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美国药典 USP36微生物限度检查

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USP36 1117 优良微生物检测规范(中英文1/ 2)

2013-08-09 15:30:46| 分类:USP|举报|字号订阅

1117 MICROBIOLOGICAL BEST LABORATORY PRACTICES 优良微生物检测规范INTRODUCTION 介绍

Good laboratory practices in a microbiology laboratory consist of activities that depend on several principles: aseptic technique, control of media, control of test strains, operation and control of equipment, diligent recording and evaluation of data, and training of the laboratory staff. Because of the inherent risk of variability in microbiology data, reliability and reproducibility are dependent on the use of accepted methods and adherence to good laboratory practices.

优良微生物检测规范由一些活动组成,这些活动依赖于几个基本要素:无菌技术、培养基控制、检测用菌株控制、设备操作和控制、完善的记录和数据评估、化验室员工的培训。由于微生物数据具有天生的不确定性,数据的可靠性和重复性取决于是否使用被接受的方法,以及是否严格遵守化验室规范。

MEDIA PREPARATION AND QUALITY CONTROL 培养基制备和质量控制

Media Preparation 培养基制备

Culture media are the basis for most microbiological tests. Safeguarding the quality of the media is therefore critical to the success of the microbiology laboratory. Media preparation, proper storage, and quality control testing can ensure a consistent supply of high-quality media.

培养基是大多数微生物测试的基础。保证培养基的质量因而成为微生物实验室成功的关键。培养基的制备、合适的存贮和质量控制检测可以保证持续高质量培养基供应。

It is important to choose the correct media or components in making media based on the use of accepted sources or references for formulas. The manufacturer's formula and instructions for preparation routinely accompany dehydrated media and

ready-made media. Because different media types may have different preparation requirements (e.g., heating, additives, and pH adjustment), it is important to follow these instructions to ensure preparation of acceptable media quality. A certificate of analysis describing expiration dating and recommended storage conditions accompanies ready-made media, as well as the quality control organisms used in growth-promotion and selectivity testing of that media.

在制备培养基过程中使用已接受的来源或配方标准,选择正确的培养基或成份是非常重要的。一般生产商在供应培养基干粉和配制好的培养基时,其配方和配制指示都会随货发送。由于不同的培养基类型可能有不同的配制要求(例如,加热、添加剂,和pH值调节),重要的一点是需要遵守其提供的配制指示以保证配制出的培养基质量。如果是已制备好的培养基碟/瓶,随货会收到指明有效期和推荐的存贮条件的分析报告,以及促生产试验用微生物种类,和该培养基的选择性试验用微生物种类。

Water is the universal diluent for microbiological media. Purified Water is most often used for media preparation, but in certain cases the use of deionized or distilled water may be appropriate. Water of lesser quality should not be used for microbiological media preparation. The volume of the water used should be recorded.

水是通用的微生物培养基稀释剂。纯化水常用于培养基制备,但在某些情况下,也可以使用去离子水或蒸馏水。更低品质的水不应用于微生物培养基制备。水的用量应记录。Consistent preparation of media requires accurate weighing of dehydrated media or media constituents. A calibrated balance with the appropriate weight range for the ingredients should be used (See Weighing on an Analytical Balance1251). Clean weighing containers and tools (such as spatulas) should be used to prevent foreign substances from entering the formulation. The weight of the components should be recorded.

要保持培养基配制的一致性,需要对培养基干粉或培养基组份进行准确称量。应使用在所需称量范围内经过校正的天平(见1251分析天平称量)。应对称重容器和工具(例如料勺)进行清洁以保证无异物进入所配物料。各成份的重量应进行记录。Dehydrated media should be thoroughly dissolved in water before dispensing and sterilization. If heating is necessary to help dissolve the media, care should be taken not to overheat media, because all culture media, to a greater or lesser extent, are

heat-sensitive. Equipment used in the preparation of media should be appropriate to allow for controlled heating, constant agitation, and mixing of the media.

培养基干粉应在水中完全溶解,然后进行配制和灭菌。如果需要加热助溶,要注意不能过热,因为所有的培养基,或多或少,都是对热敏感的。用于培养基配制的设备应适当,以便控制加热、持续搅拌和培养基混合。

Darkening of media (Maillard-type reaction or nonenzymatic browning) is a general indication of overheating. When adding required supplements to media, adequate mixing of the medium after adding the supplement should be performed.

培养基变黑(美拉德类型反应或非酶褐变)一般说明过热。在向培养基中加入所需要的补充成分时,在加入后需要进行充分搅拌混合。

Preparation of media in poorly cleaned glassware can allow inhibitory substances to enter the media.

在清洁不彻底的玻璃器皿中配制培养基会使得抑制性物质带入培养基。

Inhibitory substances can come from detergent residue after cleaning glassware or from prior materials used in the glassware. Be sure that the cleaning process removes debris and foreign matter, and that the detergent is thoroughly rinsed out with Purified Water. See Cleaning Glass Apparatus1051for additional guidance.

抑制性物质可能来自于玻璃器皿中的清洁剂残留,或来自于玻璃器皿中上次所盛装的物料。要保证清洗程序可以去除残渣和外来物质,并且清洁剂可以被纯化水彻底冲洗掉。参见1051玻璃容器的清洁。

Sterilization of media should be performed within the parameters provided by the manufacturer or validated by the user. Commercially prepared media should provide documentation of the sterilization method used.

培养基灭菌应在生产商提供的参数范围,或用户验证的参数范围内实施。商业制备好的培养基应随货有所用的灭菌方法。

Autoclaving by moist heat is the preferred sterilization technique, except in instances when boiling is required in order to avoid deterioration of heat-labile components of the media. Sterilization by filtration may also be appropriate for some formulations.

湿热灭菌是较好的灭菌技术,除非需要煮沸以避免培养基中不耐热成分被破坏。有些配方可能适用过滤灭菌。

The effects of the sterilization method and conditions on the media should be validated by sterility and growth-promotion testing of the media. In addition, if sterilized by moist heat, the autoclave cycle should be validated to ensure proper heat distribution for selected loads and volumes. Typically, manufacturers recommend using an autoclave cycle of 121 for 15 minutes using a validated autoclave. These conditions apply to time at temperature of the media. As container size and the load configuration of the autoclave will influence the rate of heating, longer cycles may be required for larger loads. However, the sterilization time will be dependent on the media volume and autoclave load. Sterilization cycles in which the autoclave is slow to come up to temperature may result in overheating of the media. Therefore, care must be taken to validate a sterilization cycle, balancing the need for sterile media against the tendency of the media to degrade under excessive heating. Storage of the media in the autoclave after the liquid cycle is completed is not recommended after cooling, as it may damage the media. Improper heating or sterilizing conditions—for commercially prepared or internally prepared media—may result in a difference in color change, loss of clarity, altered gel strength, or pH drift from the manufacturer's recommended range, as well as reduced growth-promotion activity and/or selectivity.灭菌方法和条件对培养基的影响应经过无菌验证和培养基促生长试验确认。另外,如果采用湿热灭菌,灭菌周期应进行验主下以保证在所选的负载和体积下的热分布。生产商一般会推荐采用121℃15分钟作为灭菌条件,培养基灭菌即采用此条件。由于容器尺寸和灭菌器的负载参数会影响加热速度,如果负载较大时,应延长灭菌时间。当然,灭菌时间还是取决于培养基体积和灭菌负载。升温较慢的灭菌条件可能会导致培养基过热,因此需要特别注意灭菌周期的验证,在培养期灭菌要求和培养基在过热条件下分解中寻求平衡点。在灭菌结束冷却后,不建议将培养基留在灭菌器中存贮,因为可能会对培养基造成损坏。不适当的加热或灭菌条件---对于商业制备的培养基或公司自制的培养基-----可能会导致颜色变化差异、澄清度差、胶强度改变、或pH值超出生产商指定范围、以及促生产试验表示出活性下降和/或具有选择性。

The pH of each batch of medium should be confirmed after it has cooled to room temperature (20 –25 ) by aseptically withdrawing a sample for testing. Refrigerated purchased media should be allowed to warm up to ambient room temperature if it is to

be checked for pH confirmation. A flat pH probe is recommended for agar surfaces, and an immersion probe is recommended for liquids. See pH791for guidance with pH measurement and instrument calibration. The pH of media should be in a range of ±0.2 of the value indicated by the manufacturer, unless a wider range is acceptable by the validated method.

每个批次培养基在冷却到室温后(20-25℃),应采用无菌方式取样检测pH值;冷冻的采购来的培养基应在升温至室温后检测pH值。建议对培养基平面采用扁平的pH探头,液体培养基则采用浸入式探头。pH值测量和仪器校正指南见pH791.除非有验证过的方法可以接受一个更宽的范围,否则培养基的pH值应在生产商指示的pH值±0.2之内。

Prepared media should be checked by appropriate inspection of plates and tubes for the following:

培养基制备好后,应对碟或管进行以下检查

—Cracked containers or lids

—容器或盖裂开

—Unequal filling of containers

—容器填充不匀

—Dehydration resulting in cracks or dimpled surfaces on solid medium

—脱水导致固体培养基裂开或凸陷

—Hemolysis

—溶血

—Excessive darkening or color change

—太黑或颜色变化

—Crystal formation from possible freezing

—可能因为冷冻引起的结晶

—Excessive number of bubbles

—过量气泡

—Microbial contamination

—微生物污染

—Status of redox indicators (if appropriate)

—氧化还原指示剂状态(适用时)

—Lot number and expiration date checked and recorded

—检查批号和有效期并记录

—Sterility of the media

—培养基灭菌

—Cleanliness of plates (lid should not stick to dish)

—培养基用碟清洁(盖不应该粘在碟上)

Media Storage 培养基存贮

It is prudent to consider how the manufacturer or supplier transports and stores media before distribution to the end user. Manufacturers of media should use transport and storage conditions that minimize the loss of moisture, control the temperature, prevent microbial contamination, and provide mechanical protection to the prepared media.

培养基的生产商或供应商在培养基销售给最终用户前的运输和存贮方式是需要慎重考虑的。培养基生产商所采用的运输和贮存条件应最大程度降低水份损失、保证温度的控制、防止微生物污染,提供对已制备培养基的物理保护。

Media should be labeled properly with batch or lot numbers, preparation and expiration dates, and media identification. Media should be stored according to the manufacturer's instructions. Media prepared in house should be stored under validated conditions. Do not store agar at or below 0℃, as freezing could damage the gel structure. Protect stored media from exposure to light and excessive temperature. Before prolonged storage, agar plates should be placed into a sealed package or container to retard moisture loss.

培养基应标识批号,制备时间和有效期,以及培养基识别信息。培养基应根据生产商指示进行存贮。公司自己制备的培养基应在经过验证条件下存贮,不要将培养基存贮等于或低于0℃条件下,因为结冻可能会对胶质结构造成损伤。存贮期间培养基应避光,避免超温。如果要延长存贮时间,培养基碟应放在密封的包装或容器中以减少水分损失。Remelting of an original container of solid media should be performed only once to avoid media whose quality is compromised by overheating or potential contamination. It is recommended that remelting be performed in a heated water bath or by using free-flowing steam. The use of microwave ovens and heating plates is common, but care should be taken to avoid damaging media by overheating and to avoid the potential injury to laboratory personnel from glass breakage and burns. The molten agar medium should be held in a monitored water bath at a temperature of 45 to 50 for not more than 8 hours.

固体培养基只能解冻一次,以避免培养基由于过热或潜在污染造成质量问题。建议在热水浴中或使用自由流动蒸汽中解冻培养基。通常会使用微波炉和加热盘,但需要注意避免因为过热造成培养基损伤,避免因玻璃仪器破裂和燃烧引起化验室人员受伤。熔融的培养基应在40-45℃水浴中不超过8小时。

Caution should be taken when pouring the media from a container immersed in a water bath to prevent water from the bath commingling with the poured sterile media. Wiping the exterior of the container dry before pouring may be advisable.

将培养基从浸在水浴中的容器中倒出时要特别注意,避免水浴用水混入倒出的无菌培养基中。最好在将容器从水浴中取出后、倾倒前,将容器外表面擦干。

Disposal of used cultured media (as well as expired media) should follow local biological hazard safety procedures.

使用过的培养基处理(和过期的培养基)需要按照微生物危险控制程序处理。

Quality Control Testing 质量控制检测

Although growth media can be prepared in a laboratory from individual components, many laboratories, for ease of use, use dehydrated media or purchase commercially prepared media in plastic plates or glass containers. Manufacturers of media attempt to standardize raw materials from biological sources, but must constantly deal with unavoidable differences in raw materials obtained from natural sources, and therefore,

lot-to-lot variability of media must be considered. In addition, the performance of media prepared in a laboratory or by a manufacturer is highly dependent on preparation and storage conditions.

虽然生产用培养基可以采用各组份配制而成,但许多化验室为了方便,采用培养基干粉或采购商业制备的装在塑料培养皿或玻璃容器中的培养基。培养基生产商会尽量采用同一生物来源的原料,但这些原料不可避免会有差异,因此需要考虑到培养基批次之间的差异。另外化验室制备的或者生产商制备的培养基的性能很大程度度上取决于培养条件和存贮条件。

Improper media preparation can cause unsatisfactory conditions for microbial growth or recovery and unreliable results.

培养基制备不当会导致微生物生长或回收条件不理想,从而导致不可靠的结果。

Therefore, quality control tests should be performed on all prepared media, including media associated with swabs or media in strips and other nontraditional formats. Tests routinely performed on in-house prepared media should include pH, growth promotion, inhibition, and indicative properties (as appropriate), and periodic stability checks to confirm the expiration dating.

因此,需要对制备的所有培养基进行质量控制检测,包括擦拭结合培养基、条状培养基和其它非传统方式。一般公司自制培养基检测应包括pH值、促生长试验、抑制试验和指示性试验(如需要),并进行定期稳定性检查以确认有效期。

When in-house prepared microbiological media are properly prepared and sterilized using a validated method, the growth-promotion testing may be limited to each incoming lot of dehydrated media, unless otherwise instructed by the relevant compendial method. If the media preparation procedure was not validated, then every batch of media should be subjected to growth-promotion testing. Test organisms may be selected from the appropriate compendial test chapter. In addition, microorganisms used in growth-promotion testing may be based on the manufacturer's recommendation for a particular medium, or may include representative environmental isolates (but these latter are not to be construed as compendial requirements).

如果公司采用经过验证的方法进行培养基制备和灭菌,则促生产试验可以是只针对购入的每个培养基干粉批次,除非相关药典方法另有要求。如果培养基制备程序未经验证,则所制备的每个批次培养基均需要进行促生长试验。检验用菌种可以从相应的药典检测章节中选择。另外,对于特殊的培养基,用于促生长试验的菌株可以采用生产商推荐的品种,或包括有代表性的环境隔离物(但后者不构成药典要求的内容)。

Expiration dates on media should have supporting growth-promotion testing to indicate that the performance of the media still meets acceptance criteria up to and including the expiration date. The length of shelf life of a batch of media will depend on the stability of the ingredients and formulation under specified conditions, as well as the type of container and closure.

培养基的有效期应能支持促生长试验,在培养基有效期内及到到有效期时,该培养基应仍符合可接受标准。一个批次培养基货架期长度取决于配料成份的稳定性、在特定条件下的配方,以及容器和密封的形式。

When a batch of media does not meet the requirements of growth-promotion testing, an investigation should be initiated to identify the cause. This investigation should include a corrective action plan to prevent the recurrence of the problem. Any batch of media that fails growth-promotion testing is unsuitable for use.

如果培养基的促生长试验失败,则应启动调查程序寻找原因。该调查应包括纠正措施以防止相同问题重复发生。所有促生产试验失败的培养基不得用于检测。[NOTE—Failed growth-promotion test results may not be used to negate positive test results. ]

注:促生产试验失败可能会导致阳性检测为阴性。

Some reagents are used for diagnostic purposes to help support identification of microbial organisms, e.g., Gram stain and oxidase test reagents. These may have attributes that can be quality control tested similar to microbiological media. Select the correct quality control standard microorganisms, following the manufacturer's instructions, and perform the testing before unknown sample diagnostic testing. All relevant diagnostic reagents should be subjected to incoming quality confirmation before use.

有些诊断试剂用于帮助鉴别微生物种类,例如革兰氏染色和氧化酶检测试剂。这些试剂具有与微生物培养基类似的进行质量控制测试的特性。选择正确的质量控制标准微生物,按照生产商指示,在未知样品诊断检测前进行测试。所有相关的诊断试剂均应进行进厂质量确认才可使用。

Special care should be taken with media that is used in sterility tests (see Sterility Tests71for requirements) and in environmental monitoring studies. Media used for environmental monitoring of critical areas should preferably be double-wrapped and terminally sterilized. If terminal sterilization is not performed, media should be subjected to 100% pre-incubation and inspection before use within a critical area. [NOTE—Growth-promotion testing for this media must be performed after the preincubation stage. ] This will prevent extraneous contamination from being carried into controlled environments and will prevent false-positive results. A raised agar level for surface contact plates should be verified.

用于无菌检测(见71无菌检测)和环境监控研究的培养基需要特别注意。用于关键区域环境监控的培养基最好用双层包装,并采用最终灭菌方式。如果无法进行最终灭菌,则在使用前应进行100%预培养并检查【注:该培养基的促生长试验必须在预培养阶段后进行】。这样能防止由于携入受控制环境中所产生的额外污染,防止假阳性结果。接触碟培养基厚度应进行确认。

MAINTENANCE OF MICROBIOLOGICAL CULTURES 微生物培养维护

Biological specimens can be the most delicate standards to handle because their viability and characteristics are dependent on adequate handling and storage. Standardizing the handling and storage of cultures by the user laboratory should be done in a way that will minimize the opportunity for contamination or alteration of growth characteristics. The careful and consistent treatment of stock cultures is critically important to the consistency of microbiological test results. Cultures for use in compendial tests should be acquired from a national culture collection or a qualified secondary supplier.

生物种属可能是最精致的分类标准,因为其活性和属性取决于充分的处理和存贮。在使用菌种的化验室,其菌种处理和存贮应采用标准化程序以最大程度降低污染或生长特性变异。对库存菌种进行小心的处理对于保证微生物检验结果的一致性是至关重要的。在药典检测中使用的菌种应从国家菌种保藏中心或有资质的二级供应商处获取。

They can be acquired frozen, freeze-dried, on slants, or in ready-to-use forms. Confirmation of the purity of the culture and the identity of the culture should be performed before its use in quality control testing.

菌种可以是冰冻、冻干、斜面或即用即配形式。在将其用于质量控制检测前应对培养物的纯度进行确认和鉴别。

Ready-to-use cultures should be subjected to incoming testing for purity and identity before use. The confirmation of identity for commonly used laboratory strains should ideally be done at the level of genus and species.

临用现配菌种应在进厂时检测其纯度和鉴别方可使用。化验室常用菌株的鉴别最好在其属和种的层次进行。

Preparation and resuscitation of cultures should follow the instructions of the supplier or a validated, established method. The “Seed-Lot” technique is recommended for storage of stock cultures.

菌种的制备和接种应遵守供应商的指示,或遵守经过验证的已有的方法。建议对菌种保藏采用“种子批”技术。

The original sample from the national culture collection or a qualified secondary supplier is resuscitated and grown in an appropriate medium. Aliquots of this stock culture (the first transfer or passage) are suspended in a cryoprotective medium, transferred to vials, and frozen at –30℃ or below, until use. If stored at –70 ℃, or in lyophilized form, strains may be kept indefinitely. These frozen stocks can then be used to inoculate monthly or weekly working cultures. Once opened, do not refreeze unused cell suspensions after culturing a working suspension. The unused portion should be discarded to minimize the risk of loss of viability and contamination of the stock.

从国家菌种保藏中心或有资质的二级供应商获得的原始样品在适当的培养基中进行复苏和生产。库存菌种(第一次传递或通道)的分装为低温防护培养基形成混悬液,转移至小瓶,在-30℃下冷冻直至使用。如果在-70℃下存贮,或以冻干形式存贮,菌种可以无限期地存贮。这些冷冻存贮的菌种可以用作每周或每月的工作菌种。未使用的部分应该弃去以最大程度降低活性损失的风险和存贮污染的风险。

The number of transfers of working control cultures should be tracked to prevent excessive subculturing that increases the risk of phenotypic alteration or mutation. The number of transfers allowable for specific compendial tests may be specified in that test. One passage is defined as the transfer of organisms from a viable culture to a fresh medium with growth of the microorganisms. Any form of subculturing is considered to be a transfer/passage.

工作控制菌种的传代应可以追溯,以防止过度传代,从而增加表型变异性或异化的风险。特定的药典检测所允许传代的次数必须在该检测中指明。一种途径可以界定为从活菌传代至新鲜培养基,在其中微生物可以生长。任何形式的接种都应被作为是传代/通道。LABORATORY EQUIPMENT 实验室设备

Most equipment (incubators, water baths, and autoclaves) is subject to standard validation practices of incoming qualification, operational qualification, and performance qualification. Additionally, periodic calibration (generally annually) is commonly required. New equipment, critical to the operation of the laboratory, should be qualified according to a protocol approved by the quality assurance unit (QAU). In addition, regular cleaning and sanitization of equipment such as incubators, refrigerators, and water baths should be performed to minimize the potential for contamination in the laboratory. Door seals of incubators and refrigerators should be cleaned and checked for state of repair.

主要设备(培养箱、水浴锅、灭菌器)需要进行标准验证,包括进厂确认、操作确认和性能确认。另外,一般还需要对其进行周期性校正(一般每年校正)。化验室操作的关键新设备应根据质量部门批准的方案进行确认。此外,对设备,如培养箱、冰箱和水浴锅,进行定期清洁和灭菌都是需要的,这样可以最大程度降低化验室中污染的风险。培养箱和冰箱的门封应进行清洁并对维修状态进行检查。

Instruments (pH meters and spectrophotometers) used in a microbiology laboratory should be calibrated on a regular schedule and tested to verify performance on a routine basis. The frequency of calibration and performance verification will vary based on the type of instrument and the importance of that equipment to the generation of data in the laboratory.

在微生物化验室使用的仪器(pH计和光度计)应按计划进行定期校正,并测试以按照常规要求确认其性能。校正频率和性能确认可以根据仪器的类型和仪器重要性而制订不同的周期。

Equipment that is difficult to sanitize (such as refrigerators and incubators) should be dedicated to aseptic operations (such as storage of media for testing and incubation of sterility test samples) and live culture operations to minimize the potential for inadvertent contamination of the tests.

难以灭菌的设备(例如冰箱和培养箱),如果用于无菌操作(例如测试用培养基存贮和无菌测试样品的培养)和活菌操作,则分开专用,以最大程度降低可能无意的污染。Autoclaves are central to the operation of the laboratory and must have proper validation in place to demonstrate adequate sterilization for a variety of operations. Autoclave resources must be available (and validated) to sterilize waste media (if performed in that laboratory) as well as the media prepared in that laboratory. The choice of one or several autoclaves is not driven by a need to separate aseptic and live operations (everything in the properly maintained autoclave is sterile after the cycle) but rather driven by resource considerations (see below).

灭菌器是化验室操作的核心设备,必须经过适当验证以证明其不同操作的灭菌保障。灭菌器资源(经过验证)应支持废培养基灭菌(如果在化验室灭菌),在化验室制备的培养基灭菌。是选择用一台还是多台灭菌器不需要根据将无菌操作和活菌操作分开的原因(所在经过适当维护的灭菌器灭菌的物质均是无菌的),而是应根据化验室要保证提供操作所需的充分资源(参见下文)来考虑。

LABORATORY LAYOUT AND OPERATIONS 实验室平面设计和操作

Laboratory layout and design should carefully consider the requirements of good microbiological practices and laboratory safety. It is essential that

cross-contamination of microbial cultures be minimized to the greatest extent possible, and it is also important that microbiological samples be handled in an environment that makes contamination highly unlikely.

化验室平面设计应全面考虑优良微生物规程和化验室安全要求。对此基本的要求是应尽可能降低微生物培养基的交叉污染,同样重要的是样品操作的环境应保证无污染。

In general, a laboratory should be divided into clean or aseptic areas and live culture areas. Areas in which environmental or sterile product samples are handled and incubated should be maintained completely free of live cultures, if possible. If complete separation of live and clean culture zones cannot be accomplished, then other barriers and aseptic practices should be employed to reduce the likelihood of accidental contamination. These barriers include protective clothing, sanitization and disinfection procedures, and biological safety cabinets designated for clean or aseptic operations only. Procedures for handling spills or mishaps with live cultures should be in place, and all relevant technical personnel should be trained regarding these methods.

一般来说,微生物检验室应分为洁净区域或无菌区域、活菌区域。如有可能,环境监控样品或无菌产品样品操作和培养的区域应保持无活菌。如果活菌和无菌培养区域无法完全隔离,则应采用物理隔断和灭菌措施以降低可能的意外污染。这些物理隔断包括防护服、灭菌和消毒程序,仅供洁净或无菌操作所用的生物安全柜。应对操作中活菌洒出或灾祸制订书面程序,所有相关的技术人员均应接受此相关培训。

Some samples will demonstrate microbial growth and require further laboratory analysis to identify the contaminants. When growth is detected, the sample should be taken from the clean section of the laboratory to the live culture section without undue delay. Subculturing, staining, microbial identification, or other investigational operations should be undertaken in the live culture section of the laboratory. If possible, any sample found to contain growing colonies should not be opened in the clean zone of the laboratory. Careful segregation of contaminated samples and materials will reduce false-positive results.

有些样品可能会发现有微生物生长,需要进一步的实验分析以确定污染物。如果发现有微生物生长,样品应立即从洁净区域移至活菌区域。次培养、染色、微生物鉴别,或其它调查操作应在活菌区域进行。如有可能,所有发现有菌株生长的样品均不可化验室洁净区域打开。对受污染样品和物料小心进行隔离可以减少假阳性结果。

Staff engaged in sampling activities should not enter or work in the live culture handling section of a laboratory unless special precautions are taken, including wearing protective clothing and gloves and careful sanitizing of hands upon exiting.

Ideally, staff assigned to sampling activities, particularly those in support of aseptic processing, should not work in the vicinity of live culture laboratory operations.

取样人员不应进入或在活菌操作区域工作,除非采取了特殊的预防措施,包括穿着防护服和手套、退出时进行仔细的手消毒。理想情况下,取样人员尤其是那些无菌工艺的取样人员,不应在活菌操作附近工作。

It is important to consider that microbial contamination of samples, which leads to false-positive results, is always possible unless careful aseptic precautions are taken. Facilities should be designed so that raw material and excipient sampling can be done under controlled conditions, including proper gowning and sterilized sampling equipment. It may not always be possible to sample utility systems, such as water systems, under full aseptic conditions; however, it should be noted that when samples are not taken aseptically, their reliability is inevitably compromised.

考虑样品被污染的可能性是非要重要的,这种情况可能会导致假阳性结果,除非采取了严格的无菌预防措施,否则总会存在这种可能性。设施的设计应使原料和辅料取样操作在控制环境下进行,包括进行适当的更衣和对取样工具进行灭菌。对公用系统进行无菌条件下取样有时可能无法实现,例如水系统,此时如果不是在无菌条件下取样应注意其可靠性不可避免地会降低。

Environmental sampling methods should require minimal aseptic handling in loading and unloading sampling instruments. Whenever possible, sampling equipment should be loaded with its microbiological recovery media in the environment that is to be sampled.

环境取样方法应尽可能减少取样工具的无菌操作。只要可能,取样工具应在将要取样的环境里载入其微生物回收培养基。

All testing in laboratories used for critical testing procedures, such as sterility testing of final dosage forms, bulk product, seed cultures for biological production, or cell cultures used in biological production, should be performed under controlled conditions. Isolator technology is also appropriate for critical, sterile microbiological testing. Isolators have been shown to have lower levels of environmental contamination than manned clean rooms, and therefore, are generally less likely to produce false-positive results. Proper validation of isolators is critical both to ensure environmental integrity and to prevent the possibility of false-negative results as a

result of chemical disinfection of materials brought into or used within isolators

(see Sterility Testing—Validation of Isolator Systems1208).

在化验室进行的所有关键检测,例如制剂无菌测试、原料药、生物制品接种、或生物制品细胞培养,均应在受控环境下进行。分离技术也适用于关键的无菌微生物测试。隔离器经证明比手工清洁房间具有更低的环境污染水平,因此一般不可能产生假阳性结果。对隔离器进行适当的验证很关键,可以保证环境的完整性,以及防止由化学消毒物质引起的可能的假阳性结果。(参见无菌测试----隔离系统验证1208)

SAMPLE HANDLING 样品制备

Viable microorganisms in most microbiology samples, particularly water, environmental monitoring and bioburden samples, are sensitive to handling and storage conditions. Critical parameters in these conditions include product (or sample) composition, container composition, time of storage, and temperature of storage. Therefore, it is important to minimize the amount of time between the sampling event and the initiation of testing and to control, as much as possible, the conditions of storage. If the sample is to be transported to a distant location for testing, then the conditions of transport (time, temperature, etc.) should be qualified as suitable for that test and sample. Guidance for water testing in this regard can be found in Water for Pharmaceutical Purposes 1231 . Product mixing before sampling may need to be evaluated and applied in order to ensure microbial dispersement and representation in the sample aliquot.

大多数微生物样品中的活菌,尤其是水样、环境监控样品和生物负载样品,对处置过程和存贮条件非常敏感。这些环境下的关键参数包括产品(或样品)成分、容器成份、存贮时长、存贮温度。因此,尽量缩短取样和检验开始的时间间隔非常重要,以及尽可能控制存贮环境。如果样品需要送到一个较远的检测场所,则传送条件(时间、温度等)应针对所做的检测和样品进行确认以保证其合适。有关水检测的指南参见1231制药用水。在取样前即进行混合的产品可能需要进行评估,以保证微生物水平及样品代表性。All microbiological samples should be taken using aseptic techniques, including those taken in support of nonsterile products. If possible, all microbiological samples should be taken under full aseptic conditions in specialized sampling areas. The areas should be as close to the point of use as possible to minimize contamination during transit.

所有用于微生物检测的样品均应在无菌环境下取样,包括用于非无菌制剂的样品。如有可能,所有微生物检测用样品应在特定的无菌条件的取样区域取样,该区域应与使用时的环境尽可能接近,以最大程度降低转移过程中的污染。

Samples submitted to the microbiology laboratory should be accompanied by documentation detailing source of the sample, date the sample was taken, date of sample submission, person or department responsible for the submission, and any potentially hazardous materials associated with the sample. The testing department should acknowledge receipt of the sample and reconcile the identity and number of samples as part of this sample documentation.

样品传递至微生物化验室时应附有详细的记录,包括样品来源、取样日期、样品传递日期、传递人员或部门、样品可能会含有的危险物质。检验部分应告知样品收到,并核对编号和样品数量,在取样记录中注明。

MICROBIOLOGICAL MEDIA INCUBATION TIMES 微生物培养基培养时间Incubation times for microbiological tests of less than 3 days' duration should be expressed in hours: e.g., “Incubate at 30 to 35 for 18 to 72 hours”. Tests longer than 72 hours' duration should be expressed in days: e.g., “Incubate at 30 to 35 for 3 to 5 days”. For incubation times expressed in hours, incubate for the minimum specified time, and exercise good microbiological judgment when exceeding the incubation time. For incubation times expressed in days, incubations started in the morning or afternoon should generally be concluded at that same time of day.

微生物测试的培养时间如果少于3天,则应表述为小时,例如“在30-35℃培养18-72小时”。如果大于72小时,则应表述为天数,例如“在30-35℃培养3-5天”。如果培养时间以小时计,则培养时间应为指定的最短时间,如果超出指定的培养时间,则需要应用好的微生物判断。如果培养时间以天计,则上午或下午开始进行培养一般会在结束天的同一时间进行判定。

TRAINING OF PERSONNEL 人员培训

Each person engaged in each phase of pharmaceutical manufacture should have the education, training, and experience to do his or her job. The demands of microbiological testing require that the core educational background of the staff, supervisors, and managers be in microbiology or a closely related biological science.

They should be assigned responsibilities in keeping with their level of skill and experience.

参与药品生产各阶段活动的所有人员均需要进行教育、培训,具备其所操作岗位的经验。微生物检测岗位要求操作人员、主管和经理的基本教育背景为微生物学或相关生物学科。公司应根据人员的技能水平和经验赋予不同的责任。

A coherent system of standard operating procedures (SOPs) is necessary to run the microbiology laboratory. These procedures serve two purposes in a training program. Firstly, these SOPs describe the methodology that the microbiologist will follow to obtain accurate and reproducible results, and so serve as the basis for training. Secondly, by tracking the procedures in which a particular microbiologist has demonstrated proficiency, the procedure number or title also serves to identify what training the microbiologist has received specific to his or her job function.

要使微生物室正常运行,需要有一套条理分明的标准操作规程(SOP)。这些程序对于培训来说有两个目的,一是这些SOP描述了微生物化验员需要遵守以获得准确和可重复的结果的方法,从而作为培训的基础教材,二是在SOP中由指定的微生物化验员进行了专业描述,该SOP的编号和题目可以用以识别微生物化验员接受了其岗位所对应的培训。

Training curricula should be established for each laboratory staff member specific to his or her job function.

对各化验室人员,应根据其岗位要求制订相应的培训课程。

He or she should not independently conduct a microbial test until qualified to run the test. Training records should be current, documenting the microbiologist's training in the current revision to the particular SOP.

化验室人员在未获得资格前,不得独立进行微生物测试。培训记录应保持更新,记录微生物化验员根据特定SOP现行版本所进行的培训。

Periodic performance assessment is a wise investment in data quality. This performance testing should provide evidence of competency in core activities of the microbiology laboratory such as hygiene, plating, aseptic technique, documentation, and others as suggested by the microbiologist's job function.

对化验员进行周期性的绩效评估是对数据品质的明智投资。这种行为测试应提供微生物核心活动合格的证据,如卫生、铺碟、无菌操作、记录和其它微生物化验员工作内容的活动。

Microbiologists with supervisory or managerial responsibilities should have appropriate education and inhouse training in supervisory skills, laboratory safety, scheduling, budgeting, investigational skills, technical report writing, relevant SOPs, and other critical aspects of the company's processes as suggested in their role of directing a laboratory function.

微生物室具有监督或管理职责的人员应具有适当的教育背景,以及公司内部培训,内容包括监管技巧、化验室安全、制订计划、制订预算、调查技巧、技术报告书写、相关SOP、公司程序所要求其岗位应具体的领导化验室的职责的其它关键方面。Competency may be demonstrated by specific course work, relevant experience, and routinely engaging in relevant continuing education. Achieving certification through an accredited body is also a desirable credential. Further, it is expected that laboratory supervisors and managers have a demonstrated level of competence in microbiology at least as high as those they supervise. Expertise in microbiology can be achieved by a variety of routes in addition to academic course work and accreditation. Each company is expected to evaluate the credentials of those responsible for designing, implementing, and operating the microbiology program. Companies can thus ensure that those responsible for the program understand the basic principles of microbiology, can interpret guidelines and regulations based on good science, and have access to individuals with theoretical and practical knowledge in microbiology to provide assistance in areas in which the persons responsible for the program may not have adequate knowledge and understanding. It should be noted that microbiology is a scientifically based discipline that deals with biological principles substantially different from those of analytical chemistry and engineering disciplines.

人员是否合格可以通过特定工作、相关经验和日常从事相关持续教育进行证明。获得相关机构的证书也是一种理想的方法。另外,最好化验室主管和经理能具备其所监管的微生物工作的至少同样水平的能力。除通过专业课程和专业机构证书外,也可以通过不同的方法达到微生物专业水平。公司应评估负责微生物程序设计、实施和操作的负责人员的证书,从而保证这些人员具备基本的微生物原理,可以对指南和法规基于科学理论进

行解释,并知晓哪些人具备理论和实践微生物知识,能在负责某程序的人不具备充分知识和理解时提供相关的帮助。需要注意的是,微生物学是一门科学严谨的学问,是与生物原则相关的学科,根本区别于分析化学和工程学原理。

Many times it is difficult for individuals without specific microbiological training to make the transition.

一个人如果没有特定的微生物培训知识,要进行知识传递是非常困难的。LABORATORY RESOURCES 化验室资源

The laboratory management is responsible for ensuring that the laboratory has sufficient resources to meet the existing testing requirements. This requires some proficiency in budget management and in determining appropriate measures of laboratory performance. A measure of laboratory performance is the number of investigations performed on tests conducted by the laboratory, but this measure alone is not sufficient. In addition to tracking investigations, the period of time between sample submission and initiation of testing should be tracked, as well as the period of time between end of test and report release (or test closure). Significant delays in these measures are also indications of an under-resourced laboratory staff.

实验室管理人员应保证实验室具有充足的资源,以满足现有的检测要求。要做到这点,需要有充足的预算以及对化验室表现做出适当的评估。化验室表现的评估标准之一是化验室所做检测的调查数量,但仅采用该标准是不够的。除了追踪调查之外,还应追踪样品传送间隔和检测开始时间,以及检测结束到出具报告(或检测关闭)的时间间隔。这些行为的延迟也说明化验室人员未满足资源要求。

The laboratory management should have sufficient budget to meet testing requirements. Particular measures of budgetary requirements will be specific to the given laboratory, but budgetary considerations related directly to the need of the laboratory for sufficient resources must be addressed to ensure reliable testing results.

化验室管理应具备充足的预算,以满足检测的要求,预算应细化针对各特定的化验室,与化验室资源是否充分直接相关的预算要求则必须进行说明,以保证获得可靠的检测结果。

DOCUMENTATION 文件记录

微生物限度检查方法及其验证报告(修改)

文件编号:73021微生物限度检查方法及其验证报告

目录1 样品相关信息 1.1 基本信息 2 主要仪器设备和试验耗材信息 2.1 主要使用的仪器设备 2.2 试验用培养基 2.3 试验用试剂 2.4 试验用菌种 3 试验环境 3.1 无菌室 3.2 洁净工作台 3.3 生物安全柜 4 试验方案 4.1 验证试验目的 4.2 微生物限度检查方法草案 5 方法验证试验 5.1 菌液制备 5.2 计数培养基适用性检查 5.3 控制菌检查用培养基使用性检查 5.4 供试液制备 5.5 方法验证 5.5.1 菌落计数方法验证试验 5.5.2 控制菌检查方法的验证 5.6 方法验证结论 6 供试品微生物限度检查结果

1 样品相关信息 1.1 基本信息(三批) 2 主要仪器设备和试验耗材信息2.1 主要使用的仪器设备 2.2 试验用培养基 2.2.1 对照培养基

2.2.2 试验用培养基 2.3 试验用试剂 2.4 试验用菌种

3 试验环境 《中国药典》2015版规定,微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域进行。 本公司微生物限度室、阳性对照室、生物安全柜及超净工作台洁净度检测无特殊情况下每季度进行一次。 3.1 无菌室 无菌室按《医药工业洁净厂房设计规》GB 50457-2008监测,静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对10000级洁净度要求。 3.2 超净工作台 超净工作台按《医药工业洁净厂房设计规》GB50457-2008监测,静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。 超净工作台沉降菌检测记录 2015.11.15 3.3生物安全柜 生物安全柜按《生物安全实验室建筑技术规》GB50346-2011监测,静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。 生物安全柜沉降菌监测记录 2015.11.15 4 试验方案 按《中国药典》2015年版第四部:(通则1105)非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法、(通则1106)非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法、(通则1107)非无菌药品微生物限度标准及(通则1121)抑菌效力检查法规定,本品微生物限度标准为:1g供试品中,需氧菌总数不得过1000cfu,霉菌和酵母菌总数不得过100cfu,大肠埃希菌不得检出。

常见的微生物检测方法

常见的微生物检测 方法

摘要:微生物的检测,无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义,本文分生长量测定法,微生物计数法,生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量,体积,大小,生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法,简要介绍了这些方法的原理,应用范围和优缺点。 概述: 一个微生物细胞在合适的外界条件下,不断的吸收营养物质,并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用,则其原生质的总量(重量,体积,大小)就不断增加,于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长,即各细胞组分是按恰当的比例增长时,则达到一定程度后就会发生繁殖,从而引起个体数目的增加,这时,原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长,就引起了这一群体的生长,这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长,微生物的个体生长在科研上有一定困难,一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的,因此,微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标,同

时,微生物在生产实践上的各种应用或是对致病,霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加,因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据,而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量,能够从其重量,体积,密度,浓度,做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法:又称测菌丝浓度法。 经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是,取一定量的待测培养液(如10毫升)放在有刻度的离心管中,设定一定的离心时间(如5分钟)和转速(如5000 rpm),离心后,倒出上清夜,测出上清夜体积为v,则菌丝浓度为(10-v)/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放,简便,快速,但需要设定一致的处理条件,否则偏差很大,由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物,结果会有一定偏差。 称干重法:

美国药典简介

美国药典简介 1. 标题和修订(Title and Revision). 9 2. 药典地位和法律认可(Official status and legal recognition)9 2.10 药典正文(Official Text) 9 2.20 药典物品(Official Articles). 9 2.30 法律认可(Legal Recognition). 10 3. 与标准的符合性(Conformance to standard). 10 3.10 标准的适用性(Applicability of standard) 10 3.10.10 制剂、原料药、辅料的标准的适用性(Applicability of Standards to Drug Products, Dru g Substances, and Excipients). 10 3.10.20 医疗器械、营养补充剂、以及其组成成分的标准的适用性(Applicability of Standards to Medical Devices, Dietary Supplements, and Their Components and Ingredients)11 3.20 一致性的标示(Indicating Conformance). 11 4. 药典各论和通则(Monographs and general chapters)12 4.10 各论(Monographs) 12 4.10.10 检测程序的适用性(Applicability of Test Procedures) 12 4.10.20 接受标准(Acceptance Criteria) 12 4.20 附录(General Chapter). 12 5. 各论组成(Monograph Components). 13 5.10 分子式(Molecular formula). 13 5.20 附加物质、赋形剂、组分(Added Substances, Excipients, and Ingredients) 13 5.20.10官方原料药中附加的物质、赋形剂、组分(Added Substances, Excipients, and Ingredien ts in Official Substances). 13 5.20.20官方制剂中的附加物质、赋形剂、组分(Added Substances, Excipients, and Ingredients in Official Products). 13 5.30 性状和溶解性(Description and Solubility). 14

微生物限度检测方法验证操作规程(2015年版)

微生物限度检测方法验证操作规程 1 目的 确认所采用的方法适合于该产品的微生物限度检测。 2 依据 《中国药典》2015版。 3 范围 所有需进行微生物限度检测的产品。 4 责任 4.1验证小组负责检验方法验证/确认方案的起草、验证/确认方案的实施。 4.2验证委员会负责验证/确认方案的审批,验证/确认结论的审核。 5 程序 5.1 由验证小组提出验证申请,验证方案编制完成后,填写《确认和验证方案审批表》,经验证小组会签,报验证委员会审核,由生产负责人和质量负责人批准后,验证方案编制人对验证小组其余人员进行培训后,方可按验证方案试验。 5.2 试验完成后及时编制验证报告,并填写《验证报告审批表》,经验证小组会签,报验证委员会审核,由生产负责人和质量负责人批准后,验证报告结论才可实施。 6 内容 6.1 概述 通过验证以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌的检查。根据样品特性制订检验方法和检验条件,按制定的方案进行试验,根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合,按验证的方法和条件进行产品的微生物限度检查;若不符合,重新建立制订检验方法和检验条件,再进行验证,直至验证结果符合设立的验证标准。 6.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证 6.2.1 验证用菌株

铜绿假单胞菌[CMCC(B)10 104] 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003] 枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501] 黑曲霉[CMCC(F)98 003] 白色念珠菌[CMCC(F)98 001] 6.2.2 验证用菌液制备 6.2.2.1接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中,于30~35℃培养18~24小时。取上述培养物各1ml,用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液,备用。 6.2.2.2 接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基中,于20~25℃培养2~3天。取上述培养物1ml,用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液,备用。 6.2.2.3接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂培养基上,于20~25℃培养5~7天,加入含0.05%(ml/ml)聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液,将孢子洗脱。然后,用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内,用含0.05%(ml/ml)聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的孢子悬液,备用。 6.2.3 供试液的制备 6.2.3.1 水溶性供试试品 取供试品,用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:10供试液。若需要,调节供试液pH值至6~8。必要时,用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 6.2.3.2 水不溶性非油脂类供试品 取供试品,用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:10供试液。分散力较差的供试品,可在稀释液中加入表面活性剂如0.1﹪的聚山梨酯80,使供试品分散均匀。若需要,调节供试液pH值至6~8。必要时,用一稀释液将

无菌检验室、微生物限度检验室、阳性对照室验证方案

无菌检验室微生物限度检验室 阳性对照检验室黑曲霉对照检验室 验证方案 上善医疗器械 2011年月 目录 1.验证的目的 2.验证小组成员 3.验证小组分工 4.验证依据 5.标准容 6.检验室的自净器和超净台安装确认 7.自净器和超净台的运行确认 8.洁净度的测定 9.验证结果及评价: 10.责任 1.验证的目的 1.1检查并确认检验室的自净器和超净台的安装符合设计要求。 1.2检测并确认检验室的自净器和超净台的运行性能应能达到检验要求及验证标准。 1.3洁净度测试,确认检验室能达到规定的洁净度。

3验证小组分工: 3.1组长:负责审核验证方案是否可行。 3.2副组长:负责组织实施验证、审核测试结果、评价及结论,负责验证报告的会签与批准。 3.3组员:负责无菌检验室、微生物检验室、阳性对照检验室、黑曲霉对照检验室的验证过程;提供监测结果。 3.4组员:负责无菌室正常管理。 4.验证依据: GB—T16294—1996 医药工业洁净室(区)沉降菌的测试方法 YY0033-2000 无菌医疗器具生产管理规 6.检验室的自净器和超净台安装确认 6.1部件安装确认

6.2高效过滤器的检漏测试 采用尘埃粒子计数器对高效过滤器进行检漏测试,采样头离过滤器距离约2cm,沿过滤器出风侧及边框来回扫描。 检漏测试结果记录在自净器和超净台运行确认记录上。 7.自净器和超净台的运行确认 7.1风速测定 采用风速仪贴近高效过滤器出风口测定,一般测定4个点,求出平均风速。 超净台测定8个点,求平均风速。 7.2压差测定 采用微压表测定 7.3温度、相对湿度测定 采用温湿度记录仪测定 7.4结果记录如下:

微生物限度检查记录 版

表:微生物限度检查记录(通用) 三、大肠埃希菌检查 胰酪大豆胨液体培养基(配制批号:)、麦康凯液体培养基(配制批号:)麦康凯琼脂培养基(配制批号:)

微生物限度检查记录 (30~35℃,3~5天) 20℃~25℃,5~7天) 沙氏葡萄糖琼脂培养基(配制批号:) 三、控制菌检查(30-35℃)

表: 胰酪大豆胨液体培养基(配制批号:)、麦康凯液体培养基(配制批号:)麦康凯琼脂培养基(配制批号:) (30℃~35℃) 胰酪大豆胨液体培养基(配制批号:)、RV沙门增菌液体培养基(配制批号:),木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基(配制批号:)、三糖铁琼脂(配制批号:) 五、耐胆盐革兰阴性菌检查 胰酪大豆胨液体培养基(配制批号:)、肠道菌增菌液体培养基(配制批号:),紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基(配制批号:)

表: (含药材原粉的片剂) 胰酪大豆胨液体培养基(配制批号: )、麦康凯液体培养基(配制批号: )麦康凯琼脂培养基(配制批号: ) (30℃~35℃) 胰酪大豆胨液体培养基(配制批号: )、RV 沙门增菌液体培养基(配制批号: ),木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基(配制批号: )、三糖铁琼脂(配制批号: ) 五、耐胆盐革兰阴性菌检查 胰酪大豆胨液体培养基(配制批号: )、肠道菌增菌液体培养基(配制批号: ),紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基(配制批号: )

表:微生物限度检查记录(蛇胆川贝液) 三、大肠埃希菌检查 胰酪大豆胨液体培养基(配制批号:)、RV沙门增菌液体培养基(配制批号:),木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基(配制批号:)、三糖铁琼脂(配制批号:)

食品中有害微生物快速检测方法概述

(一)、概述 食用被微生物污染的食品而导致的疾病,称作食源性疾病。导致这类疾病的微生物叫食源性致病菌。随着人们居住和卫生条件的不断改善,以及抗生素的滥用,人类对病菌的抵抗能力却在不断下降,食源性疾病一直呈上升的趋势。因此,对食品中致病菌的监测和检验也就越显示其重要性,常规的检验大多依靠培养目标微生物的方法来确定食品是否受到此微生物的污染,这些方法需要一定的培养时间,少则2~3天,多至数周,才能确定。而现行有效的一些快速检测方法不仅可以大大缩短检测时间提高微生物检出率并可用于微生物计数、早期诊断、鉴定等方面,以做到快速、简便、准确。快速方法包括了微生物学、分子化学、生物化学、生物物理学、免疫学和血清学等领域。 (二)、常见、常用的快速、简便的检测微生物数量的方法如下: 1、活细胞计数的改进方法 (1)、旋转平皿计数方法 (2)、疏水性栅格滤膜法(HGMF)或等格法(isogrid method) (3)、血膜系统(Pertrifilm) (4)、酶底物技术(ColiComplete) (5)、直接外荧光滤过技术(DEFT) (6)、“即用胶”系统(SimPlate) 2、用于估计微生物数量的新方法 (1)、阻抗法 (2)、A TP生物发光技术 3、其他方法 (1)、微量量热法 (2)、接触酶测定仪 (3)、放射测定法 (三)、食品中沙门氏菌的快速筛检方法 1、沙门氏菌显色培养基法 2、免疫学方法 3、分子生物学方法 4、自动传导法 (四)、大肠杆菌O157:H7快速检测方法 大肠杆菌O157:H7肠出血性大肠杆菌的主要血清型,自1982年在美国被分离并命名以来,陆续发现本菌与轻度腹泻、溶血性尿毒综合症、出血性肠炎、婴儿猝死综合症等多种人类病症密切相关,是食源性疾病的一种重要致病菌。E.coli O157:H7属于肠杆菌科埃希氏菌属,为革兰氏阴性杆菌,有鞭毛。近年来作为食品卫生及流行病学的研究热点,E.coli O157:H7的分离和鉴定方法已取得了较大进展。利用其生化特征、免疫原性建立的方法以及现代分子生物学技术的应用,可以从多方面对E.coli O157:H7进行检测。 1、E.coli O157:H7鉴别培养基及显色培养基 2、免疫学检测方法 3、分子生物学方法 (五)、金黄色葡萄球菌的快速检测方法 金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌,呈普通串状排列无芽孢,无鞭毛,不能运动。该菌在自然界中分布广泛,如空气、水、土壤、饲料和一些物品上,是最常见的化脓性球菌之一,食品受其污染的机会很多。金黄色葡萄球菌食物中毒是其肠毒引起的,目前已确认的肠毒素至少有A,B,C1,C2,C3,D,E和F8个型。由金黄色葡萄球菌肠毒素引发的中毒爆发事件,近年来

USP1227-VALIDATION OF MICROBIAL RECOVERY FROM PHARMACOPEIAL ARTICLES美国药典微生物回收率验证

1227VALIDATION OF MICROBIAL RECOVERY FROM PHARMACOPEIAL ARTICLES This chapter provides guidelines for the validation of methods for the estimation of the number of viable microorganisms, for the detection of indicators or objectionable microorganisms, for the validation of microbiological methods used in antimicrobial effectiveness testing, and for the sterility testing of Pharmacopeial articles. It is generally understood that if a product possesses antimicrobial properties because of the presence of a specific preservative or because of its formulation, this antimicrobial property must be neutralized to recover viable microorganisms. This neutralization may be achieved by the use of a specific neutralizer, by dilution, by a combination of washing and dilution, or by any combination of these methods. The tests under Antimicrobial Effectiveness Testing 51, Sterility Tests 71, and Microbial Limit Tests 61require the validation of recovery methods. To ensure that the results of the tests are credible, neutralization of antimicrobial properties of the test solution is required before estimating the number of viable microorganisms. INFLUENTIAL FACTORS Several factors affect the measurement of a test solution's antimicrobial activity, and these must be considered in the validation design. They include the nature of the microorganisms used as challenge organisms, the preparation of the inoculum of challenge organisms, the specific conditions of the test, and the conditions of recovery. These factors also affect the validation of recovery methods for aqueous or nonaqueous products, irrespective of their antimicrobial properties; thus, all test methods should be validated with these factors in mind. The nature of the challenge microorganism exerts a strong effect upon the response to the antimicrobial agent, and so upon the neutralization required for recovery. Represented among these organisms in compendial tests are Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria, yeasts, and molds. Each organism to be used in the test must be included in the validation.

微生物限度检查办法验证方法

精心整理 微生物限度检查方法验证方案 1.目的: 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查,包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查,特制定本验证方案,通过比较试验菌的恢复生长结果,来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性,以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计,所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 2.3. 4.0.22um 121营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基(BL )、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基(MUG )等脱水培养基,按照相应的配制说明,用纯化水配制、分装后,在2小时内,放于湿热灭菌器中,在121℃,灭菌15 min ,在3周内使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备:取在有效期内的试剂,按照相应的配制方法,配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%(ml/ml )聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等,用纯化水配制,加热使溶,过滤,分装,在121℃,灭菌15 min ,在3周内使用。

4.4.2 试验菌的制备和稀释: 4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液: 4.4 4.4 4.4 4.4.2.2控制菌检查方法验证用菌液: 1ml 含菌10 3g单 45℃pH7.0 液。 3 4.4.4.2试验组: 4.4.4.2.1 平皿法:分1:20的供试液1ml和试验菌液(含菌50~100CFU)1ml,注入同一直径90mm的灭菌平皿中,每株试验菌平行制备2个平皿。 4.4 4.4

4.4.4.4.1 平皿法:取1:20供试液1ml,注入直径90mm的灭菌平皿中,每种培养基平行制备2个平皿。 4.4 4.4.4.5稀释剂对照组:若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心等特殊处理时,需增加稀释剂对照组,以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。 4.4 养48 培养72 稀释剂对照组回收率= 结果判定:在3次独立的平行试验中,稀释剂对照组的回收率应均不低于%。试 菌回收率低于70%,则应采用薄膜过滤法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、中和法等方法或联合使用上述方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行方法学验证。 4.4.4.11细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果:

微生物限度检查室沉降菌检查标准操作程序

微生物限度检查室沉降菌检查标准操作程序 一、目的:为规定微生物限度检查室沉降菌测试方法和要求,特制定本操作规程。 二、适用范围:适用于公司微生物限度检查室沉降菌测试。 三、责任者:质量监督员、质量检验人员。 四、正文: 2 仪器和设备: a、高压消毒锅 b、恒温培养箱 c、培养皿(φ90mm×15mm) d、培养基(营养琼脂培养基) 3 测试方法: 3.1 将已制备好的培养皿按要求放置,打开培养皿盖,使培养基表面暴露 0.5h,再将培养皿盖盖上后倒置。 3.2 全部采样结束后,将培养皿倒置于恒温培养箱中 30~35℃培养 48h。 3.3 每批培养基可选定 3 只培养皿作对照试验,检验培养基本身是否污 染。 3.4 用肉眼直接计数,标记或在菌落计数器上点计,然后用 5~10 放大镜 检查,有否遗漏,若培养皿上有 2 个或 2 个以上的菌落重叠,可分 辨时,仍以 2 个或 2 个以上菌落计数。 3.5 注意事项: 3.5.1 测试用具要作灭菌处理,以确保测试的可靠性、正确性。 3.5.2 采取一切措施防止人为对样品的污染。 3.5.3 对培养基培养条件及其他参数作详细的记录。 3.5.4 采样前应仔细检查每个培养皿的质量,如发现变质、破损或污染的 应剔除。 4测试规则: 4.1 测试状态: 4.1.1 沉降菌测试前,微生物限度检查室的温湿度须达到规定的要求;换

气次数,空气流速必须控制在规定值内。 4.1.2 测试前,微生物限度检查室应已经消毒过。 4.1.3 测试状态为静态测试,并在报告中注明测试状态。 4.2 测试人员: 4.2.1 测试人员必须穿戴符合洁净室级别的工作服。 4.2.2 静态测试时,室内测试人员不得多于二人。 4.3 测试时间:对单向流,如 100 级净化工作台,测试应在净化空调系 统正常运行不少于10min 后开始。 采样点布置见“质检微生物限度检查室悬浮粒子测试操作规程”。 4.4.1 采样点的布置: 采样点的位置可以同悬浮粒子测试点。 4.4.1.1 工作区采样点的位置离地 0.8m~1.5m 左右(略高于工作面)。 4.4.1.2 可在关键设备或关键工作活动范围处增加采样点。 4.5 记录: 测试报告中应记录房间温度、相对湿度及测试状态。 4.6 结果计算: 4.6.1 用计算方法得出各个培养皿的菌落数。 4.6.2 平均菌落数的计算 平均菌落数M= M1+M2+ +Mn N 式中:M:平均菌落数; M1:1 号培养皿菌落数; M2:2 号培养皿菌落数; Mn:n 号培养皿菌落数; N:培养皿总数 5 结果评定: 用平均菌落数判断微生物限度检查空气中的微生物。 5.1 微生物限度检查室内的菌落数必须低于所选定的评定标准。 5.2 若某区域的平均菌落数超过评定标准,则必须对此区域进行消毒,然后采样两次,测试结果均须合格。

制药企业微生物限度控制菌检查培养基适用性检查记录表式样

控制菌检查培养基适用性检查记录 一、菌液制备(需要的菌种在□内划“√”): □(1)大肠埃希菌新鲜肉汤培养物1ml ,9ml0.9%无菌NaCl溶液,10倍递增稀释; □(2)金黄色葡萄球菌新鲜肉汤培养物1ml,9ml0.9%无菌NaCl溶液,10倍递增稀释; □(3)乙型副伤寒沙门菌新鲜肉汤培养物1ml,9ml0.9%无菌NaCl溶液,10倍递增稀释; □(4)铜绿假单胞菌新鲜肉汤培养物1ml,9ml0.9%无菌NaCl溶液,10倍递增稀释; □(5)生孢梭菌新鲜硫乙醇酸盐流体培养物1ml,9ml0.9%无菌NaCl溶液,10倍递增稀释; 二、每ml菌液含菌量的计数测定。 测定方法:取稀释后的菌液1ml(剩余的菌液冷藏保存),置直径90mm的无菌平皿中,注入15-20ml已经过适用性检查确正的温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基(细菌类别计数选用该培养基)或玫瑰红钠琼脂培养基(霉菌、酵母菌类别计数选用该培养基),混匀,凝固,倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。细菌类别培养温度为30℃~35℃;霉菌、酵母菌类别培养温度为23℃~28℃。细菌类别培养3天,霉菌、酵母菌类别培养5天。 三、检查结果:需做的检查在□内划“√”。 □ 1. 增菌培养基促生长能力检查

分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较,被检培养基管试验菌。 检验标准:与对照培养基管比较,被检培养基管试验菌应生长良好。 结论: □ 2. 固体培养基促生长能力检查 检验标准:被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比大于70%,且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。 结论: □ 3. 培养基抑制能力检查 分别接种试验菌于被检培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养,试验菌。 检验标准:试验菌应不得生长。 结论: □ 4. 培养基指示能力检查 分别接种少量试验菌于被检培养基和对照培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养。被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等。 检验标准:被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。 结论: 结论: 检验人:复核人:

最新美国药典-微生物检测

〈61〉非无菌产品的微生物检测:微生物计数检测法 生长促进试验和计数方法的适用性 概述 在供试品存在的情况下,必须确立检测微生物的试验能力。 如果引入了可能影响试验结果的在测试性能或产品方面的变更,则必须确认其适用性。 供试菌株的制备 使用供试菌株的标准化稳定悬浮液或者按照以下所述制备。使用菌种保存技术(种子批系统)以便用于接种的可萌发微生物从最初的主种子批不超过五代。按照表1中的描述,分别培养每种细菌和真菌供试菌株。 表1.供试微生物的制备和使用

用pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲溶液或pH7.2的磷酸盐缓冲液配制供试悬浮液;为使黑曲霉孢子悬浮,可将0.05%的聚山梨醇酯80加入该缓冲液中。这些悬浮液需在2个小时之内使用,或存放在2o~8o 条件下24小时内使用。作为制备并稀释黑曲霉或枯草杆菌营养细胞的新鲜悬浮液的替代方法,可制备稳定的孢子悬浮液,然后将适量的孢子悬浮液用于试验接种。稳定的孢子悬浮液可在2o~8o下保存,保存期经过时间验证。 阴性对照 为了确认试验的条件,用所选的稀释液替代供试品阴性对照。必须没有微生物的生长。 培养基的生长促进 对每一批已制备好的培养基和每一批从脱水培养基或根据描述的组分制备出来的培养基进行测试。

在部分/整个平皿内的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基和大豆酪蛋白消化物琼脂培养基中接种少量(不超过100cfu) 表1中指定的微生物,每种微生物均使用单独一部分/整个平皿培养基。在平皿内的沙氏葡萄糖琼脂培养基中接种少量(不超过100cfu)表1中指定的微生物,每种均使用一个单独平皿的培养基。按照表1中描述的条件进行培养。 对于固体培养基,所获得的生长与标准化接种体的计算值之间的差异因素不大于2。对于刚刚制备好的接种体,发生的微生物生长与用此前检验并批准过的培养基批次所得到的微生物生长相当。如果出现了与此前从上一个经过测试并通过的培养基批次获得的微生物生长相当、清晰可见的微生物生长,则液体培养基适用。 供试品计数法的适用性 样品的制备 样品制备方法取决于供试品的物理特征。如果以下描述的规程不能够被令人满意地证实,则必须开发一个适用的替代规程。 水溶性产品—溶解或稀释(通常制备1:10的稀释液)供试品,于pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液,pH7.2的磷酸盐缓冲液或大豆酪蛋白消化物肉汤培养基中。如有必要,调整pH值为6至8。需要时,用相同的稀释剂作进一步稀释。 不溶于水的非脂肪性产品—将供试品(通常制备1:10的稀释液)悬浮于pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液,pH7.2的磷酸盐缓冲液或大豆

微生物限度检查方法验证方案

微生物限度检查方法验证方案 1.目的: 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查,包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查,特制定本验证方案,通过比较试验菌的恢复生长结果,来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性,以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计,所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的容进行,若因特殊原因确需变更时,应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2.围: 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3.规性引用文件: 根据《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求,由于某些供试品具有抗菌活性,在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时,可能影响检验结果的准确性,必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4.验证实施: 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备:将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、 滤膜(孔径0.22um、直径50mm)、平皿、空三角瓶、称量纸等,用牛皮纸包扎 好后,放于湿热灭菌器中,在121℃,灭菌30 min,在3天使用。 4.4.1.2试验用培养基的制备:取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫 瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基(BL)、改良马丁琼脂 培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基(MUG)等脱水培养基,按照相应的配制 说明,用纯化水配制、分装后,在2小时,放于湿热灭菌器中,在121℃,灭 菌15 min,在3周使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备:取在有效期的试剂,按照 相应的配制方法,配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、

无菌检查室微生物限度检查室的管理规定

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1. 明确无菌检查室、微生物限度检查室的要求和规定,确保检验结果的准确性。 2.范围: 适用于本厂质监科无菌检查室、微生物限度检查室的操作。 3.责任: 质监科化验室有关人员。 4.内容:

4.1本厂无菌检查室为1万级、局部(净化操作台)100级的洁净室;微生物限度检查室为1 万级的洁净室。 4.2室内严禁放置杂物,无关人员严禁入内。 4.3室内应保持整洁,定期用甲醛熏蒸消毒(每月一次);使用前用0.1%新洁尔灭溶液擦拭消 毒净化工作台。 4.4在操作前,对菌检室、缓冲间及净化工作台进行紫外线消毒30分钟,并打 开净化工作台的层流净化装置。操作完毕及时清理,擦净台面,再开紫外灯 照射30分钟。 4.5化验员进入无菌室,必须按规定程序进行更衣、戴帽、换鞋等;操作前用0.1%新洁尔灭或 75%酒精进行手消毒。 4.6吸取菌液时,切勿直接用口接触吸管。吸完菌液的吸管放入5%石炭酸消毒液中。 4.7接种针在每次使用前后,必须通过火焰烧红灭菌,冷却后方可接种培养物。 4.8所有带菌的实验用品,须经有效的消毒灭菌方法处理后,再洗刷,严禁污染下水道。 第2页/共2页 4.9如有菌液污染桌面或地面,应立即用消毒水彻底消毒后,再作处理。

4.10无菌室每月检查杂菌数(在室内打开营养琼脂培养皿30分钟,经37℃培养48小时),10000 级平均菌数不得过3个/皿,100级平均菌落数不得过 1个/皿,如超过应进行清洁消毒。 4.11无菌检查室和微生物限度检查室的清洁卫生均按“1万级洁净区的清洁卫生操作规程”进 行。 欢迎下载阅读!

无菌检查和微生物限度检查操作规范

无菌检查和微生物限度检查操作规范 (中国药品生物制品检定所) 一、无菌室的要求: 无菌室是无菌检查、微生物限度检查的重要设备,面积不小于6平米,高度2.4-2.8m为宜。建筑材料要光洁,不吸潮,无凸起,耐腐蚀,易清洗。无菌室内部应六面光滑,无缝隙,里面连接处应呈凹凸形,不留死角。操作间和缓冲间的门不应直对,缓冲间两个。 无菌室内采光面积要大,照明灯应镶嵌在天花板内,光照应分布均匀,光照度不低于300lux,电源开关应设在室外。 无菌室、缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯,每立方米2-2.5瓦,距实验台高度不超过1米,并应定期检查辐射强度,距1米处应不低于70微瓦/平方厘米,无菌室内应安装空气除菌过滤层流装置及调温装置,控制温度18-26℃,相对湿度40%-60%,操作间或净化工作台的洁净空气应保持与相临环境形成正压,不低于4.9帕。操作区洁净度100级,操作间洁净度10000级,洁净度定期检查。 无菌室及缓冲间不得存放其他杂物,如培养箱。 用消毒液清洁无菌室操作台面,开启无菌室紫外灯和层流空气过滤30分钟以上。无菌室的无菌程度,常用的沉降菌测定方法为:取营养肉汤琼脂平板3个,置无菌室的操作区台面左、中、右位置上,开盖暴露30分钟,在30-35℃培养2天后,计算菌落数。用于无菌检查的无菌室或微生物限度检查的无菌室,细菌总数应小于3个,浮游菌每立方米应小于5个,否则,不能用于无菌检查和微生物限度检查。 二、培养基的准备 1、培养基的制备: 配制培养基的蒸馏水或去离子水应符合规定。再称取需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基的干燥培养基,加水溶化后,调节PH值,使灭菌后需气菌、厌气菌培养基的PH值为7.0-7.3,真菌培养基的PH值为6.2-6.6,分装、盖塞、灭菌,待用。 2、培养基灵敏度试验: 培养基是无菌试验的基准物质,关系到无菌试验结果的科学、准确、可信度,因此,培养基灵敏度试验是无菌试验的重要组成部分。只有使用灵敏度试验合格的培养基,才能保证无菌试验结果准确、可靠。 培养基灵敏度试验操作如下:取藤黄微球菌、生孢梭菌、白色念珠菌的新鲜培养液,分别10倍递增稀释,制成每ml 含10-100个菌,并作菌落记数。将制备好的菌液分别加至需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基各3管。至规定温度培养5天,每株菌接种的培养基不少于2管生长,则改培养基的灵敏度试验合格。 3、培养基用前的检查: (1)无菌检查:各种培养基在规定温度培养3天,应无菌生长。 (2)新鲜程度检查:需气菌、厌气菌培养基氧化层的颜色用前不能超过1/5,否则,不能使用。应煮沸去氧,只限加热一次。 4、培养基的保存时限: 配制好的无菌试验用培养基在2周内用完。 三、菌种复苏和保藏 1、菌种复苏: 先将冻干菌种的封口端用砂轮刻痕,在刻痕处过火焰数次,用无菌湿棉球炸裂后打开,然后,加入0.3-0.4ml稀释液于菌种管底部,将菌种稀释、混匀,并吸出菌液,接种于适宜的培养基。培养时间和温度根据不同的菌种而定。仔细检查菌种的有关特性,如无发现异常,即可传代、使用。 2、药品微生物用的菌种传代方法: 取复苏好的菌种一支,接种于规定的培养基数管,培养后,置冰箱中保藏。取出使用的菌种,经一段时间后即可废弃。 为防止微生物突变,菌种应尽量避免不必要的接种和传代。

微生物限度检查法应用指导原则

微生物限度检查法应用指导原则 为更好应用微生物限度检查法(附录ⅪJ),特制定本指导原则。 微生物限度检查法可用于判断非规定灭菌制剂及原料、辅料是否符合药典的规定,也可用于指导制剂、原料、辅料的微生物质量标准的制定,及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。本指导原则将对标准和方法中的特定内容及标准的应用做进一步的说明。 1.微生物限度检查过程中,如需要使用表面活性剂、灭活剂及中和剂,在确定其能否适用于所检样品及其用量时,除应证明该试剂对所检样品的处理有效外,还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出(即无毒性),因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株,而应当包括产品中可能污染的微生物。 2.供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及细菌、霉菌及酵母菌计数方法应尽量选择微生物限度检查法中操作简便、快速的方法,且应避免损伤供试品中污染的微生物。对于抑菌作用较强的供试品,在供试品溶液性状允许的情况下,应尽量选用薄膜过滤法进行试验。 3. 微生物限度检查法(附录ⅪJ)收载的离心沉淀法仅适用于制备细菌计数或控制菌(细菌)检查用的供试液,规定的500转/分钟、不超过3分钟只用于去除供试液中的沉淀物。采用该方法时,供试液中的样品颗粒大小、粘稠度及污染的微生物大小,转速等直接影响着样品中微生物的回收,易造成检验结果不能真实反映供试品的污染情况。因此,供试液制备时尽量避免使用该方法,更不宜采用高速离心沉降集菌。 4.对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基,用于培养基适应性检查。由中国药品生物制品检定所研制及分发。 5. 进行验证试验时,若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败,应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法验证试验。此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行,但最高稀释级供试液选择应根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则,如供试品应符合的微生物限度标准是1克细菌数不得过1000cfu,那么最高稀释级是1:10-3。

微生物限度检查室管理规程 (2)

目的:规范微生物实验室管理,确保微生物检验结果的准确性。 范围:适用于微生物实验室。 职责:微生物检测人员及检验室负责人对此规程执行负责。 内容: 1.微生物实验室包括微生物限度检查室、阳性菌接种室及抗生素微生物检定室。1、1 微生物实验室结构应坚固、严密、防尘、光线明亮,地面应光滑,并应有缓冲间,设双层传递窗传递物件。 1、2 室内温度18~26℃,相对湿度为45~65%,室内必须保持整洁。 2、微生物实验室洁净度要求: 2、1微生物实验室洁净度应符合相应的医药洁净室设计规范与验收要求。 2、1、1 操作室洁净度应符合洁净度C级要求。 2、1、2 操作台洁净度应符合洁净度A级要求。 3.微生物实验室的使用: 3.1微生物实验室由微生物检验员管理及使用,其她人员须经主管人员批准后方可进入与使用。 3、2 微生物实验室的人员需经过相关的岗位培训,必要时定期进行再培训。 3、3微生物实验室操作人员应严格遵守洁净工作区域净化控制规定。 3.3、1 保持个人卫生,不得佩带饰物,不得涂抹化妆品。 3、3、2 室内应穿戴专用衣帽、口罩及鞋子。 3、3、3 手部应进行2次消毒,宜带无菌手套。 3、3.4 在操作中,操作台面应垫上消毒布巾,以防操作中有滴落液污染台面。3、3、5 人员进入微生物限度检查室、阳性对照室或抗生素微生物检定室前,在一更脱外衣、换鞋后,进入一更缓冲间洗手,并消毒后,进入二更自上而下依次换上洁净帽、口罩、洁净服、洁净鞋后,进入二更缓冲间,手经再次用消毒液消毒后方可进入微生物限度检查室或阳性对照室,实验操作前须带上无菌手套。 3、4微生物实验室使用前应确保操作室的洁净程度。 3、4.1微生物实验室的清洁分为一般清洁及彻底清洁,其具体的清洁部位、方式方法、频率见下表所示:

微生物限度检查操作流程

微生物限度检查工作流程 实验前: 1.对实验器皿的准备:对玻璃器皿进行清洗,将洗净干燥的平皿、乳钵、刻度吸管等用牛皮纸包裹,放入鼓风干燥箱中于160℃干热灭菌2小时或放入高压蒸汽灭菌柜于121℃湿热灭菌30分钟,备用。 2.对实验用培养基及稀释液的准备:按规定比例配制实验所需的各种培养基及稀释液,包好,放入高压蒸汽灭菌柜于121℃湿热灭菌30分钟,备用。 3.洁净服的准备:将当天实验所用洁净服放入高压蒸汽灭菌柜于121℃湿热灭菌30分钟,备用。 实验中: 1.将实验所需器皿、培养基、洁净服、样品、稀释液放入相应的传递窗中,打开紫外灯,照射30分钟。 2.打开洁净室的通风设备1小时以上,观察洁净室各个规定区域的压差是否符合相应规定范围,若不符合,则因通知设备部门及时进行调整。 3.进入洁净室,换上工作鞋,用洗手液洗手,烘干,换上洁净服,戴上口罩、手套,并与喷手器下用75%乙醇或0.1%新洁尔灭对双手进行消毒。 4.进入万级洁净走廊,观察各个规定房间的温度、湿度、压差是否符合规定,并与传递窗中将经紫外灯照射后的样品、器皿稀释液及培养基,放入相应的实验室(如微生物限度检查室或无菌检查室)。并将培养基的温度控制在45℃以下(若培养基出现凝固现象时,因微波炉加热融化;若温度太高时,则因用纯化水降温至不烫手背宜。 5.打开超净工作台的紫外灯,照射30分钟,然后再打开超净工作台的通风设备。用75%乙醇或0.1%新洁尔灭对实验所用工作台面进行擦拭消毒(消毒时应遵循由里到外,由上到下,由洁净要求高到洁净要求低的原则)。 6.按照适宜的次序于超净工作台内摆放好稀释液、天平、消毒液、集菌仪、剪刀、镊子等物品,用75%酒精棉球进行消毒,将样品内包装表面用碘酒棉球以及75%酒精棉球依次进行消毒。将营养琼脂平板与超净工作台的做、中、右各置一个(平板需经下预培养48小时且无菌生长),开盖暴露30min,测定的沉降菌每平板不得超过1cfu,则符合百级超净工作台的沉降菌标准(注:在洁净工作台进行操作时,为防止污染,应用酒精棉球对双手反复消毒)。 7.样品处理(以采用离心薄膜过滤法为例):用天平称取规定量的样品,置于乳钵中,碾碎,少量几次加入规定量(用灭好菌的两头高量取)的稀释液,研磨均匀,以制备供试液。8.细菌的检查:用灭菌吸管吸取规定量的供试液于离心管中,500转/秒,离心3分钟。离心后用注射器吸取规定量的上清液于集菌仪中(集菌仪中的滤膜应事先用少量的蛋白胨溶液进行润洗),再用规定量的蛋白胨溶液进行反复冲洗(每次冲洗量不得超过100ml,每张滤膜的总的冲洗量不得超过1000ml,且冲洗过程中应该保持滤膜的完整性)。并用等量的蛋白胨溶液制备阴性对照的滤膜。 8.打开集菌仪,用镊子夹取滤膜于在30~35℃预培养48小时且无菌生长的营养琼脂平板上,切忌滤膜与琼脂间有气泡。并且制备2个只加入15~20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂的平板作空白对照。 9.霉菌及酵母菌的检查:取相应稀释级的供试液1ml,加入五个无菌平板中,每个0.2ml,注入15~20ml温度不超过45℃的溶化的玫瑰红钠琼脂培养基,摇匀。

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