免疫组织化学(傅琦博)-免疫组织化学

免疫组织化学

傅琦博

引言

酶工程是生物工程的重要组成部分，近几十年来，随着研究手段的更新和技术水平的提高，产生了一门以研究酶在细胞内的存在及其动态，以阐明组织细胞的结构和功能为主要内容的科学——酶组织化学。酶组织化学是利用酶化学反应的产物可在光学显微镜或电子显微镜下被识别的特性，借以从形态学角度判定酶在组织细胞内的存在的部位的一门技术，其基础是组织化学。它具有将形态学、生物化学和生理学联系起来的特点，在生物学、生物化学、医学生物领域内日益发挥着重要的作用。研究组织细胞内特定酶分布的酶组织化学方法大致分为：（1）利用酶的活性反映的方法；（2）利用抗原抗体反应（免疫应答）证实酶的存在部位的方法。后者也被称之为免疫组织化学。

免疫组织化学概述

免疫组织化学简称免疫组化，是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分，进行原位的定性、定位或定量的研究。这种技术称为免疫组织化学技术。免疫组化是利用抗体与抗原的结合具有高度特异性的特点，采用一直的抗体检测组织或细胞的抗原物质，以期确定组织或细胞是否存在未知抗原，并进行定性、定位或定量的研究。抗原与抗体结合形成的免疫复合物是无色的，故必须借助组织化学方法，将抗体抗原反应部位显示出来。它的主要研究方法是免疫组织染色法（简称免疫染色法），食用该方法检测细胞内物质，必须具备两个条件：①作为检测对象的物质须具有抗原性，能制作出与之相应的特异、高效价的抗体；②在免疫反应发生之前，目标物质要保持抗原性，同时还要保持在组织细胞内的稳定状态。要检测抗原，就要用与之相应的抗体进行免疫反应，同时要用可视的标记标出抗原或抗体，采用这种方法的免疫染色法称为标识抗体法或标识抗原法，常用的表示抗体法有直接法、间接法、补体结合法以及多重染色法等。直接法是标识要检出的抗原的抗体，然后进行反应的方法，其特异性高，但检出的敏感度不如间接法，标识抗体的食用范围手局限。间接法是以未标识的第一抗体进行反应，接着标识以第一抗体为抗原所制作的抗体（即第二抗体）进行重叠反应，间接的证明抗原，这种方法的缺点是容易出现非特异性反应，但敏感度较高，标识抗体的用途也广；补体结合法是将间接法中的第二抗体作为标识抗补体抗体食用；多重染色法则是在同一标本上检出多种抗原物质的方法，可以用反复进行的重复标记的直接法，也可以用酶标记的重复进行的间接法。此外，还有后标识抗体的免疫染色法，此法先采用未标识的抗体进行反应，反应结束后，通过免疫化学反应或其他化学反应，用适当的标记物质来识别已与组织细胞内抗原发生结合的抗体。

免疫组织化学技术的发展

免疫组织化学技术是形态学研究领域一门新兴方法学。自它问世以来发展迅猛,用“日新月异”一词形容它毫不过分。酶标免疫组织化学技术是由Nakane 等人于60 年代末期创立的最早的免疫酶组织化学技术,之后Sternberger 等人于70 年代初期便在此基础上建立了非标记抗体酶法(又称间接法) 和PAP 法(过氧化酶抗过氧化酶法) 。80 年代初期美籍华人Hsu 又建立了卵白素生物素复合物法(ABC法) ,自此之后,免疫金银染色法、免疫电镜等技术相继问世。80 年代末期人们又发现链霉菌抗生物素蛋白(或译成链霉菌亲合素,St reptavidin) 与生物素结合力极强,遂用它标记过氧化酶建立起了SP 法,或称LSAB 法(链霉菌亲合素生物素过氧化酶法) 。由于链霉菌亲合素不与人组织中的内源性生物素起非特异性结合反应,故背景染色更加清晰,且敏感性比ABC 法高4～8 倍,比PAP 法高8～16 倍。进入90 年代,免疫组织化学又向基因水平深入发展,与分子生物学技术的结合日益紧密。如原位杂交后信

号的放大与显示便是采用了免疫组织化学显色技术,因而又可称之为原位杂交免疫组织化学技术。而图象分析、流式细胞仪的运用，是免疫细胞化学定量分析技术提高到更精确的水平。现就该技术的发展及其应用作一概述。

1利用免疫荧光标记技术可以分辨出标记抗原抗体所在的位置及其性质, 并可利用荧光定量技术计算抗原(或抗体) 的含量, 以达到对定性、定位、定量测定的目的[2 ]。如黄祥瑞等人(1999) 利用免疫荧光细胞化学技术研究西藏环状病毒细胞生物学特性和敏感细胞范围(CPE) , 成功地观察到该病毒的细胞病变效应特异荧光发生的部位、细胞数量和病毒的形态发生。辛德毕斯热是由辛德毕斯病毒Sindbis V irus (SiN ) 引起的人兽共患虫媒病毒病, 1974 年南非发生辛德毕斯热大流行。1991年梁国栋等通

过免疫荧光技术首次从新疆分离到SiN 病毒。1999 年陈振光等利用间接免疫荧光试验检测到福建宁化林区人群、野兔、狐狸、狗存在SiN 感染, 抗体阳性率分别为12. 86%、5. 88%、14. 29%、6. 45%。因而判定福建宁化林区可能存在辛德毕斯热自然疫源地。

2抗生物素—生物素—过氧化酶复合物技术(A vidin B io t in 2Peroxidase Comp lex technique, 简称ABC 技术) 是H su 等于1981 年创立, 其特点是利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。该方法简便、节约时间, 敏感性、特异性高, 背景染色淡。由于生物素与抗生物素具有与多种示踪物结合的能力, 可用于双重或多重免疫染色。如李月白等采用ABC 法研究发现绒毛层滋养细胞、绒毛中轴的基质细胞、毛细血管的内皮细胞、毛细血管腔内的淋巴细胞以及血岛细胞均表现为P 物质(SP) 受体免疫反应阳性, 阳性物质分布于胞质和胞膜上, 胞核呈阴性反应。该研究为其对胎盘及胚胎发育的作用提供形态学依据。张雅萍在ABC 法基础之上改进, 建立了生物素- 抗生物素- 过氧化物酶复合物( sABC) 法, 探讨了IL 28 在甲状腺肿瘤组织中的表达及意义。

3葡萄球菌蛋白A (Staphylococal P ro tein A , SPA 或SP) 具有免疫特性, 发展成为免疫学上一种极为有用的工具。其优点是不受种属特异性的限制, 染色时间短、灵敏性高和背景染色淡等。故在目前各种免疫细胞化学技术中得到广泛的应用。如肖华亮等[9 ]用此法检测、探讨骨肉瘤MDM 2 和p 53 蛋白定位、表达水平及相互关系和其对骨肉瘤转移及预后的影响。应用SPA 与胶体金或铁蛋白相结合, 可在电镜水平检查抗原抗体反应的定位。自Pomano 和Romano (1977) 首次报告用蛋白A -胶体金技术(P ro tein A 2Go ld technique, PGA 技术) 标记细胞表面抗原、包括淋巴细胞、血小板、大鼠肾脏细胞及感染的病毒细胞获得成功以来, SP 法已得到愈来愈广泛的应用, 并发展成为一种较为理想的免疫电镜技术。

4碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶方法(简称A PAA P 法) 克服了辣根过氧化酶(HRP) 的不足。沈岩等用A PAA P 法结合单克隆抗体(mA b) KL 21 (广谱抗人细胞角蛋白, 德国) 比较分析不同肿瘤细胞间同种细胞凝集力、靶器官定植力、细胞增殖和细胞凋亡现象、癌基因及肿瘤相关抗原表达等生物学特征。进一步明确肿瘤细胞相关生物学特性与肿瘤细胞转移能力间的关系。而链霉素亲和素(St rep tavidin, SA ) 具有高度的亲和力, 利用生物素结合的二抗与酶标记的SA 亲和(L SAB 法) 是免疫组化中非常有用的方法。沈靖南等采用该法, 检测84 例骨肉瘤中p2糖蛋白(p 2gp ) 表达, 半定量化计量p2gp 的着色强度及阳性率, 通过多因素相关分析和生存分析, 探讨骨肉瘤预后的相关因素和高危因素, 研究骨肉瘤多药耐药性的表达与预后, 并证实p2gp 介导骨肉瘤的MDR 现象, 明确p2gp 表达与肺转移的关系。

5凝集素( (Phytoagglut in, PHA ) 作为一种探针研究细胞膜上特定的糖基, 具有多价结合能力。直接将标记物标记在凝集素上, 再与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合, 该法简便, 但灵敏性不够高。经研究发现将凝集素直接与切片中的相应糖基结合, 可提高敏感性高5～ 10 倍或更多一些, 有人认为若将凝集素与特定的糖基作成三明治样的糖2凝集素2糖的结合物, 特异性、灵敏度将会更高。而且能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合, 从而在光镜与?或电镜水平显示其结合部位。N ewman 等(1979)以荧光素标记凝集素PHA 实验, 发现在大鼠乳腺上皮的不同分化时期显示不同的荧光

强度。Kivela 和Farkkanen (1987)用凝集素作为细胞特殊类型的标记实验发现, 在人视网膜上PHA 标记视锥细胞而不标记视杆细胞。在乳腺、乳腺上皮细胞呈PHA 阳性反应, 而肌上皮细胞和间质细胞呈PHA 阴性反应。他以多种凝集素对小鼠、大鼠和兔的肾组织切片进行染色结果表明, 刀豆素A 和蓖麻素存在于肾脏的各部, PHA 和双花扁豆凝集素(DBA ) 主要分布于远曲小管和集合小管上皮细胞, 荆豆凝集素(U EA ) 主要分布在血管内皮细胞, 而麦芽素分布在肾小球。St reit 和Kreutzberg (1987)发现Griffonia Simp licifo lia 凝集素能特异性标记面神经节内的小胶质细胞, 而其它类型的胶质细胞如星状胶质细胞(A st ro2cyte) 等都显示阴性反应。如果在切断面神经后, 增殖的小胶质细胞对Griffonia Simp licifo lia 凝集素的反应加强。大量研究发现, 凝集素可作为肿瘤组织源性的标记、肿瘤特异性诊断的标志、肿瘤恶性的标记和不同肿瘤的分化标记。如张华忠等(1987)报道115 例胃癌标记PHA 阳性率高达90. 43% , 而正常胃粘膜基本是阴性, 故认为PHA 是胃癌的诊断性标志。BSA对乳腺恶性肿瘤阳性率达79% , 而对良性病变均呈阴性反应,提示BSA 可能为乳腺恶性肿瘤的相关标志。HRP 本身虽含有甘露糖, 能与刀豆凝集素A、扁豆凝集素和豌豆凝集素结合。但对其它的凝集素, 需要将糖基化(Glyco sylat ion) 过氧化物酶结合到该凝集素上, 且糖基化过氧化物酶品种尚有限, 故目前本法在应用还有一定困难。

免疫细胞化学技术尚在继续改进和完善中, 除目前国内外已广泛应用的免疫金技术和免疫金银技术外, 新的免疫细胞化学技术不断出现。1984 年国外学者首次将CRNA 探针应用于原位杂交, 核酸探针为单链的RNA 分子, 产生自具有质粒逆转录系统的cDNA 克隆。在1987 年Wo lf 等建议插入确定长度的寡核苷酸至载体内产生cRNA 分子, 这种cRNA 分子称为“寡核苷酸核酸探针”(o ligo ribo－p robes) , 现在已被广泛的用于原位杂交实验。国内的杨春花等采用免疫组化和cDNA 2mRNA 原位分子杂交技术分

别检测了24 例RA , 18 例骨关节炎(OA ) 和6 例正常滑膜组织中uPA , uPAR 蛋白和mRNA 的分布及

表达情况。科研工作者根据免疫组织化学中材料的特性把同位素、生物素、光敏生物素、酶促生物素、地高辛标记cRNA上成功的制成探针。尤其地高辛与放射性标记相比, 标记探针具有非放射性探针的优点, 对人体无害, 不受半衰期限制, 探针可长期保存; 与生物素标记探针相比, 不受组织、细胞中内源性生物素的干扰, 敏感性、分辨率较高, 反应产物颜色鲜艳, 反差好, 背景染色低, 制备探针可较长期保存, 对人体无害等优点,已日益显示出它的优越性和广泛的应用前景。并且进一步研究发现它能根据需要人工用DNA 合成仪合成, 其长度及分子大

小比较一致, 可控地高辛同位素寡核苷酸探针。另外, 放射性同位素、荧光素、生物素也能成功标记寡核苷酸作为探针, 成功地运用于培养细胞、组织切片和染色体铺片等的原位杂交中。虽然有些人认为其敏感度不如来自质粒扩增的cRNA 或DNA探针, 但由于探针制备简便再加之于近年非放射性标记的成功, 寡核苷酸探针在生物基础医学及临床学科领域中得到较为广泛的应用。

免疫细胞化学技术与流式细胞术(FCM ) 结合进行多参数FCM 分析血液淋巴细胞免疫表型(亚群) 方法学因素对实验结果的影响。当血液采集后1h 和6h 测定淋巴细胞免疫表型结果差异无显著。如黄勇华等采用单标或双标直接免疫荧光标记法标记20 种细胞表面分化抗原, 经流式细胞仪测定。后进行分析185 例白血病患者骨髓或外周血白血病细胞的免疫分型及CD117 的表达细胞表面分化抗原(CD) 117 在

各型白血病中的表达及其意义。

免疫细胞化学技术先进仪器和方法结合已呈现新的趋势，如用荧光显微分光光度计和图像分析仪等定量检测, 将结果客观打印、报告, 这更适合于临床诊断和科学研究。如杨希谦

等采用非放射碘标记人直肠癌相关抗原单克隆抗体(M cA b)技术与生物导向CT 显像进行肿瘤的免疫组

化鉴定与免疫显像研究。

免疫组织化学技术在临床病理诊断中的重要作用

100 年前发明的用光学显微镜观察HE 染色切片法仍然是当前各级医院病理科中的基本方法。该方法

的局限性在于仅能从细胞水平反映疾病性质,诊断中观察者的主观推测成份高,常常是同一疾病出现分歧颇大的数个不同诊断,多年来成为临床病理诊断中的突出问题。而免疫组织化学方法是通过抗原抗体反应客观地反映疾病性质,在观察HE 切片基础上,再结合免疫组织化学染色结果可对某一疾病做出较为客观

公正的评价,从而可避免主观因素的影响。自免疫组织化学技术应用于临床病理诊断以来,在以下几类疾病的鉴别诊断中发挥着重要作用。

1 高度未分化肿瘤细胞起源的鉴别:发生在胃肠道的这类肿瘤应首选CEA 与Vimentin 两种抗体鉴别

是上皮源性抑或是间叶源性肿瘤。因为CEA 在消化道上皮源性肿瘤的阳性率高,但在鳞癌时阳性率低;而消化道以外部位发生者,上皮性标记物宜选用EMA ,该抗体在90 %以上上皮源性肿瘤呈阳性表达。

2 小圆细胞肿瘤的鉴别:小圆细胞肿瘤包括小细胞未分化癌、恶性淋巴瘤、小细胞软组织肉瘤、神经内分泌肿瘤以及小细胞黑色素瘤。这类肿瘤鉴别诊断时应使用EMA 或CEA , LCA , Vimentin , NSE ,S100 和HMB45抗体。

3 大细胞型肿瘤鉴别:这类肿瘤可以是大细胞未分化癌、低分化肉瘤、大细胞性黑色素瘤和大细胞性恶性淋巴瘤。在鉴别诊断时应该选用EMA 或CEA ,Vimentin ,S100 和LCA 抗体。

4 梭形或多形性软组织肉瘤的鉴别:此类肿瘤包括平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、梭形细胞血管肉瘤、梭形细胞黑色素瘤、多形性横纹肌肉瘤、多形性恶性纤维组织细胞瘤以及多形性脂肪肉瘤。以下抗体可用于鉴别诊断: Actin , EMA , F ⅧAg , S100 , MB4

5 ,Myoglobin ,Desmin ,α12AT 以及α12ACT。

5 恶性淋巴瘤分型:在免疫组织化学研究领域，当前对恶性淋巴瘤的免疫组织化学研究最为活跃与细致。截止目前为止,已有下列亚型可以通过免疫组织化学染色确立。它们是:B 细胞淋巴瘤,L2

6 阳性,LN2 阳性; T 细胞淋巴瘤,MT1 阳性,UCHL1 阳性;N K细胞淋巴瘤C123C 阳性;树突网织细胞淋巴

瘤,Ber2MAC2DRC 阳性; 指状突网织细胞淋巴瘤,S100 阳性; 真性组织细胞淋巴瘤, Mac387 阳

性,Lysozyme 阳性,α12ACT 阳性; 何杰金病R2S 细胞,LeuM1 阳性,Ber2H2 阳性;大细胞间变型淋巴瘤Ber2H2 (或称Ki21) 阳性。

6 神经内分泌肿瘤的确立:90 %以上的神经内分泌肿瘤NSE 阳性。由于NSE 与其它肿瘤有交叉反应, 故必要时可加染Chromogranin A 或Synaptophysin 抗体。当需要弄清神经内分泌肿瘤有否内分泌功能时,再加染多肽类激素抗体。

7 肿瘤预后的推测:最早用于推测肿瘤预后的抗体有抗雌激素受体ER 及抗孕激素受体PR ,二者阳性时预后较好。新近又发现, 转移抑制基因产物nm23 呈高表达时预后较好。而下列几种抗体呈高表达时均提示预后差：C2erbB22 , C2myc , P53 , EGFR , PCNA , Ki267 , BrdU , P120 , P105。

8 感染性疾病病原体的检测: 其中HBsAg 及HBcAg 抗体常用于肝病研究与诊断。而尖锐湿疣及宫颈癌时常常可以检测到乳头状瘤病毒HPV。鼻咽癌、何杰金病时EB 病毒抗体多呈阳性。

免疫组织化学技术由于它自身独有的特点, 使得广大科研作者在组织细胞定位、定性、定量研究中经常选取的技术, 因此随着科研工具的更新, 科研工作者对免疫组织化学更广泛深入的理解、并与其他研究手段深入结合, 优化技术路线地设计,而推动免疫组织化学技术的进一步发展。如范少地等运用GA P243cDNA 探针(生长相关蛋白243 (Grow th associated p ro2tein 43, GA P243) 原位杂交技术来观察这一变化过程中GA P243mRNA 表达水平, 阳性细胞定位及分布的变化。李月白等应用免疫组化L SAB 法和原位杂交方法, 观察了骨肉瘤患者p 21w af1?c ip 1 表达水平与临床预后之间的关系。而倪灿荣等应用他们实验室制备的催化信号放大(Catalyzed signal amp lifi2cat ion, CSA ) 试剂应用于IHC 检测50 例10 种不同类型的肿瘤切片中40 种不同的抗原和ISH 检测6 种不同的RNA 成分, 并与常规方法进行敏感性比较: CSA 2IHC 法较传统的PA P 法、ABC 法和L SAB 法敏感500～ 1 000 倍, 较EnV ision 法敏感20～ 100 倍。

参考文献

[1] 巴德年当代免疫学技术与应用北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1999. 1- 11.

[2] 沈关心, 周汝麟现代免疫学实验技术湖北科学出版社, 1998. 1- 50.

[3] 黄翔瑞, 陈娟, 李晓萸等西藏环状病毒细胞生物学特性研究军事医学科学院院刊, 2000, 24

(3) : 173- 176.

[4] P ritchard L I, Gould AR. Phylogenet ic comparison of thesero type2specific V P2 p ro tein of blue tongue and relatedo rbiviruses[J ]. V irus Res, 1995, 39 (2- 3) : 207- 210.

[5] 梁国栋, 李其平, 何英等我国首次分离到辛德毕斯病毒病毒学报1993, 5 (1) : 55- 57

[6] 陈振光, 陈娟, 黄翔瑞等福建宁化辛德毕斯热血清学调查中国媒介生物学及控制杂志, 2000, 11 (2) : 137-139.

[7] 李月白, 秦国斌, 王义生等人骨肉瘤中p 21w af1/cip 1 基因的表达中华骨科杂志, 2000, 20 (1) : 30- 33.

[8] 张雅萍, 姬秋和, 张南雁等甲状腺肿瘤组织中IL 28 的表达及意义第四军医大学学报, 2000, 21 (6) : 125-128.

[9] 肖华亮, 陈俐, 王东 MDM 2 蛋白和P53 蛋白在骨肉瘤组织中的表达及意义第三军医大学学报, 2000, 22 (4) :357- 359.

[10] 沈岩, Vogel IKalthoff H, 于吉人, 等. 不同转移能力肿瘤细胞间转移相关特征的比较研究[J ]. 中华肿瘤杂志,2000, 22 (3) : 201- 204.

[11] 沈靖南, 王晋, 韩士英等骨肉瘤p2糖蛋白表达水平与肺转移中华骨科杂志, 2000, 20 (1) : 21- 23.

[12] 蔡文琴, 王伯倪实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术成都: 四川科学技术出版社, 1994. 1- 20.

[13] N ewman RA. B inding of peanut lect in to breast ep ithe2lium , human carcinoma and cultured rat mammary stemcells:U se of the lect in as a marber ofmammary differen2t iat ion[J ]. J N at l Cancer Inst, 1979, 63: 1339- 1342.

[14] Kiverla T and Tarkanen A. A lect in cytochem ical studyof glycoconjugates in the human ret ina [J ]. Cell T issueRes, 1987, 249: 277- 280.

[15] St reitWJ and Kreutzberg GW. lect in binding by rest ingand react ive m icroglia [J ]. N eurocyto logy, 1987, 16: 249- 251.

[16] 张华忠. 凝集素在人体正常组织的定位中华医学杂志, 1985, 65: 144- 147.

[17] 金冬雁, 李孟枫, 译. 分子克隆实验指南北京科学出版社, 1992: 495- 569.

[18] 杨春花, 黄烽类风湿关节炎中尿激酶型纤溶酶原激活物及其受体蛋白和基因的表达现代妇产科

进展,2000, 9 (5) : 5- 7.

[19] 黄勇华,M argaret ta B joeling 脑出血患者血肿周围星形细胞内皮素21 表达免疫组化研究

军医进修学院学报, 2000, 21 (1) : 5- 8.

[20] 杨希谦, 李建远, 刘奉立等碘标记直肠癌相关抗原单克隆抗体的免疫显像研究中国肛肠病杂志, 2000,20 (4) : 4- 7.

[21] 范少地缓慢牵伸肢体延长时周围神经损害及修复过程中生长相关蛋白243mRNA 表达的实验研

究第三军医大学学报, 2000, 22 (2) : 470- 473.

[22] 倪灿荣, 郑建明, 朱明华等催化信号放大系统的制备及其在免疫组化和原位杂交中的应用[J ]. 第二军医大学学报, 2000, 21 (4) : 336- 340.

[23] 黄晓赤，罗克枢免疫组织化学技术的临床应用概况成都医药2003 年10月第29 卷第5期

[24] 李再新，孙素荣，张富春免疫组织化学技术进展及在医学研究中的应用地方病通报2002年第17卷第3期

[25] 刘复生免疫组织化学癌症进展杂志2004年5月第二卷第3期

[26] 蔡太生免疫组织化学技术 DIGEST OF THE WORLD LASTEST MEDICAL INFORMATION December 2004. Vol.3.No.6

[27] 于颖彦免疫组织化学研究新进展河北医科大学学报 1999年5月第20卷第3期

[28] 蔡俊杰有关免疫组织化学技术方法若干问题的探讨中国组织化学与细胞化学杂志1998年9月第7卷第3期

免疫组织化学技术在病理诊断中的应用题库2-0-8

免疫组织化学技术在病理诊断中的应用题 库2-0-8

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]下列标记可用来鉴别上皮样淋巴瘤和上皮样肉瘤的是（） A.CK B.calretinin C.LCA D.CgA E.CD68 CK为上皮性标志物；calretinin为间皮细胞肿瘤标志；CgA为神经内分泌标志物；CD68为组织细胞标志物。LCA为淋巴细胞标志物，因此可用来鉴别上皮样淋巴瘤和上皮样肉瘤。

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]AFP为下列哪种肿瘤的标记物？（） A.宫内膜癌 B.黑色素细胞瘤 C.肝细胞癌 D.乳腺癌 E.鼻咽癌 AFP为肝细胞癌和内胚窦瘤的标志物；HMB45和S-100为黑色素细胞的标志物；ER和PR为乳腺癌和子宫内膜癌的分化标志物。

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]关于小圆细胞肿瘤的描述，下列错误的是（） A.是一类细胞形态为小圆形的细胞 B.常规诊断基本可以明确诊断 C.免疫组化诊断胚胎性横纹肌肉瘤首选Desmin D.原始间叶性肿瘤诊断困难，可采取排除法 E.免疫组化诊断尤因肉瘤首选CD99 小圆细胞恶性肿瘤是病理学从镜下形态的分类，不能说明肿瘤的组织来源，需要免疫组化进一步诊断。 (吉林快3 https://www.wendangku.net/doc/1f3453901.html,)

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]下列免疫组化结果有助于诊断皮肤Merkel瘤的是（）。 A.Vimentin（+），CK（+），NSE（-） B.Vimentin（-），CK（-），NSE（+） C.Vimentin（-），CK（+），NSE（-） D.Vimentin（-），CK（+），NSE（+） E.Vimentin（+），CK（-），NSE（+） 皮肤Merkel瘤可同时表达CK、NSE，而Vimentin常呈阴性反应。

免疫组化原理

免疫组织化学的概念： 免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。 免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。 免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？ 实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。 其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。 石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？ 石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。 免疫组化常用的染色方法有哪些？ 根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。 抗体的保存： 抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下可保存3-5年。保存稀释后的单抗应加入0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4℃下保存数月。 多聚赖氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution） Cat.No.: SGP8920 Size: 10ml Conc.: 0.1% w/v, in water Storage: 18-26℃ Thimerosal, 0.01%, added as preservative 多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。 适用组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理，以防实验操作过程中组织掉片。也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。 [使用说明] 免疫学 操作步骤（可直接在玻片上涂布） 1．灭菌的ddH2O 1:10稀释该多聚赖氨酸溶液。

免疫组化技术全程原理

免疫组化技术全程原理 一、概念和常用方法介绍 1、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。 2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。 3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。 4、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 2）免疫酶标方法

免疫组化技术(原理、分类、步骤及主要试剂、设备准备)

免疫组化技术 免疫组化技术
业精于勤而荒于嬉 行成于思而毁于随
免疫组化技术
原理
抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色 来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取 出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并 用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗 体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂 DAB 显示 为棕黄色颗粒） 。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产 物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨 基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）
1、免疫荧光方法
最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内 的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某 种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较 广。
2、免疫酶标方法
免疫酶标方法是继免疫荧光后， 60 年代发展起来的技术。 于 基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用， 然后加入酶的底物， 生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标 技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种 标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属 PAP 法（过氧化物酶-抗过氧化物酶） 、ABC 法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物） SP 、SP 、即用型二步法（聚合物链接）等。 法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶） 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）
3、免疫胶体金技术
免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白 的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作为 探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免 疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银 加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法
标本
1、组织标本：石蜡切片 石蜡切片（病理切片和组织芯片） 、冰冻切片 石蜡切片 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
---------------------------------------------------------------------------------华中科技大学同济医学院
1

《组织化学与免疫组织化学》实验教学大纲

白求恩医学班《组织化学与免疫组织化学》实验教学大纲 课程代码：10271815 课程名称：组织化学与免疫组织化学 英文名称：Histochemistry and Immunohistochemistry 课程类别：学科基础课 课程性质：选修课 授课对象：白求恩医学班 开课学期：第3短学期 课程学时：20学时 选用教材：《组织化学与免疫组织化学》（第1版）李和、周莉主编 人民卫生出版社 2008年8月 授课地点：形态学教学中心 执笔人：刘佳梅（教授） 审核人：周莉（教授） 编写日期：2010年9月 一、实验教学目标 组织化学与免疫组织化学是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些多肽和蛋白质等大分子物质进行原位定性、定位或定量研究的技术，此技术已成为医学与生命科学研究中重要的研究手段之一。学生通过本课程掌握石蜡、冰冻组织切片标本制作和HE染色、碱性磷酸酶染色和免疫组织化学SP法染色技术，同时，在实验过程中学会发现问题，分析问题和解决问题。通过本课程的基本技能训练，掌握医学形态学研究思维方式和基本方法，并在实际工作中触类旁通，灵活运用。 二、实验学时分配 三、实验教学内容 实验一组织标本石蜡切片制备与HE染色（8学时） Preparation and HE staining of paraffin tissue sections 【实验要求】 掌握：组织标本石蜡切片制作技术；组织切片HE染色技术。 了解：组织标本冰冻切片制作技术。 【实验内容】

1．组织标本石蜡切片和HE染色实验步骤原理 2．组织取材、固定、脱水和透明、浸蜡、包埋、修块、切片。 3．示教：组织取材、冰冻切片。 4．HE染色：烤片、脱蜡、梯度乙醇水化、苏木精染色，伊红染色、分色、上行梯度乙醇脱水、透明、封片。 5．光学显微镜观察结果并拍照 实验二碱性磷酸酶染色（4学时） Alkaline phosphatase staining 【实验要求】 掌握：组织化学常用的碱性磷酸酶显示方法。 【实验内容】 1．碱性磷酸酶显示法实验步骤原理 2．使用含有氯化钙的孵育液孵育组织切片 3．硝酸钴置换 4．硫化铵处理 5．显色和封片 6．光学显微镜观察结果并拍照 实验三免疫组织化学染色SP法（5学时） Immunohistochemistry staining:SP method 【实验要求】 掌握：免疫组织化学SP法的基本原理、实验步骤和注意事项； 了解：免疫荧光组织化学技术的基本原理、实验步骤和注意事项。 【实验内容】 1．免疫组织化学SP法实验步骤原理和注意事项 2．免疫荧光组织化学技术实验步骤原理和注意事项 3．示教：免疫荧光组织化学染色 4．烤片、脱水和水化 5．抗原修复、细胞膜打孔 6．封闭非特异性反应 7．第一抗和第二抗体孵育；显色剂显色 8．复染和封片 9．光学显微镜观察结果并拍照 实验四实验设计—课堂讨论（3学时） Experiment design—discussion 【讨论要求】 掌握：通过设计自己感兴趣的小实验（全文不少于2000字），掌握实验设计的基本思路和方法。 熟悉：如何在实验中应用免疫组织化学技术。 了解：医学形态学的多种研究方法。 【讨论内容】

《酶组织化学与免疫组织化学》习题

《酶组织化学与免疫组织化学技术》习题第一部分组织学技术和免疫组织化学技术 一、选择题 （一）A1型题(标准型) 1.C 2.B 3.A 4.C 5.A 8.B 9.C 10.D 14.A 23.D 1.免疫组化技术的关键步骤是 A.标本处理 B.抗体的处理与保存 C.免疫染色 D.设立对照试验 E.结果判断 2.免疫组化技术的首要试剂是 A.抗原 B.抗体 C.标记物 D.固定剂 E.洗涤液 3.酶免疫组化技术中，关于标本处理的说法正确的是 A.充分洗后于室温用0.3%H2O2和80%甲醇处理20～30min。 B.充分洗后于室温用0.3%H2O2和80%甲醇处理40～50min。 C.充分洗后于室温用0.5%H2O2和90%甲醇处理20～30min。 D.充分洗后于4℃用0.3%H2O2和80%甲醇处理20～30min。 E.充分洗后于4℃用0.3%H2O2和80%甲醇处理40～50min。 4.PAP法是Sterberger等于哪一年建立的 A.1950 B.1960 C.1970 D.1980 E.1990 5.PAP复合物中的酶是 A.辣根过氧化物酶 B.碱性磷酸酶 C.葡萄糖氧化酶 D.胃蛋白酶 E.胶原酶 8.PAP法中的“桥”是 A.第一抗体 B. 第二抗体 C. 第三抗体 D.亲和素 E.第四抗体 9.ABC技术由美籍华人Hsu于哪一年建立，已广泛应用于免疫学检测技术 A.1961

B.1975 C.1981 D.1985 E.1990 10.ABC法中的“桥”是指 A.第一抗体 B. 第二抗体 C. 第三抗体 D.亲和素 E.链霉素亲和素 14.免疫组化法吸收试验是用过量已知抗原与抗体在多少度以下充分反应，离心后再行免疫组化染色 A.4℃ B.20℃ C.40℃ D.37℃ E.50℃ 23．PAS反应是检测组织内的： A.核酸 B.脂 C.蛋白质 D.多糖 E.抗原 一、填空 1、免疫组织化学中最常用的标记物是__荧光素________、___酶_________ 、____生物素和亲和素_______、___________。原位杂交组织化学中常用的标记物有___________和___________两大类。 2、常用的粘附剂有__________、____________ 、__________等。 3、抗原决定簇是指_____________分子表面的、具有活性的___________。 4、一般组织化学是利用化学或物理反应，在组织标本上加入一定的_____________，使其发生反应，形成_____________，能在显微镜下观察。常用于检测__________、____________ 、__________等。 5、酶组织化学是利用酶对其____________的催化作用，生成__________，再与某种__________反应，形成____________沉淀，检测___________分布及活性的方法。常用的方法有___________ 、___________、____________、__________和____________。 6、最常用于显示细胞、组织内的多糖和蛋白多糖的方法是过碘酸-雪夫反应PAS。 7.、免疫染色对特殊标本的进一步处理常用________和________法。 8、免疫组化中最常用的制片方法是________和________。 9、免疫组化染色后，阳性细胞的染色分布有三种类型，分别是_________、_________ 和_______。

免疫组织化学(傅琦博)-免疫组织化学

免疫组织化学 傅琦博 引言 酶工程是生物工程的重要组成部分，近几十年来，随着研究手段的更新和技术水平的提高，产生了一门以研究酶在细胞内的存在及其动态，以阐明组织细胞的结构和功能为主要内容的科学——酶组织化学。酶组织化学是利用酶化学反应的产物可在光学显微镜或电子显微镜下被识别的特性，借以从形态学角度判定酶在组织细胞内的存在的部位的一门技术，其基础是组织化学。它具有将形态学、生物化学和生理学联系起来的特点，在生物学、生物化学、医学生物领域内日益发挥着重要的作用。研究组织细胞内特定酶分布的酶组织化学方法大致分为：（1）利用酶的活性反映的方法；（2）利用抗原抗体反应（免疫应答）证实酶的存在部位的方法。后者也被称之为免疫组织化学。 免疫组织化学概述 免疫组织化学简称免疫组化，是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分，进行原位的定性、定位或定量的研究。这种技术称为免疫组织化学技术。免疫组化是利用抗体与抗原的结合具有高度特异性的特点，采用一直的抗体检测组织或细胞的抗原物质，以期确定组织或细胞是否存在未知抗原，并进行定性、定位或定量的研究。抗原与抗体结合形成的免疫复合物是无色的，故必须借助组织化学方法，将抗体抗原反应部位显示出来。它的主要研究方法是免疫组织染色法（简称免疫染色法），食用该方法检测细胞内物质，必须具备两个条件：①作为检测对象的物质须具有抗原性，能制作出与之相应的特异、高效价的抗体；②在免疫反应发生之前，目标物质要保持抗原性，同时还要保持在组织细胞内的稳定状态。要检测抗原，就要用与之相应的抗体进行免疫反应，同时要用可视的标记标出抗原或抗体，采用这种方法的免疫染色法称为标识抗体法或标识抗原法，常用的表示抗体法有直接法、间接法、补体结合法以及多重染色法等。直接法是标识要检出的抗原的抗体，然后进行反应的方法，其特异性高，但检出的敏感度不如间接法，标识抗体的食用范围手局限。间接法是以未标识的第一抗体进行反应，接着标识以第一抗体为抗原所制作的抗体（即第二抗体）进行重叠反应，间接的证明抗原，这种方法的缺点是容易出现非特异性反应，但敏感度较高，标识抗体的用途也广；补体结合法是将间接法中的第二抗体作为标识抗补体抗体食用；多重染色法则是在同一标本上检出多种抗原物质的方法，可以用反复进行的重复标记的直接法，也可以用酶标记的重复进行的间接法。此外，还有后标识抗体的免疫染色法，此法先采用未标识的抗体进行反应，反应结束后，通过免疫化学反应或其他化学反应，用适当的标记物质来识别已与组织细胞内抗原发生结合的抗体。 免疫组织化学技术的发展 免疫组织化学技术是形态学研究领域一门新兴方法学。自它问世以来发展迅猛,用“日新月异”一词形容它毫不过分。酶标免疫组织化学技术是由Nakane 等人于60 年代末期创立的最早的免疫酶组织化学技术,之后Sternberger 等人于70 年代初期便在此基础上建立了非标记抗体酶法(又称间接法) 和PAP 法(过氧化酶抗过氧化酶法) 。80 年代初期美籍华人Hsu 又建立了卵白素生物素复合物法(ABC法) ,自此之后,免疫金银染色法、免疫电镜等技术相继问世。80 年代末期人们又发现链霉菌抗生物素蛋白(或译成链霉菌亲合素,St reptavidin) 与生物素结合力极强,遂用它标记过氧化酶建立起了SP 法,或称LSAB 法(链霉菌亲合素生物素过氧化酶法) 。由于链霉菌亲合素不与人组织中的内源性生物素起非特异性结合反应,故背景染色更加清晰,且敏感性比ABC 法高4～8 倍,比PAP 法高8～16 倍。进入90 年代,免疫组织化学又向基因水平深入发展,与分子生物学技术的结合日益紧密。如原位杂交后信 号的放大与显示便是采用了免疫组织化学显色技术,因而又可称之为原位杂交免疫组织化学技术。而图象分析、流式细胞仪的运用，是免疫细胞化学定量分析技术提高到更精确的水平。现就该技术的发展及其应用作一概述。 1利用免疫荧光标记技术可以分辨出标记抗原抗体所在的位置及其性质, 并可利用荧光定量技术计算抗原(或抗体) 的含量, 以达到对定性、定位、定量测定的目的[2 ]。如黄祥瑞等人(1999) 利用免疫荧光细胞化学技术研究西藏环状病毒细胞生物学特性和敏感细胞范围(CPE) , 成功地观察到该病毒的细胞病变效应特异荧光发生的部位、细胞数量和病毒的形态发生。辛德毕斯热是由辛德毕斯病毒Sindbis V irus (SiN ) 引起的人兽共患虫媒病毒病, 1974 年南非发生辛德毕斯热大流行。1991年梁国栋等通

病理学技术(主管技师)：免疫细胞化学技术考点.doc

病理学技术(主管技师)：免疫细胞化学技术考点 考试时间：120分钟 考试总分：100分 遵守考场纪律，维护知识尊严，杜绝违纪行为，确保考试结果公正。 1、单项选择题 与ABC 法有关的复合物是（ ）A.抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物 B.过氧化物酶-抗过氧化物酶 C.碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶 D.链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物 E.抗体-亲和素-生物素过氧化物酶复合物 本题答案： 2、单项选择题 凝集素是指（ ）A.一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因能凝集红细胞，因而得名 B.一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的脂蛋白或 能与脂类结合的脂蛋白lE.以AS-MX 为底物、FB/FR 为发色剂时呈蓝色／红色 本题答案： 4、单项选择题 下列有关HRP 的描述，错误的是（ ）A.ICC 染色最为常用的醇 B.特异底物为AS-MX C.在酶反应部位呈棕褐色 D.常用戊二醛作为耦联剂 E.最适pH5～5.5 本题答案： 5、单项选择题 姓名：________________ 班级：________________ 学号：________________ --------------------密----------------------------------封 ----------------------------------------------线----------------------

EPOS法（）A.把生物素耦联到特异性第一抗体上，将生物素化抗体直接和ABC复合物结合 B.先用PAP法，然后用ABC法 C.先用PAP法，后用LAB法 D.抗体亲和素-生物素-过氧化物酶复合物的一步法 E.HRP-多聚化合物-特异性抗体复合物一步法 本题答案： 6、单项选择题 免疫组织化学染色Envision法的原理是（）A.将亲和素-生物素-过氧化物酶复合物中的亲和素替换为链亲和素，特异性更高 B.利用线状的葡聚糖分子与大量的AP或HRP酶结合，再将葡聚糖-酶复合物连接到第二抗体上，形成酶-葡聚糖-第二抗体复合物，灵敏度高 C.用AP取代PAP法的过氧化物酶而成，显色对比好 D.将游离酶和抗酶抗体制成稳定的酶-抗酶抗体复合物 E.通过复合物中亲和素的桥梁作用，将亲和素-生物素-过氧化物酶复合物与生物素化的抗体结合在一起，达到检测抗原的目的 本题答案： 7、单项选择题 酶桥染色法中的桥抗体是指（）A.免疫反应系统中的特异性抗体 B.显色系统中的抗酶抗体 C.第二抗体 D.第一抗体 E.以上均不对 本题答案： 8、单项选择题 PAP-ABC法（）A.把生物素耦联到特异性第一抗体上，将生物素化抗体直接和ABC复合物结合 B.先用PAP法，然后用ABC法 C.先用PAP法，后用LAB法 D.抗体亲和素-生物素-过氧化物酶复合物的一步法 E.HRP-多聚化合物-特异性抗体复合物一步法

免疫组织化学及HE染色实验步骤复习过程

免疫组织化学及H E 染色实验步骤

免疫组织化学（ immunohistochemistry） 1组织脱水、包埋及切片 （1）将剥离出瘤组织切成合适大小的组织块放于4%多聚甲醛中固定2天，固定时间最长不能超过1个月； （2）将组织块从固定液中取出，PBS漂洗1h，然后开始进行组织脱水，程序如下：70%乙醇浸泡30min—80%乙醇浸泡30min—90%乙醇浸泡30min—95%乙醇浸泡30min—95%乙醇浸泡30min—无水乙醇浸泡30min—无水乙醇浸泡30min—无水乙醇浸泡30min—二甲苯 浸泡30min—二甲苯浸泡30min； （3）将组织块完全浸泡在蜡液中60℃过夜； （4）打开包埋仪器，设置相应参数，2h后将蜡液中的组织块取出放入包埋机的蜡缸中，将包埋所用铁槽清理干净放入蜡缸，用镊子将组织块放于铁槽正中央，取出铁槽接取少量蜡液使凹槽填满，将包埋盒倒置卡在铁槽上，放于低温工作台上冷却凝固，待其完全凝固后，取下包埋好的蜡块； （5）在切片前，先将蜡块表面修平，切成连续的厚度为5μm的切片，放入冷水中展片，用刀片将连续蜡带分开，然后放入40℃水浴锅中，用防脱载玻片捞出目的蜡带，放入烤片机上过夜，组织切片4℃保存。 2免疫组化染色 （1）首先，用二甲苯脱蜡，然后用梯度酒精和水使切片充分复水，详细流程为：二甲苯浸泡10min—二甲苯浸泡10min—无水乙醇浸泡5min—无水乙醇浸泡5min—90%乙醇浸泡5min—80%乙醇浸泡5min—自来水冲洗5min； （2）抗原修复：微波炉中火预热配制好的枸橼酸缓冲液3min，将切片浸入修复液内，用微波炉中火加热3min，在此过程中注意不要让修复液溢出，以免切片变干，加热

免疫组化技术总结(较好)

个人免疫组化感悟（Jane） 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？ 这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37 度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。 相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。 免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。 阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。 如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。 我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。 失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。 如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过

免疫组织化学及其应用

免疫组织化学及其应用 浙江大学病理学与法医学研究所 周韧 1．免疫组织化学的历史、现状和发展 1．1．历史 ●人类的历史有多长，医学的历史也就有多长.医学的任何一个进步都是建立在当 时科学与技术发展的相应水平上的. ●医学的目的: 解除人体的病痛 ●核心: 诊断和治疗。 任何疾病的有效治疗均来源于正确的诊断。●疾病的诊断手段准确性，首推病理诊断准确性高，即病理组织学诊断。更准确、 更可信、更有权威性。 ●免疫组织化学（以下简称免疫组化）已成为病理诊断中的一种常用手段。 病理诊断发展过程的主要事件 年代作者事件 1632年 Severino 肿瘤切开后观察的书 1661年 Malpighi 放大镜观察后的报告 1761年 Morgagni 肿瘤与外科方面的书 1829年 Horner 首篇病理论文 1832年Hodgkin 报告7例尸检结果的论文 1858年Virchow 发表《细胞病理学》 1863年 Paget 发表《外科病理学》 1897年 Mallory和Wright 发表组织学技术的书 1914年 Mallory 发表《细胞组织学原则》 1919年 Ewing 发表《肿瘤病》 1924年 McFarland 发表《外科病理学》 1926年 Karsner 发表《人体病理学》 1928年 Papanicolaou 发表细胞学方面的书 1951年电镜应用于病理诊断 1974年免疫组化用于病理诊断 ●诊断病理学开始于19世纪 ●20世纪的第二个25年中达到光学显微镜诊断的辉煌。随之而起的电子显微镜 ●20世纪第三个25年中成为诊断病理的发展高峰。

●进入20世纪最后25年，取而代之的便是免疫组化了。 1．2．免疫组织化学的发展 1．2．1．免疫学的发展 1．2．2．单克隆技术的出现 ●病理诊断的确立：是找到“特征性”形态表现。 常规苏木素伊红（HE）染色 几百种的“特殊染色” ●免疫组织化学产生： 抗原抗体结合原理 ●从组织细胞水平进行抗原抗体反应，于是就了免疫组织化学技术。 主要的发展过程 年代研究者事件 1941年 Coons 实用免疫荧光技术 1948年 Fagraeus 进一步发展免疫荧光技术 1970年 Sternberger 抗体酶标记技术 1974年 Taylor 证实组织中的浆细胞免疫 1975年 Kohler和Milstein 单克隆抗体技术 1981年 Hsu ABC法 90年代以来 SP法，原位杂交及原位PCR免 疫组化法

免疫组化实验步骤

免疫组化实验步骤 Revised final draft November 26, 2020

石蜡切片免疫组化实验步骤 石蜡切片步骤按照晓峰整理的步骤进行（From徐晓峰、朱老师的“石蜡切片”方案）： 1）材料的准备 在本实验室条件下推荐使用FAA（50%ethanol,5%aceticacid,3.7%甲醛）固定材料。 FAA固定液（100ml），室温保存： 无水乙醇50ml 冰醋酸5ml 37%甲醛10ml 水35ml 第一天：组织固定 用FAA固定，详见“石蜡切片”protocol。 第二天：脱水 以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4℃冰箱等待，并不时轻摇。 *组织可在70%ethanol4℃可存放几个月 第三天：进一步脱水和浸蜡 以下所有步骤在4℃进行并不时轻摇

以下所有步骤在室温进行并不时轻摇 准备工作：60℃预热plus蜡片（ParaplastPlus）石蜡可反复融凝而去气泡 第四天：浸蜡2 将材料置于42℃直至蜡块完全熔化。再加1/4体积的蜡块至完全熔化后移至60℃。几个小时后换上新鲜熔好的蜡液，过夜。 第五天：浸蜡3 换蜡两次（ParaplastPlus） 第六天：浸蜡4 换蜡两次（ParaplastPlus） 第七天：浸蜡5 换蜡两次（ParaplastPlus） 准备工作：60℃预热Regular蜡片（ParaplastRegular）

第八天：包埋（包埋块可长久保存） 第九天及之后： 开始切片，切片应包括自己的片子及正负对照等。事先打开烘片机至37度，在涂有多聚赖氨酸的玻片上加1~2ml的蒸馏水。切好的片子轻至于加水的玻片上。待所有片子准备完之后盖上盖子，烘片过夜。 用自来水及双蒸水清洗免疫组化专用塑料，放在烘箱烘干待用。 第二天：开始脱蜡（From徐晓峰、朱老师整理的“石蜡切片”protocol） （用新买来的免疫组化塑料小盒，每一步只需加入试剂220~250毫升） 抗原修复： 在切片还浸入酒精时，可以事先将煮锅清洗干净，用蒸馏水洗1~2遍，最后加入0.01M柠檬酸钠缓冲液(PH=6.0)，煮沸(保持在95度左右)，将过完PBS的片子让入煮沸的锅中，煮片10~15min。然后将电磁炉关闭，自然冷却锅中切片（千万不要把片子拿出来，放在缓冲液中一起自然冷却至室温！！！） 将片子浸入PBS（PH=7.4）5min。

免疫组织化学技术题库1-2-10

免疫组织化学技术题 库1-2-10

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫组化技术的优点不包括（）. A.高特异性 B.高敏感性 C.形态学的直观性 D.精确定量分析 E.能对抗原表达情况进行分析 免疫组化技术重要的特点是形态学的直观性，用于抗原表达的定性分析，不能精确定量。

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫组织化学技术中，必须保证组织材料（）. A.取材新鲜 B.形态保存良好 C.抗原物质的抗原性不被破坏 D.以上均包括 E.以上均不包括 取材必须新鲜、形态保存良好、抗原性不被破坏。

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫细胞组织化学技术包括（）. A.酶免疫组织化学技术 B.荧光免疫组织化学技术 C.亲和素免疫细胞组织化学技术 D.以上均包括 E.以上均不包括 免疫细胞组织化学技术包括以上所有。 (NBA总冠军 https://www.wendangku.net/doc/1f3453901.html,/)

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]免疫标记电镜技术获得成功的关键是（）. A.对细胞超微结构完好保存 B.保持被检细胞或其亚细胞结构的抗原性不受损失 C.选择的免疫试剂能顺利穿透组织细胞结构与抗原结合 D.以上叙述都正确 E.以上均不正确 上述均为免疫标记电镜的成功关键。

问题： [单选,A2型题,A1A2型题]胶体金是氯金酸在何者的作用下聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态（）. A.还原剂 B.氧化剂 C.变构剂 D.化学物质 E.以上都不对 氯金酸在还原剂如白磷、维生素C等的作用下还原为金颗粒。

《分子实验》06 免疫组化实验

免疫组化操作步骤 （一）、仪器设备 1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉. 2. 水浴锅 （二）、试剂 1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl 2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用 10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml. 4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至ph8.0, 加水1000ml。 5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。 6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制 7.风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合b 油和TBS(PBS)配制 8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本 （三）、操作流程 1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟

b 无水乙醇中浸泡五分钟 c 95%乙醇中浸泡五分钟 d 75%乙醇中浸泡五分钟 2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片： A 抗原热修复 a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 b 沸热修复电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。 c 微波炉加热在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。适用的抗原Bcl-2. Bax. AR. PR. C-fos. x-jum. z-kit. c-myc. E-cadherin. ChromograninA. Cyclin. ER. Heatshock. Protein. HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等 B 酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原：包括Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等 3、免疫组化染色SP法 （1）脱蜡、水化 （2）PBS洗2-3次各5分钟 （3）3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟

免疫细胞化学技术题库9-2-10

免疫细胞化学技术题 库9-2-10

问题： [单选,A1型题]应用尚无文献报道的抗血清或自己制备的抗血清进行免疫酶组织细胞化学染色时，必须设置的对照是（） A.交叉实验 B.替代实验 C.吸收实验 D.置换实验 E.阳性对照

问题： [单选,A1型题]可引起免疫酶组织化学染色假阳性的是（） A.组织内待检抗原过多 B.内源性过氧化物酶丰富 C.洗液用TBS缓冲液 D.抗体浓度过低 E.抗体特异性高

问题： [单选,A1型题]免疫酶组织化学染色中过氧化氢液的作用是（） A.提高抗原抗体的识别能力 B.减少内源性过氧化酶的活性 C.修复抗原 D.提高敏感性 E.激活抗原 https://www.wendangku.net/doc/1f3453901.html,/ 月子病

问题： [单选,A1型题]ABC法的基本原理是（） A.利用抗卵白素分别连接卵白素标记的第二抗体和卵白素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原 B.利用抗卵白素分别连接卵白素标记的第一抗体和卵白素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原 C.利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原 D.利用抗生物素分别连接生物素标记的第一抗体和生物素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原 E.利用抗地高辛分别连接生物素标记的第一抗体和生物素标记的酶来检测组织和细胞中的抗原

问题： [单选,A1型题]BRAB法的基本原理是（） A.用生物素标记抗体，然后与生物素和酶形成复合物 B.用生物素分别标记抗体和酶，然后以抗生物素为桥，把两者连接起来 C.用卵白素标记抗体，然后与卵白素和酶形成复合物 D.用卵白素分别标记抗体和酶，然后以抗卵白素为桥，把两者连接起来 E.用亲和素分别标记抗体和酶，然后以抗亲和素为桥，把两者连接起来

免疫组织化学实验之常用染色方法 百度文库

免疫组化的相关知识！ 一、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC) 免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。 二、免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？ 实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片(病理大片和组织芯片)和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。 三、石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？ 石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。 四、免疫组化实验用抗体的选择 1、一抗选择要点 (1)选择单克隆还是多克隆抗体。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对较低；而多克隆抗体特异性稍弱，抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色(可以通过封闭等有所避免)。 (2)种属来源。一般家兔来源的抗体多是多克隆；而小鼠来源的抗体多是单克隆，但也有另外。这条主要要与后面的二抗来源相匹配。 (3)实验目的是检测什么种属的抗原，即species reactivity。这一点很重要，一般说明书