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HLA基因分型方法:RFLP法

HLA基因分型方法:RFLP法
HLA基因分型方法:RFLP法

1)常规制备DNA

盐析法

1.用淋巴细胞分离液从抗凝血中分离出白细胞。

2.每3ml细胞悬液加10ml红细胞裂解液溶解红细胞两次,再加2ml白细胞裂解液溶解白细胞。

3.加50μl 10%SDS和70μl蛋白酶K消化蛋白质,37℃过夜或55℃3h。

4.加0.25体积饱和醋酸钠溶液,剧烈摇动15s。

5.2000r/min离心15min,收集上清。

6.加入2.5倍预冷无水乙醇沉淀DNA,-20℃过夜。

7.吸取DNA团块用70%乙醇洗3次,每次10 000r/min,10min。再溶于适量TE缓冲液中,4℃保存。

酚抽提法

1.采集EDTA抗凝血0.5ml,加双蒸水2.5ml,溶解红细胞。

2.离心10 000r/min,5min,弃上清。

3.加0.5ml生理盐水,混匀,离心10 000r/min,5min,弃上清。

4.加500μl TES,混匀,再加20%SDS 25μl,蛋白酶K 4μl置55℃水浴4h或37℃水浴过夜。

5.加等体积饱和酚,混匀,离心10 000r/min,5min,吸取上层水相,再加等体积饱和酚抽提一次。

6.加等体积氯仿:异戊醇再抽提一次。

7.吸取上层液,加1/10体积醋酸钠,2.5倍体积无水乙醇,混匀,-20℃过夜,沉淀DNA。

8.吸出DNA团块,用预冷70%乙醇洗1次,弃尽液体,真空抽干DNA,加适量TE溶解。

4℃保存。

2)限制性内切酶消化

在无菌EP管中依次加入双蒸去离子水7μl,10×缓冲液2μl,限制性内切酶1μl,DNA 10μl。反应体系含1×缓冲液、DNA 5μg、酶10U。稍离心以混匀,37℃水浴1~1.5h。酶解结束后向反应管中加1/10体积的终止液终止反应,冷却至4℃,准备电泳。

3)琼脂糖凝胶电泳

1.配制1%琼脂糖凝胶板:取0.4g琼脂糖加40ml TBE,微波炉熔化,加少量双蒸水补充蒸发的水分,将其冷却至60℃,倒入凝胶槽内,充分凝固后拔出样品梳。

2.从制胶槽中卸下凝胶板,放入电泳槽,加入1×TBE,使其液面略高于琼脂糖板。3.DNA样品按4:1的比例加样液,全部加样于琼脂糖板的样品孔中。

4.电泳80V,约2h。

5.加等体积饱和酚,混匀,离心10 000r/min,5min,吸取上层水相,再加等体积饱和酚抽提一次。

6.加等体积氯仿:异戊醇再抽提一次。

7.吸取上层液,加1/10体积醋酸钠,2.5倍体积无水乙醇,混匀,-20℃过夜,沉淀DNA。

8.吸出DNA团块,用预冷70%乙醇洗1次,弃尽液体,真空抽干DNA,加适量TE溶解。

4℃保存。

2)限制性内切酶消化

在无菌EP管中依次加入双蒸去离子水7μl,10×缓冲液2μl,限制性内切酶1μl,DNA 10μl。反应体系含1×缓冲液、DNA 5μg、酶10U。稍离心以混匀,37℃水浴1~1.5h。酶解结束后向反应管中加1/10体积的终止液终止反应,冷却至4℃,准备电泳。

3)琼脂糖凝胶电泳

1.配制1%琼脂糖凝胶板:取0.4g琼脂糖加40ml TBE,微波炉熔化,加少量双蒸水补充蒸发的水分,将其冷却至60℃,倒入凝胶槽内,充分凝固后拔出样品梳。

2.从制胶槽中卸下凝胶板,放入电泳槽,加入1×TBE,使其液面略高于琼脂糖板。3.DNA样品按4:1的比例加样液,全部加样于琼脂糖板的样品孔中。

4.电泳80V,约2h。

5.加等体积饱和酚,混匀,离心10 000r/min,5min,吸取上层水相,再加等体积饱和酚抽提一次。

6.加等体积氯仿:异戊醇再抽提一次。

7.吸取上层液,加1/10体积醋酸钠,2.5倍体积无水乙醇,混匀,-20℃过夜,沉淀DNA。

8.吸出DNA团块,用预冷70%乙醇洗1次,弃尽液体,真空抽干DNA,加适量TE溶解。

4℃保存。

2)限制性内切酶消化

在无菌EP管中依次加入双蒸去离子水7μl,10×缓冲液2μl,限制性内切酶1μl,DNA 10μl。反应体系含1×缓冲液、DNA 5μg、酶10U。稍离心以混匀,37℃水浴1~1.5h。

酶解结束后向反应管中加1/10体积的终止液终止反应,冷却至4℃,准备电泳。

3)琼脂糖凝胶电泳

1.配制1%琼脂糖凝胶板:取0.4g琼脂糖加40ml TBE,微波炉熔化,加少量双蒸水补充蒸发的水分,将其冷却至60℃,倒入凝胶槽内,充分凝固后拔出样品梳。

2.从制胶槽中卸下凝胶板,放入电泳槽,加入1×TBE,使其液面略高于琼脂糖板。

3.DNA样品按4:1的比例加样液,全部加样于琼脂糖板的样品孔中。

4.电泳80V,约2h。

5.取出凝胶板,置溴化乙锭溶液中染色30min。

6.紫外灯下观察结果,可用全色黑白胶卷拍照,镜头加红色滤色镜,光圈2,速度15~40 s。

4)分子杂交

DNA转移

1.将琼脂糖凝胶切下,放入盛有变性液的搪瓷盘中,浸泡15~20min,用蒸馏水洗涤2~3次,用中和液再浸泡15~20min。

2.取一托盘放入10×SSC缓冲液,托盘上放一转移用支架,支架上搭滤纸桥,使溶液能够虹吸上来。

3.在支架上依次放入Whatman 3MM滤纸,处理好的凝胶,硝酸纤维素膜,Whatman 3M M滤纸,吸水纸,玻璃板,适量重物500~1000g。

4.放4℃冰箱转移12~16h,中间更换吸水纸。转移结束后,去除上面的东西,用镊子将膜

取出,用清水冲洗一下后,让膜自然晾干。

5.80℃真空干燥2h,将DNA固定于膜上,保存于干燥处待用。

预杂交液

将转移好的硝酸纤维素膜用2×SSC溶液浸透,装入可加热封口的杂交袋中,按0.2ml/cm2加入适量预杂交液,用塑料热封口机封口。于37~42℃预杂交4~6h。

杂交

1.将塑料袋剪一小口,取出预杂交液。

2.将标记好的探针加热变性,煮沸7min,骤冷至0℃,加入杂交液。

3.将含探针的杂交液加入袋中,封口。

4.42℃水浴杂交20h,取出杂交液。

洗膜

1.1×SSC,0.1%SDS室温15min×2。

2.0.25×SSC,0.1%SDS室温15min×2。

放射自显影

1.洗涤后的膜置于干净的滤纸上,室温自然晾干。

2.用塑料薄膜包好膜,做好标记。

3.在暗室内将2张X线胶片放在增感屏的内侧,并将硝酸纤维素膜放在2张X线胶片之间。4.盖严暗盒,放-50℃冰箱放射自显影2~7天。

5.在显影液中显影2~4min。

6.在定影液中定影20min。

7.用清水洗胶片20min,晾干,读片检测结果。

PCR-RFLP法

1)提取细胞总DNA

方法同前。

2)PCR扩增引物的设计

1.引物长度一般为15~30bp,G+C含量应在45%~55%之间。

2.应避免连续出现4个以上的单一碱基。

3.不能含有自身互补序列。

4.两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基,不然会形成引物二聚体。

5.与非特异扩增序列的同源性应小于70%,或少于连续8个互补碱基。

6.扩增HLA-D区基因多态性区段的引物应在该区第二外显子或高变区的边缘。

3)PCR扩增

1.每100μl反应体系中分别加入:缓冲液10μl,引物各25pmol,DNA 1~2μg,10μl dNTPs,混合均匀后在95~97℃变性5~10min。

2.加Taq DNA聚合酶2U,液体石蜡50μl覆盖放置水分蒸发,将样品置PCR扩增仪中完成扩增反应,变性,退火,延伸温度时间及Mg2+的浓度随扩增引物及区段的不同而改变。

4)限制性内切酶消化

取5μl PCR产物分别用2个单位限制性内切酶(如HinfI)在总体积为12μl的反应体积中酶解,37℃保温2~3h。

PCR-SSCP法

1)提取DNA

同前RFLP法

2)PCR扩增

同前PCR-RFLP,也可加入1μCi32P-dCTP标记产物。

3)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

1.取PCR的扩增产物,加凝胶加样液3μl,95℃加热变性2min,冰浴骤冷。同位素掺入的DNA取1μl稀释10倍,加样3μl。

2.取样品用微量加样器加入非变性聚丙烯酰胺凝胶样品孔中,200V电泳过夜。

4)放射自显影

1.未掺入同位素的PCR产物电泳后,取出凝胶床,撬去粘附的玻璃板,将凝胶浸在固定液中15min。

2.用0.2%AgNO3浸泡10min,用去离子水冲洗。

3.在显色液中显影,直到获得满意效果。将显色好的凝胶转贴到滤纸上,照相分析结果。

ABO血型分型方法

华科基因ABO血型分型方法 按照Bernstein三复等位基因学说,ABO基因座主要有三个等位基因A、B和O。A、B对O为显性,O为隐性。ABO血型的表型与基因型的关系是:A型为AA或AO;B型为BB 或BO;AB型为AB;O型为OO。因为隐性基因O存在,ABO基因型不能直接用凝集反应来确定,但可通过DNA分型技术直接检测基因型,或通过表型的家系调查来推定。 ABO血型分型方法 一、ABO血型血清学分型方法 ABO血型是根据红细胞与特异性抗体的反应来分型。即用抗A抗体判定A抗原,用抗B抗体判定B抗原,这种检查法称作正定型试验(direct grouping)。同时依据血清中的凝集素与标准型别红细胞膜上的凝集原反应的性质来检验结果。即用标准的A型红细胞判定抗A抗体,用标准的B型红细胞判定抗B抗体,称作反定型试验(reverse grouping)。为使结果准确,应进行正反两个试验来分型,同时也应用抗H抗体判定H抗原。当正反试验的结果与常规的ABO分型原则不符的时候,提示可能是弱亚型或变异型。 二、ABO血型DNA分型方法 分子生物学技术将ABO血型分型由血清学水平深入到基因水平。DNA分型方法都是针对核苷酸顺序差异而设计的。常用的有序列特异性引物PCR技术与PCR-RFLP技术等。序列特异性引物PCR(PCR-sequence-specific primers,PCR-SSP)是根据等位基因的序列,设计具有序列特异性的引物,对样本进行DNA分型。该方法是以引物决定分型特异性,具有特异性强、重复性好、结果易于判定的优点。 ABO血型分型可提供以下样本: 常用样本:血液,血痕,带毛囊的毛发,口腔粘膜细胞(口腔拭子)等。 特殊检材:如精斑、混合斑、肌肉、烟蒂、胎儿的羊水等都可以采用。 采样建议: 1.我们建议您采用血痕或口腔棉签作为检测样本,或采用毛发(带毛囊)作为检测样本。 2.如果您的孩子未满四周岁,请采用血痕、口腔棉签作为样本。 3.如果孩子还未出生,则参考羊水样本抽取方法。

SNP基因分型的高通量方法

Chapter16 High-Throughput Methods for SNP Genotyping Chunming Ding and Shengnan Jin Abstract Single nucleotide polymorphisms(SNPs)are ideal markers for identifying genes associated with complex diseases for two main reasons.Firstly,SNPs are densely located on the human genome at about one SNP per approximately500–1,000base pairs.Secondly,a large number of commercial platforms are available for semiautomated or fully automated SNP genotyping.These SNP genotyping platforms serve different purposes since they differ in SNP selection,reaction chemistry,signal detection,throughput,cost,and assay flexibility.This chapter aims to give an overview of some of these platforms by explaining the technologies behind each platform and identifying the best application scenarios for each platform through cross-comparison.The readers may delve into more technical details in the following chapters. Key words:Whole genome association,fine mapping,single nucleotide polymorphism,copy number variation,haplotyping. 1.Introduction Single nucleotide polymorphisms(SNPs)are best known as genetic markers in disease-association studies to identify genes associated with complex diseases(1,2).However,SNPs are also used in many other clinically and biologically important applica- tions(3).A large variety of commercial platforms are available for semiautomated or fully automated SNP genotyping analysis.On the basis of the purposes of the study,SNP genotyping can be divided into two domains:whole genome association(WGA)and fine mapping(Fig.16.1).Most of the genotyping platforms can be classified accordingly.This chapter aims to briefly explain the principles behind various platforms which lead to a comparison of these platforms so that the readers will get a quick overview before delving into the technical details of some of these methods in the following chapters. A.A.Komar(ed.),Single Nucleotide Polymorphisms,Methods in Molecular Biology578, DOI10.1007/978-1-60327-411-1_16,aHumana Press,a part of Springer Science+Business Media,LLC2003,2009 245

高通量SNP基因分型技术研究进展

10 Sheng W et al.J Virol,2003;77(6):3859 11 C ohen J I,et al.J Virol,1999;73(9):7627 12 Wei MX et al.Cancer Res,1994;54(7):1843 13 G ao Y et al.Oncogene,2002;21(5):825 14 T anner J E et al.J In fect Dis,1997;175(1):3815 Decaussin G et al.Cancer Res,2000;60(19):5584 16 Brink AA et al.J Clin M icrobiol,1998;36(11):3164 17 Hayes DP et al.M ol Pathol,1999;52(2):97 18 zur Hausen A et al.Cancer Res,2000;60(10):2745 (2002211201 收稿) 高通量SNP基因分型技术研究进展 方唯意综述 姚开泰审阅 中南大学湘雅医学院肿瘤研究所(长沙,410078) 摘要 在后基因组时代,单核苷酸多态性研究已迅速成为了生物医学许多领域的焦点。发展可靠、敏感、经济、稳定、高通量的S NP基因分型技术已迫在眉睫。本文主要着重于高通量S NP基因分型技术的原理、利弊以及这些技术在这个领域过去几年中的进展。 关键词 高通量;单核苷酸多态性;基因分型 单核苷酸多态性(S NPs)是最普遍的遗传变异形式。通过开展具有明显表型特征的S NPs基因分型大规模相关研究,有助于鉴定许多复杂疾病原因,了解个体对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。人类基因组测序的完成和142万个S NPs在基因组上的定位[1],为首次在全基因组水平上进行S NPs研究打开了方便大门。经典的S NPs分析方法是PCR 扩增后用凝胶电泳检测,虽然可靠性好,但缺乏效率。寡核苷酸微阵列和其他高通量筛选技术效率有了明显的提高,但临床应用绝非可靠,因此,有必要改进和发展新的可靠、敏感、高通量、经济、稳定的S NPs基因分型技术。在本文中,我们主要阐述高通量S NPs基因分型方法,包括一步均质法、焦磷酸测序、DNA芯片/阵列分析法、微球法、MA LDI2T OF质谱基因分型分析法等,讨论这些技术的目前状态和将来潜力。 1 一步均质法 T aqman、Scorpion分析和分子灯塔组成了微滴定平板荧光阅读系统。T aqman和分子灯塔都依赖于等位基因特异性寡核苷酸杂交在PCR期间对等位基因进行区分。而Scorpion分析能使用等位基因特异性PCR或是等位基因特异性杂交反应[2]来区分等位基因。它们作为一个末端分析能在一个完全均质的反应条件下进行分析。在反应起始,所有试剂和基因组DNA都混合在一起,经热循环步骤后,荧光信号能被检测到。该反应既没有单独的预扩增步骤,也没有中间的处理过程,因此它们是一种最简单的分析方法。由于没有适合这些方法的384孔荧光检测器,以及荧光标记探针的价格过高和缺乏可靠的自动化基因型呼叫软件,因此阻碍了这些方法的发展。最近,Applied Biosystems公司新开发的7900HT型高通量荧光定量PCR仪,使得进行384孔微滴定平板荧光检测成为了可能,这主要归因于高通量能力的增加和反应容积的减少。当如果要发展更高的基因分型通量时,一个可靠的自动化等位基因呼叫能力是必须的,它不只是纠正基因型呼叫信号更快,而且在处理和加工数据上必须更迅速,更准确。近来研究表明,自动化基因型呼叫在无阳性对照情况下进行聚类分析是可行的[3]。 2 焦磷酸测序Pyrosequencing 焦磷酸测序是对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量、精确和重复性好的分析方法。其反应原理是当测序引物与PCR扩增的,单链DNA模板杂交,和各种酶包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、以及底物、荧光素一起共同孵育。4种dNTP之一被加入反应体系,如与模板配对,该dNTP与引物的末端形成共价键,dNTP 的焦磷酸基团释放出来。ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸生成ATP,ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化,氧化荧光素发出的可见光信号与ATP量成正比。ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解,光信号淬灭,并再生反应体系,然后再加另一种dNTP继续反应。焦磷酸测序最初作为DNA测序方法而发展起来的,其化学反应与Sanger双脱氧二核苷酸法完全不同。它无需灌胶、毛细管电泳,也无需同位素或荧光染料

判断遗传方式及确定基因的位置

遗传题解题思路 ——判断遗传方式及确定基因的位置 一、遗传方式归纳及判断 细胞质遗传 Y染色体遗传 X染色体显性遗传 细胞核遗传X染色体隐性遗传 常染色体显性遗传 常染色体隐性遗传 Ⅰ.判断细胞质遗传还是细胞核遗传 此判断通常用正反交实验来进行。若是细胞质遗传,正反交结果F 1 表现型分别与其母 本相同、表现为母系遗传;若是细胞核遗传,正反交结果F 1 表现型不与母本相同,一般表现为显性性状,有时还会与性别相关(这时为伴性遗传)。 Ⅱ.判断核遗传中单基因控制的性状的五种遗传方式(用人类的单基因遗传病来说明)1.若为Y染色体遗传,其特点为传男不传女,只有男性患者没有女性患者,且男性患者的上下代男性全为患者; 2.若为X染色体显性遗传,其特点为(患者以上)代代相传,男性患者的母亲及女儿一定是患者,且患者女性多于男性; 3.若为X染色体隐性遗传,其特点为隔代遗传,交叉遗传,女性患者的父亲及儿子一定是患者,且男性患者多于女性; 4.若为常染色体显性遗传,其特点为(患者以上)代代相传,通常男女患病机会均等; 5.若为常染色体隐性遗传,其特点为隔代遗传,通常男女患病机会均等; 以上判断规律可总结为:(除细胞质遗传和Y染色体遗传外) 无中生有为隐性,隐性遗传看女病,父或子无病非伴性。(父和子都有病,则都可能)有中生无为显性,显性遗传看男病,母或女无病非伴性。(母和女都有病,则都可能) 二、确定基因的位置 Ⅰ.判断基因在细胞质还是细胞核中的方案 例1.自然界中玉米的绿色茎为稳定遗传,但在田间偶尔也会出现紫色茎的玉米。请用绿茎玉米和紫茎玉米为材料,设计一个方案判断这一性状是细胞质遗传还是细胞核遗传,写出实验方案。 ①实验方案:P♀绿茎×♂紫茎P♂绿茎×♀紫茎 ↓↓ F 1F 1 ②预测结果及结论:若两个杂交组合后代中F 1 都表现为绿茎或紫茎,则为细胞核遗传; 若杂交组合一的后代F 1表现为绿茎,若杂交组合二的后代F 1 表现为紫茎,则为细胞质遗传。 【小结】正交和反交。若正反交结果F 1 表现型分别与其母本相同、表现为母系遗传,

遗传标记STR基因座分型

遗传标记STR基因座的高分辨电泳分型 摘要:STR(Short Tandem Repeat,短片段重复序列)广泛存在于人类及哺乳动物的基因组中,具有高度多态性,一般由2~6个碱基构成一个核心序列,核心序列串联重复排列,由核心序列重复数目的变化产生长度多态性。本实验用磁珠法提取人类基因组DNA后,用三对引物(D1S1677、D4S2364和D10S1248)分别对一号染色体、四号染色体和十号染色体的STR序列进行PCR扩增,通过聚丙烯酰氨凝胶电泳技术(PAGE)对PCR产物进行分离,最后用EB染色凝胶后在紫外灯下观察实验结果并进行分析。通过此次实验,我们了解了STR序列的特征和相关应用,掌握了磁珠法提取人类基因组DNA技术、PCR技术,以及聚丙烯酰氨凝胶电泳技术(PAGE)。 关键词:STR磁珠法PCR扩增聚丙烯酰氨凝胶电泳技术(PAGE) 1.引言 DNA指纹技术是一项具有广泛应用价值的技术。它在人类医学中被用于个体鉴别、确定亲缘关系、医学诊断及寻找与疾病连锁的遗传标记;在动物进化学中可用于探明动物种群的起源及进化过程;在物种分类中,可用于区分不同物种,也有区分同一物种不同品系的潜力。在作物的基因定位及育种上也有非常广泛的应用。 DNA指纹技术的发展经历了三代。第一代DNA指纹技术利用了DNA 指纹图谱。1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针,同人体核DNA的酶切片段杂交,获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹,这种图纹极少有两个人完全相同,故称为“DNA指纹”,意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。众多“DNA指纹”组成“DNA指纹图谱”。第二代DNA指纹技术用PCR 的方法对STR位点进行PCR扩增可得到不同长度DNA片段,用银染或荧光的方法对扩增后的DNA片段检测得到DNA指纹。第三代DNA指纹技术是用PCR的方法对SNP位点进行PCR扩增。 STR(Short Tandem Repeat,短片段重复序列)广泛存在于人类及哺乳动物的基因组中,具有高度多态性。它们一般由2~6个碱基构成一个核心序列,核心序列串联重复排列,由核心序列重复数目的变化产生长度多态性。对于一个特定的个体,染色体上某个特定位置的重复序列的重复次数是固定的,而对于不同的个体在同一位置处的重复次数可能不同,这就构成了人群中这些重复序列的多态性。由于人类基因组中这种重复序列非常多,通过对这种多态性的检测,就可以明确区分个体与个体的不同,确定父母子的亲缘关系,这就是STR 分型。联合应用16个STR位点的特异性,其个体识别率可达0.999999999998,其父权排除率可达0.99998。 本次实验中人类基因组DNA的提取使用的是磁珠法核酸纯化技术。它采用了纳米级磁珠微珠,这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团,能同核酸发生吸附反应。该方法快速简捷,一般可在36分钟完成。不用多次漂洗磁珠也可确保基因组DNA的高纯度,提取出的基因组DNA OD260/OD280典型的比值达 1.7~1.9,长度可达20kb~50kb,可直接用于PCR、Southern-blot和各种酶切反应。 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是体外核酸扩增技术,由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。本实验以人类基因组DNA为模板,以dNTP为原料,以含有Mg2+的buffer为缓冲液,在Taq酶催化下,用特定引物(D1S1677、D4S2364和D10S1248)为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,获得不同基因座的STR扩增片段。可用于基因分离克隆,序列分析,基因表达调控,基因多态性研究等许多方面。总之,PCR是一项DNA 体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆,序列分

用探针法进行基因分型的方法

用非标记探针、遮蔽技术及高分辨率熔解扩增子分析对RET原 癌基因进行基因分型 RET原癌基因单个碱基的突变可以引发多发性内分泌腺瘤2型。RET突变传统的基因分型方法是外显子测序。一种闭管操作的基因分型方法已经成熟,此方法用的是一种饱和DNA 染料,非标记探针及高分辨率熔解扩增子分析。此方法需要两个连续的聚合酶链式反应阶段,主要的和第二次实验。主要的实验共用7个反应和8个非标记探针分析RET基因外显子10、11、13、14和16 。主要实验基因分型了野生型外显子,外显子13普通的多态性,外显子16的一个突变及其它检测到的序列变化。主要非标记探针数据限制检测到的RET基因序列突变的基因分型,这些突变位点的基因分型在第二次实验的2-5个反应中进行。设计6条探针,所用方法是:用遮蔽技术和遮蔽选择的序列变化使探针下其它位置的突变的分析变得明确。这两步RET基因分型之后,少于实验0.2%的外显子需要测序确定基因型。对5个野生型和29个可用的RET序列突变样品(与测序结果100%一致)做盲研究。用非标记探针和遮蔽技术进行高分辨率熔解分析是快速、精确的基因分型方法,>50的RET序列突变可以进行基因分型。 多发性内分泌腺瘤2型(MEN2)综合症,MEN2A,MEN2B及家族性甲状腺髓样癌由生殖细胞系RET基因外显子10、11、13和16的突变引发。MEN2综合症是常染色体显性秩序失调引起的高生命危险的甲状腺癌。RET突变的遗传学检测可以确认处于甲状腺癌危险中但是没有爆发癌症的病人,此时切除甲状腺可以增加存活的机率。 之前有许多实验方法检测或基因分型RET突变,比如说单链构象多态性,变性梯度凝胶电泳,温度梯度毛细管电泳,限制性内切酶消化PCR产物,焦磷酸测序,荧光标记杂交探针及微卫星。但是,这些方法中的大多数需要PCR反应之后的操作来检测突变。其中一些方法报道突变检测的敏感性为95%或少于95%,或者仅实验了RET突变样品的一小部分。这些方法分析RET序列变化的限制范围,可能只以普通突变为目标而错过了稀有突变。此外,不致病多态性的存在可以导致异常的结果。因为这些限制,RET外显子测序保持黄金标准。 测序是一种耗时且昂贵的开管实验,需要生成PCR产物之后的额外操作。相反,高分辨率熔解曲线的突变扫描分析是一种快速且便宜的闭管操作实验,不需要进行PCR产物之后的额外操作。通过用一种饱和DNA染料:LC Green,高分辨率熔解曲线分析可以检测PCR扩增子之

如何判断基因位置(学生版)

如何判断基因的位置 基因是控制生物性状的基本单位,其位置可以有以下几个地方: (1)位于细胞质中还是位于细胞核中; (2)位于细胞核中的核基因又分为以下四种情况: ①位于常染色体上还是位于X染色体上;②位于常染色体上还是位于X、Y染色体的同源区段; ③位于X、Y染色体上的同源区段还是仅位于X染色体的特有区段上; ④控制两相对性状的两对等位基因是一对同源染色体上还是位于非同源染色体上。 一、探究某性状的遗传是细胞质遗传还是细胞核遗传 1、正反交法。判断某对相对性状是细胞核遗传还是细胞质遗传,应该做正交实验和反交实验。(该法必须为纯合子)(1)若正交与反交的结果,子代的性状都与母本一致,说明属于细胞质遗传。 (2)若正交与反交的结果,子代性状表现相同,与母本无关(表现的都是显性性状),说明属于细胞核遗传。 例1、有人发现了一种受细胞质基因控制的大豆芽黄突变体(其幼苗叶片明显黄化,长大后与正常绿色植株无差异)。请你以该芽黄突变体和正常绿色植株(均为纯合子)为材料,用杂交实验的方法,验证芽黄性状属于细胞质遗传。(要求:用遗传图解表示)答案: 正交:P 红花♀×白花♂反交:P 白花♀×红花♂ ↓↓ F1 F1 若正交与反交产生的F1的性状表现都与母本相同,则该花色的遗传为细胞质遗传。 若正交与反交产生的F1的性状表现与母本无关,表现为红花或白花的一种,则该花色的遗传为细胞核遗传 二、判断基因位于x 染色体上还是常染色体上(通常不考虑性染色体的同源区段) 1、已知基因的显隐性:选择隐性雌性个体与显性雄性个体进行交配。 ①若后代中的所有雌性个体表现出显性性状,所有雄性个体表现出隐性性状,说明该基因位于X染色体上。 ②若后代中雌雄个体表现出显性性状或均表现出显隐性性状,说明该基因位于常染色体上。 3、已知雌雄个体均为纯合子:正交和反交,观察后代的表现型是否一致。 ①若后代的表现型一致,与性别无关,说明该基因位于常染色体上。 ②若后代的表现型不一致,与性别明显相关,说明该基因位于X染色体上。 例3、现有一定数量长翅果蝇和残翅果蝇(均有雌雄),且长翅对残翅为显性。请设计实验来确定其基因位于x 染色体上还是常染色体上。写出你的实验设计思路,并对可能的结果进行分析。 方法一:一对残翅雌×长翅雄 若子代雌全为长翅,雄全为残翅,这对基因在x 染色体上 若子代雌、雄全为长翅,这对基因位于常染色体上 若子代雌、雄既长翅又有残翅,这对基因位于常染色体上 方法二:多对残翅雌×长翅雄 若子代雌全为长翅,雄全为残翅,这对基因在x 染色体上 若子代雌、雄既长翅又有残翅,且长翅多于残翅,这对基因位于常染色体上 方法三:多对长翅雌×长雄 ①若残翅只出现在子代雄性个体中,则基因位于X染色体上。 ②若残翅同时出现在雌雄性个体中,则基因位于常染色体上。 例4、己知果蝇的直毛与非直毛是一对等位基因。若实验室有纯合的直毛和非直毛雌、雄果蝇亲本,你能否通过一代杂交试验确定这对等位基因是位于常染色体上还是X染色体上?请说明推导过程。答案:能。 正交和反交(即直毛×非直毛,非直毛×直毛)。 (1)若正、反交后代性状表现一致,则该等位基因位于常染色体上,(2)若正、反交后代性状表现不一致,则该等位基因位于X染色体上。 三、题目给信息要考虑性染色体的同源区段,判断基因仅位于X染色体特有区段还是在同源区段 1、选择隐性雌性个体与纯和显性雄性个体进行交配。 ①若后代中的所有雄性个体表现出显性性状,说明该基因位于X、Y染色体上的同源区段。 ②若后代中的所有雄性个体表现出隐性性状,说明该基因仅位于X染色体上。

HBV基因和亚型:分型技术

参考文献:南方医科大学硕士学位论文~《HCV基因型和亚型:分型技术、临床意义及其流行病学研究》 HBV基因型和亚型:分型技术 乙肝临床与分型研究国际现状: 乙型肝炎病毒(HBV)是一种嗜肝病毒,在全世界长期感染约3亿人,据报道每年造成约100万人死亡。基于对完整基因组的序列相似性,将诸多HBV分离株分为8个基因型A至H。HBV基因型显示特征性地理分布:基因型A流行最广,但普遍是在北欧、北美和中非;在东亚,韩国、中国、日本、波利尼西亚和越南发现了基因型B和C;基因型D也是大流行性基因型,但最要在地中海地区、中东和印度为主要分布地;基因型E是非洲的典型常见型;美国当地人和波利尼西亚发现基因型F;基因型G在西欧和北美,基因型H主要发现在中美洲。不仅对于分子流行病学的目的,HBV的基因分型是重要的;最近的几项研究也表明,一些基因型的慢性结局和肝脏疾病的严重程度可能是不同的。来自:National Center for Biotechnology Information—Viral Genotyping Tool Hepatitis B virus (HBV) is a hepatotropic virus, that chronically infects some 300 million people worldwide and is thought to be responsible for a million deaths annually. Numerous HBV isolates have been grouped into eight genotypes, A through H, on the basis of sequence similarities of their complete genomes. HBV genotypes show a characteristic geographical distribution: genotype A is pandemic but most prevalent in northern Europe, North America and central Africa; genotypes B and C are found in eastern Asia, Korea, China, Japan, Polynesia and Vietnam; genotype D is also pandemic but is predominant in the Mediterranean area, the Middle East and India; genotype E is typical for Africa; genotype F is found in American natives and in Polynesia; genotype G in western Europe and North America and genotype H is found predominantly in Central America. Genotyping of HBV is important not only for molecular epidemiology purposes. Several recent researches demonstrated that rate of the chronic outcome and the severity of liver disease can be different for some genotypes. 来自:National Center for Biotechnology Information—Viral Genotyping Tool 乙肝临床与分型研究中国现状: 目前(追溯至2005年),根据乙型肝炎病毒(HBV)全基因组序列差异大于8%或者S基因序列大于4%,将HBV分为A、B、C、D、E、F、G、H等8个基因型,当时报道,HBV每个基因型还可以分为不同亚型,如:A基因型可分为Aa和Ae亚型;B基因型可分为B1、B2、B3和B4亚型,C基因型可分为C1、C2、C3和C4亚型等。有研究表明,HBV基因型与感染途径、感染谱、疾病进展有一定相关性。但是在2005年,国内现有关于HBV亚型的报道。我们研究组应用特异性引物聚合酶链式反应法对我国多个城市的445份HBV感染者血清进行了HBV基因型和亚型的分析。来源:北京大学医学部微生物系,庄辉课题组 乙型肝炎病毒(HBV)是引起人兽共患病的最小DNA病毒,全球分布,引发急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、乙肝相关性肝癌,对人类健康威胁大。目前(追溯至2005年),根据HBV全基因序列异质性大于8%或者S基因序列大于4%,将HBV分为8个基因型A~H,并根据全基因序列异质性不大于8%,大于4%将HBV同一种基因型再分为不同的亚型。不同基因型、亚型的HBV各具独特的流行病学特点及分子生物学特征。并发现可能与HBV感染途径、疾病谱、病程进展以及抗病毒治疗的反应局相关性。来源:福建医科大学附属第一医院肝病中心 乙肝病毒与复制 乙型肝炎病毒(HBV)为直径42~47nm的球形颗粒(Dane颗粒),由外壳与核心两部分组成。外壳有许多小球状颗粒,只含病毒表面抗原(HBsAg)。核心含环状双股脱氧核糖核酸(DNA)、DNA多聚酶、核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)。双股DNA的正链短且不完整,长度仅为负链的50%,不含开放读码区,不能编码蛋白。负链完整,长度恒定,约含3200个核苷酸,有4个大开放读码区,可编码全部病毒蛋白:①S区基因。编码病毒外壳蛋白(HBsAg),分为S、前S1、前S2基因区共同编码3种外壳蛋白肽段,即主蛋白由S基因编码,中蛋白由前S2和S基因编码,大蛋白由前S1、前S2和S基因编码。3种外壳蛋白的功能和性质有所不同;②C基因。编码核心抗原蛋白及其可溶成分e抗原,前C基因区可能在HBV的装配和分泌中起作用;③P基因。其翻译产物为病毒的DNA多聚酶;④X基因。编码HBxAg,存在于HBsAg或HBcAg阳性病例的肝细胞核内,可能是一种转录调节蛋白。来自:百科全书

乙型肝炎病毒基因分型方法简述

乙型肝炎病毒基因分型方法简述 邵 玲 张 男 【摘要】乙型肝炎病毒是一种嗜肝脱氧核糖核酸病毒,属于一种复合体DNA病毒。乙型肝炎病毒可按两种方法分型:血清型和基因型。随着分子生物学的发展以及对乙型肝炎病毒研究的深入,乙型肝炎病毒血清分型法已不能适应对该病毒感染研究的需要,而出现的基因分型法则引起广泛的重视。 【关键词】乙型肝炎病毒;基因分型方法 H epatitis B virus gene minute method summ ary S HA O L in Z HA N G N an 【Abstract】The hepatitis B virus is one kind is addicted to the liver deoxyribonucleic acid virus,belongs to one kind of complex DNA virus.The hepatitis B virus may according to two method minutes:Blood serum and genotype.Along with molecular biology’s development as well as to hepatitis B virus research’s thorough,a hepatitis B virus blood serum minute law has not been able to adapt to this virus infection research need,but appears a gene minute principle brings to the widespread attention. 【K ey w ords】Hepatitis B virus;Gene minute method 乙型肝炎病毒是一种嗜肝脱氧核糖核酸病毒,属于一种复合体DNA病毒。乙型肝炎病毒可按两种方法分型:血清型和基因型。随着分子生物学的发展以及对乙型肝炎病毒研究的深入,乙型肝炎病毒血清分型法已不能适应对该病毒感染研究的需要,而出现的基因分型法则引起广泛的重视。1988年Ok2 mamoto[1]对18株不同亚型的HBV基因序列两两进行比较后,根据核苷酸序列异源性>8%的原则,将18株HBV DNA序列分为A~D4个基因型,提出了HBV基因型的概念。1992年Norder[2]发现ayw4和adw4q-两旧亚型之间及基因型A~D 之间S基因差异>4%,提出了两种新的基因型E,F,1994年Norder通过全基因序列P3测定加以证实。2000年Stuyver[3],在研究来自法国和美国的慢性乙肝病人血清样本时,发现有13株病毒无法归入A~F型,命名为G型。随后,日本和德国也相继发现了G基因型。2002年Arauz~Ruiz[4]对10株HBV进行基因型研究,发现其中3株虽与F型相近,但与F型又有明显的不同,进而命名为H型。截止现今,HBV基因型可分为A~H八型。 目前,国内外对HBV进行基因分型主要有“基因序列测定法、聚合酶链反应———限制性片段长度多态性分析法、基因型特异性表位单克隆抗体的EL ISA、基因型特异性线形探针检测法、基因型特异性引物PCR法和基因芯片技术”。 1 基因分型原理 1.1 全基因序列测定。全基因序列测定是根据HBV所有病毒核苷酸异源性>8%进行分型的。Okamoto对从日本及印度尼西亚adw2慢性携带者中分离出的3株HBV进行全序列测序及比较,其核苷酸的异质性为3.9%~5.6%,而与美国2株相同血清亚型HBV序列比较,异质性达8.3%~9.3%,达到甚至超过不同血清亚型HBV的异质性,从而说明血清学分型不能真正反映HBV基因变异。再经对18株HBV DNA进行两两比较分析,根据同源性<92%、异质性>8%,将其分为A, B,C及D4个基因型,初步建立了基因分型体系。12年后Stuyver使用该方法,发现了一种新的3248bp的HBV基因型G 。 1.2 S基因序列测定。由于乙型肝 炎病毒基因可分为p基因、前s基因、编 码HBs4的s基因、C基因及X基因(如 图),可分别对它们进行研究,从而找出各 个基因型在各个基因之间的差异。Nor2 der[5]对32例HBV患者s基因测序结果 进行分析,并建立进化树,基因型间异质 性>4%。除证实了Okamoto的A~D分型外,还发现了2个新的基因型E和F,使HBV基因型达到6个(A~F)。在其后对28例HBV全基因组、p基因、前s基因、编码HBs4的s基因、C 基因及X基因分别比较并建立进化树,进一步证实根据s基因序列分型最接近全基因组,从而证明了单独使用S基因进行分型的可靠性。目前,此法尚在使用,主要有SSP和SSO[6],即基因型特异性引物PCR法和基因型特异性线形探针检测法。 2 基因分型方法 2.1 序列测定法。即直接测定核苷酸序列,根据差异分型。自Okamoto据HBV基因型之间的全序列异质性8%进行分型以来,测序由于方法直接、可靠而成为主要鉴定HBV基因型的方法。同全序列进化树图比较,发现S基因的序列变化同全基因序列的变化一致,可用S基因序列代替全基因序列进行分型,界限为核昔酸序列的异质性4.0%。该法虽较为可靠但操作繁琐、费用昂贵,不适于临床大量标本检测。 2.2 聚合酶链反应———限制性片段长度多态性分析法(PCR~RFL P)。目前常用的基因分型方法,通过PCR扩增出目标基因片段(通常为S基因或Pres/s基因),用特定的限制性内切酶进行酶切,根据酶切图谱进行基因分型。Mizokami[7]通过分子进化方法对已知基因型的68例HBV患者全基因、106例HBV患者s基因序列进行分析,发现并确认基因型特异性酶切位点区域。Lindh[8]对不同基因型S基因的特异酶切位点进行分析,设计使用限制性内切酶Trp509I和Hinf I使S基因PCR产物产生不同长度的酶切片段,成功地将166/180例患者HBV实现A-F基因分型。RFL P敏感性高,但酶切位点易受基因变异影响,且遇混合感染或酶切不完全,会出现复杂条带,影响分型结果判断。 2.3 基因型特异性表位单克隆抗体的酶联免疫吸附法(EL ISA)PreS2多肽有多组抗原表位。基因型不同抗原表位也不同,从而可以鉴定不同基因型。Usuda[9]等用此法制备前S2区域基因型特异性表位的单克隆抗体,并用辣根过氧化酶进行标记,对68例HBV阳性患者血清检测,分型结果与S基因测序分型完全一致。在后期实验中发现,适用于大规模的流行病学调查,使较大范围的HBV的研究成为可能。 2.4 基因型特异性线形探针检测法。该方法是设计型特异的探针,检测HBV扩增产物,以产物的不同长度或与探针的反应性来区分不同型别。Kato[10]利用G基因型的病毒在核心区有36个核苷酸的插入,设计引物用PCR的方法可以对G基因型进行特异的筛查。早在1983年Wu用酶切的方法研究血清型的酶切图谱,来区分不同的血清型。王虹[11]等采用PCR2核酸杂交/EL ISA检测,主要是联合利用PCR、核酸杂交和酶联免疫技术,设计前C和C区的探针,可以快速准确的区分HBV的基因型。另外Van G eyt[12]根据A~F基因型的保守序列设计了18种型特异性探针与HBV S (下转12页)

10知识讲解_基因自由组合定律的判断及应用

高考总复习10 基因自由组合定律判断及应用 【考纲要求】 1.基因的分离定律和自由组合定律。 2.应用遗传基本规律分析解决一些生产、生活中生物的遗传问题。 【考纲要求】 区 别 分离定律 自由组合定律 研究性状 一对 两对或两对以上 控制性状的等位基因 一对 两对或两对以上 等位基因与染色体关系 位于一对同源染色体上 分别位于两对或两对以上 同源染色体上 细胞学基础 (染色体的活动) 减Ⅰ后期同源染色体分离 减Ⅰ后期非同源染色体自 由组合 遗传实质 等位基因分离 非同源染色体上非等位基 因之间的自由组合 F 1 基因对数 1 n (n ≥2) 配子类型及其比例 2(1 :1) 2n (数量相等) F 2 配子组合数 4 4n 基因型种类 3 3n 表现型种类 2 2n 表现型比 3 :1 (3 :1)n F 1 测交 子代 基因型种类 2 2n 表现型种类 2 2n 表现型比 1 :1 (1 :1)n 联 系 (1)形成配子时(减Ⅰ后期),两项定律同时起作用 (2)分离定律是自由组合定律的基础 要点二、用“分解法”解自由组合定律习题 “分解法”是以一对基因的杂交组合的结果为基础,根据题意,灵活地分解题目的杂交组合、表现型比例、基因型比例等条件,直接利用一对基因交配的结果,从而简化问题,快速求解的一种解题方法。“分解法”的应用举例如下。 1.计算概率 例:基因型为AaBb 的个体(两对基因独立遗传)自交,子代基因型为AaBB 的概率为________。 将AaBb 自交分解为Aa 自交和Bb 自交,则Aa ??? →1/2Aa ,Bb ? ??→1/4BB 。故子代基因型为AaBB 的概率为1/2Aa ×1/4BB=1/8AaBB 。 2.推断亲代的基因型 例:小麦的毛颖(P )对光颖(p )是显性,抗锈病(R )对不抗锈病(r )为显性。这两对性状的遗传遵循自由组合定律。已知以毛颖感锈病与光颖抗锈病两植株作亲本杂交,子代有毛颖抗锈病∶毛颖感锈病∶光颖抗锈病∶光颖感锈病=1∶1∶1∶1,写出两亲本的基因型。 将两对性状分解为:毛颖∶光颖=1∶1,抗锈病∶感诱病=1∶1。 根据亲本的表现型确定亲本部分基因型是P_rr ×ppR_,只有即Pp ×pp ,子代才能表现为毛颖∶光颖=1∶1,同理,只有rr ×Rr ,子代才能表现为抗锈病∶感锈病=1∶1。综上所述,亲本基因型分别是Pprr 与ppRr 。

多对相对性状的基因型表现型以及比例的简单确定

多对相对性状的基因型表现型以及比例的简单确定 在高中生物学中生物基因型、表现型以及概率的判断和计算是高考考查的重点内容 , 也是学生学习的一个难点 , 在生物教学中,如何把复杂问题简单化 , 提高教学效率 ,是每个老师深入研究的问题。下面谈谈本人在遗传定律的教学中 , 如何用较简单的方法判断多对相对性状个体的基因型、表现型以及出现概率计算方法。 一、一对相对性状的遗传规律是解决复杂问题的基础研究多对性状的遗传规律 , 首先必须掌握一对相对性状的 6 种杂交组合方 式 , 以及后代中基因型、表现型以及比例关系 , 这是解决复杂问题的最基础知识 , 所以教学中让学生打好一对相对性状的遗传规律有关基础 , 是解答复杂问题的关键。 二、多对相对性状的基因型以及比例的计算 1、已知亲本基因型判断子代基因型以及比例 例如:AaBbCc与AaBbCc的两亲本杂交,子代基因型及比例是。 首先把多对性状遗传研究简单化 , 以一对相对性状的研究为单位进行分析使问题简单化。此题中控制A(或a)性状的基因型有3种,比例是AA: Aa: aa=1 : 2 : 1,控制B(或b)性状的基因型有3种BB: Bb: bb=1 : 2 : 1.控制 C(或c)性状的基因型有两种 CC: Cc=1: 1, 以分枝法确定子代基因型 1/4AA1/4BB1/2CC1/2Cc 1/4Bb1/2CC1/2Cc

1/4bb1/2CC1/2Cc 1/2Aa1/4BB1/2CC1/2Cc 1/4Bb1/2CC1/2Cc 1/4bb1/2CC1/2Cc 1/4aa1/4BB1/2CC1/2Cc 1/4Bb1/2CC1/2Cc 1/4bb1/2CC1/2Cc 据图分析子代共有 18 种基因型 , 每种基因型的比例是三种基因型共同出现的乘积。 2、已知子代基因型判断亲本基因型 (1) 根据表现型初步确定基因型。 (2) 根据子代基因型及表现型比例具体确定。 例如: 亲本种黄色圆粒与绿色皱粒豌豆杂交 ,F1 中有 4 种表现型以及比例:黄圆:黄皱:绿园:绿皱=3: 1 : 3 : 1 根据表现型初步确定亲本基因型为Y R X yyR 根据子代中有绿色豌豆 yy, 确定亲本中黄色豌豆基因型为 Yy; 根据子代中圆粒:皱粒 =3: 1, 确定双亲中控制粒形的基因型都为Rr。确定亲本基因型为 Yy R r X yyR r. 三、用数学方法计算子代基因型 ,表现型及比例 1、子代基因型以及比例的计算 例如:AaBbx aaBb个体杂交 由一对相对性状分析可知,控制A(或a)基因型有2种,控制 B (或b)性状的基因型有3种,子代共有6种基因型,另一种基因型的比例是两种基因型共同出现比例的乘积。

CRISPR基因编辑基因型鉴定方法

CRISPR基因编辑基因型鉴定方法 CRISPR 组分导入细胞/ 动物后,要确定细胞/ 动物的基因编辑效果,需要对细胞/ 动物进行基因型鉴定(genotyping),整个过程包括提取细胞/ 组织基因组,含靶点基因组片段的PCR,T7E1突变检测,测序,TIDE 分析等。确定细胞/ 动物基因突变效率及突变情况。 基因型鉴定主要分为四种类型,第一种类型单gRNA Cas9(NHEJ修复)造成的Indel突变,检测办法是提取细胞/组织基因组,PCR,T7E1 突变检测,测序,TIDE 分析。由于单gRNA Cas9 造成的基因突变都是小片段的插入或缺失(一般都在20 bp 以内),通过PCR 无法判断基因是否发生突变,利用T7E1 可对不完全匹配DNA 进行切割的特点,将PCR 产物完全变性后复性,如果PCR产物靶点处发生Indel 突变,就会形成两侧匹配,靶点处不匹配的DNA 结构,T7E1 会识别不匹配位点并切断DNA。通过切割条带与未切割条带光密度对比计算突变效率,PCR 产物测序结果显示在靶点处出现大量双峰,通过专用软件TIDE 可分析Indel 突变类型及突变效率。 第二种类型是双gRNA Cas9 造成的基因片段缺失,检测方法是先提取基因编辑细胞基因组,通过靶点两侧设计的引物PCR 扩增得到野生型条带及突变型条带(突变型条带较野生型条带少一段缺失序列,所以条带比野生型条带小),PCR 产物跑胶即可大致判断敲除效率,进一步通过测序确定缺失突变情况第三种类型是基因敲入,修复,修饰,主要检测基因发生同源重组的情况,一般一条检测引物设计在同源臂以外,一条引物设计在同源臂内,分别检测5‘端和3’端重组情况,结合PCR产物测序,可确定同源重组及其效率。 第四种类型是点突变,点突变相对野生型来说只发生了一个碱

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