细菌鉴定及检测方法
细菌鉴定及检测方法
一、启动条件
1、目的样出现坏包，若批次相同，取表现性状相同的任意一包进行细菌初步鉴
定。若批次不同则分别进行细菌初步鉴定。
2、随机样出现坏包，必须进行细菌初步鉴定。
二、胀包
1、记录批次。
2、及时用72%的酒精对样品的外表进行消毒，尽量不损坏封合待以后检查。在
超净台内以无菌操作剪开包装，再避开横竖封处剪开一个圆形或三角形。3、对样品进行微生物划线培养。
3.1采用普通营养琼脂培养基做细菌的划线培养36±1℃、48小时。
3.2分别吸取10毫升样品到两个无菌的小试管中，，分别在80和100℃的水
浴中加热10分钟，冷却用营养琼脂分别做芽孢（36±1℃、72小时）
和耐热芽孢（55±1℃、72小时）的划线培养。
3.3采用普通营养琼脂培养基或快速检测培养基做嗜冷菌/低温菌的划线培
养（4—6℃ 10天或21±0.5℃ 25小时）。
3.4 必须用高盐察氏或虎红琼脂培养基做霉菌和酵母菌的划线培养
（25—28℃ 5--7天）
4、对样品做感官检测。
5、用PH计检测样品的PH值。
6、将样品倒掉，进行包装密封性检查，并进行记录。
7、记录菌落特征。
8、选区不同形态的单一菌落进行坚定。
8.1 革兰氏阴性菌和阳性菌的鉴定：
8.1.1涂片、革兰氏染色、镜检。或结晶紫染色、镜检、氢氧化钾拉
丝试验。
8.1.2革兰氏染色、结晶紫染色方法见《微生物检测》
8.1.3氢氧化钾拉丝试验
在微生物载物片上滴一滴3%氢氧化钾，用接种针从培养皿上的
菌落中挑取微生物，放在氢氧化钾溶液中用力搅拌。7—10秒后，抬
起针头，观察针头和玻片之间是否有丝状物，如果15—20 秒后二者
之间无丝状物，停止搅拌。
判定：无丝状物阳性；有丝状物阴性。
8.2 过氧化氢酶试验（或过氧化氢酶试纸）（产气试验）：
试剂：10%过氧化氢溶液
步骤：在微生物载物片上滴一滴10%过氧化氢，用接种针从培养皿上的菌落中挑取微生物，放在过氧化氢溶液中看是否有气体产生。
判定：产气阳性；不产气阴性。
8.3氧化酶试验
试剂：含1%四甲基双噻二胺和99%的乙醇溶液。
步骤：用上述试剂将一张滤纸浸透（或直接采用氧化酶试纸条），然后进行细菌培养物的涂片试验。
判定：30秒内使显色物质变为深蓝色阳性，不变色阴性。
三、酸包
1、发现酸包后，及时将料液快速转入无菌瓶中。
2、记录批次
3、其它项目检测同胀包。
普通细菌培养鉴定操作规程
普通细菌培养鉴定操作规程 1 检验目的 做疾病的病原学诊断，查找于疾病有关的病原菌以及了解微生物与疾病的关系，指导临床治疗及预后和流行病学的调查。 2 原理 人体很多部位与外界相通，存在栖息菌群，但不致病，当菌群失调或分离到致病菌则具有临床意义；另外机体某些部位是无菌的，如检出细菌则视为致病菌。并排除采样及操作污染。 3 标本要求 （1）标本类型：血液，骨髓，脑脊液，胸水，腹水，尿液，等体液；痰液，前列腺液，脓液，组织分泌物或穿刺液等。 （2）标本采集：见标本采集手册 （3）标本储存和运输：室温放置，室温运输并立即送检。 （4）标本拒收状态：非无菌方式采集的标本或未按要求部位采取的标本。 4 容器和添加剂类型 均使用灭菌器皿盛放标本 5 试剂 （1）试剂名称：革兰氏染液、氧化酶试剂、3%触酶、血平板、中国蓝平板、SS平板、柯玛嘉平板、相关生化试剂等。 6仪器设备： （1）接种针、接种环、酒精灯 （2）梅里埃ATB药敏鉴定仪 （3）显微镜、SPX-150B型生化培养箱、超净工作台、台式离心机、天平 7 校准程序 (送市计量质量检测研究所校准) 8操作步骤
（1）所有标本按照培养目的增菌培养12-18小时后盲目接种，血培养发现阳性立即进行接种。 （2）接种：以上增菌标本及其他临床标本用接种环取标本接种环划线血平板及其他选择性培养基上,35℃培养过夜，观察结果。 （3）涂片：肉眼见细菌生长，取生长物涂片做革兰氏染色； （4）纯培养：根据需要接种血平板、巧克力、中国蓝/柯玛嘉或厌氧平板过夜培养以获得纯培养。 （5）鉴定：按照鉴定仪要求调配菌液浓度，细菌的鉴定见梅里埃ATB微生物鉴定系统 9质量控制： 参加我科质量管理小组组织的各项质量控制活动 10 生物参考区间 血液，尿液，脑脊液等无菌部位采取的标本未见细菌生长；其他标本如大便，痰液为正常菌群或未见致病菌。 11 患者检验结果的可报告区间 细菌鉴定到种或属；菌群调查报告比例。 12 临床意义： 为医生提供病原学诊断，并为进一步药敏实验提供依据。
16S_rDNA鉴定细菌的方法
16S rDNA鉴定细菌的方法 细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分： 1.提取细菌基因组DNA, 2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。 3.琼脂糖凝胶电泳分离 4.胶回收目的片段 5.目的片段测序。 6.BLAST比对获取相似片段。 7.构建系统进化树 试剂： 1.1培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。）。 1.2 1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高压灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。 1.3 0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA?2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。 1.410×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。高温高压灭菌，室温保存。1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。 1.5 10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65℃溶解。配置时要戴口罩。 6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。 7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。用之前在65℃溶解。 8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。 9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。 10、TAE缓冲液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。浓储存液50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。 11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)（0.2 ml），4℃保存。 12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。 13、EB：10 mg/ml。称取1g溴化乙锭定容至100ml。棕色瓶室温避光保存。EB的工作浓度为0.5ug/ml。当配置50ml 琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。（因EB是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有Gelred等） 14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20℃保存，反应浓度50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度37-56℃。无需预处理。 15、RNase A：10 mg/ml。25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，无菌水2460 ul，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。（为避
细菌培养与鉴定
菌落 定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。 菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性。 2、细菌在液体培养基中的生长现象 混浊 沉淀：多见于链状排列的细菌。 菌膜：多见于厌氧菌。 3、细菌在半固体培养基中的生长现象 有鞭毛细菌： 在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘模糊。 无鞭毛细菌： 只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。 生化试验鉴定：糖发酵试验、淀粉实验、油脂水解试验、吲哚实验、M.R.及V.P的原理及方法。 1.淀粉水解试验 1.将固体淀粉培养基熔化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。 2.用记号笔在平板底部划成4部分。 3.将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别在不同的部分点种， 在平板的反面分别在4部分写上菌名。 4将平板倒置在37℃温箱中培养48h。 5观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳 性。透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。 2油脂水解试验 1将熔化的固体油脂培养基冷却至50℃左右时，充分摇荡，使油脂均匀分布，无菌操作 倒入平板，待凝。 2用记号笔在平板底部划成4部分，分别在4部分标上菌名。 3用无菌操作将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别划接种 于平板的相对应部分的中心。 4将平板倒置，37℃温箱中培养48h。 5取出平板，观察菌苔颜色。如出现红色斑点，说明脂肪水解，为阳性反应。 3糖发酵试验 1用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名。 2取葡萄糖发酵培养基试管3支，分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌，第三支不接种， 作为对照。另取乳糖发酵培养基试管3支，同样分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌，第 三支不接种，作为对照。在接种后，轻缓摇动试管，使均匀，防止倒置的小管进入气泡。 3将接过种和作为对照的6支试管均置37℃中培养48h。 4观察各试管颜色变化及徳汉氏小管中有无气泡。 4吲哚试验 1用接种针将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入2支蛋白胨水培养基中，置37℃中培养 48h。 2于培养48h后的蛋白胨水培养基内加入3~4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚
痢疾杆菌分离与鉴定培训
痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国
宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分
基本常规医疗流程答案
太原九龙泌尿外科医院基本医疗流程 基本医疗流程 本流程根据医疗常规接诊程序设计，适用于医院日常规范化医疗服务培训、运作、指导。 一、医疗行为准则 ·以病人为中心，医患合作，“一对一”平等交流； ·以主诊为中心，首诊负责，各科配合，流程运作，规范医疗； ·仁爱行医，诚信待人，真诚服务，体贴关爱。 ·交流“五不”：与患者交谈中，不讲不文明的生硬话、不讲与病无关的题外话、不讲不留余地的过头话、不讲不顾后果的刺激话、不讲不负责任的议论话。 ·三个“留意”：留意患者及亲属的情绪变化、留意他们对疾病认识和治疗的期望、留意自我情绪控制和态度。 ·“六心”服务：听主诉及解释耐心；观察、检查细心；语言上贴心；主动帮热心；询问上爱心；行为表达责任心。 二、医疗服务模式 ·链式服务：建立环环相扣的“健康产业”医疗服务链，全程导医，全程陪护，链式服务。 ·行为模式：如图示（附1） 三、医疗责任与义务 1、责任：所有医护人员在医疗服务过程中，均负有医疗质量安全责任；负有医院文化 传播、医疗服务宣传、品牌形象维护与推广责任；负有维护医院及社会大局利益和患者合法权益之责任。 2、义务：所有医护人员在医疗服务过程中必须对患者履行“观察、注意、告知”等法律义 务，为患者提供满意的人文关怀服务。其中： ·观察：认真观察患者生命体征和病情变化；详细记录病情变化与病历，及时分析处置。 ·注意：医师不能只限于常规项目检查，同时必须注意患者特殊症状、体征的专项检查。 不能仅仅只听主诉，只限于单病种诊断，要提高对疾病鉴别诊断水平。 ·告知：常规检查、治疗、手术预先告知；病情变化、特殊处置、治疗方式预先告知；危重病人抢救治疗要事先告知患者家属确认、签字。 3、岗位责任分工
细菌鉴定方法
1.2.1 形态学特征 按照东秀珠和蔡妙英编《常见细菌系统鉴定手册》（1999），中科院微生物所编著《一般细菌常用鉴定方法》（1978）的方法进行鉴定。芽孢杆菌属鉴定到种，参照了蔡妙英等译《芽孢杆菌属》（1980）的方法。 （1）革兰氏染色：挑选少许菌苔，涂布于干净玻片的蒸馏水中，风干固定，结晶紫染色（结晶紫2g，草酸铵0.8g，95%乙醇20 ml，加水至100 ml）1min，水洗后碘液（碘1g，碘化钾2g，水300 ml）作用1min，水洗，脱色，用番红O 液染3min，水洗，风干，光学显微镜观察。 （2）鞭毛染色：将16~24h菌龄的菌苔在载玻片上的水滴中轻蘸几下，将玻片倾斜，使菌液缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。干燥后滴甲液（丹宁酸5g，FeCl3 1.5g，15%福尔马林2ml，1%NaOH 1ml，蒸馏水100 ml）染6~10min，水洗，干燥后，用乙液（2%AgNO3溶液）加热复染30min，蒸馏水冲洗，干燥，镜检，菌体为深褐色，鞭毛为褐色。 （3）运动性：半固体琼脂穿刺法，将菌种接在可使鉴定菌生长良好的培养基中，其中含0.3~0.6%的琼脂。适温培养，运动性可用透射光目测，如生长菌只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表明鉴定菌无运动性；如生长菌由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状，则表示鉴定菌有运动性。 （4）芽孢染色：孔雀绿染色法。按革兰氏染色涂片后，用饱和的孔雀绿水溶液（约7.6%）染20 min，水冲洗后在用0.5%番红O复染20~30s，水洗，吸干，镜检。芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。 （5）抗酸染色：常规涂片，石碳酸复红（10%碱性复红乙醇饱和液10 ml，5%石碳酸水溶液100 ml）加热染色5 min，倾去染液用酸性乙醇脱色，吕氏美蓝（2%亚甲基蓝乙醇饱和液30 ml，0.01%KOH 100 ml。）复染2min，水洗，吸干，镜检。 （6）荚膜染色：在载片一端滴一滴无菌水，取少许菌苔在水滴中制成悬液。取一滴墨汁与菌悬液混合，并用另一载片之一端将此水滴在载片上刮成薄膜风干。用纯甲醇固定1min，加0.5%番红O液数滴滴于涂片上，冲去残余甲醇，并染30s，然后倾去染液，立即吸干，镜检。 1.2.2 培养及生理特性 （1）菌落形态：用划线法将菌种接在平板培养基上，适温培养1~2d，出现单菌落开始观察，包括形状和大小，边缘，表面，隆起形状，透明度，菌落和培养基的颜色等。 （2）生长温度和耐热性：将菌种转接到几支试管中，分别在不同温度下培养，每处理2管，目测生长情况。
细菌鉴定及检测方法
细菌鉴定及检测方法 一、启动条件 1、目的样出现坏包，若批次相同，取表现性状相同的任意一包进行细菌初步鉴 定。若批次不同则分别进行细菌初步鉴定。 2、随机样出现坏包，必须进行细菌初步鉴定。 二、胀包 1、记录批次。 2、及时用72%的酒精对样品的外表进行消毒，尽量不损坏封合待以后检查。在 超净台内以无菌操作剪开包装，再避开横竖封处剪开一个圆形或三角形。3、对样品进行微生物划线培养。 3.1采用普通营养琼脂培养基做细菌的划线培养36±1℃、48小时。 3.2分别吸取10毫升样品到两个无菌的小试管中，，分别在80和100℃的水 浴中加热10分钟，冷却用营养琼脂分别做芽孢（36±1℃、72小时） 和耐热芽孢（55±1℃、72小时）的划线培养。 3.3采用普通营养琼脂培养基或快速检测培养基做嗜冷菌/低温菌的划线培 养（4—6℃ 10天或21±0.5℃ 25小时）。 3.4 必须用高盐察氏或虎红琼脂培养基做霉菌和酵母菌的划线培养 （25—28℃ 5--7天） 4、对样品做感官检测。 5、用PH计检测样品的PH值。 6、将样品倒掉，进行包装密封性检查，并进行记录。 7、记录菌落特征。 8、选区不同形态的单一菌落进行坚定。 8.1 革兰氏阴性菌和阳性菌的鉴定： 8.1.1涂片、革兰氏染色、镜检。或结晶紫染色、镜检、氢氧化钾拉 丝试验。 8.1.2革兰氏染色、结晶紫染色方法见《微生物检测》 8.1.3氢氧化钾拉丝试验 在微生物载物片上滴一滴3%氢氧化钾，用接种针从培养皿上的
菌落中挑取微生物，放在氢氧化钾溶液中用力搅拌。7—10秒后，抬 起针头，观察针头和玻片之间是否有丝状物，如果15—20 秒后二者 之间无丝状物，停止搅拌。 判定：无丝状物阳性；有丝状物阴性。 8.2 过氧化氢酶试验（或过氧化氢酶试纸）（产气试验）： 试剂：10%过氧化氢溶液 步骤：在微生物载物片上滴一滴10%过氧化氢，用接种针从培养皿上的菌落中挑取微生物，放在过氧化氢溶液中看是否有气体产生。 判定：产气阳性；不产气阴性。 8.3氧化酶试验 试剂：含1%四甲基双噻二胺和99%的乙醇溶液。 步骤：用上述试剂将一张滤纸浸透（或直接采用氧化酶试纸条），然后进行细菌培养物的涂片试验。 判定：30秒内使显色物质变为深蓝色阳性，不变色阴性。 三、酸包 1、发现酸包后，及时将料液快速转入无菌瓶中。 2、记录批次 3、其它项目检测同胀包。
细菌鉴定流程
细菌鉴定流程： 取一环标本四区划线接种平板（如为粪便标本接种SS,MAC平板） 培养18-24小时后取一区菌落革兰染色，报告为革兰阳性球菌/革兰阴性球菌/革兰阳性杆菌/革兰阴性杆菌，注意区分细菌和真菌 一般情况下不会给你们做革兰阳性杆菌和革兰阴性球菌 革兰阳性球菌鉴定流程： 先做3%触酶试验：阳性的为葡萄球菌或微球菌，阴性为链球菌或肠球菌 葡萄球菌和微球菌的区别：葡萄糖OF试验，葡萄球菌为F型，微球菌为O型 所以如果做到一个触酶阳性的革兰阳性球菌都要做下葡萄糖OF试验，DNA酶试验，新生霉素试验，血浆凝固酶试验 链球菌和肠球菌的区别：链球菌高盐和胆汁七叶苷试剂均为阴性，而肠球菌都为阳性。 链球菌属内区别：本来可以通过溶血来区分一些的，但是由于实验室的平板αβ溶血比较难区分 所以如果做到一个触酶阴性的革兰阳性球菌都要做下高盐，胆汁七叶苷，杆菌肽，奥普托欣，CAMP 如果做到一个奥普托欣敏感的革兰阳性球菌再加做胆汁溶菌试验和菊糖试验（阳性为变红）可判定为肺炎链球菌 革兰阴性杆菌鉴定流程： 先做氧化酶试验： 氧化酶阴性的革兰阴性杆菌都要做下KIA，MIU，葡磷两支(做MR，VP)，苯丙，枸橼酸盐，硝还，蛋白胨水（做吲哚试验），赖氨酸，鸟氨酸，氨对 如果KIA结果为A/A或者K/A的应为肠杆菌科细菌，如上面向个反应还不能区分细菌到种根据教科书307页加做试验。 一般情况下只会给你们做大肠埃希菌，志贺菌属（四种），沙门菌属（甲副，乙副，伤寒），弗劳地枸橼酸杆菌，肺炎克雷伯，产酸克雷伯，产气肠杆菌，阴沟肠杆菌，普通变形杆菌，奇异变形杆菌，沙雷菌属，摩根菌属，普罗威登斯菌属。 如果KIA结果为K/K应怀疑为不动杆菌属或者嗜麦芽窄食单胞菌：这两个菌区分可通过麦芽糖和赖氨酸试验区分， 如为氧化酶阳性，要做葡萄糖的OF试验（用非发酵），硝还产气，精氨酸双水解酶，一般情况下只有两种菌给你们做一个是铜绿假单胞菌，一个是粪产碱杆菌， 真菌给你们做的一般情况只有白色念珠菌和新生隐球菌，通过墨汁负染，芽管试验，厚膜孢
临床标本细菌培养鉴定常见的个疑问
临床标本细菌培养鉴定常见的个疑问
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问题1:如何正确应用药物敏感结果? 正确运用药敏试验结果应考虑以下3个方面: 首先要确定病原菌，如未找到真正的致病菌，药敏实验不但不能指导用药甚至可能误导临床； 重视耐药监测，这是经验用药的一个重要的参考； 考虑到药敏试验的局限性:体外报告敏感的药物体内治疗不一定有效，而体外报告耐药的药物体内治疗不一定无效。 问题２:是否MIC越低的药物越好？ 不一定。因为不同药物对同种细菌，同一药物对不同细菌的折点均可不同，并且若细菌产生某些特殊耐药机制时，即使体外敏感也应报耐药，另外尚需考虑药动学和耐受性。因此，不能单纯比较MIC值而认为ＭＩＣ越低的药物就一定越好。ＭＩC只表示一种药物对某一株细菌抗菌作用的强弱，MIC越低（离中介值越远)说明该药物对相应的病原菌的作用越强。只能比较同一种药对同一株菌，若MIC值升高，可认为其耐药性提高。 问题３：是否所有报告的细菌均为病原菌? 不一定。原因如下: 所报告细菌为污染菌或定植菌，细菌培养结果的临床意义大小与所取标本有关。如为血液等无菌标本则临床意义较大，但即使血培养阳性也可能为污染菌。某些标本易受污染如痰标本易于受咽喉部携带菌的污染,尿培养易受下尿道、尿道口寄居菌污染。 可能为应用抗菌药后的菌群交替或菌群失调。特别是原为复数菌感染时,针对优势菌治疗一段时间后可能非优势上升为优势菌，或广谱抗菌药治疗后可能
出现真菌感染。 有2种以上病原菌时因生长速度不同、营养要求不同，培养结果不能真实反映病原菌的种类、数量。 问题4:为什么有时痰涂片结果与痰培养结果不一致？ 由于痰标本进行培养和涂片时选取的部位不一致; 某些快生长菌所占比例并不多，但由于生长速度快、营养要求低,能在培养过程中迅速变为优势菌而掩盖其他菌的生长； 标本从采集到接种的时间过长,造成部分苛养菌死亡，在涂片中看到的只是菌的残骸而非活菌。 问题５:我们想用的药物在药敏试验中没有做? 1.天然耐药 ２.可能是药物的敏感性被其他药物所预报 问题6：为什么有的菌报告很多种药物,有的仅报告几种药物? 报告的药物种类根据细菌种类的不同而有所不同，如铜绿假单胞菌报告的药物较多,而嗜麦芽窄食单胞菌报告的药敏较少。 问题７:是否能将所用的药都做药敏试验? 1．没有必要:通过耐药机制和标志性药物可以预测其他抗菌药物的敏感性 2.没有可能:不是所用药物都可以做药敏试验(需要药物在体外稳定,需要有操作标准和解释标准） 问题8:选择药敏报告敏感的药物,为什么临床治疗无效？ ①体外药敏试验只能预测体内治疗效果,并不等同；一般来说，耐药＝治疗无效;敏感≠治疗有效；
细菌鉴定学习
现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌,请你鉴定其革兰氏染色反应.你 怎样运 传统的细菌革兰氏染色法操作繁琐，初学者不易掌握，寻找一种简便方法。方法：玻璃片上将细菌与碱液混合，用接种环或接种针往上挑，观察有无丝状物出现，我们把它叫作“细菌拉丝实验”。结果：用本法鉴别细菌革兰氏染色性质，G＾－菌有丝状物出现，即拉丝实验阳性，G＾＋菌无丝状物，拉丝实验阴性经过对照使用，本法具有快速，准确，简便，结果易判断，成本低廉等优点，值得推广应用。 由于细菌细胞壁的结构不同，革兰氏染色法可使有的细菌染上初染的的紫色，为革兰氏阳性细菌，有的细菌染上复染的的红色，为革兰氏阴性细菌。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，染色后为红色，细菌形态为短小的杆状，单个存在。枯草杆菌是革兰氏阳性菌，染色后为紫色，细菌形态为杆状，比大肠杆菌大，可排成链状的，有的菌体里有椭圆芽孢（无色）或在视野中有散在的芽孢。 实验十肠杆菌科 肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是一大群寄居于人和动物肠道中、生物学性状相似的革兰阴性杆菌。多数为肠道的正常菌群，但在机体免疫力低下或寄居部位发生改变时可引起感染。根据其生化反应、血清学试验、DNA同源性等可将肠杆菌科分为120多个菌种，其中与医学密切相关的有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属等。 一、大肠埃希菌 大肠埃希菌(E. coli)俗称大肠杆菌，是寄居于人和动物肠道的正常菌群。当机体抵抗力下降、该菌侵入肠外组织或器官，可引起急性炎症或继发感染；有些血清型可引起腹泻。从水和食品中检出较多大肠杆菌时，可判断它们已被粪便污染。因此，大肠杆菌常被作为饮水、牛乳及食品的卫生学检测指标。 （一）形态与培养特性 【材料与方法】 1．大肠杆菌革兰染色标本片。 2．大肠杆菌普通琼脂平板、SS平板、中国蓝平板、伊红美蓝(EMB)平板培养物。 【结果】 1．大肠杆菌为革兰阴性、中等大小杆菌，两端钝圆或稍弯曲，呈分散排列。 2．菌落特征(表10-1)。 表10-1 大肠杆菌在普通琼脂平板及选择鉴别培养基上的菌落特征 培养基菌落特征 普通琼脂平板圆形，中等大小，灰白，整齐，光滑菌落 SS平板呈红色 中国蓝平板呈蓝色 伊红美蓝平板呈紫黑色，有金属光泽 （二）生化反应 【材料与方法】 1．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管，37℃培养24h，观察结果。 2．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于双糖铁培养基，37℃培养24h，观察结果。 3．靛基质产生、甲基红、VP、枸橼酸盐利用试验(IMViC试验)，见实验四。 【结果】
(完整版)细菌培养技术
第二节细菌培养检测技术 节概述 细菌的培养技术是微生物实验中基本技术之一。大多数细菌均可用人工方法培养，只有将细菌培养出来才能对它进行研究和鉴定 知识点导航 一.培养基的种类 培养基（culture medium）是细菌生长繁殖所需要的各种营养物质的人工制品。适宜的培养基 能使细菌在体外迅速生长繁殖，便于对细菌进行分离和鉴别。可分为基础培养基、营养培养基、选 择培养基、鉴别培养基、厌氧菌用培养基和特殊培养基。 （一）基础培养基 只含有细菌生长所需的最基本营养成分，应用最广泛，为制备多种培养基的基础，常见的有肉 汤培养基、琼脂培养基。 （二）营养培养基 在基础培养基中加入葡萄糖、血液、血清、腹水或酵母浸膏等有机物，可供营养要求较高的细 菌生长需要或增菌用。如结核分枝杆菌培养基中添加鸡蛋、马铃薯、甘油等。 （三）选择培养基 利用不同种类细菌对化学物质的敏感性不同而制成，使分离菌大量繁殖而抑制其它细菌生长的 培养基。培养基中含有的抑制剂能抑制非目的菌生长或使其生长不佳，有利于目的菌的检出和识别 。选择培养基多为固体平板，用于从标本中分离某些特定的细菌。 （四）鉴别培养基 培养基中加有某些特定成分，如糖、醇类和指示剂等，用于检查细菌的各种生化反应，以资鉴 别和鉴定细菌。 （五）厌氧菌用培养基 专性厌氧菌须在无氧条件下才能生长，故需在培养基中加入半胱氨酸、硫乙醇酸钠等还原剂，降低培养基中氧化还原电势，并应与外界空气隔绝，使培养基本身为无氧的环境。 （六）特殊培养基 为某些需要在特殊条件下才能生长的细菌培养之用。如高渗盐增菌培养基、高渗糖增菌培养基、改良Kagan氏培养基等。 二.培养基的制备 制备一般培养基的主要过程基本相似，包括调配、溶化、调整pH、过滤、分装、灭菌及检定和 保存。 三.细菌检验室的注意事项及无菌技术
微生物菌种、毒株和样本标准操作程序与流程
病原微生物菌（毒）种和样本的标准操作 规程流程 1．目的：对本实验室菌种、毒种的申购、保存、保管、领用、处理等各个环节实行有效的监督控制，防止意外事故发生，确保疾病预防与控制检验业务及科研教学工作。 2．适用范围及菌种、毒种专职管理人员 适用于本科微生物实验室菌种、毒株的管理； 菌种、毒种专职管理人员：于瑞芳、侯恩言 3．职责 ①微生物实验室负责菌、毒种的出入库保管、保存及处理等日常管理。 ②科室指定2名菌种、毒种库管理人员承担菌、毒种日常管理。 ③科室负责人负责一、二类菌、毒种的出入库和向上级索取及对下级发送的审核。 ④技术管理层批准本实验室一、二类菌、毒种的出入库和向上级索取及对下级发送的审批。 4．工作程序 ⑴报送及入库 ①当微生物实验室检出菌、毒株应及时报送市疾病预防控制中心。 ②新发现的菌、毒种，要做好原始记录，逐级报送进行复核确认，报送时须2人参加。 ③一、二类菌、毒种入库前，科室审核，技术管理层批准后入库
④个人不得擅自保留菌、毒种，必须由科室进行统一编号、登记入库管理 ⑤菌、毒种入库时， 2名菌、毒种保管人员须认真做好菌毒种的编号、登记工作。 ⑵日常管理 ①保管人员由于瑞芳、侯恩言2名检验人员组成。 ②菌、毒种入库时，保管人员应及时验收，统一编号，填写《菌、毒种登记表》 ③严禁随意将菌、毒种置于非菌、毒种专用保存场所，应做到三专（专室、专柜、专锁）。 ④菌、毒种库由2名保管人员双锁管理，铁门与锁必须牢固有效，发现损坏须及时报修。未经各科室负责人同意，不得擅自将钥匙委托他人代管。 ⑤菌、毒种保管人员应定期对库内温度、湿度、通风及冰箱、冰柜等菌、毒种保藏设备运转情况进行检查，并做好记录。 ⑥菌、毒种保管人员根据菌、毒种的保存期限，及时通知分管病种的检验人员进行传代，定期鉴定，并详细记录在《菌、毒种登记表》⑦菌、毒种保管人员发现菌、毒种发生变异和死亡，应及时向科室负责人报告，并填写《菌、毒种登记表》。科室须将变异及死亡的一、二类菌、毒种通报技术管理层。 ⑶索取、领用和发放
菌种鉴定常见问题解答
菌种鉴定常见问题解答 1.菌种鉴定的方法和步骤是什么？ 菌种鉴定一般就只要提取基因组DNA，然后PCR扩增16srDNA片段，上GeneBank或者Eztaxon对比即可。一般序列相似度在97%以上就可以认为是同种细菌（当然也有例外，DNA序列仅仅是一个参考指标）。 -----消息来源：百度问答 . 2. 微生物的菌种鉴定可以鉴定到“株”一级吗？ 如果你的菌株是自然界中分离得到，就只能鉴定到种，不能鉴定到株，因为多多少少和其他株系的细菌有区别，即便你做了一些特征的鉴定，发现和某一株细菌一模一样，你也没有理由说你的细菌就是那一株细菌，因为你不可能把所有的特征都做完，株和株之间的关系就相当于不同的人之间的关系，世界上不可能有完全相同的两个人。除非你知道你的细菌本来就是某一株细菌扩增出来的（而且要保证没有变异，否则就是一个新株），可是这样就没必要鉴定了。 -----消息来源：百度问答 3．为什么鉴定出来的菌种跟我想象的相差太大？ 答：我们菌种鉴定使用PCR直接扩增的方法，即以客户提供的菌株为模版直接进行PCR扩增，中间不经过传代培养，因此不会引入新的污染，如果出现结果不一致的情况，一般有以下原因导致： 1、您提供的样品未经过三次分离纯化，含有其他杂菌； 2、您提供样品的真实情况确认如此。 建议您提供三次纯化的菌株重新进行鉴定。 4．为什么有时会出现PCR扩增不出的现象； 答：扩增不出的原因主要有以下几种： 1、您提供的菌种从严格意义上讲不是细菌或者真菌，或者是信息有误； 2、您提供的菌种为革兰氏阳性菌，由于细胞壁较厚，采用常规方法不能有效地破壁； 3、培养基或菌体中表达产物含有抑制PCR产物的组份。 对于第二种或第三种情况需要提供基因组DNA。 5．PCR扩增直接测序为什么会出现套峰的现象； 答：1、测序结果个别碱基出现N，是由细菌rDNA多态性造成，对菌种鉴定没有无影响； 2、所有测序反应均出现大面积套峰，是由于您提供的样品模版不纯造成的。这种情况需要重新纯化菌种。 6．PCR产物克隆测序为什么会出现结果分离的现象？ 答：我们以菌种为模版直接进行PCR扩增，然后对PCR产物进行克隆测序，如果出现2种或以上的测序结果，说明您提供的模版不单一，即菌种不纯，含有其他杂菌，这种情况建议您将菌种重新进行三次以上纯化。 7．菌种鉴定可以鉴定到种吗？ 答：利用rRNA的保守区域进行鉴定只是菌种鉴定的一个分子生物学指标，通过鉴定结果可以了解未知菌株和NCBI公布序列的哪个种属比较接近。
检验科实验室安全管理制度和流程图
检验科实验室安全管理制度和流程 一、目的：规范临床实验室的安全管理。 二、适用范围：检验科实验室和工作人员安全的一般要求.防火、用电、化学危险物品、微生物的安全要求.以保证检验科实验室的安全运作.将事故控制在最低限度。 三、安全管理流程： 1 工作人员和实验室安全的一般要求 1.1 实验室工作区内绝对禁止吸烟 点燃的香烟是易燃液体的潜在火种；香烟、雪茄或烟斗都是传染细菌和接触毒物的途径。 1.2 食物应放置在允许进食、喝水的休息区内 实验工作区内不得有食物、饮料,实验室工作区内的冰箱禁止存放食物。 1.3 实验工作区内禁止使用化妆品或进行化妆.但建议经常洗手的实验人员使用护手霜。 1.4 眼睛和面部的防护 处理腐蚀性或毒性物质时.须使用安全镜或其它保护眼睛和面部的防护用品。使用、处理能够通过粘膜和皮肤感染的试剂.或有可能发生试剂溅溢的情况时.必须佩带护目镜、面罩或面具式呼吸器。 1.5 服装和个人防护装备
除要求符合实验室工作需要的着装外.工作服应干净、整洁。所有人员在各自实验区内必须穿着长身的工作服 （白大褂）并佩戴其它防护装备如：手套、护目镜、披肩 或面罩等。个人防护服装应定期更换以保持清洁.遇被危险 物品严重污染.则应立即更换。 1.6 鞋 在各工作区内.应穿舒适、防滑、软底并能保护整个脚 面的鞋。在有可能发生液体溅溢的工作岗位.可加套一次性 防渗漏鞋套。 1.7 洗手 实验室工作人员在脱下手套后、离开实验室前、接触 患者前后、以及在进食或吸烟前都应该洗手。接触血液、 体液或其它污染物时.应立即洗手。 1.8 眼睛冲洗 眼睛若被血液或其它体液溅到.立即用大量的生理盐水 冲洗。 1.9 移液 所有实验室操作禁止用口移液具.应使用助吸器。 1.10 锐利物品 谨慎处理针头和碎玻璃等锐利物品。使用后的针具不 要折断、弯曲、破损、重复使用或用手重装在针管上的。 一次性注射器上的针头用后不要取下.锐利物品应立即放置 在不易刺破的容器内.在完全装满之前就应及时丢弃。 1.11 工作环境
细菌培养基的制作培养和鉴定
细菌培养基的制作及细菌的培养和鉴定 (杭州师范大学临床医学09级) [摘要]：目的：掌握细菌的细菌的培养基制作、高压蒸汽灭菌法的使用、细菌的接种法（无菌操作技术）、细菌的形态学检查法、细菌的培养物观察、肠道杆菌的生化反应、分离与鉴定模拟粪便7种生化反应结果观察、细菌的药敏试验、紫外线杀菌试验等一些基本的实验操作。 [关键词]：培养基;SS培养基; EMB平板;药敏试验; 细菌培养基的制作及细菌的培养和鉴定是我们做微生物实验的基础，细菌培养基的制作，高压蒸汽灭菌法的使用、细菌的接种法（无菌操作技术）、细菌的形态学检查法、细菌的培养物观察、肠道杆菌的生化反应、分离与鉴定模拟粪便7种生化反应结果观察、细菌的药敏试验、紫外线杀菌试验等一系列实验都是基本的微生物实验操作，掌握这些基本技巧对微生物的实验研究有着至关重要的地位，培养基是细胞生长的基础，高压蒸汽灭菌保证了培养基的绝对灭菌，细菌的形态学检查可以区别有无鞭毛，7种生化反应结果观察可以区别不同的细菌。 1.细菌的培养基制作 培养基是按微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质人工配制而成的营养基质。 我组主要制作平板（大小平板）培养基的制作。 1.1平普通板培养基: 用途：细菌的分离培养、药敏试验等 配方：按试剂瓶（营养琼脂培养基）说明配制。 操作： 1. 配制600ml 1000ml的三角烧瓶→高压灭菌→倒30块大平板，约20ml/块。
2. 配制500ml×2=1000ml，分2瓶配制 1000ml的三角烧瓶→高压灭菌→倒60块小平板，约15ml/块。 图1：普通平板培养基 1.2 SS培养基： 用途：用于沙门菌属、志贺氏菌的选择性分离培养。 配方：肉膏汤琼脂100ml 乳糖1克胆盐0.85克枸橼酸钠0.85克硫代硫酸钠0.85克10%枸橼酸铁水溶液1ml 1%中性红水溶液0.25ml 1%煌绿水溶液0.033ml 操作： 除了煌绿、中性红以外，将其他各成分混合均匀，加热熔化，调ph至7.0，再加入煌绿和中性红，分装于三角烧瓶中，以68.95kpa高压灭菌10分钟，待冷至50℃左右，倾注于无菌平板中，冷后备用。 :图2：SS培养基
感染处理流程图
附件34-1 手术部位感染监测规范及操作流程 涂片白细胞- 涂片白细胞+ 阴性 阳性 登记线索：交班本、手术记录、 医嘱单、麻醉单 发热T ＞38℃；切口发红，有分泌物；切口敷料有脓液、脓血渗透；提前拆线引流；术后24小时后仍用抗菌药物；医生诊断切口感染（临床诊断） 标本采样（涂片、培养） 住院期间无感染症状 手术结束后，医院感染监控人员到病房 填写手术病人登记表，观察切口情况，查阅病历、询问医师，观察换药情况 术后随访30天（有植入物者 手术随访1年） 目标监测人群-接受以下手术的住院患者： 1.胆囊切除或和胆管手术 2.结肠、直肠切除术 3.阑尾切除术 4.疝手术 5.乳房切除术 6.剖宫产等 7.子宫切除术附件切除术 8.全髋置换术 未找到病原菌 找到病原菌 无切口感染 随访结果 a ．1～2位医院感染监控专职人员每日安排固定时间到目标监测病房收集登记数据，与科室负责监测工作的医护人员进行交流，并密切观察与感染有关的因素：体温、敷料、切口外观、应用抗菌药物、切口引流。 b ．目标监测科室负责护士（每个目标科室培养3位）协助提供手术患者的情况、手术数据的登记、患者入出院宣教。 c.患者入院时登记出院后的联系方式，手术后填写登记表时核对电话号码并 告知出院后注意事项，手术后一月左右电话询问切口愈合情况。 d.随时干预监测中存在的问题，对出院病历资料进行完善。 怀疑感染 实验室诊断 做好记录 通知医院感染 监控专职人员 到医院就诊
附件34-2 呼吸机相关肺炎监测流程 1、住ICU 超过48小时，转出ICU48h 小时内 2、有呼吸道感染症状，如咳嗽、咳脓痰、痰多、肺部听诊有罗音 3、有全身感染的症状，如体温上升，白细胞上升或下降 临床医师填写相关检查和检验申请，如痰培养、胸部X 线检查、血常规 或血培养，并做好病程记录。ICU 护士填写ICU 患者日志 痰培养采集方法：ICU 护士戴无菌手套，按吸痰方法将痰吸入无菌集痰器内，加盖送检，或是按照吸痰法无菌抽吸痰液送检 临床医师根据患者症状、体征、实验室报告及胸部X 线检查结果判断是否为呼吸机相关肺炎（VAP ） 每3个月小结，得出呼吸机使用率及其相关肺炎感染率，找出不足及时 改正，并召开座谈会与科室进行交流，给予合理建议 如果是VAP ，根据微生物学监测结果选择用抗菌药物，并通知医院感染监控专职人员，做好病程记录 1～2位医院感染监控专职人员每周2～3次到ICU 收集登记数据，同时观 察与感染有关的因素 住进ICU 使用了呼吸机的患者
病原细菌的分离与鉴定
病原细菌的分离与鉴定.txt24生活如海，宽容作舟，泛舟于海，方知海之宽阔；生活如山，宽容为径，循径登山，方知山之高大；生活如歌，宽容是曲，和曲而歌，方知歌之动听。病原细菌的分离与鉴定 发布日期：2009-05-09 浏览次数：827 字号：[ 大中小 ] 一、实验目的 系统学习兽医临床病原细菌的分离与鉴定技术，促进学生系统掌握各类病原细菌的基本特性与实验诊断技术，增强学生应用所学知识解决生产实践过程中的传染病的诊断和防控问题的能力，为预防、控制和消灭畜禽病原微生物，保障畜牧业生产的健康发展服务。 二、知识背景 细菌分离是细菌学检验中的极其重要的环节。正确的分离有助于很快得到可疑的致病菌，对疫病的诊断与防控至关重要。在细菌分离时应注意的事项： 1．病料采集 （1）病料的种类主要决定于疫病的性质，一般方法为： ①全身感染→血液及内脏； ②局部感染→病患部位； ③特殊病例→特殊处理。特殊情况的正确处理与操作者的专业知识有很大关系。无论全身或局部感染，均应采含菌最多或病变明显的组织 （2）病料的采集时间也应特别注意： ①活体病料→应考虑病原在疾病发展过程中部位的变化； ②患畜死后→应立即采集病料，越早越好。 2．无菌操作 无菌操作是指在微生物研究过程中，既要避免各种外界的微生物进入操作对象又要杜绝操作对象污染周围环境的操作技术。 无菌操作是对微生物学工作者最基本的要求，必须经过严格训练才能形成无菌操作素养。不论何种情况下，头脑中都应该有这个概念。 无菌操作贯穿于整个分离过程，例如：病料的采集、器材的准备、具体的操作。所用器械及物品均应事先灭菌备用，金属器具包装后高压灭菌或煮沸30min，玻璃器皿可高压灭菌也可
菌种保藏中的细菌鉴定方法
菌种保藏中的细菌鉴定方法 作为科研生产中最重要的基础性资源—菌毒种,其收集、保藏及相关的研究工作在我国正处于整理、整合以及全方面逐步正规化阶段.2003年7月23日,科技部在北京召开了“国家科技基础条件平台建设”部际联席会和专家顾问组成立大会,正式启动了国家科技基础条件平台建设工作.国家自然科技资源共享平台建设作为其中的一个重要组成部分同步启动.作为该项8的一个重要组成部分,微生物菌种资源整理、整合工作同期启动,在此项工作中,中国兽医药品监察所承担了兽医微生物资源整理、整合工作.本所在行业内发展了数家加盟单位,在整理、整合菌种资源的过程中遇到了一些实验室细菌鉴定结果出现偏差的问题.经分析调查,多是由于实验室人员结构以及实验室的硬件水平差别较大等原因,造成实验室间鉴定能力的参差不齐,致使鉴定项目完成情况不尽相同,细菌鉴定结果出现偏差. 细菌鉴定是指将分离培养获得的病原菌,通过纯化培养使其达到不含有其他微生物的纯培养程度,继而进行系统鉴定.而菌种保藏机构在收集一些已经冻干的菌种时,应在开启后经过两代的适应性培养方可进行复核性的系统鉴定.系统鉴定是通过细菌的形态结构、生长特性、抗原性、病原性以及目前流行的核酸测定方法等检测,并用已知标准免疫血清确定分离细菌的属、种和型(群).目前菌种保藏机构通常使用的细菌鉴定方法大致有以下几种: 1、传统方法 常规宏观菌落形态学观察,主要观察菌落在其适合的培养基上的生长状况:细菌在固体培养基上的生长形态、大小、颜色是否均匀一致,菌落个体表面及边缘的生长状况;在液体培养基上的浑浊状况、沉淀状况、液面菌膜状况;半固体上穿刺接种后,观察细菌是否沿着接种线生长以及其生长状态是呈毛刷样生长还是均匀生长,上下生长是否一致.在鉴别培养基上培养,观察结果是否跟预期结果相同. 细菌的个体形态学观察,即通过显微镜观察.观察前细菌需要着色,要根据预先确定的观
细菌鉴定流程
细菌鉴定流程 细菌鉴定 细菌形态学鉴定16S rDNA 鉴定生理生化鉴定 一、细菌形态学鉴定 1.从-80??冰箱中取出菌株放4??复苏，轻柔混匀后用接种环接一环 菌液在培养基平板上划线活化，根据菌株来源选择适宜的培养基。 2.放入培养箱倒置培养，实验室一般采用28??培养，特殊菌株依据 该菌最适条件（时间、温度）培养24-48h。 3. 纯化：从活化培养基平板上挑取单菌落继续划板培养。 4. 观察记录菌落形态特征：大小（mm）、形状、干湿、透明度、颜色、边缘整齐还是，，，，，，， 形状干湿透明度颜色边缘细菌大小 （mm） 注意事项： ①接种划线应在酒精灯旁边操作 ②培养时应倒置培养，防止污染
二、革兰氏染色 1.涂片固定 将纯化后的菌株进行革兰氏染色，滴一滴生理盐水于载玻片上，无菌条件下用接种环挑取少量菌落均匀涂布水滴中，使其自然干燥，菌面向上，经火焰固定。 注意事项：菌液涂片时不可过于浓厚，干燥、固定。固定时通过火焰1~2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2.染色 一般包括初染、没染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：（1）加上结晶紫后，染色1分钟，水洗。 （2）加上碘液染色1分钟，水洗。 （3）加上95%酒精，摇动玻片，根据涂片厚度，脱色约20~60秒，水洗，吸去水分。 （4）加上蕃红后，染色1分钟，水洗。 （5）吸干或在空气中晾干后，油镜镜检。 3.结果观察：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以均匀 分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，都常呈现假阳性。 注意事项： ①标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不再出现紫色为止。 ②玻片通过火焰温度不能太高。
细菌分离及鉴定的实验方案
从土壤里分离及鉴定细菌的实验方案 1实验材料：新鲜土壤。 a)培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；高氏一号培养基；马铃薯蔗糖培养基； 细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培 养基；LB培养基 b)试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95% 乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等 c)仪器：有玻璃珠100ml三角瓶（1）、培养皿（50套）、试管（20支）、移液 管（3支）、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U 型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无 菌操作台、灭菌锅、纱布，电子天平、记号笔，火材等 相关培养基的配方:
1.1实验总流程 1土壤取样：
2制备土壤稀释液： 2.1. 称取土壤1g，放入99mL无菌水的三角瓶中，振荡20min，即为稀释10-2的土壤悬液。 2.2. 另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔分别编上10-3、10-－4、10-5、10-6。取已稀释成10-2的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10-3的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10-3土壤稀释液。同法依次连续稀释至10-4、10-5 、10-6,10-7土壤稀释液。 在土壤稀释过程中，需换用不同的吸管（或枪头） 3倒平板富集培养 3.1 按照配方分别在三种培养基上富集培养，每一个稀释梯度每一个培养做三个平行实验。 3.2吸取稀释液 取一吸管，以无菌操作法分别吸取10-4、10-5、10-6,10-7土壤稀释液0.1mL，加在已制好的平板培养基上。 3.3涂板 用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，倒置于恒温箱培养。 3.4计算出每克土壤中细菌的数量。 细菌数=某一培养皿内真菌的菌落数×该培养皿接种液的稀释倍数即得 4分离 4.1配置LB培养基