学(实验反应原理)的方法应用于疾病的诊断、治疗、监控的实验分支。 一个生化实验的最后测定结果应包括四大部分来完成。 一、实验反应原理及分析方法（理论依据） 二、实验检测技术（手段）生化仪的分析技术。 三、质量控制程序（质量保证）室内质控、室间质评、仪器、试剂、人员五要素。 四、临床意义（目的）咨询服务、异常结果的解释。 实验反应原理及分析方法(理论依据) 一个生物化学实验的反应原理设计，首先要找出所检测的化学特性，如测定体液（首先是血液）中酶的含量血液中除少数酶（如凝血溶血酶、铜氧化酶及假性胆碱脂酶等）含量较多外，血液正常生理状况下含量微乎其微。一般每毫升含微微克（Pg）水平，要直接测定如此微量物质是相当困难的。用免疫化学方法可测定全部酶蛋白分子含量（不论其有无活性）而用化学方法测定只能测定酶的催化活性，间接计算出酶的含量。目前利用酶具有催化活性这一特性，在临床上已普遍应用测定酶蛋白，同时还可以测定三大代谢的产物，如糖、脂类、蛋白质、这样也就建立起利用酶促反应的一级反应测定代谢物的方法。一级反应—反应速度与底物浓度成正比，因此只有当酶反应为一级反应时，才能准确测定底物含量，（如测定血糖、总甘油三脂、总胆固醇等）。从此在临床试剂盒的方法中出现了以酶为试剂测定各种代谢产物。 临床化学方法的分类 特别是自动生化仪方法的特点 以往临床化学实验都采用比色法进行各个项目的测定，这是因为比色法具有微量、迅速、准确的优点，特别适合于微量的生物体体液中各项物质测定。 在一般比色法中，手工使用比色计或分光光度计可以测定各种反应溶液的吸光度，但由于很难控制测定时间和反应温度，很难准确记录反应过程中吸光度变化，因此，毫不奇怪在很长一段时间内我们所使用的方法，都是在呈色反应达到完全或者反应达到平衡时，吸光度达到稳定时才进行测定。即所谓平衡法或终点法。 但自从自动生化仪出现后，从根本上改变了上述情况。通过各项先进技术，人们可以精确测定反应的动态过程。并可以准确计算任何一段反应时间内的反应速率，这样大大开阔了临床化学家对方法选择。除经典的终点法外还可以进行动态测定。这样不仅缩短了操作时间，大大提高了工作效率，还可进行一些用常规比色方法不能进行的测定。如测定酶反应的初速 度（V o ）等等。测酶初速度（V o ）只能用分光光度法。 因此，用好自动生化仪一个重要前提必须对自动生化仪可以提供的测试方法类型有所了解。 生化自动分析仪特点： 1 精确测定反应的动态过程； 2 准确计算任何一段反应时间内的反应速率； 3 除经典的终点法外还可以进行动态测定。 分析方法的分类
动物生物化学实验指导
动物生物化学实验指导 （修订版） 武汉工业学院
生物化学实验室规则 1．每个同学都应该自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退，不大声谈笑。 2．实验前必须认真预习，熟悉本次实验的目的、原理、操作步骤，懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验。 3．实验过程中要听从教师的指导，严肃认真地按操作规程进行实验，并把实验结果和数据及时、如实记录在实验记录本上，文字要简练、准确。完成实验后经教师检查同意，方可离开实验室。 4．实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐。公用试剂用完后，应立即盖严放回原处。勿使试剂、药品洒在实验台面和地上。实验完毕，仪器洗净放好，将实验台面抹拭干净，才能离开实验室。 5．使用仪器、药品、试剂和各物品必须注意节约。洗涤和使用仪器时，应小心仔细，防止损坏仪器。使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障须立即报告教师，不得擅自动手检修。 6．实验室内严禁吸烟！加热用的电炉应随用随关，严格做到：人在炉火在，人走炉火关。乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热，并要远离火源操作和放置。实验完毕，应立即拨去电炉开关和关好水笼头，拉下电闸。离开实验室以前应认真、负责地进行检查水电，严防发生安全事故。 7．废液体可倒入水槽内，同时放水冲走。强酸、强碱溶液必须先用水稀释。废纸屑及其他固体废物和带渣滓的废物倒入废品缸内；不能倒入水槽或到处乱扔。 8．要精心使用和爱护仪器，如使用分光光度计时，不能将比色杯直接置于分光光度计上，并注意拿放比色杯时，不要打碎。仪器损坏时，应如实向教师报告，并填写损坏仪器登记表，然后补领。 9．实验室内一切物品，未经本室负责教师批准，严禁带出室外，借物必须办理登记手续。
《动物生物化学》课程教学设计
《动物生物化学》课程教学设计（14高3牧医） 一、教学设计依据 ㈠使用教材 《动物生物化学》，高职高专教育“十二五”规划建设教材；李京杰主编；中国农业大学出版社出版。 ㈡人才培养方案 二、教学实施条件 （一）教学团队组成及分工 任课教师具有多年教学经验。 （二）教学设施及配置 学院有生物检测室及农业基础实验室，可以满足实验需要。 三、单元教学方案设计 （一）单元内容
课程项目结构与学时分配表
（二）课程目标 “动物生物化学”是以动物体为研究对象，在分子水平上研究生命有机体化学本质及其生命活动过程化学变化规律的科学。它是畜牧兽医专业主要的专业基础课程。现代生物化学的理论和实验方法已经作为通用的“语言”和有力的“工具”被广泛用于生命科学的表述和研究之中。因此，学习和掌握生物化学知识对于动物生产和动物健康事业有着重要意义。它对于学生学习后续课程、提高学生综合素质，培养生产、管理、服务等第一线应用性专业人才具有十分重要的意义。 1、专业能力目标 a知识培养目标： (1)了解该课程的性质、地位和独立价值，了解该学科的研究范围、研究方法。 (2)理解该学科的主要概念、基本理论，重点掌握蛋白质、核酸、糖、脂肪等生物大分子的结构与功能；掌握以糖代谢为代表的分解代谢与合成代谢，及生物氧化的实质和内容；掌握酶与维生素的关系及酶在生物代谢中的重要作用。 b技能培养目标：实验课的开设，使学生能对一些常用的基本生化实验方法，通过亲自的操作而有所认识，有助于生化理论的学习与理解,通过实验加深对蛋白质、核酸、糖、脂肪、维生素等有关性质的理解。 2、方法能力目标 (1)采用讲授式、启发式、互动式、课堂讨论等教学方法，使课堂教学生动活泼。(2)尽可能采用多媒体教学，以求取得良好的教学效果。(3)加强实验教学，使学生加深对所学理论知识的理解。 3、社会能力目标 保持和增强学生对生命中的化学现象的好奇心和探究欲，培养学生在生产和实践中发现、分析和解决问题的能力。
动物生物化学试题最新完整标准答案
动物生物化学试题(A) 2006.1 一、解释名词（20 分，每小题 4 分） 1. 氧化磷酸化 2. 限制性核酸内切酶 3. Km 4. 核糖体 5. 联合脱氨基作用 二、识别符号（每小题 1 分，共5 分） 1.SAM 2.Tyr 3.cDNA 4.PRPP 5.VLDL 三、填空题（15 分） 1. 蛋白质分子的高级结构指的是（1 分）， 稳定其结构的主要作用力有（2 分）。 2. 原核生物的操纵子是由(1 分) 基因，(1 分) 基因及其下游 的若干个功能上相关的（1 分）基因所构成。 3. NADH 呼吸链的组成与排列顺序为 （3 分）。 4. 酮体是脂肪酸在肝脏中产生的不完全分解产物，包括（1 分）， （1 分）和（1 分），在肝外组织中 利用。 5. 脂肪酸的氧化分解首先要（1 分）转变成脂酰辅酶A，从胞浆转入线粒 体需要一个名为（1 分）的小分子协助；而乙酰辅酶A须经过 （1 分）途径从线粒体转入胞浆合成脂肪酸。
四、写出下列酶所催化的反应，包括所需辅因子，并指出它所在的代谢途径 （10 分） 1. 氨甲酰磷酸合成酶I 2. 谷丙转氨酶 五、问答题（50 分） 1. 什么是蛋白质的变构作用（ 4 分），请举例说明（ 4 分）。（8 分） 2. 以磺胺药物的抗菌作用为例（ 4 分），说明酶的竞争抑制原理（ 4 分）。（8 分） 3. 一摩尔的乙酰辅酶 A 经过三羧酸循环完全氧化分解可以生成多少ATP？（3 分）请说 明理由（ 5 分）。（8 分） 4. 比较在原核生物DNA复制过程中DNA聚合酶III 和聚合酶I 作用的异同。（8 分） 5. 真核基因有什么特点，简述真核生物mRNA转录后的加工方式。（8 分） 6. 简述由肾上腺素经PKA途径调控糖原分解代谢的级联放大机制。（10 分）
生物化学技术 习题册答案(DOC)
上海交通大学网络教育学院医学院分院 生物化学技术课程习题册答案 专业：检验技术层次：专升本 绪论 一、名词解释 1.生物化学技术：是研究生物体的化学组成、结构、功能以及在生命活动中化学物质的代 谢、调节控制等的实验方法。 2.盐溶：蛋白质、酶及其它们与其它物质的复合体在离子强度低的盐溶液中，其溶解度随 着盐溶液浓度的升高而增加，此现象称为“盐溶”。 3.盐析：当溶液中盐浓度不断上升，达到一定程度，蛋白质等的溶解度反而逐渐减小，并 先后从溶液中析出，称为“盐析”。 4.透析：利用溶液组分能否通过半透膜并由引起膜两边溶液的化学势能不同，而达到去除 溶液中的小分子物质。 5.超滤（反向渗透）：利用压力或离心力，迫使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋 白质不能透过半透膜仍留在膜上。 6.凝胶层析法（Gel Chromatography)：利用各种物质分子大小不同，在固定相上受到阻 滞程度不同而达到分离的一种层析方法。 二、单选题 1.凝胶层析不可应用于：（ B ） A. 脱盐 B. 一步分离纯化生物大分子物质 C. 高分子溶液的浓缩 D. 测定高分子物质的分子量 E．分离分子大小不同的物质 2.核酸在紫外区有强吸收，其最大吸收值是在波长：（ C ） A．206nm B．240nm C．260nm D．280nm E．304nm 3.对260nm波长的紫外有强吸收主要是因为（ E ） A．核糖的环式结构 B.脱氧核糖的环式结构 C．嘌呤的双环结构 D.嘧啶的单环结构 E. 嘌呤和嘧啶环中的共轭双键 4.蛋白质在紫外区有强吸收，其最大吸收值是在波长：（ D ） A．206nm B．240nm C．260nm D．280nm E．304nm 5.用紫外分光光度法测定蛋白质，因为蛋白质在紫外区有个最大吸收峰，其峰值波长是：D A．220nm B．245nm C．260nm D．280nm E．340nm 6.用吸收光谱法测量双链DNA的含量为：（ A ） A.C（ug/ml）=A260×50×稀释倍数 B.C（ug/ml）=A260×40×稀释倍数 C.C（ug/ml）=A260×30×稀释倍数 D.C（ug/ml）=A260×20×稀释倍数 E.C（ug/ml）=A260×10×稀释倍数 7.用吸收光谱法测量单链DNA的含量为：（ B ） A.C（ug/ml）=A260×50×稀释倍数 B.C（ug/ml）=A260×40×稀释倍数 C.C（ug/ml）=A260×30×稀释倍数 D.C（ug/ml）=A260×20×稀释倍数 E.C（ug/ml）=A260×10×稀释倍数 8.用吸收光谱法测量RNA的含量为：（ B ）