毒性试验整理
实验一发光细菌的急性毒性评价试验
一、实验器材
1.菌株
明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）
2.培养基
酵母膏0.5%，胰蛋白胨或多聚蛋白胨（Polypetone）0.5%，甘油0.3%，NaCl 3%，Na2HPO4 0.5%, KH2PO4 0.1%，pH6.5。固体培养基再加琼脂2%。
3.溶液、试剂及待测物质
酵母粉，蛋白胨，NaCl（AR），Na2HPO4（AR），KH2PO4（AR），甘油（AR），二甲基亚砜（AR），乙酸乙酯（AR），HCl（1M），去离子水。
4.仪器及其他用品
生物毒性测试仪；电热恒温鼓风干燥箱；振荡培养箱；DELTA 320pH计；氮吹仪；镊子，移液枪，三角锥形瓶等。
二、目的要求
1.学习了解发光细菌的急性毒性评价试验的基本原理。
2.掌握发光细菌的急性毒性评价试验的操作要领和评价方法。
三、基本原理
发光细菌是指在正常的生理条件下能够发射肉眼可见的蓝绿色荧光的细菌，这种可见荧光波长在450-490 nm之间，在黑暗处肉眼可见。不同种类发光细菌的发光机理是相同的，都是由特异性的荧光酶(LE)，还原性的黄素(FMNH2)，八碳以上长链脂肪醛(RCHO)，氧分子(O2)所参与的复杂反应，大致历程如下：
FMNH2+LE→FMNH2·LE+O2→LE·FMNH2·O2+RCH→LE·FMNH2·O2·RCHO→LE+FMN+ H2O+RCOOH+光
具体来说，生物发光反应由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为FMN及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为
407-409 nm处的蓝绿光。
发光细菌法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响。发光细菌含有荧光素、荧光酶、ATP等发光要素，在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微弱荧光。当细胞活性升高，处于积极分裂状态时，其ATP含量高，发光强度增强。发光细菌在毒物作用下，细胞活性下降，ATP含量水平下降，导致发光细菌发光强度的降低。实验显示，毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系，因而，可以根据发光细菌发光强度判断毒物毒性大小，用发光度表征毒物所在环境的急性毒性。
四、操作步骤
1. 待测样品处理
1) 萃取
将降解后的培养液组(样品，30 mL)用等体积的乙酸乙酯萃取四次，前两次不酸化，后两次需用HCl酸化（浓盐酸，一滴，约0.2 mL）。步骤如下：先加一滴浓盐酸（如需酸化），再加入30 mL乙酸乙酯，将锥形瓶用封口膜及报纸封口，放入摇床摇30分钟，取出，将上清液与下层液体分离，继续进行下一次，上清液即我们所需样品。
2）氮吹
四次萃取液合并后，摇匀，并取10 mL的萃取液于试管内在40℃下氮吹至乙酸乙酯挥发干净，并放入-20℃冰箱待用。
2.培养基的配置以及发光细菌的培养
配置培养基所需试剂及剂量如下表所示：
培养基成分培养基含量（g/L）
酵母粉 5
蛋白胨 5
NaCl 30
Na2HPO4 5
KH2PO4 1
甘油 3
培养基为100 mL，按上表加入各成分后，需将pH调整至7.2，发光细菌的接种量为10%，培养温度为18℃，需放置在150 rpm的暗摇床中，培养18-20个小时后达到发光细菌的稳定生长期，即可以进行毒性评价使用。
接种：接种前，配置好的培养基应放入灭菌锅内灭菌，灭菌结束后，取出放入无菌操作台内冷却至室温，同时无菌操作台用紫外灯消毒15分钟，消毒完成后打开通风，点燃酒精灯（一切操作要在酒精灯边完成），将培养基封口膜打开约三分之二，然后将原本保存在冰箱内的装在EP管内的发光细菌用移液枪移入培养基内，即可，随后放入暗摇床内培养。
3.利用发光细菌进行毒性评价
在冷藏的样品中加入2.5 mL配置好的2%DMSO和98%的3%NaCl混合溶液进行溶解，由于样品是放在-20℃的冰箱内保存，氮吹后的样品较难以溶解，故可以在60℃的水浴锅内进行水浴10分钟。
用配置好的DMSO和NaCl混合溶液(98%的3%NaCl和2%的DMSO)调节发光细菌溶液浓度，使其（空白样）发光度在800-1200范围内，然后即可测定样品的发光度：在溶解了的2.5
mL样品中取0.2 mL于小试管中，并加入1.8 mL的DMSO和NaCl混合溶液，再加入200 μL可供检测的菌液，摇匀，静置5 min后测定并记录结果。每个样品做3组平行样，得出的结果取平均值，作图，得到结果。
4.数据处理与分析方法
相对发光率(%)=样品发光强度*100%/对照发光强度
实验二蚕豆微核率检测实验
一、实验器材
4.实验对象
松滋蚕豆（Vicia faba）
5.溶液、试剂及待测物质
5mol/L HCl溶液；
卡然诺氏溶液：无水乙醇（或95%乙醇）：冰醋酸3:1，需现配现用；
Shiff试剂：0.5g碱性品红加100ml蒸馏水于三角烧瓶中煮沸5min，并不断搅拌使之溶解。冷却到58℃时，过滤于棕色试剂瓶中，待滤液冷却至25℃时再加入10ml 1mol/L HCl 和1g Na2S2O5（或K2S2O5）充分振荡使其溶解。塞紧瓶塞用黑纸包好，置暗处24h后，检查染色液，若透明无色即可使用。可将其置于4℃冰箱保存，若出现沉淀则不能继续使用；
SO2洗涤液：现配现用，取10% Na2S2O5（或10%K2S2O5）溶液5ml，加1mol/L HCl溶液5ml，再加100ml蒸馏水配置而成。
4.仪器及其他用品
显微镜，解剖盘，培养皿，尼龙纱布等。
二、目的要求
1.学习了解蚕豆微核率检测实验的基本原理。
2.掌握蚕豆微核率检测实验的操作要领和评价方法。
三、基本原理
蚕豆根尖细胞在分裂时，染色体要进行复制，在染色体的复制过程中常发生断裂，断裂下来的断片在正常情况下能自行复位愈合，这样细胞可以维持正常生活。如果在细胞分裂是受到外界诱变因子的作用，不仅会阻碍染色体片段的愈合，而且有随因子作用使断裂程度加重的趋势，于是在细胞分裂中会出现一些染色体片段，这些片段由于不具有着丝点而不受纺锤丝牵引，游离在细胞质中。当新的细胞核形成时，这些片段就独自形成大小不等的小核，即微核。由于产生的微核数量与外界诱变因子的强弱成正比，所以可以利用微核率来表观环境中毒性物质的毒理情况，如：多环芳烃的影响程度。
四、操作步骤
1.浸种
松滋青皮豆种子于自来水（或蒸馏水）25℃温箱26 h-30 h，期间至少换水2次（水事
先置于25℃中）
2.催芽
待种子吸胀后，用纱布包裹与解剖盘内，保持湿度，25℃催芽12h-24h。待初生根露出2-3mm，再选取发芽良好的种子放入尼龙纱网中并将其放入盛有自来水（蒸馏水）的解剖盘中，使根尖与水接触，仍置于25℃温箱继续催芽，每天换水，经36h-48h初生根至2-3cm 时，选择粗细，长短一致且发育良好的种子用于检测。
3.染毒
每组6-8粒，放入盛有被测液的培养皿中，根据文献报道，可设置待检液的浓度梯度及对照组。用被测液浸泡根尖4-6h即可。
4.恢复
将处理的种子用自来水（蒸馏水）浸洗3次，每次2-3min。洗净后的种子再放入铺好脱脂棉的培养皿中25℃温箱恢复22-24h。
5.固定
将恢复后的种子从根尖顶端切下1cm的幼根放入烧杯中，加卡诺氏固定液固定24h（固定后的幼根若不及时制片可换入70%乙醇中4℃冰箱保存）。
6.染色
1）固定好的幼根用蒸馏水浸洗2次，每次5min。吸净蒸馏水后，再加5mol/L HCl浸泡，连瓶放入28℃水浴锅中水解幼根10min至幼根软化。
7.脱色
用蒸馏水浸洗幼根2次，每次5min。吸净蒸馏水后，在暗室或遮光条件下加shiff试剂，用量掩住幼根高出2mm为宜，4-6h。随后，再用SO2洗涤液浸洗幼根2次，每次5min，再用蒸馏水浸洗5min后将幼根放入新换的蒸馏水中4℃冰箱保存，供随时制片。
8.制片
将幼根放在干净的载玻片上，用解剖针截下1mm左右根尖，滴上少许45%的醋酸溶液，用解剖针将根尖捣碎后加上盖玻片，并在盖玻片上加一小块滤纸后轻轻敲打压片。
9.镜检
先置低倍镜下找到分生组织区且细胞分散均匀，膨大，分裂相较多的的视野，再换高倍镜（物镜40×）下观察。
实验三单细胞凝胶电泳（彗星实验）实验
一、实验器材
1.细胞
K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
2.培养基
培养基：10％新生牛血清，90％RPMI-1640培养液；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；Triton X-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。
3.溶液、试剂及待测物质
Tris-HCl (pH7.5) 缓冲液或双蒸水，溴化乙锭，生化试剂均为分析纯。
4.仪器及其他用品
电泳仪；电泳槽；显微镜；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.2，
https://www.wendangku.net/doc/1c3211161.html,/index.php下载)
二、目的要求
1.学习了解彗星实验的基本原理。
2.掌握彗星实验的操作要领和评价方法。
三、基本原理
彗星实验(Comet assay)，又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE)，
各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可在单细胞水平灵敏、快速地检测DNA 损伤。可用该方法检测，并在统计学基础上对损伤程度做出评估。
本实验对受类重金属，重金属及有机污染物等污染的实际场地的提取水样进行细胞培养，诱导K562细胞DNA损伤，用彗星实验检测损伤程度，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标来评价污染样的毒理特征。
四、操作步骤
1. 各种培养的K562细胞用冰冷的PBS 洗1~2次，离心收集，用PBS 0.3 ml重悬，密度为1×105-6个/ml。
2. 铺胶
下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS 配制：
第1层凝胶的制备：用微波炉加热溶解正常熔点琼脂糖(NMA)，再冷至45～60℃，取
适量（100μL~1ml）铺于载玻片上，立即盖上干净盖玻片，再置4℃下至少30min 使NMA 凝固。也可以先铺胶，晾干后无尘存放，1周内使用。
第2层凝胶的制备: 低熔点琼脂糖LMA在微波炉中加热使之完全溶化，冷至37℃（可以放置于细胞培养箱中或水浴箱冷却至37℃，低熔点琼脂糖LMA在37℃可维持3小时）。移去盖玻片，将20μL 细胞悬液和75μL的LMA 混合均匀,然后，迅速将适量含细胞的LMA 滴到第1 层琼脂糖上，立即盖上干净盖玻片，置4℃30min 使第2 层LMA 凝固。注意，使用盖玻片的目的是使琼脂糖平整，显微镜下方便观察。
3. 细胞裂解
移去盖玻片，将载玻片置于平皿中，轻轻加入预冷的新鲜配置的细胞裂解混合液(PH 10.0)。4℃下裂解1~3h或过夜。取出载玻片用蒸馏水漂洗2次，要求动作轻柔，以免琼脂糖脱落。
4. DNA 碱解旋
将载玻片置于水平电泳槽正极端，并列放置，不留空隙。倒入新配制的电泳缓冲液约覆过载玻片胶面0.25cm 左右，室温放置20~40min，以便使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段，使DNA 断链在电场中易于迁移。
5. 细胞电泳
稳压25V，稳流300ｍＡ，电压、电流可用改变缓冲液面高低来调节，电泳时间为
20~30min。
6. 漂洗
电泳后将载玻片置于平皿内，缓缓沿壁加入0.4mmol/L Tris-HCl (pH7.5) 缓冲液或双蒸水，漂洗2次，每次5~15min，弃去Tris-HCl或双蒸水，使用PBS洗干净，并用滤纸吸干水分。（再缓缓加入无水乙醇将凝胶浸埋脱水10 min~1h之后，吸去乙醇，自然凉干或室温下过夜。）
7. 染色
每张载玻片加2~3滴染色剂（常用30 l溴化乙锭溶液染色），盖上盖玻片（也可以不盖上），避光染色20min。盖上盖玻片的目的是可以隔日分析，或便于操作。
8. 观察、拍照和统计学分析
荧光显微镜515~560nm （绿光）波长的激发光，可清楚地观察到核DNA和迁移的DNA （即慧星尾）。每个样本随机选择20~100 个细胞，图片保存后，用相应的软件分析结果。
实验四Ames突变和致癌试验
一、实验器材
6.菌株
鼠伤寒沙门氏菌TA98。
7.培养基
营养肉汤：牛肉膏0.5%，蛋白胨（Polypetone）1%，NaCl 1.5%，pH7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。
底层葡萄糖基本培养基平板：V ogel-Bonner 培养基E：MgSO4·7H2O 0.2 g，柠檬酸（C6H8O7·H2O）2.0 g，K2HPO4 10g，磷酸氢铵钠（NaHNPO4·4H2O）3.5 g，蒸馏水200mL，121℃高压蒸汽灭菌20min；配葡萄糖100 mL，121℃高压蒸汽灭菌30min；15 g琼脂粉加700 mL蒸馏水，121℃高压蒸汽灭菌20min。以上3种培养基分开灭菌后，80℃左右时2 L 的无菌三角烧瓶中混匀各组分，倒入每平皿约25 mL，冷凝后即成。
上层琼脂培养基试管：琼脂粉0.6 g，NaCl 0.5 g，蒸馏水100 mL，将上述各组分混合，加热溶化后再加入10 mL的0.5 mmol/L L-组氨酸+ 0.5 mmol/L D-生物素混合液（1.22 mg D-生物素、0.77 mg L-组氨酸溶于10 mL温热蒸馏水中即成），加热混匀后趁热分装入小试管，每管装2.5 mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。
8.溶液、试剂及待测物质
无菌水，4-硝基-o-苯二胺溶液（4-NOPD，10ug/uL），未知的可能致癌物溶液，从家里带来的待测物。
4.仪器及其他用品
培养箱；恒温水浴；振荡水浴摇床；压力蒸汽消毒器；干热烤箱；低温冰箱(-80℃) 或液氮生物容器；普通冰箱；天平(精密度0.1g和0.0001g)；混匀振荡器；匀浆器；菌落计数器；低温高速离心机；玻璃器皿等。
二、目的要求
1.学习了解Ames突变毒性评价试验的基本原理。
2.掌握Ames突变毒性评价试验的操作要领和评价方法。
三、基本原理
Ames氏试验又称鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体试验，它是由Bruce Ames 在美国加利福利尼利亚大学建立的。这种试验是目前国内外公认并首选地一种检测环境致突变物的短
期生物学试验方法，其阳性结果与致癌物吻合率高达83%。一旦测出某种物质能引起突变，可将这种物质用于动物试验，以确证其致癌性。
Ames氏试验是利用鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型（his-）菌株发生突变的性能来检测待测物的致突变率；让试验菌株在缺乏组氨酸的的培养基上培养并接触待测物，然后测定这种培养基上长成的原养型（his+）菌落数。
本实验使用的是鼠伤寒沙门氏菌TA98。这一菌株不但是组氨酸缺陷型，还缺乏DNA 修复酶，可防止DNA损伤的正确修复。以往的试验中还要加入脯乳动物肝微粒体酶系，使待测物活化，表现出致癌活性。本实验省略了这一酶系的加入，因其制备条件要求较高。本实验在没有加入酶系的情况下，用4-硝基-o-苯二胺作为阳性对照物，采用点试法，也会取得良好的效果。
四、操作步骤
1. 试验菌液的制备
挑取适量菌种于盛有10mL营养肉汤的小三角烧瓶中，37℃振荡培养10~12h，菌液浓度要求达到（1~2）×109/mL。（菌液浓度的判断可参照多次活菌计数及在650nm波长下册其透光率，以透光率作为菌液浓度参数。试验菌液符合要求后应尽快投入试验。）
2.点试法致突变性试验
（1）取4套葡萄糖基本培养基平板，在背面分别作阳性对照、阴性对照、未知的可能致癌物和任选的标记。
（2）液化4支上层琼脂培养基，并冷却到45℃。
（3）用一支1 mL吸管吸取0.1mL试验菌液，放入一支在45℃保温的上层琼脂培养基试管。（4）用振荡混合器混匀3 s，或用两个手掌搓匀，迅速倒在阳性对照的葡萄糖基本培养基平板上，使它铺满底层。
（5）重复如上（3）和（4）步骤，分别将其余3管的内含物倒在底层平板上。
（6）用镊子吧无菌滤纸圆片垂直放在阳性对照平板的中心附近（镊子头要蘸乙醇，过火燃烧灭菌）。
（7）用以无菌滴管吸取4-硝基-o-苯二胺溶液慢慢从滤纸圆片上方放入，让其饱和为止。然后将圆片放平。
（8）如上操作，把无菌滤纸圆片放入阳性对照平板的中心附近。用无菌水打湿滤纸圆片，然后将圆片放平。
（9）如上操作，把圆片放入未知的可能致癌物平板。用未知的可能的致癌物溶液浸润圆片，然后将圆片放平。
（10）在第4套任选平板上，如上操作，放一滴从家里带来的待测物溶液到圆片上，然后将
圆片放平。如果待测物为结晶体，可直接放少许到平板中心。
（11）将如上制得的4套平板放入37℃恒温箱，保温培养2d。
3.观察评价结果
凡在点试法圆片周围长出一圈密集可见的his+会变菌落者，即可初步认为待测物为致突变无。如没有或只有少数菌落出现，则为阴性。菌落密集圈外出现的散在大菌落是自发突变的结果，与待测物无关。
观察结果时，一定要见到试验平板琼脂表面his+回复突变菌落下有一层菌苔背衬，方可确定为his+回变菌落。这是上层培养基中所含微量组氨酸使his-菌株细胞生长分裂数次所形成的。诱变作用的发生需要这种生长。
实验五半致死浓度毒性评价实验
一、实验器材
1.对象
赤子爱胜蚓（Eisenia foetide）
2.仪器及其他用品
可控环境生长箱，硬质玻璃培养皿，1 L标本瓶，无灰定性滤纸等。
二、目的要求
1.学习了解半致死浓度毒性评价实验的基本原理。
2.掌握半致死浓度毒性评价实验的操作要领和评价方法。
三、基本原理
半致死浓度是指在动物急性毒性试验中，使受试动物半数死亡的毒物浓度，用LC50表示。使受试动物半数死亡的毒物剂量，称为半数致死量，用LD50表示。是衡量存在于毒物对动物的毒性大小的重要参数。半数致死量（LD50）是药物、毒物及病原微生物等毒力水平的一个标志。它表示能使全部实验对象死亡半数的剂量或浓度。在比较各种污染物的毒性、不同种或不同发育阶段的动物对污染物的敏感性以及环境因素对毒性影响方面的研究中，都以LC50为依据。由于生物间存在个体差异性，因此LD50需用一批相当数量的实验对象进行实验方能测得。
测定LD50的方法很多，如目测机率单位法、直线回归法、累计法及序贯法等。由于寇氏法较常用，并有计算简便，结果较准确等特点。以浓度的常用对数为横坐标，死亡率的概率单位为纵坐标，通过回归方程，将时间点的半致死浓度（LC50）和95%的置信限采用寇氏法( Karber 氏法)求得:
lg LD50＝X K－d(∑P-0.5)
式中：X K——死亡率为100%组的对数剂量
d——对数组距
∑P——各组死亡率之和
当Pm >0.8或Pn < 0.2时可用下公式计算：
lg LD50＝X K－d(∑P
LC50的95%可信限：
∮= LD50 ± 4.5S㏒LD50·LD 50
S㏒LD50 ＝d√∑p（1-p）/（n-1）
式中：S ㏒LD50——㏒LD50的标准误
P——各组死亡率
n——每组动物数
四、操作步骤
1.预备实验
（1）摸索上下限：即用少量动物逐步摸索出使全部蚯蚓死亡的最小剂量（Dm）和一个蚯蚓也不死亡的最大剂量（Dn）。即：定出一个估计量，观察 2～3只蚯蚓的死亡情况。如全死，则降低剂量；如全不死，则加大剂量再行摸索，直到找出Pm=100%和Pn=0%的剂量，此两量分别为上下限。
（2）确定组数，组距及各组剂量
①组数：一般5～8组，可根据适宜的组距确定组数，如先确定5组，若组距过大，可再增加组数以缩小组距。有时也可根据动物死亡情况来决定增减组数。
②组距：指相邻两组剂量对数之差，常用“d”来表示。D不宜过大，因过大可使标准误增大；也不宜过小，因过小则组数增多，各组间死亡率重叠造成实验动物的浪费。组距大小主要取决于实验动物对被试因素的敏感性。敏感性大者，死亡率随剂量增加（或减少）而增加（或减少）的幅度大，组距可小些；反之，敏感性小者，死亡率随剂量变化的幅度小，则组距应大些。上下限之间的距离可作为敏感性大小的标志。距离大，说明敏感性小；距离小，则说明敏感性大。一般要求d应小于 0.155，多在 0.08～0.1之间。
③确定组距方法：把上下限的剂量换算成对数值，设上限剂量的对数值为 X
K
，下限剂
量的对数值为X
1，组数为G，则：d＝（X
K
-X
1
）/（G-1）
④确定各组剂量：由X
1逐次加d（或由X
K
）逐次减d），得出各组剂量的对数值，再分
别查反对数，即得出各组剂量（呈等比级数排列）。
（3）配制等比药液，并使每只蚯蚓在给药容量上相等（如 0.5ml/20g ）。
2.正式实验
（1）实验蚯蚓分组
分组原则：每组蚯蚓数必须多于组数。因为每组动物数如少于组数，就不能充分反映各组死亡率的差别。（如共8组，每组10只蚯蚓，高剂量三个组的死亡数分别为6、9、10，但如果每组只用6只蚯蚓，则高剂量三个组的死亡数可能都是6。）
（2）给药、观察死亡数、求出死亡率
给药顺序：宜采取间隔跳组方法。如共7组，先按2、4、6 组顺序给药，然后逆行按7、 5、3、1组的顺序给药。这样可避免药物放置过久或动物饥饿造成的偏向性误差。而且当第3组给药后，如第2组动物已经全死，则可省下第1组动物及1号药液。如第7组
已死亡，可补做第8组，争取做出0%死亡率的组来。每只动物的给药容量可按个体体重或平均体重确定。
观察时间：直到动物不再因药物作用而死亡为止。在观察期间应注意保证食、水、温度等生活条件，严防非被试因素引起的死亡。
公司实验室管理制度(试行)
公司实验室管理制度（试行） 实验室是化验分析、科学研究和技术开发的重要基地，实验时要始终贯彻“安全第一”思想，确保人员和设备的安全。 1.管理目的 实验室仪器和设施是测试产品及各种材料物资性能和质量情况的基本工具，只有实验分析仪器设施的质量可靠，功能正常，正确使用，才能提供出准确、可告、真实的检测实验数据。所以公司必须加强对实验室仪器设施的规范管理，特制定本制度。 2.管理职责 实验室仪器、设施的管理由研发中心负责，其责任内容包括保管、使用、保养、检修、申请更新等各个环节的工作。公司技术员工在使用实验室、设备和仪器前需要在研发中心进行登记并身着实验服，研发中心负责对本次实验责任人的工作进行指导和管理，并按本制度规定的实施内容进行工作检查和考核。 3.精密仪器的管理 3.1 各种精密仪器（包括电子天平、紫外可见光分度计、GC-MS气质联用仪、 激光气体分析仪、大气重金属分析仪、颗粒物分析仪等）需保持环境清洁、安放安全稳固，并注意防尘、防震、防潮、防止阳光直接照射、防腐蚀和防止电炉高温热源的影响。 3.2 不得随意搬动拆卸、改装精密仪器，如确有需要必须上报主管领导同意， 并应作出相关的备查记录。 3.3 精密仪器的使用操作方法必须严格按说明书规定，使用完后必须清理干 净设备、仪器残留样品、试剂，并整理归位。实验无关人员不得随意拨动仪器旋钮，以免损坏仪器，也不得挪作它用。 3.4 精密仪器技术资料应作为技术档案妥善保管，并做好使用检修记录。非 常用的技术资料应统一存放公司研发中心保管。 4. 玻璃仪器及化验仪器用具的管理
4.1 滴定管、移液管、容量瓶等玻璃仪器须放在平稳不易摔落之处。 4.2 容量仪器的使用方法应严格按操作规定进行，以保证分析结果的准确度。 4.3带磨口塞的仪器（包括容量瓶、酸式滴定管、比色管、试剂瓶等）在清 洗前必须先作记号，塞口不能互混。带磨口塞的仪器长期不用时，磨口塞应垫一张纸片，磨口塞间若有沙粒时不能用力转动，磨口塞间不能用去污粉擦洗，以免损伤。 4.4 所有玻璃仪器在使用过程应特别注意轻拿轻放，防止破损。使用完毕后 必须洗干净，不要在容器内遗留油脂、酸、碱液等腐蚀性及毒性物质，并及时归回原位。滴定管、移液管等洗净后要用净滤纸包住两端，以防沾污。5. 实验设备(设施)的管理 5.1 所有的实验设备均应制定安全技术操作规程，严格要求操作者照章使用 设备，防范事故发生。 5.2 实验设备的配套电气设施如电源控制柜等如发生故障应通知相关专业人 员修理，非本专业操作者不得擅自处理，以防意外事故。 5.3 实验设备中的机械传动部位的润滑和维护等工作，应按设备动力科制定 的润滑控制点图表和检查维护部位，按时进行保养和检查。常见的一般故障由操作者排除，出现大故障应通知设备科安排解决。 5.4 实验设备使用后均要进行保养和场地清理，保持良好的实验环境，离开 实验室前必须检查设备开关断电情况，做好防火防电和防漏等安全事项。6. 实验仪器及设备的报废、更新管理 6.1 实验仪器（包括器具）和设备由公司各部门根据公司产品生产的需要， 统一进行计划管理，由各部门报出申购计划，经公司审核后统一规划安排采购，并在研发中心做好仪器、设备等进出情况记录。 6.2 仪器、设备的更新应遵循精度对口、选型先进、经济合理的原则。对有 特殊要求的仪器在购置时，实验室可派专人配合采购部门进行质量把关。 6.3 实验室应本着节约的原则，对能修复使用，又不影响测试工作精度的仪 器设备不能作报废更新上报。无法修复，失去使用价值的，也要报请上级部门组织鉴定方能作报废和淘汰更新处理。 7. 设备报废及事故的处理
亚慢性毒性试验
毒理学作业 农药2,4-滴钠盐原药为白色粉末，水溶性，表1是其对SD大鼠的急性经口试验结果，请根据表中结果，给出该农药的90天亚慢性试验的试验方案，以及如何对保证实验质量予以控制。 表1 2，4-滴钠盐原药对SD大鼠急性毒性实验结果 剂量设置高剂量为25%LD50，中剂量为12.5%, 低剂量为6.3%。 雌性LD50为584mg/kg，高剂量为146mg/kg,中剂量为73mg/kg,低剂量为37mg/kg；雄性为501mg/kg，高剂量为125mg/kg，63mg/kg,低剂量为31mg/kg。 根据GB15670《农药登记毒理学实验方法》的农药急性毒性分级标准，2，4-滴钠盐原药的LD50>500mg/kg，属于低度农药。因此试验时选择SD大鼠的LD50为584mg/kg。
农药2,4-滴钠盐原药SD大鼠亚慢性毒性试验 目的;研究喂饲农药2,4-滴钠盐原药对大鼠的亚慢性毒性。 方法：取初断乳SD大鼠80只，雌雄各半按照体重随机分为4组。将2,4-滴钠盐原药按146、73、37mg/kg mg/kg剂量分别拌入饲料经口喂饲染毒90d。 观察：大鼠外观体征、体质量、进食情况等。在实验中期和末期采血检测检测血液学。试验末期检测血生化指标以及尿常规检查。实验结束时处死实验动物，计算脏器指数，并对主要脏器进行病理组织学观察。 1 材料和方法 1.1 受试物 农药2,4-滴钠盐原药，白色粉末，水溶性，由某地某农药公司提供。SPF级初断乳大鼠80只，雌雄各半，体质量50~100 g，由XXX实验动物研究所繁育场提供，动物合格证号为医动字第XX-XXXX号。 1.2 饲养与管理 SPF 环境条件下，同组同性别两只一笼喂养，自由进食和饮水。环境温度21～25℃，相对湿度40%～60%。严格控制昼夜交替。 1.3实验方法 试验前将雌、雄大鼠各半按体重随机分为3个剂量组和1个对照组，每组20只，将2,4-滴钠盐原药按146、73、37mg/kg mg/kg剂量分别均匀混入饲料中制成颗粒饲料辐照灭菌后分别供高、中、低剂量组动物食用，连续每日一次喂养90d；对照组给予不加受试物的正常饲料。 1.4 观察指标 1.4.1一般情况 试验期间观察动物的一般情况包括外观体征和行为活动、粪便性状、食物摄入量及体重变化等。 1.4.2血常规 在实验中期和末期按常规方法测定血液学指标 1.4.3血液生化指标 试验末期检测血液生化指标 1.4.5尿常规检查 尿常规测定颜色、pH值、比重(SG)、尿糖(GLU)、尿蛋白，将尿液离心，并对尿中沉淀物进行镜检。 1.4.6脏器病理 解剖动物，取心、肝、脾、肺、肾、胃肠、肾上腺、胸腺、脑和卵巢、睾丸等脏器，观察大体变化并称重（胃肠除外），计算脏器指数[脏器质量/体重）×100%]。 将解剖取得的脏器福尔马林固定，常规制片，HE 染色，光学显微镜进行病理组织学检查。
长期毒性试验
长期毒性试验 药物毒性是否产生，取决于： a药物本身的理化特性b给药情况c如何被机体代谢 对一特定药物而言，最重要的影响毒性的因素： a给药途径b体内停留时间c给药频率 （影响靶组织的药物浓度） 1.半数有效量（ED50）：能引起50%的动物或实验标本产生反应的浓度或剂量。 2.半数致死量（LD50 ）：能引起50%的动物死亡的浓度或剂量。 3.治疗指数：TI= LD50/ ED50 药物实验动物的LD50和ED50的比值称为治疗指数（TI），用以表示药物的安全性。 4.安全范围：ED99~LD1（或ED95~LD5）之间的距离。值越大越安全。 ?有效量曲线和致死量曲线的斜率不一样时，以TI评价药物的安全性并不可靠。（原因？）六、药物毒性作用类别 药物不良反应（adverse reaction)：凡是不符合用药目的并为病人带来不适或痛苦的有害反应统称为药物不良反应。 包括：副反应、后遗效应、停药反应、毒性反应、变态反应、特异质反应、致癌性、致畸性、致突变性； （三)药物毒性临床前评价程序（三水平） 第一水平，急性毒性试验： 第二水平，长期毒性试验（第一阶段） 第三水平，长期毒性试验（第二阶段） （四）药物毒理学研究在新药临床试验各阶段的任务 第一期临床研究→探索安全的人用剂量 第二期临床研究→安全性{疗效（有效性）不良反应（安全性） 第三期临床研究→大范围的社会考察 不良反应监测→提高疗效，降低不良反应 多数毒物发挥其毒性作用至少经历四个过程： a毒物吸收后经过多种屏障转运到一个或多个靶部位； b进入靶部位的终毒物与内源靶分子发生交互作用； c毒物引起机体分子、细胞和组织水平功能和结构紊乱； d机体启动不同水平的修复机制。当此机制低下或功能和结构紊乱超过机体修复能力时，机体即出现组织坏死、癌症、纤维化等毒性损害。 长期毒性试验的意义 a判断受试药物能否进行临床试验； b预测人类临床用药时可能毒性和安全范围； c制定临床试验中的防治措施； d确定应该着重评价的生理生化指标； e选择I期临床试验时的初试剂量，等。 一、一般原则 1动物选择： a.敏感动物，年轻动物，雌雄各半 b.2种（啮齿—大鼠6w、非啮齿—比格犬4-6m） c.体重差异不大于平均体重的20% d..单笼饲养、定量喂食
实验室管理制度
实验室管理制度(试行) 为加强实验室日常管理，明确人员职责，进一步为全院科研和工程试验做好服务，结合实验室现状，在原《实验室管理制度》的基础上，制定本管理制度。 第一章实验室运行管理程序 第一条重点实验室对实验室的运行管理负总责，监督检查实验室管理制度的执行情况。 第二条实验室设日常管理人员（以下简称“管理员”）一名，其待遇参照院办公室工勤岗人员执行，负责实验室日常管理工作。 第三条实验室服务对象为院内人员和开放基金课题负责人。委托样品测试需填写来样测试委托表（见附件1），由重点实验室安排专人负责试验。自行开展试验需填写实验申请单（见附件2），经分管副院长、实验室主任批准后方可进场，新进人员进场前要参加实验室安全知识培训并通过考核。外部人员进入实验室试验，由试验负责人负责收取每人500元押金，交至院财务后方可上岗。 第四条试验人员应严格执行本制度，违反规定或不接受管理员监督管理的，管理员有权停止其试验工作，并通报其所在部门负责人和分管副院长按照有关规定处罚。 第五条试验完成后，试验人员须清理干净试验现场和设备装置，清点归还借用物品，按照收费标准（见附件3）
到院财务缴纳相应的费用，报管理员检查批准后方可取回押金、离开实验室。试验评估表（见附件4）由试验负责人填写，评估结论由管理员或实验室主任填写。 第六条实验室原则上不安排加班试验、过夜试验及节假日试验。如有特殊需要，由试验负责人提出试验申请（含安全防范措施及应急方案），由所在部门负责人、分管副院长签字后，经实验室主任同意、实验室分管副院长批准后方可进行试验，重大节假日试验需得到院长批准。 第七条实验室主任原则上每周至少检查实验室安全卫生情况两次，发现问题应及时通知管理员进行整改并按相关规定进行处罚。发现重大安全隐患应及时向院领导书面汇报并提出整改建议。 第八条院办公室和分管行政副院长不定期检查实验室安全卫生情况，发现问题应及时通知实验室主任进行整改，并按相关规定对有关人员进行处罚。 第九条日常检查中发现管理员或试验人员违反本制度的，将对试验人员和试验负责人、管理人员采取教育、罚款和院内通报等处罚措施，具体处罚细则由重点实验室另行制订公布。 第二章安全卫生管理规定 第十条管理员负责安全卫生规定的实施，日常安全卫生工作内容包括：安全监督、安全教育、采取各种防火防盗防毒的安全措施以及负责试验场所、仪器设备的清洁卫生。
微生物实验室规章管理制度
实验室管理总则 一、实验室管理是所有实验人员共同的责任，每一位实验人员都应对实验室的正常、高效运转尽自己的义 务和责任，自觉遵守实验室的规章制度和管理办法。 二、本章程为实验人员的行为规范，目的使大家在一个有组织、有秩序的环境下工作，在最大限度地为大 家提供一个能充分发挥自己才能的空间的同时，使实验人员养成良好的工作习惯，为良好的完成工作任务打下基础。 三、实验室的管理遵循三条原则 （1）岗位责任制原则 实验室的每一项管理工作都有明确的责任要求，并有专人负责。 （2）规范化原则 管理制度化，从设备、器材、药品等的使用到实验方法、安全卫生都制定标准化的规范，大家都 按照规范执行，以确保管理工作的有效性和连续性。 （3）记录监督原则 实验室管理的各方面都要求有及时、准确的记录，以保证实验室所有工作的可追溯性。 实验室人员行为规范 一、严格遵守“武汉烁森生物科技有限公司微生物实验室规章管理制度” 二、每位实验室成员都应以主人翁精神参与实验室的建设与管理，积极参加实验室的各种活动和公益 劳动，自觉维护本实验室的声誉。
三、对所有违规人员和行为，本室将进行登记，屡教不改者，从重处理。 四、实验室内严禁吸烟、喝酒。 五、不准在实验室大声喧哗、随地吐痰、打闹、讲粗口； 六、未经许可，不得随意带他人进入本实验室。 七、爱护仪器设备，节约用水、电及实验材料等，注意安全。 八、室内设备仪器不得擅自拆卸、挪动，与本人实验无关的设备不可随意开启。 九、实验仪器的使用要严格遵守操作规程，并认真填写设备使用记录，设备存放应做到整洁有序，便 于检查使用。 十、必须注意实验安全，加强安全防范意识。 十一、注意公共卫生，不准随意丢弃杂物废纸等，影响实验室环境卫生。 十二、高温、高压等易燃易爆实验，需要特别注意安全防范。 十三、最后离室者，做好安全检查，检查仪器电源、空调、水、气瓶、门、窗等是否关好，并在最后离室登记簿上签名。 实验设备及耗材管理 一、实验设备管理 1.实验设备按指定位置摆放，不得擅自改变仪器设备及其附件的存放位置。确需移动位置时，必须经主任 同意，使用后应及时整理复原。 2.精密仪器须专人负责管理，使用者经过培训合格后方能使用，对于没有按规定操作导致设备故障者，要
毒理学实验方法与技术
毒理学实验方法与技术 作者：王心如主编 出版社：人民卫生出版社 ?出版时间：2006-2-1 ?字数：302000 ?版次：1 ?页数：203 ?印刷时间：2006-2-1 ?开本： ?印次： ?纸张：胶版纸 ?I S B N ：9787117056618 ?包装：平装 所属分类：图书>> 医学>> 医药卫生教材 第一章毒理学实验基础 第一节毒理学实验的原则和局限性 在描述毒理学的试验中，有三个基本的原则： 1.化学物在实验动物产生的作用，可以外推于人。基本假设为：①人是最敏感的动物物种；②人和实验动物的生物学过程包括化学物的代谢，与体重(或体表面积)相关。这两个假设也是全部实验生物学和医学的前提。以单位体表面积计算在人产生毒作用的剂量和实验动物通常相近似。而以体重计算则人通常比实验动物敏感，差别可能达10倍。因此可以利用安全系数来计算人的相对安全剂量。已知人致癌物都对某种实验动物具有致癌性。实验动物致癌物是否都对人有致癌性，还不清楚，但此已作为动物致癌试验的基础。一般认为，如果某一化学物对几个物种实验动物的毒性是相伺的，则人的反应也可能是相似的。 2.实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对人潜在危害的必需和可靠的方法。此原则是根据质反应的概念，随剂量或暴露增加，群体中效应发生率增加。毒理学试验中，一般要设3个或3个以上剂量组，以观察剂量-反应(效应)关系，
确定受试化学物引起的毒效应及其毒性参数。毒性试验的设计并不是为了证明化学品的安全性，而是为了了解化学品可能产生的毒作用。仅仅检测受试化学物在人的暴露剂量是否引起毒效应是不够的，尽管此剂量已超过人可能的暴露剂量。当引起毒效应的最低剂量(LOAEL)与人的暴露剂量接近时，说明该化学物不安全。当该剂量与人的暴露剂量有很大的距离(几十倍，几百倍或以上)，才认为具有一定安全性，此距离越大，安全性越可靠。如果在研究中所用的一系列的剂量不能引起毒性效应，则认为所用剂量还不足够高，应增加剂量，以确定受试化学晶的毒性。但如果在试验的最高剂量组的剂量与人可能的暴露剂量有足够的安全界限，则对于安全性评价来说未观察到毒效应的研究是可以接受的。在毒理学试验中实验模型所需的动物总是远少于处于危险中的人群。为了在少量动物得到有统计学意义的可靠的结果，需要应用相对较高的剂量，以使效应发生的频率足以被检测到。例如，低达0.01％的癌症发生率，这意味着在100万人群中有100人发生癌症，此发生率太高，不能为公众接受。在实验动物直接检测如此低发生率将至少需要30000只动物。因此，在毒理学试验中，对相对较少的实验动物必须以较高剂量进行试验，然后根据毒理学原则外推估计低剂量的危险性。 3.成年的健康(雄性和雌性未孕)实验动物和人可能的暴露途径是基本的选择。成年的健康(雄性和雌性未孕)实验动物是为了使实验结果具有代表性和可重复性。以成年的健康(雄性和雌性未孕)实验动物作为一般人群的代表性实验模型，而将幼年和老年动物、妊娠的雌性动物、疾病状态作为特殊情况另作研究。这样可降低实验对象的多样性，减少实验误差。毒理学实验结果的敏感性取决于受试物处理引起毒效应强度和实验误差两个因素，处理引起的毒效应强，实验误差小，则实验结果的敏感性增加，反映受试物处理的真实效应，反之亦然。实验设计是要规定实验条件，严格控制可能影响毒效应的各种因素，保证实施质量，降低实验误差。只有这样，才能保证试验结果的准确性和可重现性。外源化学物从不同途径染毒实验动物所表现的毒性可有很大差异，这是由于染毒部位解剖生理特点不同，外源化学物吸收进入血液的速度和量也不同，首先到达的器官和组织也不同。因此，毒理学试验中染毒途径的选择，应尽可能模拟人接触该受试物的方式。历史上，环境污染物及某些药物所引起的中毒和死亡多次发生，引起各国的重视，推动了毒理学的发展，各国政府主管部门制订和多次修订了有关药品
实验室安全操作规程
实验室安全操作规程 1、化验室安全操作规程 （1）实验前应做好准备，必须对所用药品与设备性能有充分的了解，熟悉每个具体操作中的安全注意事项。 （2）实验前必须熟悉实验室及其周围的环境和水龙头、电闸门的位置 （3）实验时应保持安静，思想要集中，遵守操作规程，切勿粗心大意，马马虎虎，更不准在实验室内开玩笑。 （4）严禁在实验室内饮食或煮食，或者把食具带劲实验室。 （5）每次实验完毕后应把手洗净，并检查水、电、气等安全措施完善后才能离开实验室（6）每个实验室都必须备有灭火器或砂土，并尽可能放在显眼的地方，能同事备有消防用的消防栓或水缸则更好 （7）实验室应保持空气流通，并设有专用的卫生箱，以供及时治疗的需要。常备药品有：红汞药水：供一般破伤使用 酒精：轻微的灼烧伤可用进过酒精的脱脂棉擦拭 5%硼酸氢钠溶液：受酸性物灼伤可用作冲洗 3%硼酸溶液：受碱性物灼伤可用作冲洗 还需要备有碘酒：紫药水及绷带和药棉 2、火和电的安全预防 （1）在使用中电气动力时，必须事先检查电开关，马达以及机械设备各部门是否安置妥善（2）开始工作时和停止工作时，必须将开关彻底扣严和拉下 （3）在更换保险丝时，要按负荷量，不得加大或以铜丝代替使用。 （4）严禁用湿手、湿布或铁柄毛刷等去清扫或擦拭电闸刀、点插销等，防止触电 （5）凡电气动力设备过热时，应立即停止运转 （6）定碳、定硫电炉或其他高温炉，其硅碳棒露出部分应设有安全罩，严禁将安置妥善的安全罩随意撤掉，以免发生触电事故。 （7）禁止洒水在电气设备和电线路上，以免漏电 （8）凡使用110伏以上电源装置，仪器的金属部分必须安装地线 （9）电热设备，例如马弗炉、烘箱、电炉和电热板等，所用电源的导线应经常注意检查其各接触处是否妥当，导线有无损坏和被腐蚀等 （10）马弗炉、烘箱等用电设备，使用时必须要有人负责照管，以防发生事故 （11）马弗炉需放在水泥等不燃物砌成的坚固台子上，不要靠近木板墙或木质门窗。（12）使用易燃物时，必须在距离火源较远的地方进行，绝不可靠近火源，尤其是乙醚着火的危险性极大，用时必须小心，用完后的剩余部分也应及时的存放到专门的安全地方。（13）绝不可以将氧气钢瓶存放在靠近电源的地方，并需防止强烈震动，气体出口活门处绝不可涂油和与有机物接触，以免发生爆炸的危险。 3、化学药品的安全预防 （1）距度星的药品，例如KCN、AS2O3等等，必须制定保管使用规则，并严格遵守，及时工作人员很少，也不可例外的有所忽视。这类药品不能与一般药品同样的存放和任意使用，即使用过后的余量已经很少也应及时送保管员及时查收，不应任意放在工作台上。 （2）内服有毒药品，如氰化物、铅化物、汞及汞化物、络酸盐、氧化砷钡盐等，应装在坚固的瓶中保管，禁止入口，与手接触用后要洗手。 （3）接触皮肤有毒的药品，例如氰化物、氟氢酸、溴水、过氯酸等，要装在严禁坚固的瓶中保管，使用时要特别小心，不得与皮肤接触。 （4）呼吸有毒药品（及有毒气体和蒸气）如氰化氢、氮的氧化物、氯化氢、硫化氢、溴、
制剂长期毒性研究技术指导原则
制剂长期毒性研究技术 指导原则 公司内部编号：（GOOD-TMMT-MMUT-UUPTY-UUYY-DTTI-
北京市医疗机构制剂长期毒性研究 技术指导原则 一、概述 长期毒性研究可为医疗机构制剂（以下简称“制剂”）的研发提供重要的安全性参考信息，是非临床安全性评价的重要内容。通过长期毒性研究，可预测受试物可能引起的临床不良反应，包括不良反应的性质、程度、量毒关系和时毒关系、可逆性等；判断受试物长期给药的毒性靶器官或靶组织；推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全剂量范围；提示临床试验中需重点监测的指标；提供临床试验中解毒或解救措施的参考。 本指导原则适用于中药制剂、化学制剂的长期毒性试验研究。 二、一般要求 长期毒性研究应遵守《药物非临床研究质量管理规范》，遵循毒理学研究中随机、对照、重复的基本原则进行试验设计和开展研究工作。 研究机构必须具有法人资格，具备从事药物安全性评价的相关设备、设施及资质，必须取得相应实验动物使用许可证，具有与所使用的实验动物级别相符的实验环境。 试验项目负责人必须获得相关专业领域副高级以上职称（含副高），所有参加研究的人员必须经过相关专业的业务培训。 三、基本内容 制剂的开发背景和研究基础各不相同，在长期毒性研究立题之前应进行文献查阅，根据申报品种的立题依据、临床意义、处方来源、使用历史、有效性与安全性等背景资料进行综合考虑。 （一）试验项目的选择 1.制剂注册申请
（1）中药制剂若满足以下全部条件，可免于进行长期毒性试验： ①根据中医药理论组方； ②处方中的药味用量不超过法定药品标准规定； ③处方组成中不含有法定标准中标识有毒性及现代毒理学证明有毒性的药材（毒性药材是指历版中国药典，部颁标准，进口药材标准，省、自治区、直辖市的中药材标准中标注为大毒/剧毒和有毒的药材，如制附子、制川乌、制草乌等）； ④处方组成不含有十八反、十九畏配伍禁忌； ⑤利用传统工艺配制（即制剂配制过程没有使原组方中治疗疾病的物质基础发生变化的）； ⑥急性毒性试验（采用最大给药容量、最大给药浓度）未见明显毒性反应； ⑦临床实际用药周期为1周以内。 实际用药周期超过1周者，如符合上述条件，且该处方在本医疗机构具有5年以上（含5年）使用历史、能提供可靠的临床安全性资料，亦可免于进行长期毒性试验。 （2）申请配制的化学制剂属已有同品种获得制剂批准文号的，可免于进行长期毒性试验。 （3）本医疗机构已有品种的改剂型品种，如果配制工艺无质的改变且临床用量、给药途径相同，可以免报长期毒性研究资料（缓释、控释制剂除外）。否则，应按临床拟用途径比较改变前后的长期毒性反应。 （4）化学制剂注射剂品种，参照新药的注射剂相关研究技术要求进行试验研究，提供申报资料及文献资料。 2.制剂补充申请
第一部分毒理学复习题
一、名词解释 蓄积毒性、选择毒性、代偿能力、功能容量、绝对致死量、半数致死量、最小致死量、最大耐受量、最大无作用剂量、最小有作用剂量、慢性毒性阈剂量、急性毒作用带、慢性毒作用带、GLP、SOP、急性毒性、3R、脏器系数、悉生动物、无菌动物、蓄积系数、脏器系数、突变作用、移码突变、转换型突变、染色体畸变、间接致突变物 二、问答题 1．选择毒性产生的原因？ 2. 损害作用与非损害作用有哪些特点？ 3. 损害性反应的类型及其异同？ 4. 毒性作用常用参数 5．LD50测定的意义？ 6. 试述长期毒性试验中反映肝、肾功能的主要血液学指标及其意义。 7. 分别叙述基因突变和染色体畸变的类型。 8. Ames试验的原理及此方法的优缺点。 9. Ames试验常用菌株及其用途。 蓄积毒性：当较长时间连续反复给药，或者说给药的时间间隔和剂量超过机体消除药物的能力时，出现药物进入机体的速度或总量超过排出的速度或总量的现象。这时，药物就有可能在体内逐渐增加并贮存起来产生毒性。 选择毒性：指一种化学物质只对某种生物产生损害作用，而对其他生物无害，或只对机体内某一器官发挥毒性，而对其他组织器官不具毒作用。 代偿能力：当机体组织或器官局部发生病变时，病变处功能降低，此时非病变处组织通过自身功能的加强来弥补病变处功能不足的能力。 最大无作用剂量：指药物在一定时间内，按一定方式与机体接触，按一定的检测方法或观察指标，不能观察到任何损害作用的最高剂量。 急性毒作用带：用于表示一种药物的急性毒性，用药物的半数致死量与急性毒性最小作用剂量的比值表示。 慢性毒作用带：用药物的急性毒性最小作用剂量与长期毒性最小有作用剂量表示，亦可用于表示一种药物的长期毒性。 SOP：标准操作规程，为得到准确的实验数据，要求正确而且统一的操作，对所有实验操作应以SOP为标准，是GLP中最重要的工作软件。 急性毒性：是指24h内单次或多次大剂量给予某药所出现的有害作用，即指机体（人或实验动物）一次性大剂量接受某种药物后所产生的快速而剧烈的中毒反应，包括死亡效应。 脏器系数：指内脏器官重量（g）与体重（kg或100g）的比值。
化验室安全操作规程02
化验室安全操作规程 1、化验室安全操作规程 （1）实验前应做好准备，必须对所用药品与设备性能有充分的了解，熟悉每个具体操作中的安全注意事项。 （2）实验前必须熟悉实验室及其周围的环境和水龙头、电闸门的位置。 （3）实验时应保持安静，思想要集中，遵守操作规程，切勿粗心大意，马马虎虎，更不准在实验室内开玩笑。 （4）严禁在实验室内饮食或煮食，或把食具带进实验室。 （5）每次实验完毕后应把手洗净，并检查水、电、气等安全措施完善后才能离开实验室。 （6）每个实验室都必须备有灭火器或砂土，并尽可能放在显眼的地方，能同时备有消防用的消火栓或水缸则更好。 （7）实验室应保持空气流通，并设有专用的卫生箱，以供及时治疗的需要。常备药品有： 红汞药水：供一般破伤使用。 酒精：轻微的灼烧伤可用浸过酒精的脱脂棉擦拭。 5%硼酸氢钠溶液：受酸性物灼伤可用作冲洗。
3%硼酸溶液：受碱性物灼伤可用作冲洗。 还需要备有碘酒：紫药水及绷带和药棉。 2、火和电的安全预防。 （1）在使用电气动力时，必须事先检查电开关，马达以及机械设备各部分是否安置妥善。 （2）开始工作时和停止工作时，必须将开关彻底扣严和拉下。 （3）在更换保险丝时，要按负荷量，不得加大或以铜丝代替使用。 （4）严禁用湿手、湿布或铁柄毛刷等去清扫和擦拭电闸刀、电插梢等，防止触电。 （5）凡电气动力设备过热时，应立即停止运转。 （6）定碳、定硫电炉或其它高温炉，其硅碳棒露出部分应设有安全罩，严禁将安置妥善之安全罩随意撤掉，以免发生触电事故。 （7）禁止洒水在电气设备和线路上，以免漏电。 （8）凡使用110伏以上电源装置，仪器的金属部分必须安装地线。 （9）电热设备，例如马弗炉、烘箱、电炉和电热板等，所用电源的导线应经常注意检查其各接触处是否妥当，导线有无损坏和被腐蚀等。
急性毒性试验
试验目的：急性毒性试验是在24小时内给药1次或2次（间隔6-8小时），观察动物接受过量的受试药物所产生的急性中毒反应，为多次反复给药的毒性试验设计剂量、分析毒性作用的主要靶器官、分析人体过量时可能出现的毒性反应、I期临床的剂量选择和观察指标的设计提供参考信息等。 一、啮齿类动物单次给药的毒性试验 （一）试验条件 1.动物品系：常用健康的小鼠、大鼠。选用其他动物应说明原因。年龄一般为7-9周龄。同批试验中，小鼠或大鼠的初始体重不应超过或低于所用动物平均体重的20%.实验前至少驯养观察1周，记录动物的行为活动、饮食、体重及精神状况。 2.饲养管理：动物饲料应符合动物的营养标准。若用自己配制的饲料，应提供配方及营养成分含量的检测报告；若是购买的饲料，应注明生产单位。应写明动物饲养室内环境因素的控制情况。 3.受试药物：应注明受试药物的名称、批号、来源、纯度、保存条件及配制方法。 （二）试验方法： 由于受试药物的化学结构、活性成分的含量、药理、毒理学特点各异，毒性也不同，有的很难观察到毒性反应，实验者可根据受试药物的特点，由下列几种实验方法中选择一种进行急性毒性试验。 1.伴随测定半数致死量（LD50）的急性毒性试验方法。 2.最大耐受剂量（MTD）试验方法：最大耐受剂量，是引起动物出现明显的中毒反应而不产生死亡的剂量。 3.最大受试药物量试验方法：在合理的浓度及合理的容量条件下，用最大的剂量给予实验动物，观察动物的反应。 4.单次口服固定剂量方法（Fixed-dose procedure）。选择5、50、500和2000mg/kg四个固定剂量。 实验动物首选大鼠，给药前禁食6-12小时，给受试药物后再禁食3-4小时。如无资料证明雄性动物对受药试物更敏感，首先用雌性动物进行预试。根据受试药物的有关资料，由上述四个剂量中选择一个作初始剂量，若无有关资料作参考，可用500mg/kg作初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用2000mg/kg 进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束预试。如初始剂量出现严重的毒性反应，那就用下一个挡次的剂量进行预试，如该动物存活，就在此两个固定剂量之间选择一个中间剂量试验。每个剂量给一只动物，预试一般不超过5只动物。每个剂量试验之间至少应间隔24小时。给受试药物后的观察期至少7天，如动物的毒性反应到第7天仍然存在，尚应继续再观察7天。 在上述预试的基础上进行正式试验。每个剂量最少用10只动物，雌雄各半。根据预试的结果，由前面所述的四种剂量中选择出可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量；如预试结果表明，50mg/kg引起死亡，则降低一个剂量档次试验。
001-经口急性毒性试验方法-改良寇氏法
001-经口急性毒性试验方法-改良寇氏法 急性毒性试验方法 ――改良寇氏法 K?rber 法由K?rber 于1931提出，后经Finney 改进，顾汉颐作过改进，1963年孙 瑞元教授对该法进一步改进，改进后的计算方法称为点斜法或孙氏法，增加了不含0%和100%死亡率的校正式，所得LD 50及全部有关参数与正规概率单位法相近。 改良寇氏法（K?ber）试验设计的原则是：各组剂量按等比级数；各组动物数相等： 大致有一半组数的动物死亡率在10%～50%之间，另一半在50%～100%之间，最好出现0 % 和100 %的剂量组。 一、剂量选择及分组 1、剂量选择 剂量设计是否合理是急性毒性试验能否成功的关键。 探求外源化学物的急性毒性，测定其LD 50或LC 50时，应首先广泛查阅文献资料， 了解该化学物的化学结构和理化性质，如结构式、分子量、溶解度、挥发度、纯度及杂质 含量等，其次确定测定LD 50的计算方法，然后设计剂量。 2、预试验： 总的原则是先用少量动物，以较大的剂量间距染毒，求出粗略的致死剂量范围，即确 定受试动物全部致死的最小剂量（b ）和全部不致死的最大剂量（a ），即求出待测化学 物0 %~100 %的大致致死剂量范围，然后在这个剂量范围内按几何级数的间距设计5~7个 剂量组，组间剂量呈等比级数（r ），其比值为1.2~1.5。进行正式实验。 用于急性毒性试验时，动物的体重为：大鼠180~200g，小鼠18~22g，豚鼠200~250ｇ，家兔2~2.5kg，犬10~12 kg。用于实验的同一批动物体重变异范围不得超过所用动物平均 体重的20%。仍然遵守雌雄各半或雌雄兼取的原则。当预试中发现化学物的毒性有明显的 性别差异时，则需要选用雌、雄两种性别的动物分别进行试验，求出各自的LD 50。 通过预试，找出受试化学物引起动物死亡的大致剂量范围，以此为依据设计正式试验 的剂量和分组。按下式设计剂量组： r =n b a 式中：r —相邻两组剂量的比值，一般为1.2～1.5，
化验室安全操作规程
化验室安全操作规程 镇江华夏检测 2016年6月25日
第一章化验室一般安全守则 1、必须坚持“安全第一，预防为主”的安全生产方针，认真学习分析规程和有关安全技术规程，了解设备性能，严禁违章作业。 2、化验室应备有防火、防毒用具，并放置在明显处，保持良好的备用状态，化验员要熟知这些器材的使用方法。 3、化验员上岗操作应穿工作服，进入取样点必须穿戴相应的防护用品，戴好安全帽。 4、现场取样应站在上风口，防止吸入有毒气体。取样和向容器内加入药品时，面部禁止正对容器口，防止药品溅入眼内及其它部位。 5、配制有毒试剂或在试验中能放出有毒和腐蚀性气体的操作应在通风柜内进行，并保持通风良好。 6、所用药品标准溶液都应有标签，禁止在容器内装入与标签不相符的药品，禁止使用没有标签的药品。 7、配制硫酸、盐酸、硝酸、磷酸等溶液时，都应把酸倒入水中，严禁将水倒入酸中。 8、用嗅觉检查样品时，只能拂气入鼻，轻轻嗅闻，绝对不能向瓶口猛吸。尽量避免手与有毒试剂直接接触，禁止用口品尝检验性质不明的药品。 9、进行易燃易爆物质试验时，禁止明火加热或接近火源。 10、在开启易挥发有毒试剂时，禁止面对自己或他人。 11、禁止使用化学器皿盛装食物，禁止用饮具、餐具盛装药品，实验后、进食前，必须充分洗手。 12、氧化剂与有机物分开存放、防止爆炸。易燃物品应放在阴暗低温处。 13、严禁可燃物与氧化剂一起研磨，见光易分解的试剂应贮于棕色瓶中放于暗处。 14、必须掌握一定的用电常识，认真阅读所使用的电气设备说明书及操作注意事项，遵守安全用电规程。 15、在进行动火分析时，必须严格执行安全动火管理制度。 16、一旦发生火灾，化验员应临危不惧，冷静沉着，及时采取灭火措施并立即与有关部门联系。 17、工作完毕检查水、电、气、窗安全处置后方可锁门。
长期毒性
二、 动物 本试验选用两种动物大鼠和狗,均购自锦州医学院实验动物中心。经过一周检疫和适应 ,选择一般状况良好的动物用于试验。分组时称量体重 ,雄性大鼠重1 2 2.7 士 2 9.5 g,雌性大鼠重 13 6.8 土 2 6.7 g ;雄狗重1 0.8 土 2.7 k g,雌狗重9.9 士 2.6kg。 试验方法 1.分组 鉴于急性毒性试验的给药量超过了限度试验的剂量(小白鼠注射给药超过0.2 g/100 k g), 可考虑只设一个剂量组。另外,文献报告一次静脉给药的最大容量,大鼠和狗分别为0.l m l/10g 和20 m l / 只因此,本试验确定设二个剂量组:低剂量相当于上述最大容量(大鼠为10m l / k g,狗为l.7 m l / k g),高剂量则根据予试验的结果再扩大5、7倍(大鼠为4 5 m l/ k g,狗为1 3 m l / k g)。为了比较,同时设生理盐水对照组(大鼠一次静注4 5m l / k g,狗为13 m 】/ kg )。分组时将雌雄大鼠和狗按体重分层,再随机分配。大鼠每组雌雄各1 0 只,狗为各2只。 2 给药方法 连续2 8 天,每天一次,按规定剂量给动物静注复方甘油注射液。注射速度1 5 ~ 2 0m l /m i n。注射部位,大鼠取尾静脉,狗取后肢小隐静脉。 3 观察与检查 3.1 一般症状观察、体重和进食量测定每天午前、午后两次仔细观察动物的外形、活动有无异常。每周一次测定动物体重和进食量。 3.2血液学及血液生化检查 试验开始前一天及连续.给药 1 4、2 8天后,各对动物进行一次检查.血液学指标为:红细胞计数、血红蛋白、白细胞总数及分类、血小板计数。血液生化指标有:谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、尿素氮及血清钠。采血方法,大鼠,头两次以钳取眼球法,末次以断头法取血,狗则三次都是从后肢小隐静脉取血。每次采血前须让动物断绝饮食8 小时,目的减轻药物对血液稀释的影响。 3.3 心电图检查 试验前后给每只狗各做一次心电图( l导联) 检查。由于狗的心电图所受影响因素较多,个体间变异很大,而同一只狗在不同时间却变化较小的特点,故以同一狗前后自身对照为基础,判断雌雄狗不同组别的心电图波形变化之大小。 3.4 病理学检查 试验期终了,将所有狗及被抽检的大鼠(每组取雌雄大鼠各4只)以放血法快速处死。随即解剖,首先肉眼观察殉和大鼠各种内脏器官有无异常,继而摘出并称量不同性别、不同组别动物的心、肝、脾、肺、肾、脑的湿重,依据解剖当日的动物体重计算各种脏器的相对重量一脏器系数(g 100g B.W.)。最后,将上述器官连同胃和小隐静脉等一并施行 1 0 肠福尔马林固定,石腊包埋,H E 染色,光学显微镜观察。 试验结果与讨论 1 一般症状 试验过程中,大鼠或纯的不同组别间, 其外形和活动,如眼、耳、鼻、皮肤、粘膜、呼吸、进食、大小便、姿势等未见有明显差别。低剂量组雌鼠中,在第二次钳取眼球后有一只于翌日死亡,可能是失血过多引起的 2. 体重与进食量 曾先后四次测定雌雄大鼠或狗的不同组别的平均体重和进食量,结果发现同种属、同性别、不同组别间的体重增长大致相同,狗呈体重增长抑制倾向,而大鼠的体重则呈负增长
中药新药长期毒性试验研究结果与评价
中药新药长期毒性试验研究结果与评价 审评一部朱家谷 新药的长期毒性试验研究，其目的是为了最大限度地获取与受试物有关的安全性信息。长期毒性试验，应根据受试物的特点，进行科学的试验设计、实验管理和操作规程，同时应对 试验结果进行详细的描述及分析。 本文主要针对申报资料中有关试验结果及分析内容，提出一些建议，供大家参考。 一、应加强对长毒试验指标的观察 纵观现有新药长毒试验的申报资料，对试验指标的观察主要存在以下几方面的问题。 1、观察的指标不全面 一个受试物的长毒试验，少则需给药一个月，多则半年甚至更长时间，其间消耗了较多的人力、财力、物力。长毒试验的目的是最大限度地获取与受试物有关的安全性信息，与前期投入比较，进行相关的指标检测成本并不高，在未检测之前，我们对其结果是未知的，但每多检测一个指标就多一份对受试物的安全性认识。现有的多数申报资料只进行一些简单的几个指标的检测，而不根据长毒试验的目的进行试验指标的检测，如脏器系数和病理检查只有心、肝、脾、肺、肾，血液生化只测肝、肾功能各两项指标等。当然，这是1993年卫生部发布的《指南》中要求的必做项目，但该指南并未不同意进行更多指标的观察，作为研究者，如果有对自已开发品种的责任心，有对人民群众用药安全性责任心，就应自觉地进行更多指 标的检测。 2、观察的指标针对性不强 长毒试验的检测项目应具有针对性，在研究时应特别注意“抓住问题不放”，不能忽视“偶 然现象”。 一方面，我们要在长毒试验中注意发现“偶然现象”并加以解决。如有一受试物，在试验中
观察到了血红蛋白及红细胞的降低，但不进行网织红细胞及骨髓的检查，结果无法分析其结果可能的危害程度及产生的原因。再如有些试验中血液生化检测中观察到了肌酐或尿素氮的升高，在这种情况下未再进一步地进行更敏感的肾功能指标的观察，很难对其结果作出正确 判断。 另一方面，还应结合受试物的处方组成特点、有效性试验中观察到的可能毒性问题、药代动力学试验中发现的问题等进行相应的指标观察。如某些含有毒性药材的复方制剂，应根据这种药材的毒性靶器官、靶组织进行更深入的研究。如某些具有活血化瘀作用的药物，在药效学试验中可能可以观察到某些对心血管及血液学方面的影响，在长毒试验时应增加一些更敏感的检测指标，观察在大剂量下的毒性反应的暴露情况。再者，曾经有一药物，由于未重视药代动力学试验中发现的在视神经的异常分布，在长毒试验中未对相关器官组织进行病理学检查，最后导致上市后引起许多受试者的失明。 再者，长毒试验一般要求高剂量组和对照组要进行全面的病理组织学检查，但很多试验单位无论高剂量组检查结果如何，都仅对高剂量组和对照组进行检查，而不对中剂量组和低剂量组进行检查。为了减少不必要的人力、物力的浪费，如高剂量组未出现病理改变的，一般可以不必进行更低剂量组的病理组织学检查，只需取样保存，但如果高剂量组出现病理学改变，则必须对更低剂量组进行病理组织学观察，只有这样才能判断药物的安全范围，寻找量毒关系，并考虑是否应进行更进一步的毒性研究。 3、对已观察指标在资料中表述不明确 多数试验单位一般都报送了所观察的试验结果，但是对于计量资料，只在表格中将“均数±标准差”列上，并说明在正常范围内，而我们在评价时发现，有许多结果标准差很大，均数虽在正常范围，但根据所提供的标准差，应有不少数据在正常范围以外，这时如果不将正常范围外的数据另外列上并进行分析，很容易导致可能的安全性问题被掩盖。对于计数资料，如
毒理学指标及试验操作汇总
. 药物毒性试验指标 1.急性毒性试验 一、半数致死量（LD50）的测定 (一)目的:观察受试物一次给予动物后，所产生的毒性反应和死亡情况。 (二)动物分组和剂量 1.动物:一般用小白鼠8周龄，体重18---22g(同次试验体重相差不超过2g)大白鼠6~8周龄，体重120--150g，同次试验体重相差不超过10g。 2.受试物:溶于水的做成溶液，不溶于水的做成混悬液. (三)试验方法 1.剂量:一般选用3一5个剂量，各剂量间剂距根据受试物情况和预试结果而定。 2.给药途径和容积: 给药途径:应与临床试验的途径相一致。口服药物应灌胃给药，一、二类新药应采用两种途径给药，其中一种应为推荐临床研究的给药途径。水溶性好的药物还应测定静脉给药的急性毒性。 给药容积:小白鼠禁食(12~16小时)，不禁水，按体重计算:灌胃(ig)不超过0. 4ml/ 10g体重。大白鼠禁食(12~16小时)，不禁水、灌胃(ig)，不超过3ml/只。 3.测定LD:将动物按体重随机分组，每组至少10只(雌雄各半)。给受试物后立即观察50动物反应情况，每天观察一次连续观察七天。详细逐天记录动物毒性反应情况及死亡分布，并用适当的统计学方法(申报时应说明方法名称)计算出LD值及95%可信限。50 4.观察毒性反应:给受试物后应严密观察反应情况，并记录动物的外观、行为活动、精神状态、食欲(饲料消耗量)、大、小便及其颜色、被毛、肤色、呼吸、鼻、眼、口腔有无异常分泌物，体重变化以及死亡等情况。死亡动物应及时进行尸检，发现病变器官应做病理组织学检查。 若发现中毒反应或死亡率一与动物的性别有明显相关时，则应选择性别敏感的动物进 行复试。 (四)试验报告和结果评价 应详细具体，包括试验日期、动物的规格、性别、数量、受试物来源及含量、试验方法。LD 值及其95%可信限，以及各剂量组的死亡率，或最大耐受量的值及其相当于临床剂量的50倍数.详细报告实验过程中动物出现的中毒表现及致死症状，综合评价受试物毒性大小。 二、最大耐受量（MTD）的测定 方法:受试物可用临床试验的给药途径，以动物能耐受的最大浓度，最大容积的剂量一次或一日内2~3次给予动物(小白鼠至少20只，雌雄各半)。连续观察七天，记录动物反应情况，以不产生死亡的最大剂量为最大耐受量。计算出总给予药量g/Kg(合生药量g/Kg表示)，推算出相当于临床用药量的倍数。 测定最大耐受量，同样也应严密观察动物毒性反应情况，要求与观察单次给药的毒 性反应相同。 ..
有毒有害岗位职业卫生操作规程
有毒有害岗位职业卫生操作规程 （ISO45001-2018） 一、本公司有毒有害物品 苯、甲苯、二甲苯：无色透明液体，易燃烧。其蒸气与空气混合成爆炸性气体。遇到高热、明火能燃烧或爆炸。对皮肤粘膜有刺激性，对中枢神经系统有麻醉作用；短时间吸入较高浓度本品，可出现上呼吸道明显刺激作用眼结膜充血头昏恶心等症状，重症昏迷；长时间接触可发生神经衰弱综合症，皮肤皲裂等。正己烷：属于低毒类化学物质，但具有高挥发性，高融脂性，并具有蓄积作用，短时间高浓度接触或长时间接触都会对人体健康造成损害，急性吸入高浓度的正己烷可出现头晕、头痛、胸闷、眼和上呼吸道粘膜刺激以及麻醉症状，甚至意识不清，。长期接触低浓度正己烷可引起以多发性周围神经病变为主的慢性损害，可引起急性中毒及慢性中毒。对皮肤有损害，皮肤反复接触后可出现发凉、潮红和粗糙等表现。 二、本公司接触有毒有害品岗位 接触有毒有害品的岗位有：丝印岗位 三、岗位职业卫生操作规程 1、进入岗位操作前必须按照不同岗位，正确佩戴防毒口罩（面具）等岗位所需劳动保护用品并掌握基本的有毒有害气体自救措施。 2、进入岗位后要认真对岗位配置的通风设施进行检查，确认通风设施正常运转时，方可进行岗位操作。 3、如通风设施出现故障时，致使岗位操作现场有毒有害气体浓度超过正常范围，要及时报告本单位相关领导，及时安排对通风设施进行维修，确保操作现场有
毒有害气体浓度正常后，方可进行岗位操作。 4、严格按照岗位工艺操作规程进行岗位操作，避免因违反操作规程而引发安全事故，对未严格按工艺操作规程进行操作的人员，一经发现将严肃处理。 5、对生产现场经常性进行检查，及时消除现场中设备的跑、冒、滴、漏现象，降低职业危害。 6、工作时尽量站在上风侧，减少吸入有毒有害气体的机率，生产现场严禁吸烟、就餐。 7、下班前将工作服等生产现场所使用的各类劳保用品进行更换后离开工作岗位，预防将污染源带离工作岗位后传播给其它人员。 8、离开岗位后，要保持良好的卫生习惯，要对身体及衣服上粘附的污染物进行彻底清理，并及时清洗身体接触有毒有害气体的各个部位，避免污染物进入体内。 9、保持良好的个人卫生习惯、坚持下班洗澡等措施有效预防职业病。