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Lowry法和Bradford法测定玻璃酸钠中蛋白质含量的比较

Lowry法和Bradford法测定玻璃酸钠中蛋白质含量的比较

杨桂兰郭学平

Lowry改良的酚试剂法(简称Lowry法)和Bradford染料结合法(简

称Bradford法)是两种常用的蛋白质测定方法。在用于测定玻璃酸中作为杂

质的蛋白质的含量时,发现两种方法的测定结果差异很大。本文用实验和有

关文献对此进行分析。

1材料

考马斯亮蓝G 250,分析纯,上海化学试剂站进口分装;牛血清白蛋白(BSA),中国药品生物制品检定所;碱性蛋白酶,丹麦Novonordisk 公司;

玻璃酸钠(HA),山东福瑞达精细化工有限公司。

紫外可见光分光光度计,日本岛津公司。

2方法

2.1Lowry法[1,2]

精密称取HA 500mg,置于100ml 量瓶中,加水溶解至刻度,依法测定。

2.2Bradford法[3,4]

2.2.1考马斯亮蓝试液配制考马斯亮蓝100mg溶于95%乙醇50ml,再加85%磷酸100ml,加水稀释至800ml,过滤备用。

2.2.2标准曲线制作取BSA 10mg,精密称定,置于100ml量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,制得100μg/ml的BSA对照品溶液。取具塞试管6支,分别加入BSA标准液0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60ml,均补加水至1.0ml,得到含BSA 0、5、10、20、40、60μg的标准系列。分别加入考马斯亮蓝试液4ml,立即混匀,5min后在595nm波长处用1cm比色池测定吸收度,以BSA

质量(μg)对吸收度作图,得标准曲线,或计算出直线回归方程。

2.2.3供试品测定取HA 500mg,精密称定,置于100ml 量瓶中,加水溶解至刻度,取1ml 于具塞刻度试管中,以下同2.2.2项下测定吸收度,从标准曲线得到蛋白质质量(μg),以此计算HA供试品的蛋白质含量。

2.3Bradford法测定HA溶液中蛋白质的回收实验

取BSA 50mg,精密称定,溶于0.5%的HA溶液50ml中。再用HA溶液稀释成含BSA 5、40、60、80μg/ml的溶液。以0.5%HA溶液为空白,用Bradford法测定BSA溶液的蛋白质浓度。

2.4BSA水溶液酶解前后蛋白质含量的测定

取BSA 200mg,精密称定,加水溶解至200ml。取100ml,用稀氢氧化钠溶液调pH8.5,加1mg/ml的碱性蛋白酶溶液1ml,50℃酶解5h,期间维持pH 8.0~8.5。分别取酶解前后的BSA溶液1ml于100ml量瓶中,加水至刻度,用两种方法分别测定蛋白质的含量。

3结果

3.1HA供试品中蛋白质的含量

Lowry法标准曲线的回归方程式为: C = - 6.44 + 290.0A,r = 0.9991。Bradford法标准曲线的回归方程式为:C = - 0.53 + 147.62A,r= 0.9993。式中A为吸收度,C为显色试管中蛋白质的质量(μg),r为相关系数。根据两种方法的标准曲线斜率之比可计算出,Bradford法对BSA的显色灵敏度约是Lowry法的两倍。两种方法所测HA供试品中的蛋白质含量见表1。Lowry法测定结果明显高于Bradford法。

表1 HA供试品中的蛋白质含量测定值(%)(n=2)

HA供试品号Lowry法Bradford法

1 1.30 0.35

2 0.14 0.06

3 0.76 0.01

4 0.70 0.04

3.2Bradford法在0.5%HA溶液中测定蛋白质的回收率实验结果

Bradford法的回收实验结果(见表2)表明,在0.5%HA溶液中该法测定蛋白质的回收率在100%左右,符合方法学要求。同时本结果还证实,HA对Bradford法无干扰。

表2 Bradford法测定BSA的回收率(n=4)

BSA浓度(μg/ml) 实测值(μg/ml) 回收

率(%)

5 4.74 94.8

40 43.44 108.6

60 62.28 103.8

80 79.42 99.3

3.3BSA溶液酶解前后的蛋白质含量

Lowry法测定BSA溶液酶解前后的蛋白质含量分别为998、1225μg/ml;Bradford法测定BSA溶液酶解前后的蛋白质含量分别为1160、100μg/ml,结果截然相反。酶解后Lowry法的测定值略有升高,而Bradford法的测定值大幅度下降。

4讨论

测定HA供试品中的微量蛋白质杂质含量时,Lowry法的测定值显著高于Bradford法,可能有两个原因,即不同的测定反应机制和供试品中作为

主要成分HA的干扰。回收率实验结果排除了后一种原因。Lowry法测定值高,是其反应机制所决定的。该法所用的Folin酚试剂,与酚反应呈现出蓝色,进行蛋白质测定时,该试剂与酪氨酸和色氨酸等特定的氨基酸残基作用,产生显色反应。

Lowry等在Folin酚试剂法的基础上,加入了双缩脲法的优点,进行了改良。双缩脲法是利用碱性硫酸铜试液中的Cu2+与肽键络合而产生的显色反应。两种显色机制的协同作用,使Lowry改良的Folin酚试剂法,显色强度提高3~15倍,灵敏度为双缩脲法的100倍。由此机制可以看出,Lowry法对蛋白质和分子较小的多肽,具有同样的显色反应。本研究用对BSA溶液酶解前后进行蛋白测定的试验证实了这一点,而对于Bradford染料结合法,酶解后测定值下降至约1/10,说明多肽对Bradford法基本无干扰作用。实验中加入的酶只占BSA的1%,而两种方法所加酶量相等,故酶本身与结果对比,基本无影响。

Lowry法和Bradford法的比较见表3。HA供试品中含有混合蛋白质和多肽等杂质,用Lowry法测定蛋白质时,多肽也有显色反应,故测定值偏高。多肽的分子链比蛋白质短,一般无致敏作用,而测定HA产品中微量蛋白质的主要目的是将蛋白质含量控制在限量之下,根据被测物质中蛋白质为少量成分时,应选用Bradford法的原则[2],以及上述试验结果,作者认为测定HA 产品中的微量蛋白质,选用Bradford法更适合。

使用BSA作为蛋白质测定用对照品应注意下述问题[4]。所用BSA应有足够的纯度,不含脂质、无机盐和非蛋白氮化合物,低温保存,使用前应用五氧化二磷对其进行真空干燥。可用光吸收法,对BSA的纯度或称量精度进行

验证,即在279nm波长处测定1mg/ml的BSA溶液吸收度,应为0.667。

表3 Lowry法和Bradford法的比较[2,4]

方法原理有效范围

和灵敏度

优缺点干扰物适用供试品

Lowry法Cu2+与肽键的

络合及氨基

酸对Folin酚

试剂的还原

1

0~200μg

A750(1%)=3

.3

灵敏度较低,试

剂配制及测定操

作复杂,蛋白质

的种类对结果有

影响

酚、甘氨、

EDTA、硫

酸铵、肽

蛋白质为主

要成分的物

Bradfor 法与蛋白质结

合导致的颜

色改变

0.3~2.5μg

A595(1%)=9

.0

灵敏度高,只用

一种试剂,操作

简单、迅速,蛋

白质的种类对结

果有影响

表面活性

剂、碱

蛋白质为少

量成分的物

参考文献

1Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, et al. J Biol Chem, 1951, 193: 265

2董纯定. 生化药物分析. 南京:中国药科大学出版,1995,142~150

3Bradford MM. Anal Biochem, 1976, 72: 248

4Dryer RL, Lata GF. Experimental biochemistry. New York: Oxford University Press, 1989, 346~347

[原文发表于:中国生化药物杂志,2003,24(3):131~133]