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RNA提取纯化

RNA提取纯化
RNA提取纯化

准备工作:(严格的去RNA酶条件)

器材:去RNA酶的15ml离心管、1.5mlEP管、PCR的EP管、蓝黄白枪头,专用移液枪,500ml 试剂瓶*4,高压灭菌锅,4°离心机,振荡器。

试剂:苯酚,氯仿,异丙醇,无水乙醇,去RNA酶水、,DEPC, Trizol裂解液,双氧水,50*TAE,RNA酶抑制剂,DNA酶,3mol/L乙酸钠(pH5.2),10*纯化buffer,终止buffer,琼脂糖凝胶粉末,Loading buffer(+EB的预染buffer)。

1、15ml离心管分装10ml的氯仿,异丙醇,无水乙醇,用去RNA酶水配制75%乙醇。分装1ml去RNA酶水。

2、500ml试剂瓶加500ml去离子水,500ml试剂瓶加50*TAE10ml用去离子水定容到500ml,每瓶加DEPC(终浓度为0.01%,有毒,未高压灭菌前要小心),剧烈振荡混匀放置24小时后高压灭菌(降解DEPC)。

3、用DEPC处理过的水配制终浓度为3%的双氧水500ml(泡电泳槽,配胶板,锥心瓶用)。RNA提取:

1、准备去RNA酶的ep管,写好标签。

2、洗净6孔板中的液体,用移液枪每孔加1mlPBS洗涤一次。

3、用枪吸尽PBS,每孔加入1ml Trizol (有毒,最好通风橱里面加)裂解液(根据培养细

胞孔的面积加入裂解液,6孔板加1ml即可),轻轻摇晃5min左右。

4、用1ml的枪吹打细胞,使其充分脱离6孔板,将液体吸入准备好的ep管中(如果打算

以后再做可放入-80°冰箱保存)。

5、每管加入200ul氯仿(1ml加200ul),振荡使其充分混匀,冰上静置10min,这时可以

预冷4°离心机。(如果是从-80°冰箱拿出的样品需待样品溶解后振荡混匀,室温平衡5min再进行该步骤)

6、4°离心机14000g离心15min。此时准备新的ep管,每管加500ul异丙醇。

7、将上清转移至准备的ep管中(不要吸到下层液体),混匀后放入-20°冰箱30min。

8、拿出ep管,上下颠倒几次,4°离心机14000g离心10min.

9、倒掉上清,沉淀为RNA,每管加1ml 75%乙醇洗涤,4°离心机14000g离心5min.

10瞬离ep管,用枪吸尽残余液体,室温晾干。根据沉淀多少加入适量去RNA酶水(一般20ul左右),用枪混匀使沉淀完全溶解,放入冰盒中等待测浓度。

11浓度测量仪器使用前用去RNA酶水洗涤一次,每次上样2ul,上样测量完后每次都需要擦净仪器探头。需注意的数据:浓度ng/ul,260/280(2.0以上),260/230(1.8以上),峰形(单峰)如果数据没达到要求需进行RNA纯化。

RNA纯化:(冰上进行)

1、100ul反应体系:RNasein(RNA酶抑制剂)2ul

DNase(DNA酶) A ul(根据开始测的浓度,每1ug加1ul)

10*反应buffer 10ul

RNA B(提取的RNA总体积)

去RNA酶水88-A-B

37°30min

2、100ul体系中加15ul的去RNA酶水,再加入酚氯仿(1:1),体积与原体积等量。

3、混匀后4°离心机14000g离心10min。(此时准备新的ep管,每管加200ul无水乙醇和15ul醋酸钠。)

4、将水相吸至另一个离心管内,加3mol/L乙酸钠(pH5.2)至终浓度为0.3mol/L,加2.5倍体积用冰预冷的无水乙醇,充分混匀,冰浴放置2小时(上清用50ul的枪吸入准备好的ep管,混匀后室温1小时。)

5、4°离心机14000g离心10min,倒掉上清,加75%乙醇500ul洗涤。

6、4°离心机14000g离心10min,倒掉上清,瞬离ep管,用枪吸尽残余液体,室温晾干。根据沉淀多少加入适量去RNA酶水(一般20ul左右),用枪混匀使沉淀完全溶解,放入冰盒中等待测浓度。

7、浓度测量仪器使用前用去RNA酶水洗涤一次,每次上样2ul,上样测量完后每次都需要擦净仪器探头。需注意的数据:浓度ng/ul,260/280(2.0以上),260/230(1.8以上),峰形(单峰)如果数据没达到要求需再次进行RNA纯化。

RNA电泳:

1、用3%的双氧水泡电泳槽,配胶板,小锥心瓶15min。DEPC处理的水冲洗3次。

2、用DEPC处理的1*TAE配制1%的琼脂糖凝胶15ml,微波加热使琼脂糖完全溶解,冷却后倒入胶槽,等待凝固。

3、上样孔每孔500-800ng的RNA,根据测定的浓度确定上样量,不超过20ul。Loading buffer (+EB的预染buffer):样品=1:1。

4、上样后110V恒压跑10-15min至胶的中间即可。紫外下看结果,拍照。

(28S,18S, 5S分别对应rRNA,tRNA,mRNA)

RNA试剂盒提取步骤

常规植物样品总RNA小量抽提 1. 植物样品的研磨。 ?收集植物样品并尽快浸泡到液氮中以防止RNA 的降解。使用研钵、研磨棒和液氮将植物样品研磨成尽量细小的粉末。RNA 的产量取决于样品类型和研磨效果。 注:研磨后的植物粉末可直接保持于-70°C。 ?快速称取50-100mg 的研磨好的植物样品至1.5ml 预冷的离心管中。 注:在加入裂解液之前,不要让样品解冻。初次使用时,推荐先使用50mg,待取得理想结果后, 再酌情提高用量。 2. 立即加入500μlBuffer RL/β-ME混合液至样品中。立即于最高速度涡旋30-60 秒 充分打散样品,室温静置3-5 分钟让样品充分裂解。 注:使用前分装适量的Buffer RL,每1ml Buffer RL 加入20μl β-疏基乙醇(β-ME)或2M DTT。 若植物用量增加超过100mg,按比例增加Buffer RL/2-ME 的用量。 3. 室温下,14,000 x g 离心5 分钟。 4. 把gDNA 过滤柱装在2ml 收集管中。把第三步的上清液转移至gDNA过滤柱中。14,000 x g 离心1 分钟。 5. 弃去gDNA 过滤柱。加入0.5倍体积无水乙醇(~250μl)至滤液中。用移液枪吸打3-5次混匀。 6. 把HiPure RNA Mini Column 装在2ml 收集管中。转移第5 步的混合液至RNA柱子中。10,000 x g 离心30-60 秒。 7. (可选)这一步可插入DNase 进行膜上消化。(请另外订购DNase On Column Kit 进化 膜上DNase 消化)。 8. 倒弃滤液,把柱子装在收集管中。加入500μl Buffer RW1 至柱子中。10,000 x g 离心30-60 秒。9. 倒弃滤液,把柱子装回收集管中。加入600μl Buffer RW2 (已用乙醇稀释)至柱子中。10,000 ×g 离心30-60 秒。 注:在使用Buffer RW2 之前,必须按瓶子标签指示用无水乙醇进行稀释。 10. 倒弃滤液,把柱子重新装回收集管中。加入600μl Buffer RW2(已用乙醇稀释)至柱 子中。10,000×g 离心30-60 秒。 11. 倒弃滤液,把柱子套回空的收集管。10,000 ×g 离心空柱2 分钟甩干柱子。 12. 将柱子转移至新的1.5ml 离心管。加入30-50μl DEPC 水至柱子的膜中央。静置2 分钟。10,000 ×g 离心1 分钟。 13. (可选)再加入30-50μl DEPC 水至柱子的膜中央。静置2 分钟。10,000 ×g 离心1 分钟。 注:HiPure RNA Column 最小的洗脱体积是30μl,小于30μl 会导致RNA 的洗脱效率下降。如果RNA 产量超过30μg,推荐按第13 步进行第二次洗脱。 14. 弃去柱子,把RNA 保存于-80oC。

植物RNA提取步骤

植物RNA提取步骤(附图) 实验步骤 1. 在eppendorf管中加入700ul 提取液(配方见后面)和10 ul巯基乙醇(在有褐化现象的时候再加就行,否则推荐不加),65度预热(可选)。 2. 研钵液氮预冷,取适量材料加入过量液氮,迅速研磨成均匀的粉末(有滑腻感),加入到预热的eppendorf管中水浴6min(可选).取出后加入氯仿、酚各350ul,振荡20min。 3. 4℃13000rpm 离心15min,同时在另外的eppendorf管加入氯仿、酚各350ul。 4. 吸取上清,加入到上述离心管中,振荡10 min。 5. 4℃13000rpm 离心8min。同时在另外的eppendorf管加入氯仿700ul。 6. 吸取上清,加入到上述离心管中,振荡10min。 7. 4℃13000rpm 离心8min。同时在另外的eppendorf管加入350ul的75%乙醇、350ul的8MLiCl。 8. 吸取上清,加入到上述离心管中,-20℃沉淀30min,13000rpm离心20min。 9. 弃上清,75%乙醇清洗两次。 溶于30ul 的水(DEPC水),直接进行测定浓度和电泳,CTAB结果如下(左侧四个):0.155ug/ul 260/280=2.11 260/230=2.20 SDS结果如下(右侧四个) 0.102ug/ul 260/280=1.78 260/230=2.05 电泳结果如下: 加入DNase和buffer(promega),37度消化30min,氯仿抽提两次,用1/10体积NaAc 和二倍体积无水乙醇沉淀15min,13000rpm离心10min.75%酒精洗两次, 溶于30ul 的水(DEPC水)中.

提取细胞RNA的步骤

提取细胞RNA的步骤 提取细胞RNA的步骤: 1) 六孔板每孔细胞中加入1ml Trizol,冰上放置5min,枪头吹打。 2) 将各孔裂解液吸到1.5 ml EP管中,加入氯仿0.2ml/管,用力振摇15s。15-30℃下孵育2-3min,离心(4℃,12,000g,15min)。 3) 离心后液体分为三层(上层-无色水样层为RNA,中层白色为DNA和底层红色为蛋白质),小心吸取上层无色液体移入一新的EP管中。 4) 加入等体积异丙醇,0.4-0.5ml,混匀,15-30℃下孵育10-30min,离心(4℃,12,000g,10min)。其中如果加入等体积异丙醇后,置于试管架上用PE手套密封后,放于4℃冰箱中,沉淀30min效果更好。 5) 去上清,沉淀加入75%乙醇1ml,漩涡振荡30s,离心(4℃,7,500g,5min)。 6) 小心去上清,管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。最好是用枪头吸取上清,尽量除去。 7) 加入20ul DEPC水溶解,分装5ul/管,-70℃冰箱保存。 8) 细胞总RNA的鉴定:0.9-1.2%琼脂糖电泳鉴定细胞总RNA,观察出现条带及各条带亮度。紫外分光光度计测定:分别测定细胞总RNA在260nm和280nm处的光密度值(OD),并计算RNA的含量和纯度。 1、实验目的 提取人体细胞的总RNA和mRNA。 2、本实验所需试剂 1)、CNE-2细胞及培养细胞的一系列条件, 2)、PBS缓冲液, TRIZOL试剂, 3)、DEPC处理过的水、大、中、小Tip及1.5 ml EP管, 4)、新的氯仿、异丙醇和乙醇, 5)、mRNA分离试剂盒:Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN。

(完整版)总RNA提取的原理、步骤

总RNA提取的原理、步骤 1.原理及方法(异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法) TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚,其中异硫氰酸胍可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA,有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。 2.简易步骤 细胞或组织,加入0.4ml TRIZOL试剂后匀浆 ↓ 室温静置5分钟 ↓ 加入1/5 TRIZOL试剂体积量的氯仿,剧烈震荡混匀 ↓ 室温静置5分钟,12000g 4℃离心l5分钟 ↓ 将上清液转移至新的离心管中,加入与上清液等体积的异丙醇,颠倒混匀 ↓ 室温静置10分钟,12000g 4℃离心l0分钟,弃上清 ↓ 向沉淀中加入1ml的75%乙醇清洗沉淀,12000g 4℃离心5分钟 ↓ 弃上清保留沉淀,干燥 ↓ 沉淀物溶解于11μl的DEPC处理水中 ↓ 注意:以上操作应在生物安全柜内完成,以防止污染。 注意事项 ①全程配戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌,可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。 ②使用灭菌的,一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA,避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。

③在TRIZOL中,RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分钟,用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。 ④用TRIZOL抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸入。如无例外,所有的操作应该在15 -30°C的条件下完成,试剂亦在 15 -30°C的条件下。 ⑤75%乙醇(用DEPC处理过的水配制:将水加入无RNA酶的玻璃瓶中,加入DEPC至 0.01% (v/v)。放置过夜并高压灭菌。) ⑥每50—100 mg组织加1ml的TRIZOL。匀浆化时组织样品容积不能超过TRIZOL容积的10%。 ⑦单层生长的细胞直接往直径3.5 cm的培养板中加入1ml的TRIZOL溶解细胞,通过移液管分次移出细胞裂解物。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的TRIZOL 量(每10 cm2加1 ml)。当TRIZOL量不足时可导致抽提的RNA中污染有DNA。 ⑧在匀化后和加入氯仿之前,样品可以在–60—–70°C保存至少一个月。RNA沉淀(RNA 洗脱)溶于75%的乙醇在2—8°C至少可以保存一周,在–5—–20°C下至少可保存一年。 逆转录cDNA及注意事项 如果cDNA当天不使用,则要保存在-20℃或-70℃。 RNA逆转录成cDNA操作流程简图如下:(在冰盒上操作) 1.将提取的RNA溶解于11 μl DEPC-t净化水中,加入1ul引物,1ul模板RNA,1uldNTP 轻微震荡后离心3-5秒。 2.在PCR扩增仪上70℃ 5分钟。 3.冰上冷却1分钟,并短暂离心,向反应体系中加入5×reaction buffer 4μl,RibolockTM Ribonuclease inhibitor (20 u/μl) 1μl,10 mM dNTP mix 2μl。 4.轻微震荡后离心3-5秒,在PCR扩增仪上37℃ 5分钟。 5.向反应体系中加入RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase (200u/ul) 1μl,在PCR 扩增仪上42℃ 60分钟进行逆转录,70℃ 10分钟灭活逆转录酶。 6.收集反应产物,冰上冷却

RNA提取步骤

1. 组织样品:称取20mg-50mg 样品,使用液氮研磨或者匀浆器匀浆,加入RNA-Solv ? Reagent裂解 2. 室温静置2-3 分钟。 3. 加入200μl 氯仿(氯仿的使用量为1/5 RNA-Solv ? Reagent 的使用量),涡旋混匀15 秒,冰浴10 分钟。 4. 4℃,12,000×g 离心15min。 5. 小心转移不大于80%的水相层至新的离心管,加入1/3 倍体积的无水乙醇,涡旋混匀15 秒。 6. 将HiBind RNA 结合柱套在2ml 离心管中,转移不大于700μl 混合液至HiBind RNA 结合柱中。 室温下10,000×g 离心1 分钟,弃滤液。 7. 重复步骤六,直至所有的混合液全部离心,结合到HiBind RNA 结合柱上。 8. 将HiBind RNA 结合柱套在新的2ml 离心管中,加300μl RNA Wash Buffer I 至HiBind RNA 结合柱中,10,000×g 离心1 分钟,弃滤液; 9. (选做)DNase I 消化: a. 配制DNase I(Digestion Buffer, 73.5μl; RNase-Free DNase I,1.5μl),混匀。 b. 将上述75μl DNase I 溶液转移至HiBind RNA 结合柱膜的正中央,不要将消化液转移至柱子内 壁。 c. 室温静置15 分钟。 10. 将HiBind RNA 结合柱套在同一个2ml 离心管中,加入400μl RNA Wash Buffer I 洗涤,如做了DNase I 消化,需室温静置 5 分钟,10,000×g 离心1 分钟,弃滤液。 11. 将HiBind RNA 结合柱套在同一个2ml 离心管中,加入500μl RNA Wash Buffer II 洗涤,10,000×g 离心 1 分钟,弃滤液。 12. 重复步骤11 一次,>10,000xg 离心空甩2min 干燥HiBind RNA 结合柱基质。 13. 将HiBind RNA 结合柱套在干净的1.5ml 离心管中,加30-50μl DEPC Water,室温静置2min。≥10,000xg 离心1min 洗脱RNA。

Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)

Trizol法使用步骤 一、分离纯化的基本原理 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库,RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。 二、用户需自备的试剂和材料 无水乙醇、氯仿、Glycogen(可能需要)、 1.5ml Eppendorf管(RNase-free)、Tips(RNase-free) 三、准备工作 RNase酶非常稳定,是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上,因此,在与RNA制备有关的分子生物学实验时,必须戴手套。 RNase的又一污染源是取液器,根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂,一种RNase抑制剂)配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。 1、料制品的处理 尽可能使用无菌,一次性塑料制品,已标明RNase-Free 的塑料制品,如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下: 1)在玻璃烧杯中注入去离子水,加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意:DEPC为剧毒物,活性很强,小心在通风柜中使用。 2)处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入DEPC水溶液,使塑料制品

的所有部分都浸泡到溶液中。 3)在通风柜中室温处理过夜。 4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟。 5)烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。 2、璃玻和金属物品 250°C烘烤3小时以上。 四、从组织中提取总RNA 1)液氮研磨:组织块直接放入研钵中,加入少量液氮,迅速研磨,待组织变软,再加少量液氮,再研磨,如此三次,按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol,转入离心管进行第2步操作。 (液氮既能使各种组织成分不易被破坏或降解,又能使组织变硬,脆性增加易于磨碎。终止细胞内外一切生物反应,防止RNA酶的降解反应) 2) 匀浆:组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol。另外,组织体积不能超过Trizol体积的10%,否则匀浆效果会不好,用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。 五、从细胞中提取总RNA 1) 培养贴壁细胞:不须消化,可直接用Trizol进行消化、裂解,Trizol体积按10cm2/ml比例加入。 2) 悬浮细胞可直接收集、裂解,每1ml Trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞,或107细菌细胞。 六、操作步骤 1、细胞或组织加Trizol后,室温放置5min,使其充分裂解。注:此时可放入-70℃长期保持。

RNA提取一般步骤总结

RNA提取一般步骤总结 RNA提取原理: | 通过变性剂破碎细胞或者组织,然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA,再经过沉淀,洗涤,晾干,最后溶解。但是由于RNA酶无处不在,随时可能将RNA降解,所以实验中有很多地方需要注意,稍有疏忽就会前功尽弃。 RNA提取的一般步骤 所有RNA的提取过程中都有五个关键点,即:样品细胞或组织的有效破碎;有效地使核蛋白复合体变性;对内源RNA酶的有效抑制;有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离;对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸,再用氯化锂将RNA沉淀出来;直接在酸性条件下抽提,酸性下DNA 与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失,目前该方法的使用频率已很低。 实验步骤: 破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。 1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行,可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织,加入β-ME可以抑制RNA酶活性。 2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂,加入少量异戊醇,经过此步,离心,RNA一般分布于上层,与蛋白层分开。 3、沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc(pH-5.2)或异丙醇。 4、洗涤RNA使用70%乙醇洗涤,有时,为避免RNA被洗掉,此步可以省掉,洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇,但是不能过于干燥,否则不易溶解。 5、融解RNA一般使用TE。 6、保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染,从富含RNase的样品(如胰脏、肝脏)中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA,对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA,在水中贮存一个星期就基本降解了,而从大鼠脾脏中提取的RNA,在水中保存3年仍保持稳定。另外,长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性,可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中,存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA 时,可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaAc至0.3M,12,000×g离心5分钟。 I氯化锂法提取总RNA: 本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶,用氯化锂选择沉淀RNA,其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA,具有快速简洁的长处,但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片断丢失的缺陷。 试验试剂: 1、氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L,过滤灭菌】 2、悬浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】 试验步骤: 1、对于大量组织或细胞,则每克组织或细胞加入5-10ml氯化锂-尿素溶液,匀桨器高速匀桨2分钟;对于少量细胞(107个细胞/ml),则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂-尿素溶液手工匀桨,并转移至Eppendof管中。

RNA提取标准流程图

RNA提取标准流程 原理: TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol使样品细胞裂解,溶解细胞含物,同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相,RNA在水相中,取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA。 预防RNase污染注意事项: 1.经常更换新手套,皮肤上常带有的细菌,霉菌可能成为RNase的来源。2.使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。 3.RNA提取过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿、塑料制品高压灭菌,然后烘干即可。 4.配制溶液应使用无RNase的水(将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.05% v/v,充分混匀后37oC放置过夜,高压灭菌。注:DEPC有致癌之嫌,需小心操作。) RNA的提取 准备试剂:氯仿,异丙醇(可保存在-20oC,用时取出置于冰上),75%乙醇,无RNase的水。所有.溶液均需用0.05% DEPC处理过的水配制。10×Loading buffer (宝生物工程(),货号:D603,35元,1mL×5支) 准备器材:1 mL、200 μL枪头、小烧杯*3、1.5 mL Eppendorf管、2 mL Eppe ndorf管若干、报纸、卷纸、研钵,以上物品全部需要高压。 操作步骤: 1. 研磨+匀浆:将组织在液氮中磨碎(大体积不均一的样品,如下丘脑、海马等神经组织、成年动物肾上腺等腺体,必须对整个组织研磨),取50~100 mg组织样品(肝脏可减少样品量到30 mg)放入2 mL离心管中,称重记录;均一组

织或者小体积的不均一组织可直接称重后匀浆。每50~100 mg组织加入1 mL TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。 2.将匀浆样品在室温(15~30oC)放置5 min(可延长到15 min),使核酸蛋白复合物完全分离。 可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖(如肝脏和肌肉中的糖原)或胞外物质(肌肉)可于2~8℃ 10000 × g离心10 min,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量基因组DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液转入2 mL管中进行下一步操作。 3. 每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿,剧烈振荡60 s(可使用混匀器,也可手动剧烈颠倒混匀),室温放置3 min。(可延长震荡时间和放置时间到15 min,同GTC 法) 4. 4oC 10000 × g离心15 min。样品分为三层:底层为红色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。(即1mL最多600μl,为保证RNA质量,可适量减少抽取量,防止抽到下层) 5. 记录抽取水相的量,把水相转移到新的1.5 mL Eppendorf管中,用等体积的预冷的异丙醇沉淀水相中的RNA。 a. 每使用1 mL TRIzol加入0.5 mL异丙醇,室温放置10 min。 b. 可选:应对糖原含量较高的组织(如肌肉和肝脏):每使用1 mL TRIzol在水相中加0.25 mL异丙醇和0.25 mL高盐溶液(0.8 M柠檬酸钠和1.2 M NaCl)混合离心,这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中,沉淀出RNA。 6. 4oC 10000 × g离心10 min,离心前看不出RNA沉淀(肌肉和肝脏等富含糖原的组织可能出现大量糖原沉淀),离心后在管侧和管底出现白色半透明状沉淀。弃上清。 8. 向1.5 mL Eppendorf管中加入75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1 mL TRIzol 至少加1 mL 75%乙醇。4℃不超过7500×g离心5 min,弃上清。 9.室温放置于超净台通风口(垫上已灭菌的吸水纸)干燥RNA沉淀,大约晾5~ 10 min即可,过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入适量DEPC水,记录使用的DEPC水体积(适量是指加入水后仍能保证RNA浓度至少≥0.5 μg/μL,但不影响溶解,浓度在4 μg/μL以上的RNA较容易出现溶解不完全的情

RNA提取及反转录合成cDNA具体实验步骤

RNA提取及反转录合成cDNA具体实验步骤 由杨盛于2011/6/8 12:56 创建 一、RNA提取前的准备 RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解和防止所用器具及试剂中的RNA 分解酶的污染。因此,在实验中必须采取以下措施: 1、戴一次性手套; 2、使用RNA操作专用实验台; 3、在操作过程中避免讲话等。 通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。 二、使用器具 尽量使用一次性塑料器皿,若用玻璃器皿,应在使用前按下列方法进行处理: 1、用0.1%DEPC水溶液在37℃下处理12小时, 2、然后在120℃下高温灭菌30min以除去残留的DEPC, (RNA实验用的器具建议专门使用,不要用于其他实验。) 三、试剂配制 用于RNA实验的试剂,须使用干热灭菌(180℃,60min)或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装(也可以使用RNA实验用的一次性塑料容器),使用的无菌水需用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。 RNA实验用的试剂和无菌水都应专用,避免混用后交叉污染。 四、实验操作 在研磨样品前,先把所要用到的试剂和枪头、研钵(未拆开报纸)放在超净工作台上,打开紫外灯照射20-30min杀菌。 1. 50-100mg的普通组织样品:RNAiso Plus 1ml

2. 试验样品的研磨和匀浆 (1)将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中,用研钵研磨组织,其间不断加入液氮,直至研磨成粉末状(无明显的 课件颗粒,如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量)。(研磨好的 样品立即加入RNAiso Plus) (2)对于普通的RNA提取样品,可以向研钵中加入适量的RNAiso Plus,将研磨成粉末状的样品完全覆盖,然后室温静置,直至样品完全融化, 再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。 (3)将匀浆液转移至离心管中,室温静置5min。 (4)12000g 4℃离心5min。 (5)小心吸取上清液,移入新的离心管中(切勿吸取沉淀)。 3.Total RNA 的提取 (加入RNAiso Plus 后,静置5min,离心转移上清,避免未破碎的杂蛋白污染) (1)向上述步骤2的匀浆裂解液中加入氯仿(RNAiso Plus 的1/5体积量),盖紧离心管盖,用手剧烈振荡15s(氯仿沸点低,易挥发,振荡时应小心 离心管突然弹开)。待溶液充分乳化(无分相现象)后,再室温静置5min。(2)12000 g 4℃离心15min。 (3)从离心机中小心取出离心管,此时匀浆液分为三层:无色的上清液、中间的白色蛋白层及带颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的 离心管中(切忌吸出白色中间层)。 (4)向上清中加入等体积的异丙醇,上下颠倒离心管充分混匀后,在15-30℃下静置10min。

RNA提取中的原理

氯仿是分子量比较大的有机溶剂,在提取RNA时,氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。DNA提取过程有机相中主要是酚和蛋白结合,从而使得蛋白和DNA脱离,DNA 进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DNA脱离,否则DNA会释放到水相。不管有酚也好,没有酚也好,氯仿本身也对蛋白有变性作用,剧烈的震荡,很容易使得DNA 的亲水基团,与水相接触。所以不要剧烈震荡。 异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受到保护,等同于沉淀,但是这是个反应时发生在水相中,与前面的氯仿不矛盾。 氯仿的作用有多个方面,一是作为有机溶剂变性蛋白,使其沉淀并通过离心除去,同时也通过变性作用抑制RNase活性;二是RNA提取试剂中通常含有苯酚(Trizol主要成分就是苯酚,很多自己配试剂提的方法也用苯酚,抽提蛋白时也会用到苯酚),苯酚微溶于水,抽提烷之后水相里有痕量的酚,如果不除去会损伤核酸,需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉;三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质(比如油脂、脂溶性色素等),起到一定除杂作用。 通常氯仿里面会加少量异戊醇(1/25),减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫,影响后续操作,不过个人经验感觉加不加没什么太大区别,也许是我的样品里蛋白不多吧。 异丙醇是沉淀核酸用的,作用和乙醇一样。只不过用量少一点,0.6V~1V就够了,不像乙醇沉淀需要至少2V,一般需要2.5倍体积。在水相很多,离心管容积有限,加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。不过感觉效果不如乙醇,偶尔会有沉淀不出来东西的时候。 Trizol法提RNA,加氯仿就是要剧烈手摇才行,这样才能彻底地两相混匀。而且DNA 在水饱和酚的酸性条件下是会被留在有机相的,不会跑水相里头去。 醇沉淀是很经常用的方法,因为RNA和某些杂质不溶于异丙醇,所以可以用来沉淀。 l楼主问的问题,我的个人理解是: 前面提取的RNA经异丙醇沉淀后,总会含有一些未除去的蛋白和其它杂质分子,这些蛋白和杂质分子如果不除尽的话,就会直接影响所提取的RNA的纯度和稳定性。为此,就需要用70%乙醇洗涤沉淀(因为在70%乙醇里RNA是不溶的,而一些蛋白和其它杂质分子却可溶),并且最好是洗涤2次,然后高速离心后,倒去上清,即可得到较纯的RNA沉淀。用无水乙醇则达不到这个目的!。 以下是我个人提取RNA时的操作总结,不正之处,请战友指正! 1.1 匀浆 1) 每个无菌的2 ml圆底离心管中加入0.75 ml TRIZOL试剂,每个大鼠的腺垂体从-80°C取出后立即于预冷的TRIZOL试剂里用POLYTRON组织匀浆器(瑞士)进行匀浆。 【注:1. 匀浆液的量按每50-100 mg组织加1 ml TRIZOL,样品的体积不能超过匀浆液体积的10%。2. TRIZOL试剂用前应于4°C保存,操作时应带手套和口罩。3. 匀浆器头用前需在3% H2O2(DEPCC水配)里浸泡,然后于0.1% DEPC水中空转2次,最后于TRIZOL试剂中空转2次,方可用于匀浆。4. 匀浆时间不宜太长,转速不宜过大,刚开始时由慢到快至中档处,然后减速,重复1-2次,未见有组织碎块即可.5.如果样品数多的话,可先将TRIZOL试剂一并加好,然后逐一加入样品匀浆。6.特注:每加完一种试剂,都应及时盖上管盖,夹取管子或者打开管子时,尽可能不要碰到管的内缘。】。 2) 将匀浆样品置于15-30°C下静置5分钟,以使核酸蛋白复合物完全分离。如果所

RNA提取原理及步骤

细菌总RNA提取 一、TRIzol溶液提取细胞总RNA实验原理 1. TRIzol溶液的成分及作用:苯酚、异硫氰酸胍、8-羟基喹啉等。其中苯酚可有效地变性蛋白质,但不能完全抑制RNA酶活性,8-羟基喹啉(可以抑制RNase,与氯仿联合使用可增强抑制作用)、异硫氰酸胍(是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失,导致细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸分离)、β-巯基乙醇(主要作用是破坏RNase 蛋白质中的二硫键)。因此内源和外源RNase(RNA酶)受抑制,在样品裂解或匀浆过程中,TRIZOL能保持RNA完整性。 2. 提取原理:细胞用TRIzol溶液裂解后,加入氯仿后溶液分为水相和有机相,RNA在水相中(上层)、中层为DNA、下层为粉色的蛋白质层。之后将水相取出,用异丙醇或者无水乙醇沉淀回收RNA。RNA沉淀用70%的乙醇进行漂洗,最后加ddH2O溶解。 二、实验步骤 1.取一只2mL离心管,加入大肠杆菌培养液0.7ml,10,000 rpm离心2 min,倒掉上清液。 2.加入2mL TRIzol溶液, 至菌体彻底悬浮并彻底裂解。之后,在室温下放置5min,使核酸蛋白质彻底分离。 3.往管中加入0.4ml氯仿,盖好管盖,剧烈震荡15sec,之后在室温放置3min。 4.4℃,13000rmp,离心15min。取出后,可见样品分成三层,RNA在水相中(上层)、中层为DNA、下层为粉色的蛋白质。 5.将上层水相小心取出(约0.5ml),加入1.5ml离心管中,往管中加入等体积的异丙醇。室温下在室温放置5min。 6. 4℃,13000rmp,离心10min。离心后,可见管底见胶装沉淀。 7.加入2ml 70%乙醇洗涤沉淀,之后倒出液体,注意不要将沉淀倒出,若沉淀松动,可稍离心。 8.用黄色枪头将剩余液体全部吸出后,往管中加入25μl ddH2O,彻底溶解RNA。 9.电泳检测RNA以及昨天实验的DNA。各取8μl样品与2μl loading buffer 混匀,点样。

RNA提取步骤及注意事项

RNA分离纯化的原理、提取步骤及注意事项 一、分离纯化的基本原理 研究基因的表达和调控时,常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库,RT-PCR和Northern Blot等分子生物学的成败。Trizol是一种新型总RNA提取试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。 二、需自备的试剂和材料 无水乙醇、氯仿、1.5mlEP管(无RNase)、枪头(无RNase)、异丙醇、水(DEPC处理) 低温离心机 三、提取步骤 1、从组织中提取总RNA ①液氮研磨。组织块直接放入研钵中,加入少量液氮,迅速研磨,待组织变 软,再加少量液氮,再研磨,如此三次,按50-100mg组织/mlTrizol加 入Trizol,转入离心管进行第二步操作。 ②匀浆。组织样品按50-100mg组织/mlTrizol加入Trizol,另外,组织体 积不能超过Trizol体积的10%,否则匀浆效果会不好,用电动匀浆器充 分匀浆约需1-2分钟。 2、从细胞中提取总RNA ①培养贴壁细胞:不需消化,可直接用Trizol进行消化、裂解,操作步骤: 吸尽培养液,用PBS洗涤细胞2-3次,按10cm2/mlTrizol比例加入Trizol,吹打,使细胞充分裂解。 ②对于悬浮细胞,可直接收集、裂解,每mlTrizol可裂解5×106动物、植 物或酵母细胞,或107细菌细胞。操作步骤:收集细胞,600g离心5min,弃上清,PBS洗涤细胞2-3次。 ③细胞或组织加入Trizol后,室温放置5min,使其充分裂解。(此时可放 入-70℃长期保存。 ④12000rpm离心5min,弃沉淀,上清吸入到另一个RNase-free的EP管中, 按200μL氯仿/mlTrizol加入氯仿,振荡混匀后室温放置15min。(禁用 涡旋振荡器,以免基因组DNA断裂)。 ⑤4℃,12000rpm离心15min,吸取上层水相,至另一个离心管中 (RNase-free)(千万不要吸取中间界面;若同时提取DNA和蛋白质,则 保留下层酚相保存于4℃冰箱,如只提取RNA,则弃下层酚相。 ⑥按0.5ml异丙醇/mlTrizol加入异丙醇,混匀,室温放置5-10min。4℃, 13000rpm离心15min,弃上清,RNA沉于管底。 ⑦按1ml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇,温和振荡离心管(或用枪头吹打), 悬浮沉淀。4℃,13000rpm离心15min,尽量弃上清。 ⑧室温晾干或真空干燥5-10min(RNA样品不要过于干燥,否则很难溶解)。 O溶解样品,立即进行反转录。 加入20μl Elution Buffer或H 2 四、注意事项 1、RNase非常稳定,是导致RNA降解的最主要的物质,它在一些极端的条件下 可以暂时失活,但限制因素去除后又迅速复性。用常规的高温高压蒸汽灭菌

Triol提取RNA步骤

RNA的提取 准备试剂:氯仿,异丙醇,75℅乙醇,无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制) 操作步骤: 1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。 b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol 加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。 c.细胞悬液离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。 3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。 5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。 6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。 7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。 8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。 9. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g 离心5分钟,弃上清。 10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥,过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解,-70℃保存。 注意事项: 1.从少量样品(1-10mg组织或102-104细胞)中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品,沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来,糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成,也不影响PCR反应。 2.匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。 3.分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机,2600×g离心30-60分钟。 预期产量:1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为: 肝和脾6-10μg ,肾3-4μg ,骨骼肌和脑组织1-1.5μg ,胎盘1-4μg ,上皮细胞8-15μg ,成纤维细胞 5-7μg 。 常见问题分析: 得率低:A.样品裂解或匀浆处理不彻底 B.RNA沉淀未完全溶解

RNA提取步骤详细解析

RNA抽提详细解析 1、RNA抽提原理 简单地讲,RNA抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的RNA游离在裂解体系中的过程,纯化则是使RNA与裂解体系中的其它成分,如DNA、蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。Trizol试剂的出现基本能解决绝大部分样品RNA抽提,该方法已经成为了RNA抽提的主流。 2、了解你的实验样品 如果你研究某个实验样品,并且要抽提它的RNA,以下的信息一定要先行收集:该样品的RNA含量、酶含量、特殊杂质含量。如果你对样品的特点一无所知,当样品稍微有一点复杂时,抽提RNA的实验就会碰到许多问题。以血液为例,如果你不知道鸟的血液中有核细胞的含量是人血的千倍左右,而使用人血一样的起始量去抽提鸟血的基因组DNA,怎么可能成功?失败了又怎么知道原因所在?同时,只有对实验样品有所了解,才能正确选择抽提方法。但同时提醒的是:没有信息是可怕的,更可怕的是将错误的信息当真的了。 3、实验样品量的取用 样品与Trizol的比例。这个问题非常重要,应该获得足够的重视。Trizol的Protocol,提供了一个简单的比例,1ml裂解液可以用于50-100mg组织或5-10X106个细胞;我的建议是,样品量绝对要小于资料所提供的。起始样品用多大,并没有具体的说法。如果不是样品量有限,则以能抽提出满足数次成功实验所需的RNA,作为决定样品起始量的基础,会比较合理的。不要因为1ml裂解液可以抽提100mg样品,就一定使用100mg样品。裂解液的用量,表面上与抽提的结果(纯度及得率) 没有关系,然而,在实际操作中,对结果是有比较大的影响的。裂解液的用量原则是:确保能彻底裂解样品,同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低,将导致沉淀效率低,影响得率;浓度过高,去除杂质的过程复杂且不彻底,导致纯度下降。不同得样品其RNA含量差别很大。高丰度(2-4ug/mg)的如肝脏,胰腺,心脏,中丰度(0.05-2ug/mg)的如脑,胚胎,肾脏,肺,胸腺,卵巢,低丰度(<0.05ug/mg)的如膀胱,骨,脂肪。考虑后续实验,一般情况下,高丰度的样品取用量大概是10-20mg/ml Trizol,中丰度样50mg/ml Trizol,低丰度样品我们可以根据客户提供的实验样品量酌情取用。重申一下,不是越多越好,在考虑样品在1ml Trizol里能充分裂解的同时,还得考虑大量的样品可能也会带来大量的杂质!利用Trizol试剂抽提血清样品时,Trizol/血清比值不要小于7/3。石蜡样品由于RNA降解严重,含量大打折扣,所以取样时应该按低丰度样品原则取用。 4、裂解方法 裂解的目的就是破坏细胞的结构,释放出里面的RNA,使其溶解于裂解液中。绝大

提取RNA步骤

实验目的: 提取动物组织RNA,备后续实验使用。 实验试剂: 研钵、镊子、刮勺、冰盒、试管架、微量移液器、RNA无酶管、低温离心机、酒精、液氮、Takara RNA提取试剂盒、去除DNA试剂盒冰袋 实验步骤: 1、实验准备:研钵中加入少量酒精,点燃,灭菌后,超净台灭菌30min(包括研钵、镊子、刮勺、试管架、微量移液器、RNA无酶管)。 2、取液氮、冰袋备、冰盒备用 3、将研钵预冷,其中大研钵的可以放在冰袋上,然后再倒入液氮,小研钵直接倒入少量液氮预冷。 4、将超低温冻结的RNA 提取样品,剪取绿豆到黄豆大小组织(不能太大,不要大于黄豆大小),迅速转移至用液氮预冷的研钵中,用研杵研磨组织,其间不断加入液氮,直至研磨成粉末状(无明显的可见颗粒,如果没有研磨彻底会影响RNA 的收率和质量)。可用刮勺将其刮到一团。 5、可以向4的研钵中加入适量的含有裂解液的Buffer RL,(大约700ul),确保研磨成粉末状的样品完全覆盖,然后室温静置(研钵倾斜放置),直至样品完全融化后用枪头吹打混匀,只至液体中无明显沉淀。这期间可以研磨下一组织。 6、将步骤5中的匀浆液转移至1.5mlRNA无酶管中,12,000 rpm,4℃离心5 分钟。期间配置70%乙醇(7份无水乙醇+3份水(为试剂盒中的RNA无酶水)) 7、小心吸取6步骤上清液(吸取400ul即可),移入1.5ml的RNase Free collection(切勿吸取沉淀,否则会阻塞后面的膜)。然后向其中加入等体积的70%乙醇,此时可见沉淀,立即摇匀。 8、将7中的混合液,取600ul(要小于600ul)到RNA spin column (含2ml collection Tube)中,12,000 rpm,4℃离心1 分钟,弃滤液。将RNA spin column 放到2ml collection Tube管中。 9、将500ul buffer RWA加入至RNA spin column 12,000 rpm,4℃离心30s,弃滤液。 10、将600ul buffer RWB 沿壁加入至RNA spin column 12,000 rpm,4℃离心30s,弃滤液。 11、消化DNA

提取RNA原理及其常遇到的问题

RNA提取一般步骤总结 提取原理:通过变性剂破碎细胞或者组织,然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA,再经过沉淀,洗涤,晾- E/ a% A-RNA 干,最后溶解。但是由于RNA酶无处不在,随时可能将RNA降解,所以实验中有很多地方需要注意,稍有疏忽就会前功尽弃。- M: d9 I3 }8 RNA提取的一般步骤 4 e$ s" p+ [6 l6 m* b 所有RNA的提取过程中都有五个关键点,即:样品细胞或组织的有效破碎;有效地使核蛋白复合体变性;对内源RNA酶的有效抑制;有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离;对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸,再用氯化锂将RNA沉淀出来;直接在酸性条件下抽提,酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失,目前该方法的使用频率已很低。 实验步骤:: ?1 i1 U& ^% N% A! z 破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。 1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行,可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织,加入β-ME可以抑制RNA酶活性。. |# j$ w) s- q5 r5 2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂,加入少量异戊醇,经过此步,离心,RNA一般分布于上层,与蛋白层分开。8 l2 T) ^" |" L. a# n 3、沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc(pH-5.2)或异丙醇。 4、洗涤RNA使用70%乙醇洗涤,有时,为避免RNA被洗掉,此步可以省掉,洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇,但是不能过于干燥,否则不易溶解。 5、融解RNA一般使用TE。 6、保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染,从富含RNase的样品(如胰脏、肝脏)中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA,对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA,在水中贮存一个星期就基本降解了,而从大鼠脾脏中提取的RNA,在水中保存3年仍保持稳定。另外,长度大于4kb 的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性,可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中,存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时,可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaAc至0.3M,12,000×g 离心5分钟。 氯化锂法提取总RNA: 本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶,用氯化锂选择沉淀RNA,其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA,具有快速简洁的长处,但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片断丢失的缺陷。试验试剂: 1、氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L,过滤灭菌】: _* I/ t M+ w8 a# ]- K' N+ c/ a3 C 2、悬浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】% c5 L+ z& ?2 b! y3 z+ } t 试验步骤:

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