文档库

最新最全的文档下载
当前位置:文档库 > 高羊茅EST-SSR标记的开发及品种鉴定-2019年精选文档

高羊茅EST-SSR标记的开发及品种鉴定-2019年精选文档

高羊茅EST-SSR标记的开发及品种鉴定

高羊茅(Festuca arundinacea)别名苇状羊茅,属禾本科(P0aceao)早熟禾亚科(Pooideae)早熟禾族(Poeae)羊茅属内的Boyinae亚属,是温带地区广泛种植的六倍体多年生草坪草。作为耐热的冷季型草坪草,不但能忍受冬季低温,而且也能在一定程度上忍受夏季的高温而不至于枯黄,因此适合在我国大部分地区生长,近年来已成为我国主要的草坪草之一。

我国高羊茅种子主要依靠进口。一些不法种子经营者唯利是图,以劣质高羊茅种子充斥市场,给生产造成极大的损失,生产者、经营者对高羊茅纯度检验的要求日益迫切。由于高羊茅是多倍体作物,其异花授粉和自交不亲和性限制了经典遗传学研究的深入开展,分子标记是解开这道难题的便利途径。

目前已经开展的高羊茅分子标记研究包括:由Southern杂交衍生的RFLPs标记(Re-striction Fragment Length Polymorphisms,限制性片段长度多态性)和基于PCR扩增的标记,包括RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA,随机扩增多态性DNA)、AFLP(Amplified FragmentsLength Polymorphism,扩增片段长度多态性)、SSR(Simple Sequence Repeats,简单重复序列,又称微卫星DNA)及ISSR(Inter-simple Sequence

Re-peats,即简单重复序列间扩增,或锚定SSR)等,另外PCR

和RFLP结合的PCR-RFLP也已经得到应用。这些研究主要应用在

遗传图谱构建、比较基因组作图、系统分类亲缘关系的研究、遗传多样性的分析和利用品种指纹图谱进行杂种鉴定。而利用EST-SSR进行高羊茅品种鉴定尚未见报道。本研究拟对11个优良高羊茅品种的遗传多样性进行SSR分析,以期为高羊茅快速品种鉴定技术提供理论依据。

1、材料与方法

1.1 材料

试验材料:从山东各地市场搜集的主栽高羊茅品种11份,分别是:Amigo、Alamo、Quest、Re-ward、王朝、凌志、维加斯、金王月、翠碧、南方选择、爆炸组合。

引物序列:来自文献中EST-SSR,利用DNAman软件进行重新设计,设计原则如下:SSR序列的开始和结束位置分别距5?

和3?端不少于20bp;引物长度19-24bp;退火温度Tm值50-67℃。且上游和下游引物的Tm值相差不大于5℃;(G+C)含量30%

-70%;PCR扩增产物长度100-600bp;尽量避免引物二级结构和寡二聚体的出现。最后筛选到50对引物交付上海生工生物技术服务XX公司合成。PCR所用的Mg2+、Taq酶、dNTP、Buffer均购自上海生工生物技术服务XX公司。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取高羊茅是一种常异花授粉植物。根据预备试验单株幼苗的提取效果和文献报道得出的有代表性的

取样量,每品种随机选取30个生长良好的发芽7天后的单株幼

嫩叶片等量混合,采用改良CTAB法和Tiangen试剂盒法提取DNA 并进行比较试验。

利用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度,样品于4℃冰箱保存备用。

1.2.2 PCR反应体系的建立及优化

对Mg2+浓度、dNTP、引物浓度、Taq酶浓度进行4因素3水平的正交试验,并在BIOMETRA TGRADIENT梯度PCR仪上进行引物最佳复性温度的筛选。最适合于高羊茅SSR分析的20μl优化反应体系为:模板10ng/μl,dNTP 240μmol/L,引物浓度

0.4μmol/L,Taq酶1.0 U,Mg2+2.5mmol/L。PCR反应程序为:94℃预变性4min;94℃变性30s,50-57℃变性30s,72℃延伸1min,共35个循环;72℃延伸5min,4℃保存。

1.3 电泳检测

PCR产物先经3%琼脂糖凝胶(含1%Gold-viewII)电泳检测扩增效果后,再经6%脲变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,银染方法参照文献的改进方法,最后进行照相。

2、结果与分析

2.1 基因组DNA提取及检测

以Alamo幼苗进行的DNA提取方法的比较试验结果(见图1)表明:CTAB法提取的DNA量大,但存在严重的拖尾,可能是因为所提取的DNA分子量范围比较大或者存在残余的RNA。而Tiangen试剂盒法提取的DNA亮度较小,但电泳条带很狭窄,说

明所提取的DNA分子量范围均一,试剂盒中存在RNase,可以将残余的RNA降解掉。同时CTAB法需要1.5个工作日而Tian-gen 法仅需要0.5个工作日,提高了工作效率。

2.2 EST-SSR标记在高羊茅上的通用性

通过对50对EST-SSR引物的筛选,发现有42对可以从11种高羊茅上得到有效扩增产物,占引物总数的84%。但不同引物扩增情况不同。从扩增片段大小上看,大部分在预期片段范围内(表1),个别位点上出现了比预期产物大的片段。同时扩增到的片段数目也不尽相同。扩增片段大小的不同则反映出内含子的插入与否或等位基因间SSR重复模体单元的差异。扩增片段数目的差异说明相应位点上的等位基因数目不同。

2.3 供试材料SSR扩增产物的多态性分析

有效扩增的42对EST-SSR引物的电泳谱带多态性分析表明,42对引物中有12对(表1)在不同样品间产生多态性分离,引物的多态性比率为28.6%。其它引物在不同样品间获得的谱带类型一致,没有分离。因此主要利用这12对核心引物进行品种鉴定。

供试的11份高羊茅材料的扩增结果见表2。可以看出:共检测到86个等位基因,平均每个位点的等位基因数目是4.5个,变幅为3-12;从谱带类型上看:S3和S44引物扩增的谱带类型最少(2类),多态性百分率最低,为18.2%,而S11引物扩增的谱带类型最多(9种),多态性百分率最高,为81.8%;共扩增

到多态性谱带65种,平均多态百分率为59.1%。

从品种鉴定的角度看,以引物S11为例,扩增到了9种多态性谱带(图2),其中Amigo和Quest具有相同的谱带,金王月和爆炸组合具有相同的谱带,而其他品种在这个位点上谱带不同。试验中发现不同引物不同品种扩增的产物存在谱带重合的情况,因此只用1个引物进行品种鉴定区分是很不合理的,必须结合其他引物进行综合的判断。品种间存在两个以上的位点有区别才算作两个不同的品种。试验表明,利用SSR技术进行高羊茅品种鉴定是可行、有效的。

3、讨论与结论

3.1 高羊茅种子昂贵,且国内高羊茅草坪生产用种主要靠从国外引进,随着贸易量的逐年增多,加快检疫速度迫在眉睫。Tiangen试剂盒法对比传统的CTAB法提取的总DNA数量可能较少,但质量高,试剂盒中的RNase可以有效去除RNA,同时提取时间较短,可以降低降解的概率同时又大幅度提高工作效率(从18h减到6h)。有效缩短检测周期才能满足贸易性进口种子快速检疫通关的需求,这对于建立快速室内品种鉴定技术是很有意义的。

3.2 与来源于基因组的SSR标记相比,EST-SSR标记来源于相对保守的转录区域,所以比基因组SSR标记具有更高的通用性。这与本试验的结果是一致的。因此,虽然EST-SSR标记的开发仅限于EST序列数据库早已存在的物种,但对于一个特定物

种,若缺乏相关的序列资料,源于其他近缘种的EST-SSR标记将是有效和可用的标记资源,这将节约引物的开发成本,也为比较基因组学研究提供了一个新途径。

3.3 本研究从筛选出的42对SSR引物中,选取扩增谱带稳定性较好、多态性和分辨率较高的12对,利用它们的电泳图谱组合构成了供试高羊茅材料特有的DNA指纹,将这些材料逐一区分开。试验表明,SSR标记具有高分辨力特性及共显性的遗传方式,用于高羊茅鉴定是可行的。从构建高羊茅品种鉴定规程的角度看,本试验所选取的位点数目以及涉及的品种还很有限,是否可以有效鉴别其他高羊茅品种还需进行深入研究。