亲和层析标准操作规程

亲和层析标准操作规程

一、样品准备

1.制备血清-20℃或-80℃备用

2.制备相应菌株500ml，福尔马林固定，PBS洗三次

3.血清1-2ml与细菌反应于4℃作用4小时，血清与细菌的比例为2:1，期间每

30分钟重悬一次。

4.Spindowm 2000-3000 RPM作用10min，上清液冷冻保存。沉淀装于50ml 离心

管，用PBST洗三次。

5.洗脱，洗脱液收集比较。最后一次用D.W洗脱。

6.倾去上清，振摇菌块，加1-2ml 洗脱液室温10分钟后离心。

7.2500 rpm 收集上清加1/10-2/10 中和液，重悬于1-2 ml

8.洗脱液10分钟。保存于-20℃。bsa 1-2%, 叠氮钠1.5‰

注：洗脱液：0.2 N Glysis-HCl PH 2.5

中和液: 1.0 N Tris-HCl PH 8.5

二、抗体交联物的准备

mouse anti eel IgM monoclonal antibody 6G10（IgG1）、9D12（IgG1）腹水

50%SAS沉淀，PBS重悬，0.1M NaCO3(pH8.3) CB 4℃透析36小时，换液3次，500ml / 次

测定蛋白浓度

三、Sepharose 4B的准备

1. 称取CNBr活化的Sepharose 4B 1.5g

2. 100ml左右1mM HCl（pH2-3, 2.5）浸泡15min（胶膨胀3倍左右）

3. 稠布抽滤，弃去液体

4. 1mM HCl抽滤洗涤2次，每次50ml

5. 0.1M NaHCO3 (pH8.3) CB洗胶2次，每次50ml

6. 干净药匙刮到50ml玻璃离心管

三、交联

1.快速加入用0.1M NaHCO3平衡（透析）的交联物Mab——按5-10mg per gram

湿胶-------25~30mg Protein(3~4ml Ascites antibody)

2.（留下少量Protein用于测定结合率）

3.室温轻轻搅拌2 hr——摇床（4℃过夜也可以）

4.2000RPM 离心10 min——用30ml CB洗胶————收集上清备用

四、封闭多余活性位点

1.加入10倍体积(50ml) 的1M pH8.0乙醇胺(use HCl adjust pH)，室温温和搅拌

2 hr，

2.用30ml含0.5M NaCl 的0.01M PBS (hight salt) 洗胶2次，收集上清——合并

测定蛋白浓度，计算偶联率。

3.装柱，用不含盐PBS（加入NaN3至0.01%）———可以4℃保存几个月。

五、上样洗脱

1.20倍体积PBS (hight salt) 平衡后即可上样

2.上样（体积可达1/2柱体积）4℃缓慢多次加样——或泵控制流速2ml/h

3.PBS (Low salt) 沿柱内壁流下，洗涤柱顶部3次。

4.PBS (Low salt) 洗柱，开始流速慢，2ml/min，当色层移至柱底部时，提高流速

至10ml/min，直至OD280<0.02（检测不到蛋白）蒸馏水洗涤过渡（可以不用）

5.酸洗脱：0.1M pH2.4 GBS洗脱（2.5-2.8）,流速2ml / min

6.1ml/管分部收集protein阳性部分or阴性部分, 立即加入1 M Trise-buffer

(pH9.0)调节pH值至6.8—7.2。1 Mol/L Trise-buffer添加量通过预实验确定。

也可以每管预加1/3 GBS洗脱体积的0.5M K2HPO4（pH 8.0）调节pH到7.0。

7.碱洗脱：0.05M 乙二胺（DIETHYMINE）含0.15M NaCl ，pH 11.0作为洗脱

液。可以每管预加3/10洗脱体积的1.0 M Tris-Cl（pH 6.85）调节pH到7.2。

8.合并阳性管，根据需要对目的蛋白进行后续处理。

9.样品浓缩（对于病毒样品，NS稀释后40000RPM离心2-3hr蛋白样品可以蔗

糖透析处理）

10.纯度鉴定