水蛭素的应用及研究进展_高雪涛

水蛭素开发利用与专利技术大全

水蛭素开发利用与专利技术大全 【册数】: 16开精装全一卷（附光盘） 【日期】: 2010年12 【作者】: 国家专利局组织编写 【出版社】: 中国知识出版社 【定价】: 580 【现价】: 380 详细目录介绍 1 CN01141415.4 高效表达重组水蛭素及其生产方法 2 CN03113566.8 菲牛蛭的养殖方法及水蛭素的提取技术 3 CN01121593.3 水蛭素口服缓(控)释剂型 4 CN01133773.7 重组水蛭素口服肠溶缓释制剂 5 CN94194897.8 水蛭素与亲脂化合物的水蛭素结合物 6 CN96101995.6 用水蛭素和乙酰水杨酸治疗未溶栓的急性心肌梗塞病人的方法 7 CN91101687.2 含水蛭素衍生物的分泌物 8 CN91103025.5 水蛭素的重组体制备方法 9 CN92114142.4 具有改善稳定性的新的合成的异水蛭素 10 CN92107076.4 医用天然水蛭素的提取方法

11 CN92111829.5 重组水蛭素及其复合物用于制备预防和治疗血栓病药物 12 CN94190578.0 高分子量的脱硫水蛭素 13 CN95117701.X 用亲合色谱法提纯水蛭素的方法 14 CN96193457.3 基于水蛭素氨基酸序列的凝血酶抑制剂 15 CN97114426.5 水蛭素 16 CN01113526.3 新型分泌表达载体及其在重组水蛭素表达技术中的应用 17 CN01105798.X 一种新型双功能水蛭素及其制备方法和应用 18 CN00129747.3 水蛭素基因hv2－47k及其合成与表达 19 CN00812955.X 用于由大肠杆菌向培养基中分泌来制备Leu－水蛭素的信号序列 20 CN01107807.3 用酵母分泌表达重组水蛭素 21 CN03132224.7 重组水蛭素的新用途 22 CN03109244.6 水蛭素突变体的一种编码基因与高效表达菌株 23 CN03125104.8 酶性止血剂拮抗水蛭素出血作用的用途 24 CN200410034671.6 用于由大肠杆菌向培养基中分泌来制备Leu-水蛭素的信号序列 25 CN200410037695.7 一种水蛭素冻干粉针制剂及其制备方法

水蛭素治疗脑血管疾病研究进展_新洷康天然水蛭素

水蛭素治疗脑血管疾病研究进展_新洷康天然水蛭素 【关键词】水蛭素类脑血管障碍凝血 水蛭又名蚂蟥,为水蛭科动物蚂蟥、水蛭及柳叶蚂蟥的干燥体,味苦、咸、平，有小毒，为破血逐瘀之品.近年来国内外对水蛭的化学成分、药理作用及临床应用进行了大量的研究,取得了重大的进展,开发了龙生蛭胶囊、水蛭注射液及水蛭地龙注射液（舒血通）等新药.本文对水蛭治疗脑血管疾病的临床与实验研究进展进行了综述. 1 实验研究 1.1 有效成分水蛭含17种氨基酸,其中谷氨酸、天门冬氨酸及赖氨酸等的含量较高, 它的唾液含有水蛭素，并含有蛋白质、肝素、抗凝血酶及多种微量元素，主要从新鲜活日本医蛭(Hirudonipponicawhitman)中提取.水蛭素是由65个氨基酸组成的多肽，分子质量约为 7ku，对凝血酶有高亲和性，可与凝血酶形成极稳定的复合物，在低浓度下即有抑制凝血酶活性的作用，是天然的凝血酶特效抑制剂；水蛭素亦具有类似肝素样作用，但与肝素不同，它不需抗凝血酶Ⅲ作为辅助因子，不被肝素蛋白灭活，可使脑血块内或内皮下的凝血酶灭活，抑制凝血酶对血小板的作用［1］.不同种类的水蛭的活性成分不尽相同，从各种水蛭中被分离出的作用于凝血 纤溶系统的活性成分大致可分为以下几类:1)FXa抑制剂，如antistasin,ghilanten，therosasin;2)凝血酶抑制剂，如水蛭素， haemendin,bufrudin,haemadin,granulin，theromin;3)胶原诱导血小板聚集抑制剂，如calin，LAPP，血小板GPⅡb/Ⅲ a抑制剂，如decorsin，ornatin;4)纤维蛋白(原)溶解剂，如hementin，hementerin;5)FⅫa抑制剂，如tridegin［2，3］. 1.2 药理作用 1.2.1 抗凝血及抗血栓水蛭素可延长或抑制凝血过程.据报道，水蛭素可明显抑制实验性大鼠血栓形成,并对已形成的血栓具有溶栓作用,而凝血酶诱发的血液凝固是血管血栓形成的主要机理［4］.由于水蛭素直接靶向凝血酶，可有效地防止纤维蛋白和血细胞结合形成血凝块，因此可防止各类血栓的形成及延伸. 1.2.2 对血小板的作用水蛭素可降低血小板表面活性，抑制血小板聚集，降低血小板黏附性［5］.血管内皮细胞损伤和功能衰退引发血小板的激活，血小板通过其糖蛋白上的Ⅰβ和Ⅰa/Ⅱa受体与胶原组织结合，形成血小板黏附.凝血酶是作用最强的促进血小板激活的物质，水蛭素与之结合可抑制凝血酶与血小板的结合及血小板受凝血酶刺激后的释放，使两者解离，从而减弱凝血酶激活血小板的作用，抑制血小板聚集. 1.2.3 对血液流变学的影响水蛭煎剂可降低血液黏稠度，减少血浆中纤维蛋白原的含量. 1.2.4 降低血脂灌胃给予实验动物水蛭水煎剂可降低大鼠血液中甘油三酯及脂蛋白的含量,亦可降低食饵高脂血症家兔血液中胆固醇及甘油三酯的含量，使实验动物的主动脉及冠状动脉粥样硬化斑块消失,胆固醇结晶减少. 1.2.5 对脑组织的作用水蛭素可增加脑血流量,促进大鼠实验性脑血肿的吸收,减轻血肿周围炎性反应性水肿,缓解颅内高压,改善局部血液循环,保护脑组织［6］.据报道，水蛭提取液对实验性脑出血血肿周围组织的保护作用机制可能与HSP70及TGFB 1表达增强有关［7］.t pA，PAI 1是纤溶系统的重要调节因子，在纤溶平衡中起重要作用，二者主要来自血管内皮细胞，PAI 1还可来自活化的血小板a颗粒及增生的血管平滑肌细胞.t pA可激活血栓中纤溶酶原使血栓溶解，PAI 1可与t pA结合使其失活.急性脑梗死，尤其在发病早期患者血浆t pA活性明显下降，PAI 1活性明显升高.水蛭地龙注射液可明显降低急性脑梗死

低分子肝素及水蛭素在抗凝治疗中的应用

第20卷第9期 2012年9月 Vol.20 No.9 Sep，2012 中国医学工程 China Medical Engineering ? ? 187 综 述 ? ?低分子肝素及水蛭素在抗凝治疗中的应用分析 王艳春 （航空总医院，北京 100012） 中图分类号:R 973.2 文献标识码:A 抗凝疗法是使用抗凝剂对血栓栓塞性疾病进行治疗或者是预防的一种方法，其起效的主要原理是通过使用抗凝剂对纤维蛋白原的转化起到阻止的效果，避免其向纤维蛋白转化，从而防治了血栓的最终形成与发展。目前较为常用的抗凝剂为香豆类和肝素等口服抗凝剂，两者都有着较长的使用历史，并且已经有了相对成熟的经验。本文将另述两类相对较新的抗凝药物，极为水蛭素（HRD）和低分子肝素(LMMH\LMWH)。 1 低分子肝素（LMMH/LMWH） 低分子肝素又可称之为未组分肝素，其是一种经过化学处理或者是酶解法处理后得到了分子量相对较小的一种组分制品。低分子肝素的分子量平均为5000道尔顿。目前我国已有多种低分子肝素在市场上出现，但是由于不同的制备方法，导致不同厂家所生产的低分子肝素的分子量的分布、药代动力学以、平均分子量以及药效的动力学互相之间都有着一定的差异[1]。目前国内上市的低分子肝素主要有速避宁、法安明等[2]。 1.1作用机理与特点 低分子肝素通过皮下注射后，其生物利用度可以达到90%以上，比普通的肝素要高出15%左右，所以前者多采用皮下注射的方式给药。低分子肝素的半衰期较长，每天注射2次便可发挥抗凝作用，其还具有促进释放内源性的纤溶酶活化物、促进TFPI释放、增加前尿激酶和t-PA的活性等。 1.2用途与适应症 低分子肝素最早于高危患者的血栓预防中使用，取得了较好的效果，有效的降低了血栓形成的发病率，治疗效果明显比普通的肝素预防方法优秀。近年来根据相关文献报道，对于长期进行抗凝治疗的患者来说，若其难以耐受香豆素类抗凝剂的口服或者是难以耐受其所带来的明显的出血的并发症，便可以选择低分子肝素进行替代。随着低分子肝素在血栓预防方面的成功，人们逐渐的将低分子肝素用于治疗血栓栓塞性疾病方面，并且获得了较好的结果[3]。 1.3用法与用量 目前对于低分子肝素的使用并没有一个国际统一的标准，因此计量常难以进行标准的规划。目前常采取皮下注射的方式使用低分子肝素，注射次数为每日1-2次即可。目前国内治疗和预防血栓栓塞性的疾病用量为:法安明的预防用量为2500-5000u术前于皮下注射，其后每天药量同上，连续一周；治疗为每千克200U，每日皮下注射一次。速避宁预防时40-60U/(kg.d)的用量，通常治疗时的用量比预防用量多[4]。 2 水蛭素（HRD） 水蛭素是一种抗凝蛋白肽类的物质，其是由医用的水蛭中所提取出来的[5]。水蛭我国属于一味历史悠久的中药，但是水蛭中所提取之物也是直至1884才被HAYCRAFT确定有抗凝血的作用。其于1995年被MARKWARDT确定其为一种蛋白物质，并命其明为水蛭素。在一些品种水蛭的口器中可以提取出天然的水蛭素，并且此中水蛭素的产量较为有效，通常只可于研究中使用，难以在临床中被满足应用。但是由于分子生物学的不断发展，逐渐的开始有人克隆出了水蛭素的基因，并且于1986年将r-HRD制备出来[6]。 2.1r-HRD作用机理 r-HRD与天然水蛭素的分子结构极为相似，其抗凝血的作用机理是通过和凝血酶结合后形成的复合物具有不可逆的特性，使得凝血酶失去了作用。其是一种凝血酶特异性的抑制剂，目前在临床中处于观察阶段，且体内的半衰期与肝素相比较短[7]。 2.2适应症和用途 临床中常使用r-HRD治疗血栓栓塞性疾病，.其中主要包括对急性心机梗塞，血栓形成、不稳定性心绞痛等的治疗，同时还可用于血液透析、体外循环以及血管成形术中。在对术后血栓形成的方面，有学者将其和普通肝素的治疗效果进行比较，结果显示r-HRD在降低DVT方面明显比固定的低剂量肝素疗效好[8]。 2.3用法和用量 r-HRD可采取皮下注射和静脉注射两种方式进行，其剂量在10-30mg之间每天[9]。 2.4副作用 r-HRD可引起的主要并发症状便是出血，但是对其所引起的并发症的发生率报道不同，因此与其剂量无关。r-HRD 虽然是一种蛋白质物质，但是由于其分子量相对较小，其免疫原性则相对较弱，所以难以产生抗体，但是随着其在临床中的广泛应用，仍要密切观察其副作用[10]。 r-HRD在临床中的应用时间相对较短，其在各种用途中的效果都在早期的观察之中。r-HRD对凝血酶所起到的有效的特异抑制作用是极为重要的，但是其在预防和治疗血栓栓塞性的疾病方面的地位目前却难以确定。 参 考 文 献 [1] 薛玉文,王均玲,杜以明,等.肝素与低分子肝素对急性肺动脉 栓塞症抗凝治疗的作用比较[J].新医学,2005,36(3):149-150. [2] 焦华波,乔治,谭向龙,等.低分子肝素对急性胰腺炎患者预后 的改善作用[J].中国危重病急救医学,2004,16(12):712-714. [3] 姚娓,刘勇,张红,等.水蛭素对肝癌H22荷瘤小鼠的抑瘤作 用及对C-met表达的影响[J].中国肿瘤临床,2011,38(23):1427-1429. [4] 陈华友,黄静,蒋芝君,等.抗凝良药水蛭素的研究进展[J].生 物学通报,2003,38(3):3-5. [5] 秦海娜,修志龙,张代佳,等.水蛭素聚乙二醇化及其体外抗凝 活力分析[J].中国化学工程学报(英文版),2007,15(4):586-590. [6] 池小凤,许平辉,张晓莺.单剂量低分子肝素在血液灌流中抗 凝问题的探讨[J].护士进修杂志,2007,22(15):1412-1413. [7] 赵志权,磨红,蒙洁英,等.阿加曲班与低分子肝素在 连续性血液净化治疗抗凝中的对比研究[J].实用医学杂 收稿日期:2012-08-11

2020年(并购重组)重组水蛭素的聚乙二醇修饰

（并购重组）重组水蛭素的 聚乙二醇修饰

重组水蛭素的聚乙二醇修饰 李雪芹，候蓓蓓，赵军，田明玉，修志龙* 大连理工大学环境与生命学院大连116024 摘要：目的水蛭素因血浆半衰期短而严重限制了其临床应用，聚乙二醇修饰能有效地延长其半衰期。本文通过比较不同修饰位点、修饰方法所得单修饰产物的比率、纯度及其活性保留率，从而得到修饰专一性强且活性保留率较高的修饰策略。方法采用液相和固相修饰方法,用琥珀酰亚胺活化的PEG20kDa分别在pH6.0、8.0的条件下对水蛭素的His和Lys进行定点修饰；用SDS-PAGE分析产物的修饰度，并用离子交换柱对修饰后的产物进行分离，然后用凝血酶滴定法测定水蛭素单修饰产物的体外抗凝活性。另外用分子动力学模拟方法预测了pH8.0条件下PEG修饰的位点。结果在pH6.0、8.0的条件下，水蛭素单修饰率都高达90%以上，但二者的单修饰活性保留率相差较大。在pH6.0时，液、固相单修饰活性保留率为34%、34.8%；而在pH8.0时分别为55%、96%。结论在pH8.0条件下，采用“离子交换柱辅助”固相修饰的方法对Lys进行定点修饰能得到较高产率和较高活性保留率的单修饰产物。 关键词：重组水蛭素；SC-mPEG；抗凝活力；分子动力学模拟PEGylationofRecombinantHirudin LiXueqin，HouBeibei，ZhaoJun，TianMingyu，XiuZhilong* DepartmentofBioscienceandBiotechnology,SchoolofEnvironmentalandBiolo gicalScienceandTechnology,DalianUniversityofTechnology,Dalian116024,Chi na Abstract:OBJECT Hirudinisthemostpotentinhibitorofthrombinfoundinnatu re.Althoughhirudinhasthestrongestanti-thrombinactivity invivo,itsshorthalf-l

水蛭素生产创新工艺流程,水蛭素制备新方法新技术应用手册

水蛭素、蚂蝗素生产创新工艺流程与制备新方法新技术应用手册 主编：专利编写组 出版社：国家专利局内部发行资料2011年 规格：全一卷16开精装+1张CD光盘 定价：680元优惠价：550元 详细目录 1、2010.08.25 / 靶向血小板的水蛭素聚离子胶束组合物 2、2010.08.25 / 水蛭素的聚离子胶束组合物 3、2010.08.18 / 一次性软连接并联多管水蛭素抗凝采血连接器 4、2010.08.18 / 一次性硬连接并联多管水蛭素抗凝采血连接器 5、2010.07.28 / 一次性软连接水蛭素抗凝横式真空采血套件 6、2010.07.28 / 一次性硬连接水蛭素抗凝横式真空采血套件 7、2010.07.28 / 一次性水蛭素化瘀热敷贴及其应用 8、2010.07.21 / 水蛭素真空采血管 9、2010.06.30 / 一种水蛭素的双水相-反胶束提取法 10、2010.06.30 / 水蛭素的生理盐水-聚乙二醇双水相提取法 11、2009.11.25 / 一种水蛭素口服微球制剂及其制备方法 12、2008.10.08 / 一种利用阴离子交换柱辅助聚乙二醇修饰水蛭素的方法

13、2008.08.27 / 一种重组水蛭素编码基因与应用 14、2008.07.30 / 一种以菲牛蛭唾液为原材料的水蛭素生产工艺 15、2008.07.30 / 一种以菲牛蛭冷冻新鲜体为原材料的水蛭素生产工艺 16、2008.05.14 / 一种重组双功能水蛭素口服制剂及其制备方法 17、2008.04.16 / 一种测定人血浆和/或血清中重组双功能水蛭素的方法 18、2008.04.09 / 一种有利于减少水蛭素降解的重组毕赤酵母菌株及其构建方法 19、2008.04.02 / 重组水蛭素的药物组合 20、2008.01.23 / 一种天然水蛭素有效成分的提取方法 21、2007.09.19 / 水蛭素的制取方法 22、2007.03.14 / 以油体蛋白作载体在转基因大豆中生产重组水蛭素的方法 23、2007.01.03 / 水蛭素抗血栓气雾剂制造技术 24、2006.12.27 / 一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法与应用 25、2006.12.06 / 水蛭素鼻腔给药制剂及其用途 26、2006.10.04 / 天然水蛭素舌下含片 27、2006.10.04 / 天然水蛭素软膏 28、2006.08.09 / 水蛭素干粉吸入剂及其制备方法 29、2005.03.16 / 天然水蛭素复方药用保健品 30、2005.01.26 / 一种水蛭素冻干粉针制剂及其制备方法

水蛭素的分子改造与结构修饰研究进展_王航

#综述# 水蛭素的分子改造与结构修饰研究进展 王 航,许 静,谭树华* (中国药科大学分子生物学教研室,江苏南京210009) 摘要:目的 为更好地开发利用重组水蛭素,综述国内外水蛭素结构修饰研究状况。方法 依据近年来国内外文献,进行分析、归纳和总结。结果与结论 笔者通过对水蛭素进行各种分子改造或者结构修饰来产生新的类似物蛋白,从而解决水蛭素在临床应用中出现的种种问题,有的也可能会出现新的功能。关键词:水蛭素;不良反应;结构修饰do i:10.3969/j.issn.1004-2407.2011.05.032 中图分类号:R914 文献标志码:A 文章编号:1004-2407(2011)05-0385-03 Advances in the study of structural modifications of hirudin WA N G H ang ,X U Jing ,T A N Shuhua *(M olecular Biolog y Depa rtment,School of L ife Science &T echno log y,China P har maceut-i cal U niversity,Jiang su N anjing 210009,China) Abstract:Objective T o study the structural mo dificatio ns of hir udin.M etho ds Based on lit eratures,the research pr og ress in hirudin st ruct ur al analo gues was analy zed and summar ized.Result and Co nclusion H ir udin has been mo dified w ith mo lecular transfor ma -t ion and structural modificatio ns.T he obtained pr oteins can allev iate adv erse r eact ion in clinical,or br ing new functions,such as thrombolysis,inhibiting the platelet agg reg atio n,and tar geting specifically.Key words:hirudin;adv erse reactio ns;st ructur al modificat ions 基金项目:国家自然科学基金项目(编号:30873191)作者简介:王航,女,在读硕士研究生* 通信作者:谭树华,男,教授 自1986年起,基因工程技术的发展使人们获得了建立在多种载体上的重组水蛭素。它在临床治疗和预防各种血栓形成中有着显著的作用,国内外医药界学者将水蛭素作为治疗心血管疾病的有效药物进行研究[1]。但是,临床应用水蛭素还存在一定出血的危险;而且,作为抗凝血酶药物,重组水蛭素预防动脉血栓的效果并不理想。本文将就近年来重组水蛭素临床出现的一些问题,以及近年来国内外重组水蛭素结构修饰类似物研究的最新进展进行综述。1 水蛭素及其结构类似物的不良反应 水蛭素是一种小分子多肽,进入体内后,被体内的蛋白酶切割而失活;而且,水蛭素不经肝脏代谢,以原形或其衍生物的形式经肾脏排泄,肾功能不全的病人因其排泄功能严重受损,存在很大的风险。 作为一种兼有抗血小板和抗凝的药物,其主要问题是出血并发症,可引起一定程度的脏器出血,导致轻度的贫血;高剂量给药除以上类似变化外,转氨酶升高,主要是因为重组水蛭素抑制凝血酶药理活性放大。目前水蛭素引起的出血反应尚无有效药物治疗。停止给药可缓解症状,但是有的情况这种措施并不十分奏效 [2] 。 生物技术药物均有一定程度的免疫原性,水蛭素的免疫原性比较弱。文献报道[3],临床上连续给药重组水蛭素5d 以上可使74%的患者产生抗水蛭素抗体(AH A b)。重组水蛭 素可能会产生严重的变态反应。2003年,Gr einacher 等发现进行重复给药的毒性实验和临床研究中有9例严重变态反应。其中4例在首次给药时,并无不良反应。2 水蛭素结构修饰物及类似物 目前的新药研究领域,开发一个全新的药物十分困难,研究热点大都集中在对现有药物的分子改造或是结构修饰上,同时设法降低毒副作用。针对在临床应用中所出现的问题,将重组水蛭素类多肽药物进行各种类型的结构修饰,以期降低不良反应。 2.1 水蛭素融合蛋白 研究表明,许多抗凝溶栓药物具有协同和互补作用,利用蛋白融合技术连接,产生的融合蛋白较单一使用有更好的活性,有的甚至产生新的活性[4]。 2.1.1 葡激酶-重组水蛭素融合蛋白 溶栓和抗凝药物的联合治疗,是当前临床治疗血栓相关性疾病的重要给药方案。葡激酶与纤溶酶原结合后能激活纤溶酶原,使之成为有活性的纤溶酶,产生的级联反应能激活更多的纤溶酶原,发挥溶栓作用。重组融合蛋白是葡激酶和水蛭素通过1个X a 因子连接起来的蛋白多肽。L ian 等[5]通过1个螺旋结构序列将葡激酶和水蛭素构建成1个Y 形异源二聚体,使两者都具有游离的N 末端而不影响各自的功能。融合蛋白不仅保持了原有的抗凝和溶栓活性,还对富含纤维蛋白的血栓具有一定的靶向性,因而有着广阔的应用前景。 2.1.2 纤维蛋白抗体-重组水蛭素融合蛋白 纤维蛋白抗体与水蛭素通过化学偶联,能够有效抑制纤维蛋白的沉积。牛晋阳等[6]利用特异存在于凝血部位的活性凝血因子FXa 的活性和水蛭素N 末端延伸会使水蛭素丧失抗凝血活性的特性,将水蛭素的N 末端与含凝血因子FXa 识别位点的短肽相融合,使得融合蛋白在非血栓部位不表现出抗凝血活性。在血栓部位,由于人体血液中无活性的凝血因子F X 在凝血部位被活化成活性形式的凝血因子F Xa,后者再将水蛭素从融合蛋白上切割下来,使其发挥抗凝血作用,从而在不减少水蛭素抗凝血活性的同时,最大程度地降低了出血。这在临床上具有非常重要的意义。 2.2 RGD -重组双功能水蛭素 R GD 肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的短肽,是整合素与其配体蛋白相互作

注射用重组水蛭素项目书

英文名称：Recombinant Hirudin for injection 剂型：冻干粉针剂 适应症：髋关节置换术后深静脉血栓的预防 类型：国家二类新药 声明： 本项目书旨在帮助对本项目有兴趣的少数机构投资者较为深入地了解本项目，并非一般的公开发行物。请有关人士严格控制扩散范围，并要求对本项目书内容保密！

项目特点 投资小：< 1000万 市场潜力大：中国潜在适应群超过百万 利润高：直接成本4元/支，销售价以国外定价1/3～1/4为国内参考价，则约为40元/支，一个疗程5天220支，花费8800元 周期短：三年半获得新药证书，一个普通GMP车间，年产值约达2000万，生产销售一年后即可收回成本

一、项目简介 1）药物介绍 水蛭素（hirudin）因最早从水蛭中分离得到而得名。天然水蛭素为单链多肽，肽链由65个氨基酸残基组成，相对分子量为7000道尔顿。分子N端有三个二硫键(Cys6…Cys14，Cys16…Cys28，Cys22…Cys39)，使N端肽链绕迭成密集形核心环肽结构。C端富含酸性氨基酸残基，63位的酪氨酸被亚硫酸化。水蛭素存在十几种变异体，但有抗凝血酶活性的仅有HV1、HV2和HV3三种。本产品为基因工程重组水蛭素( [Leu1-Thr2]-63-desulfohirudin，Lepirudin)，由水蛭素HV1衍生而来，其中1位由亮氨酸替代缬氨酸，2位由苏氨酸替代缬氨酸，63位酪氨酸无亚硫酸根，但其构象和生物活性与天然水蛭素一致。比较实验表明，该重组水蛭素特别有利于在酵母中表达，以N末端Thr-Tyr 或Ile-Tyr开始的同系水蛭素衍生物只能以低产率表达。此外，酵母表达Lepirudin 63位上酪氨酸未亚硫酸酯化，因为酵母本身无法对表达产物进行亚硫酸根修饰。 水蛭素是迄今为止发现的最强有力的凝血酶抑制剂，还有很强的抗血栓作用，对多种实验性血栓模型有阻抑作用。水蛭素对于各种血栓疾病如静脉血栓、弥散性血管内凝血、脑凝血、血栓静脉炎及冠状动脉血栓都有预防和治疗效果，尤其是静脉血栓和弥漫性血管内凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血液循环和血液透析过程，在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。 重组水蛭素目前已经开发成功的适应症为: 用于手术时防止深部静脉血栓的形成；及用于肝素引起的II型血小板缺少症（HITII）和相关的血栓栓塞。 2）立项依据 1．风险小：97年起重组水蛭素就已在欧洲上市，因此该产品在中国研制并获得新药证书和生产已无风险。 2．市场前景光明：临床疗效明显，副作用小，患者数量大。 3．成本低：用基因工程方法生产，可实现规模化生产,成本低廉。 4．和目前主要的抗凝药肝素相比，具有一定的优点。 5．潜在适应症广。 3）研发进展 A．研制进程：2000年立项 2000.3~2000.4 工程菌构建及鉴定 2000.3~2001.9 生产工艺研究（包括发酵工艺、纯化工艺的研究及三 批中试产品的生产、检定） 2000.11~2001.1 药效学（白兔）实验 2001.5~2001.7 长毒试验研究 2001.8 完成一般药理研究

水蛭素基因植物表达载体的构建

文章编号：1000-2472（2007）03-0061-03 水蛭素基因植物表达载体的构建! 张正奇T ，荣水连，胡 华，李新梅 （湖南大学化学化工学院，湖南长沙410082） 摘 要：在不改变水蛭素原氨基酸序列前提前下，根椐植物基因密码子选择偏向，对 水蛭素基因序列进行了改造.在设计和合成的水蛭素基因序列中添加了先导链、p o l y （A ）尾、Xba I 和S ac I 双酶切位点.将所合成序列与双元载体p B I121重组，构建成p B I121hir 植物 高效表达载体.经抗性筛选法、琼脂糖凝胶电泳和测序3种方法鉴定，该载体构建成功. 关键词：水蛭素；载体；植物；重组中图分类号： 78；R169 文献标识码：A Constr ucti on of t he p lant Ex p ressi on p las m i d f or ~ir udi n G ene Z~ANG Zhen g -C i T ，RONG S hui-lian ，~u ~ua ，L I X i n-m ei （C o lle g e o f Che m istr y and Che m ical En g i neeri n g ，~unan u n iv ，Chan g sha ，~unan 410082，Ch i na ） Abstract ：A ccordi n g to t he p lant bias i n codon chioce ，t he hirudi n g ene w as reconstit uted ，t hen it w as s y n-t heted.T he s y nt heted DNAse C uence w as cloned i nto t he p lant ex p ression vector p B I121b y recom bi nant DNA techno lo gy ，so t he p lant ex p ression p las m i d p B I121hir w as constructed.T he DNA se C uenci n g ，g el elec-tro p horesis and anti biotic screeni n g test show t hat t he construction is successf ul . K e y words ：hirudi n ；vector ；p lant ； recom bi nant 急性心肌梗死等血栓栓塞性疾病的死亡率很高，对人们的生命和健康造成严重威胁.据报道，我国有1300多万人患有血栓病.治疗这类疾病的安全且有效的方法是溶栓治疗，因而许多医药学家 致力于溶栓药物的开发和应用研究［1］. 水蛭素是水蛭唾液腺分泌的一种酸性多肽，抗凝血作用较肝素强几百倍，且不引起血小板减少，是目前最强的凝 血酶特异性抑制剂［2，3］，在处理诸如败血休克、动脉 粥样硬化、脑血管梗塞、心血管病、高血压、眼科以及多种缺少抗凝血酶的疾病方面有巨大优越性和广阔应用前景.申同健等人工合成了水蛭肽基因，并在酵母中表达.周祥山等研究了用毕赤酵母来生产水蛭 素，为工业化生产水蛭素奠定了基础［4］. 李大力以p ROK II 为载体，用根癌农杆菌介导， 使水蛭素基因在甘蓝中得以表达［3］. 作者根据植物基因密码子选择偏向，对水蛭素基因进行改造，配以先导链和p o l y （A ）尾，构建了水蛭素基因植物表达载体，使之适 合在植物中高效表达，为用植物反应器来生产水蛭 素打下基础. 1 材料与方法 1.1 材料 p B I121表达载体购自武汉大学生命科学院；p M D 18T 高效克隆载体由上海博亚公司提供；XbaI 内切酶和S acI 内切酶购自B io labs 公司，!DNA ／~i ndIII 相对分子质量标准物购自M B I 公司；大肠杆菌D~5!由中南大学湘雅医学院提供，根癌农杆菌LBA 4404由湖南农业大学湖南省作物基因工程重点实验室提供；卡那霉素（Km ）和链霉素（S tr ）购自湖南省医药公司.1.2方法1.2.1 水蛭素DNA 的合成 !收稿日期：20060426 基金项目：湖南省财政厅农业发展基金资助项目作者简介：张正奇（1944-），男，湖南常宁人，湖南大学教授T 通讯联系人，E -m ail ：Zh73"s i na .com 第34卷 第3期 2007年3月 湖南大学学报（自然科学版） Journal o f ~unan u n ivers it y （N atural S ciences ）V o l .34，N o.3 M ar.2007

重组蛋白药物研究进展解析

转自<丁香园> 重组蛋白药物也称rDNA药物,不包括重组疫苗、单克隆抗体药物(抗体药物的市场和研发趋势另有文章详述[1]、检测用重组蛋白和生化提取的天然蛋白,也不包括仿制药物。重组蛋白药物虽然仅占全球处方药市场的7-8%左右,但是发展非常迅速,尤其到了21世纪其发展更是进入黄金时节,1989年的销售额为47亿美元,2001 年为285亿美元,2004年达到347亿美元[2],2005年约410亿美元,是1989年的9倍。 相对小分子药物,重组蛋白药物生产条件苛刻、服用复杂和价格昂贵,但对于有些疾病的治疗是不可替代的。绝大部分重组蛋白药物是人体蛋白或其突变体,以弥补某些体内功能蛋白的缺陷或增加人体内蛋白功能为主要作用机理,其安全性显著大于小分子药物,因而具有较高的批准率,同时,重组蛋白药物的临床试验期要短于小分子药物,专利保护相对延长,给制药公司更长的独家销售时间[3]。这些特点成为重组蛋白药物研发的重要动力。从重组蛋白药物市场的地理分布角度,美国和欧洲占有全球市场的81% [4]。重组蛋白药物研发公司6强(Amgen, Biogen IDEC, Johnson & Johnson,Eli Lily,Novo Nordisk和Roche全部来自美国或欧洲,占有75%市场份额[2]。从新药上市的数量和速度看,美国居首位,这与美国拥有较自由的药物价格环境以及医生接受新药的需求和高速度有明显关系。欧洲近几年发展也较快,率先批准上市了转基因动物(羊生产的重组人抗凝血酶(美国GTC生物治疗公司[5],以及第一个重组蛋白药物的仿制药物(Biosimilar,通用名生物药,下通称重组药物仿制药[6,7],后者结束了多年来重组蛋白药物是否能有仿制药的争论。鉴于美国和欧洲实际上主导着全球市场,分析其市场和研发趋势,也就能准确把握重组蛋白药物整体发展的脉搏。专家们对“新”重组蛋白药物的定义不尽相同,所以,不同文献中的新重组蛋白药物统计数量可能存在较大的差别。 本文以在美国和/或欧洲新上市的重组蛋白药物注册品名为准(以下通称重组药物,计有82个,包括15个“重磅炸弹”,后者2005年销售额即达278亿美元,占销售总额的66%。目前的研发重点在于解决生产能力不足、更加合理的改变重组药物结构和给药途径多样化。尽管重组药物发展面临着种种挑战,但是我们认为该市场会

重组水蛭素口服给药的抗凝血效应

重组水蛭素口服给药的抗凝血效应 阎雪莹1，唐晓飞2，张学农3，张强4 1黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨 (150040) 2黑龙江省哈尔滨市香坊区疾病预防控制中心，哈尔滨 (150031) 3苏州大学药学系，浙江苏州 (215007) 4北京大学药学院药剂系，北京 (100083) E-mail：yanxuey@https://www.wendangku.net/doc/1514290404.html, 摘要：目的：考察不同剂量重组水蛭素-2（rHV2）口服给药后的抗凝血效应。方法：以凝血时间（CT－Clotting Time）和凝血酶时间（TT-Thrombin Time）为指标，测定大鼠口服不同剂量的rHV2的抗凝血效应。结果：rHV2口服给药后，凝血时间及凝血酶时间试验均表现出显著的抗凝血效果。而且从给药后1h到4h抗凝效应一直延续。并且还可以说明这种抗凝血效应是有剂量依赖性的。当剂量范围在50 mg·kg-1~100 mg·kg-1之间，抗凝血效应随着剂量的增加而加强。结论：rHV2经大鼠口服后能够产生抗凝血效应，说明rHV2的口服是可行的。 关键词：重组水蛭素-2；口服；抗凝血；药效学 中图分类号：R969.1 文献标示码：A 1. 引言 水蛭素是一种由65个氨基酸残基组成的多肽，是目前已知的作用最强的天然凝血酶抑制剂[1,2]。由于多肽类药物易被消化道中的酶降解而失去活性，因此这类药物的给药途径以注射为主。但频繁注射给病人带来很大的不适，因此开发水蛭素的口服给药制剂具有很大的价值。韩玉珉等[3]证明重组水蛭素-2(rHV2)经十二指肠给药后表现出明显的抗凝血作用，但作用弱于注射给药。本研究考察了rHV2口服给药后的抗凝血作用，进一步验证完整的胃肠道环境对于rHV2活性的影响。从而为开发水蛭素口服给药制剂奠定了理论基础。 2. 实验材料 2. 1 试剂与药品 rHV2（4067 ATU·mg-1，北京大学生命科学院）。凝血酶（54 U·mg-1，Sigma 公司）。Tris HCl (Sigma 公司)。 2.2 主要仪器 电热恒温水浴锅（北京医疗设备厂）。精密电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）。秒表（上海手表厂）。 2.3 实验动物 SD大鼠（♂，200g），维通利华实验动物中心。 3 实验方法 3.1凝血时间（CT）测定方法 称量rHV2，加生理盐水配成溶液。大鼠随机分组，每组5只，分别按50 mg·kg-1，75 mg·kg-1，100 mg·kg-1的剂量灌胃给药。灌胃体积2 ml。给药前的凝血时间测定值设为对照。

水蛭疗法

水蛭疗法 生活环境生活在稻田、沟渠、浅水污秽坑塘等处，嗜吸人畜血液，行动非常敏捷，会波浪式游，也能作尺蠖式移行。每到春暖即行活跃，6～10月均为其产卵期，到冬季往往蛰伏在近岸湿泥中，不食不动，生存能力强。 生活习性水蛭属冷血软体动物，在中国南北方均可生长繁殖，它主要生活在淡水中的水库、沟渠、水田、湖沼中，以有机质丰富的池塘或无污染的小河中最多。生长适温为 10-40℃，北方地区低于3℃时在泥土中进入蛰伏冬眠期，次年3-4月份高于8℃左右出蜇活动。水蛭为杂食性动物，以吸食动物的血液或体液为主要生活方式，常以水中浮游生物、昆虫、软体动物为主饵，人工条件下以各种动物内脏、熟蛋黄、配合饲料、植物残渣，淡水螺贝类、杂鱼类、蚯蚓等作饵。 采制夏、秋捕捉。捕得后洗净，先用石灰或酒闷死，然后晒干或焙干。日本医蛭通常用线穿于体的中段，挂起晒干；茶色蛭除用线穿起外，并将体的一端拉长，故成狭窄的条状。由于加工后外形不同，药材中以日本医蛭的干燥品称为'水蛭'，以宽体金线蛭的干燥品称为“宽水蛭”，以茶色蛭的干燥品称为“长条水蛭”。 ⒈宽水蛭：以夏秋二季为盛产期，湖泊中产者体大，水田里

产者体小，捞出后置阳光下晒干，或放在锅内焙干。 ⒉长条水蛭：采收方法同上，惟捞出后用线穿起，体的一端拉长，挂在阳光处晒干。 ⒊水蛭：采收期同蚂蟥，捞出后用线穿起，穿时常从体的中段穿上，持于阳光处晒干。 蚂蝗治疗麦可森说，水蛭“减痛”的关键在于它的唾液，因为它的唾液里面含有几种消炎的成分，这种成分可以深入人的关节组织。加拿大多伦多大学细菌学教授戴瑟说，水蛭开口咬人的时候，会释放出一系列的化学物质，而在这些化学物质中，有些具有减少发炎的作用，相当于消炎剂。治疗用途古代医书中记载有利用蚂蟥治疗多种疾病，谓其“主逐恶血、瘀血、月闭、破血消积聚……”。医圣张仲景用其祛邪扶正，治疗“瘀血”、“水结”之症，显示了其独特的疗效。 后世张锡纯赞此药：“存瘀血而不伤新血，纯系水之精华生成，于气分丝毫无损，而血瘀默然于无形，真良药也”。 公元1500年前，埃及人首创医蛭放血疗法，到上世纪初，欧洲人更迷信医蛭能吮去人体内的病血，不论头痛脑热概用医蛭进行吮血治疗。后来随着医学的发展，这种带有迷信色彩的治疗方法才逐渐被放弃了。然而近年来，医蛭在医学上的新用途正受到人们广泛的关注。 整形外科医生利用医蛭消除手术后血管闭塞区的瘀血，减少

水蛭素简介

水蛭素简介 摘要： 水蛭素是从医用水蛭唾液腺中分离出来的一种单链多肽，是中药水蛭中的重要活性成分，水蛭作为活血化瘀类动物药材的代表药，具有破血、逐瘀、通经的功效，为迄今发现的作用最强的凝血酶抑制剂，始载于《神农本草经》。药用水蛭为水蛭科动物日本医蛭Hirudonipponica( Whitman)和宽体金线蛭whitmania pigra( Whitman)的全体。水蛭素是凝血酶的直接抑制剂，可从多个环节影响血液凝固和促进纤溶，具有极强的抑制凝血作用和抗血栓形成作用，效果明显优于肝素而副作用少，水蛭素在临床治疗和预防各种血栓形成方面有着广阔的应用前景。 关键词： 水蛭素;化学成分;生理学效应，临床应用研究 1 水蛭素发展历史 1884 年 Haycraft 首先发现医用水蛭的提取物中含有抗凝血物质，1904 年 Jacoby 将其定名为水蛭素( Hirudin) ，1955 年Markwardt 从医用水蛭咽周腺体中成功地分离出水蛭素纯品。1986 年 Harvey 分离出水蛭素编码纯系cDNA，从此利用基因工程技术制备重组水蛭素成为现实。 2 水蛭素的化学成分 水蛭属于高度特化的环节动物，始载于《神农本草经》，俗称蚂蝗，是我国传统的中药，味咸、苦，性平。《中华人民共和国药典》载具有破血、逐瘀、通经之疗效，主要用于治疗瘤症、痞块、血瘀、闭经和跌打损伤。1884 年， Haycraft 首次在欧洲医用水蛭的唾液腺里发现了一种生物活性物质水蛭素; 1927 年，Shionoya 最先把它作为抗血栓的有效药物来进行研究; 1955 Markwardt 指出其为蛋白物质，并命名为水蛭素。天然水蛭素是从医用水蛭中提取的一种抗凝血蛋白质，是由 65个或66个氨基酸残基组成的单链多肽，相对分子质量为 7 000 Dalton。水蛭素的 N 末端有3对二硫键，使N末端肽链绕叠成密集的环肽结构，对蛋白结构起稳定作用。其N 末端含活性中心，能识别底物即凝血酶碱性氨基酸富集位点，并与之结合。C 末端富含酸性氨基酸残基，最后9个氨基酸中有6个为酸

水蛭素的作用和用途

水蛭素 作者：南宁JBC 水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是“迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂”，被医学界认为是专克心血管病这个”第一杀手“的”第一高手“。对付冠心病、心肌梗塞、脑血栓、脑中风、高血压、高血粘、高血脂等，水蛭素具有独到的非凡疗效。 专家提醒： 生命本质在于人体血液循环平衡，如果血液循环平衡被破坏了，那 生命健康就会得到威胁，心脑血管疾病和“三高”都是因为人体的血液循环已经被破坏。所以治疗疾病的根本原因还是从日常饮食、运功上面注意，如果有条件的可以服用新洷康天然水蛭素，天然水蛭素是对付心脑血管病的“全能高手”，不仅能直接扩张血管，降低血液粘稠度，而且能加快血流速度，抗凝血、溶血栓、降低血小板聚集性，对人类心脑血管疾病尤其是血栓性疾病等有独特的功效。这种资源遵循的是平衡血液的循环，而非西药有破坏人体自身修复系统功能。 水蛭素能与凝血酶的催化中心及纤维蛋白原结合中心发生不可逆转的结合，使凝血酶失活，因而能够有效的防治血栓的形成，促进伤口愈合，同时具有降血压、降血脂、扩张外周血管、加速血液循环的作用。目前水蛭素主要用于各种血栓疾病，如脑血栓、静脉血栓、弥散性血管内凝血及冠状动脉血栓等的预防和治疗，也用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管形成后再栓塞，及改善体外血液循环和血液透析过程。 综合来说，水蛭素为最明显的五个作用： 1、溶解血栓； 2、消除血液垃圾； 3、减低血液粘度； 4、改善血液循环； 5、促进新陈代谢。 相对于目前临床上用于治疗心血管病最常用抗凝药物——肝素，天然水蛭素有一下优点： （1）天然水蛭素抑制凝血酶的反应不需要抗凝血酶II作为辅助因子，使其抗凝作用与量效关系更吻合；（2）肝素不能灭活结合与血栓上的凝血酶，而天然水蛭素则对血液中和结合于血栓的凝血酶都可抑制;（3）肝素用于抗血栓治疗，出血

水蛭的妙用---慢性肾功能不全

水蛭的妙用---慢性肾功能不全 转自中医于春廷慢性肾功能不全 自1980年开始，笔者在益肾汤中加用水蛭治疗慢性肾功能不全，并设置益肾汤组为对照组，收到了一定的效果，对照组14例用益肾汤，治疗组18例用益肾汤加水蛭粉内服，4周为一个疗程，每周复查各项指标，4个疗程后总结疗效。 益肾汤：生黄芪50g、附子10g、大黄10g、山茱萸10g、枸杞30g、桑葚15g、金银花15g、白花蛇舌草15g、车前草30g、益母草30g、丹参30g，每天1剂，水煎分3次服。 尿毒症严重的患者或呕吐不能进食者，用生大黄、半支莲各30g，生牡蛎50g，水煎取药汁100ml，保留灌肠20min，每天1到2次，以每天排便3到4次为宜，其它对症处理如纠酸、利尿、降血压等。 水蛭组在对照组的基础上重用生水蛭30克，研粉末每日分3次用益肾汤冲服,装胶囊更好，可避免恶心呕吐。 结果：

1.从尿素氮和肌酐比较，两组有显著差异；从症状比较，有非常显著差异。 2.从尿量比较，水蛭组有8例用药2周后尿量显著增加，水肿消退，对照组不明显。 3.副作用方面：水蛭组治疗后9例由便结转为稀便，没天2到3次，6例便稀者未见次数增加，无明显副作用。 原按：水蛭治疗本病有三个要点：时间要早、剂量要大、疗程要长。 所谓时间早指不论是代偿期，或者原发病急慢性期，不必悉具瘀血证均投之。这对于治疗原发病，延缓病情发展大有裨益。所谓剂量大指水蛭用量要大，常用到30克，量小则难以奏效，并且要生用，忌炙用或入煎，否则疗效大减。所谓长指治疗有效后可以长时间服用乃至数年，不仅延长存活期，还可以逆转肾功能。水蛭组病情稳定后继续服用水蛭，平均存活37.4个月，最长达8年，现在已经恢复工作，对照组仅29个月。 水蛭组有效病例，治疗前肾功能为中度损害，而对重度