反义纤溶酶原激活物抑制剂1RNA对家兔动脉粥样硬化形成的影响
?实验研究?[文章编号] 100723949(2003)1120320214205
反义纤溶酶原激活物抑制剂1RNA对家兔
动脉粥样硬化形成的影响
富 路1,李 佳1,李 晖2,梅 雨1,尹 申2,孔一慧1
(哈尔滨医科大学1.附属第一医院心内科,黑龙江省哈尔滨市150001;
2.生物化学教研室,黑龙江省哈尔滨市150086)
[关键词] 分子生物学; 纤溶酶原激活物抑制剂1对动脉粥样硬化形成的影响; 聚合酶链反应; 反义RNA;
组织型纤溶酶原激活物; 血脂; 动脉粥样硬化
[摘 要] 为探讨纤溶酶原激活物抑制剂1反义RNA对家兔血浆纤溶活性及纤溶酶原激活物抑制剂1的表达、血脂及对动脉粥样硬化斑块形成的影响,通过聚合酶链反应扩增纤溶酶原激活物抑制剂1第二外显子,将聚合酶链反应产物纯化克隆后连入真核细胞表达载体pcDNA3.1,构建纤溶酶原激活物抑制剂1反义RNA重组质粒。将pcDNA3.12反义纤溶酶原激活物抑制剂1重组质粒注射到哈尔滨大白兔腹部皮下组织。通过发色底物法测定家兔血浆组织型纤溶酶原激活物及纤溶酶原激活物抑制剂1活性变化,通过免疫组织化学方法检测组织中纤溶酶原激活物抑制剂1表达的改变。测定家兔血脂变化,病理检测其动脉粥样硬化程度。结果显示,应用反义纤溶酶原激活物抑制剂1RNA重组质粒的家兔血浆纤溶酶原激活物抑制剂1活性降低,组织型纤溶酶原激活物活性升高,纤溶酶原激活物抑制剂1蛋白表达于内皮细胞,而在平滑肌细胞中未表达(动脉粥样硬化对照组中内皮细胞、平滑肌细胞和泡沫细胞内均有表达);应用反义纤溶酶原激活物抑制剂1RNA重组质粒的家兔胆固醇和甘油三酯明显低于动脉粥样硬化对照组(96±42mgΠL比123±12mgΠL,15±10mgΠL比46±29mgΠL),且动脉粥样硬化程度亦轻于后者。以上提示,反义纤溶酶原激活物抑制剂1RNA重组质粒的皮下注射能有效阻断家兔体内纤溶酶原激活物抑制剂1蛋白的合成,减轻动脉粥样硬化程度。
[中图分类号] R541.4[文献标识码] A
The I nfluence of Antisense Plasminogen Activator I nhibitor21RNA on Atherosclerosis in R abbits
FU Lu1,LI Jia1,LI Hui2,MEI Y u1,YI N Sheng2,and K ONG Y i2Hui1
(1.Department o f Cardiology,the First Hospital o f Harbin Medical University,Harbin150001;2.Department o f Biochemistry,Harbin Medical
Univer sity,Harbin150001,China)
[KE Y WOR DS] Antisense RNA; T issue Plasminogen Activator; Serum Lipid; Atherosclerosis; Plasminogen Activa2 tor Inhibitor21; Immunohistochemistry
[ABSTRACT] Aim T o investigate the role of plasminogen activator inhibitor21(PAI21)antisense RNA in in fluencing plas2 ma fibrinolytic activity,and regulating the expression of PAI21and the process of atherogenesis in rabbits. Methods PAI21 antisense RNA recombination plasmid was constructed by using eukary otic cell expression vector pcDNA3.1. Thirty rabbits were classified into4groups. C ontrol group(n=7)was fed with a normal diet. Atherosclerosis(As)group(n=7)was fed with
a high cholesterol diet. Plasmid treatment group(treatment group,n=9)was fed with a high cholesterol diet and injected with
PAI21antisense RNA recombination plasmid(20μgΠkg)into the abdominal subcutaneous tissue weekly. Plasmid group(n=7) was fed with a normal diet and injected with PAI21antisense RNA recombination plasmid(20μgΠkg)into the abdominal subcuta2 neous tissue weekly. Then the activities of tissue plasminogen activator(t2PA),PAI21,and serumal lipid were detected. PAI2 1protein expression in tissues was tested by immunohistochemistry. Lastly,the extent of atherosclerosis was observed by patho2 anatomy. R esults In plasmid treatment group and plasmid group,the activity of PAI21in plasma decreased while that of t2 PA increased. Although there were no differences between As group and plasmid treatment group in the activities of PAI21and t2 PA at the beginning of the study(P>0.05),in the end the differences were significant(P<0.05). PAI21protein only exist2 ed in endothelial cells in plasmid treatment group,while in As group,it not only existed in both endothelial cells and sm ooth mus2 cle cells but als o outnumbered the former. C om pared with As group,the intima of the arterial vessel was thinner in plasmid treat2 ment group. Plasmid treatment group had a lower lipid count(serum triglyceride and cholesterol)(96±42mgΠL vs123±12
[收稿日期] 2002207228 [修回日期] 2003203225
[作者简介] 富路,女,1955年出生,辽宁省沈阳市人,主任医师,博士,博士研究生导师,研究方向为纤溶酶原激活物抑制剂1与动脉粥样硬化的关系,联系电话:04512364426525463,E2mail:Fu Lu@https://www.wendangku.net/doc/1918786468.html,。李佳,女,1971年出生,黑龙江省哈尔滨市人,主治医师,硕士,从事心血管内科工作,E2mail:almaxu@https://www.wendangku.net/doc/1918786468.html,。李晖,女,1958年出生,山东省淄博市人,教授,博士后,硕士研究生导师,主要从事生物化学及分子生物学研究。
mgΠL,15±10mgΠL vs46±29mgΠL)and a lesser degree of atherosclerosis than group B. Conclusions PAI21antisense RNA can block the translation progress of PAI21protein effectively and degrade the severity of atherosclerosis.
纤溶酶原激活物抑制剂1(plasminogen activator inhibitor21,PAI21)是组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator,t2PA)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase plasminogen activator,u2PA)的生理性抑制剂,存在于血浆、血小板和血管内皮,抑制血管内血栓的溶解。近年研究表明,PAI21血浆水平的增高与血栓性疾病包括心肌梗死和静脉血栓形成有关[1],而血栓的形成和机化是促进动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)发展的重要原因,在As形成过程中起重要作用。有研究表明,在人类冠状动脉PAI21mRNA水平随动脉粥样硬化损伤的程度加重而增加,这说明PAI21与As关系密切。本研究利用反义PAI21RNA阻断PAI21表达,观察血浆纤溶活性及PAI21蛋白表达情况、血脂水平及动脉粥样硬化程度,以期为As性疾病的防治提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料
克隆载体p GE M2T(Promega),真核细胞表达载体pcDNA3.1(-)(Invitrogen),T ag DNA多聚酶(G ibco),聚合酶链反应产物纯化及质粒提取纯化试剂(Promega),限制性内切酶类Apa I、Not I和Pst I (Promega)。聚合酶链反应引物P1:5′2C AATCTT2 G AATCCC AT ACCTG C23′,P2:5′2CTTG TCTTTGG T2 G AAGGG TCTG23′(G ibco)。PAI21及t2PA活性测定试剂盒购自上海太阳生物技术公司。纯种哈尔滨大白兔购于哈尔滨兽医研究所。
1.2 纤溶酶原激活物抑制剂1反义核苷酸的构建
提取人外周血基因组DNA,参照基因克隆手册进行PAI21特异片段扩增。聚合酶链反应(poly2 merase chain reaction,PCR)体系:1.0μg基因组DNA 做模板、引物P1、P2各20pm oL,5μL10×T ag DNA 聚合酶缓冲液,dNTP(pH8.3)各320μm olΠL。PCR 反应条件:94℃变性50s→56℃退火50s→72℃延伸50s,30个循环,延伸10min。PCR产物10μL用1. 5%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5mgΠL)电泳检查,紫外灯下观察结果。测定PAI21核酸序列。
纤溶酶原激活物抑制剂1片段产物克隆:将PCR纯化产物用T4连接酶与p GE M2T Vector连接。氯化钙法制备T op10感受态细菌。连接产物转化感受态细菌,取10m L转化菌,涂布于已制备好的蓝白筛选LB平板上,37℃培养4h。挑取白色菌落,扩
增培养。提取质粒DNA,分别用相应插入片段引物进行PCR,确定克隆产物含有所需片段。进行DNA 循环测序,确认质粒多克隆位点内确有所需PAI21顺序插入,并证实碱基顺序与原始序列一致。
纤溶酶原激活物抑制剂1反义表达载体的定向克隆:用ApaI和PstI对p GE M2PAI21重组质粒和pcDNA3.1(-)质粒进行双酶切。电泳回收目的基因片段和载体片段,T4连接酶连接。转化入感受态细菌,以含Am p的LB培养基选择培养,次日挑选阳性菌落,小量提取质粒,酶切鉴定重组子。大量提取质粒,以核酸纯化试剂盒纯化。以载体自身引物T7 Primer和目的片段特异引物P1、P2为引物进行PCR。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR循环测序鉴定插入的目的片段。
1.3 反义纤溶酶原激活物抑制剂1RNA质粒的扩增和提取
参照文献[2],采用碱裂解法进行反义PAI21 RNA质粒的扩增和提取。
1.4 动物分组
纯种哈尔滨大白兔30只,体重2.0±0.4kg,按性别、体重随机分成4组。正常对照组(n=7)饲以普通颗粒饲料;动脉粥样硬化对照组(简称As组) (n=7)喂饲高胆固醇颗粒饲料;反义PAI21RNA治疗组(简称治疗组)(n=9)喂饲高胆固醇饲料,同时,每周给予皮下注射反义PAI21RNA重组质粒20μgΠkg;反义PAI21RNA质粒组(简称质粒组)(n=7)饲以普通颗粒饲料,每周给予皮下注射反义PAI21 RNA重组质粒20μgΠkg。动物单笼饲养,每日进食量约为150g,饮水不限,实验中每日观察动物进食和行为变化,定期称体重、抽血,实验共12周。各组动物全部存活,生长发育良好。实验过程中各组动物同期体重增加无显著差异。
1.5 纤溶酶原激活物抑制剂1、组织型纤溶酶原激活剂活性和血脂水平的测定
各组实验前及实验过程中每2周由兔耳缘静脉采血2m L。采血时间为上午9～12时,以4%枸椽酸钠抗凝(9∶1),放于-4℃离心机中以4000rΠmin 离心5min,取血浆200μL分装后放于-70℃冰箱中保存,用发色底物法测定t2PA和PAI21活性。
实验前及实验过程中,每月由兔耳缘静脉采血3m L,室温下4000rΠmin离心10min,取血清1.5m L 测总胆固醇、高密度脂蛋白和甘油三酯水平。
1.6 病理及免疫组织化学检查
12周后空气栓塞处死家兔,取主动脉直至骼动
脉分叉处,剪断,彻底清除其周围结缔组织,包埋固定,切片,HE 染色,显微镜下观察。将组织漂洗固
定,加入PAI 21抗体(山羊抗人抗体)和生物素化二抗,DAB 显色,显微镜下观察。1.7 统计学方法
定量资料以x ±s 表示,应用t 检验和方差分析、q 检验,P <0.05表示差异有显著性,P <0.01表示差异有非常显著性。
2 结果
2.1 纤溶酶原激活物抑制剂1反义表达载体的定
向克隆
纤溶酶原激活物抑制剂1目的片断与pcDNA3.
1线性质粒载体连接后,用目的片断特异引物进行PCR 扩增反应,证实质粒内存在有插入片段。进一
步采用末端测序方法对克隆的表达质粒进行测序分
析,结果证明插入顺序无缺失和错配,并存在S D 序列和起始密码子ATG 位点,插入方向为反向插入。2.2 纤溶酶原激活物抑制剂1及组织型纤溶酶原
激活剂活性的变化
与实验前比较,治疗组与质粒组PAI 21活性降低(P <0.01),而As 组活性增加(P <0.05)。t 2PA 活性在治疗组与质粒组明显升高(P <0.01),As 组降低(P <0.05)(图1,Figure 1)
。
图1.各组纤溶酶原激活物抑制剂1和组织型纤溶酶原激活
剂活性的变化
图中实线为组织型纤溶酶原激活剂,虚线为纤溶酶原激活物抑制剂1。 与各组实验前比较,3:P <0.05,33:P <0.01。
Figure 1.The ch anges of plasminogen activator inhibitor 21and tissue plasminogen activation in four groups
2.3 各组血脂的变化
实验前各组总胆固醇、高密度脂蛋白和甘油三
酯水平无差别(P >0.05)。第12周时除正常对照组与质粒组间无差别外其余各组间总胆固醇均有明显差异(P <0.05),正常对照组与质粒组、治疗组与质粒组、正常对照组与治疗组间甘油三酯无差别(P >0.05),其余各组间甘油三酯有极显著差异(P <0.01),高密度脂蛋白注射前及第12周末各组间均无差异(P >0.05)。
表1.各组血清总胆固醇、高密度脂蛋白和甘油三酯水平的变化(x ±s )
T able 1.The ch anges of total cholesterol ,high density lipopro 2tein and triglyceride in each group (x ±s )组别(n )总胆固醇
(mg ΠL )高密度脂蛋白
(mg ΠL )甘油三酯
(mg ΠL )正常组(7)
实验前 5.7±2.3 2.2±0.8 5.4±2.9第12周
5.2±2.0bc 2.7±1.0 5.8±3.2f As 组(7)
实验前 5.7±2.3 2.4±0.8 5.1±1.2第12周
123±12acd 2.1±0.846±29egh 治疗组(9)实验前 5.2±1.8 2.6±0.9 5.4±1.5第12周
96±42abd 2.0±1.115±10f 质粒组(7)
实验前 5.6±1.5 2.7±0.6 5.0±2.6第12周
4.9±1.8bc
1.6±0.4
6.0±2.6f
P <0.05,a :与正常组比较,b :与As 组比较,c :与治疗组比较,d :
与质粒组比较。P <0.01,e :与正常组比较,f :与As 组比较,g :与治疗组比较,h :与质粒组比较。
2.4 病理观察及免疫组织化学测定
大体标本观察正常组和质粒组均未见到动脉粥样硬化斑块形成,而As 组与治疗组从主动脉至骼总动脉均可见不同程度的动脉粥样硬化斑块形成,但治疗组斑块面积要小于As 组,且As 组中4只家兔有肾梗死形成,而治疗组中家兔无肾梗死形成。肉眼上,心、脑等组织无明显差异。镜下:正常组和质粒组动脉相似,无明显病变(图2a ,Figure 2a )。As 组动脉内膜明显增厚,部分内皮细胞脱落,内膜中见大量泡沫细胞(图2b ,Figure 2b )。治疗组动脉内膜增厚,内可见少量泡沫细胞(图2c ,Figure 2c )。
免疫组织化学测定观察PAI 21蛋白表达情况,
其中棕褐色物质为阳性表达产物。正常组和质粒组未见PAI 21蛋白表达。As 组动脉内皮细胞、中膜平滑肌细胞和内膜中泡沫细胞表达均为阳性(图3a 、b 、c ,Figure 3a 、b 、c )。治疗组仅内皮有少量表达(图3d ,Figure 3d )。
图2.动脉病理结果(HE 染色) a :正常组和质粒组(20倍);b :As 组(10倍)动脉内膜明显增厚,部分内皮细胞脱落,内膜中见大量泡
沫细胞;c :治疗组(10倍),动脉内膜增厚,内可见少量泡沫细胞。
Figure 2.P atho 2anatomy results of the artery (HE dye
)
图3.动脉免疫组织化学结果
棕褐色物质为阳性表达产物。 a ,b ,c :分别为As 组动脉内皮细胞(10×3.3倍)、中膜平滑肌细胞(40×3.3倍)和内膜中泡沫细胞(40×3.3倍),表达均阳性;d :治疗组(20×3.3倍),仅内皮少量表达。
Figure 3.Immunohistochemistny results of the artery
3 讨论
内源性纤溶活性降低导致微血栓形成和血栓沉积,从而可能导致As 和冠状动脉综合征。内源性纤溶活性主要由PAI 21调节,增加的PAI 21活性导致内源性纤溶活性降低已被证实为是心血管疾病的一个重要独立的风险因素。越来越多的研究表明:血浆PAI 21活性升高与动脉及血栓性疾病的发生有关
[3],
且可能参与球囊血管成形术后血管的损伤过程[4]
。PAI 21可以通过促进细胞外基质聚集,促进血栓形成
和调节平滑肌细胞迁移和增殖而促进As 发展
[5]
。
我们旨在将反义PAI 21RNA 重组质粒移植于家兔体内,通过反义RNA 与特异的mRNA 分子互补结合来调控PAI 21基因表达,希望以此方法在一定程度上调节PAI 21的活性,寻找动脉粥样硬化基因治疗的
一个可行办法。
实验表明,反义PAI 21RNA 通过直接注射到家兔体内(治疗组和质粒组),其PAI 21血浆活性可见降低,说明方法有效,反义RNA 在家兔体内发挥作用。在转录水平上封闭了PAI 21mRNA ,使其表达减少。虽然其活性有一定波动性,但随时间延长,仍呈下降趋势,考虑为应用直接注射重组质粒到动物体内,由于体内一些酶类及其他物质作用,该法稳定性欠佳,但通过重复注射,仍可以取得一定的效果。随PAI 21活性下降,t 2PA 活性呈上升趋势,考虑为PAI 21表达减少而致t 2PA 水平增高。t 2PA ΠPAI 21比值升高,纤溶功能增强。
另外,免疫组织化学测定显示正常组和质粒组未见PAI 21表达,其原因很可能是由于所选用抗体为山羊抗人抗体,特异性欠佳,在PAI 21活性较低
时,因抗原量少而未见表达。但从PAI21活性变化趋势上来看,质粒组明显下降说明反义PAI21RNA 发挥了作用,封闭了PAI21mRNA,使其表达减少。而As组与治疗组见到表达是由于喂饲高胆固醇饲料造成动物动脉粥样硬化,虽抗体特异性欠佳,但由于PAI21表达增高,仍可测到。这说明:①动脉粥样硬化形成与PAI21增多密切相关;②反义PAI21 RNA能够在转录水平上封闭PAI21mRNA,使其表达减少。
临床研究表明,血浆PAI21水平与血脂关系密切相关,甘油三酯和胆固醇增加,高密度脂蛋白降低可能影响t2PA降低,PAI21增加,其中甘油三酯对PAI21影响最为显著,PAI21与甘油三酯呈明显的正相关[6,7]。本实验结果亦支持这一观点,且表明应用反义PAI21RNA在一定程度上可以抑制血脂的升高,减轻动脉粥样硬化病变的程度。但这一作用是通过降低血脂而减轻动脉粥样硬化,还是通过影响动脉粥样硬化其他因素而使血脂降低,尚需进一步研究。
本研究将反义PAI21RNA重组质粒直接注射移植到家兔体内,发现家兔血脂水平明显低于动脉粥样硬化对照组且动脉粥样硬化程度轻于后者。但是单纯应用反义PAI21RNA并未彻底预防动脉粥样硬化的发生,可能原因为①动脉粥样硬化性疾病并非单基因遗传病且与多因素相关,单纯封闭某一种基因并不能阻止其发病,而只能减轻病变程度;②应用质粒的直接注射法,虽然通过简单的重复注射可以维持效果,但基因整合的效率尚低,这需要进一步地寻找更为有效的表达载体和转移途径;③封闭效率能否与反义质粒的用量呈剂量相关性,故而进一步增加反义质粒的用量能否增加疗效需进一步实验证实。
基因治疗已被用于防治由基因缺失、突变或过度表达而导致的疾病。本研究将反义PAI21RNA重组质粒直接注射到家兔体内,观察其在体内表达情况,发现家兔血浆PAI21活性明显下降,t2PA活性升高,PAI21蛋白表达受到抑制,血脂降低,动脉粥样硬化程度减轻。通过简单的重复注射可以维持效果,这为我们寻找预防As性疾病的新方法提供了一定的思路。
参考文献
[1] G ardemann A,Lohre J,K atz N,T illmanns H,Hehrlein FW,Haberb osch W.
The4G4G gen oty pe of the plasmin ogen activator inhibitor4GΠ5G gene polym or2 phism is ass ociated with coronary atherosclerosis in patients at high risk for this disease. Thromb Haemost,1999,82(3):11212126
[2] 谷志远. 现代医学分子生物学. 北京:人民军医出版社,1998,3872
396
[3] De Y oung M B,T om C,Dichek DA. Plasmin ogen activator inhibitor ty pe1in2
creases neointima formation in balloon2injured rat carotid arteries. Circulation, 2001,104(16):19722981
[4] 陈晓文,戚文航. 球囊血管成形术后纤溶酶原激活物抑制剂21基因的
表达. 中国动脉硬化杂志,2001,9(3):2512252
[5] Zhu Y,Farrehi P M,Fay WP. Plasmin ogen activator inhibitor ty pe1enhances
neointima formation after oxidative vascular injury in atherosclerosis2prone mice.
Circulation,2001,103(25):31052110
[6] Sarkar R,Misra A,Saxena R,Pandey R M,Chaudhary D. Plasmin ogen activa2
tor inhibitor1activity in n orm oglycemic hy pertriglyceridemic n orth Asian Indian subjects:a preliminary case2control study. Indian H eart J,2001,53(1):612 65
[7] 黄秋霞,姜德谦. 冠心病患者血清甘油三酯水平与纤溶激活系统的关
系. 中国动脉硬化杂志,2001,9(4):3132315
(此文编辑 朱雯霞)
?会议征文?
首届国际腔内血管学大会
由上海长海医院血管外科、心内科和脑外科联合举办的首届国际腔内血管学大会(Endovascology2Ⅰ)将于2003年11月21～24日在上海召开。会议将针对全身血管系统疾病的腔内诊治进行专题讨论和手术演示。特邀请来自美、英、韩、意、澳、日等相关领域的国际领军人物就该专业的热点和前沿问题进行专题演讲,同时结合典型和特殊病例进行现场手术演示。凡是有关血管腔内诊治的文章均欢迎投稿。有关血管腔内治疗的术前评估、术中操作技巧、术中术后并发症的发现和处理将是研讨的重点。
投稿请寄:上海市长海路174号,长海医院血管外科曲乐丰医师收,邮编200433。信封左下角请注明“会议征文”字样。大会交流语言可用中文或英文,会议论文摘要必须为英语,并附软盘。
投稿截止日期为2003年10月15日。
注射用重组人TNK组织型纤溶酶原激活剂说明书
注射用重组人TNK组织型纤溶酶原激活剂说明书 【药品名称】通用名称：注射用重组人TNK组织型纤溶酶原激活剂 商品名称：铭复乐 英文名称：Recombinant Human TNK Tissue-type Plasminogen Activator for Injection(rhTNK-Tpa) 【成份】本品活性成份是重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体，是通过基因工程技术获得的一种基因重组蛋白。 辅料：精氨酸、磷酸、聚山梨酯80和注射用水。 【性状】白色疏松，复溶后为无色澄明液体。 【适应症】用于发病6小时以内的急性心肌梗死患者的溶栓治疗。 【用法用量】本品应当由具有溶栓治疗经验的医师开具处方。应当在急性心肌梗死的临床症状发生后尽早开始给药。用于ST段抬高型急性心肌梗死的溶栓治疗，单次给药16毫克。将16毫克rhTNK-tPA（1支）用3毫升无菌注射用水溶解后, 弹丸式静脉注射给药，在5～10秒完成注射。注意：加入无菌注射用水后轻轻摇动至完全溶解，不可剧烈摇荡，以免rhTNK-tPA溶液产生泡沫，降低疗效。溶解后的本品应单次静脉推注，其注射时间应超过5秒。本品溶解后应立即使用。如果没有立即使用，应避光冷藏保存在2～8℃并在8小时内使用。 合并用药：肝素：参照相关指南执行。 抗血小板药物：阿司匹林和氯吡格雷的用法参照相关指南执行。 【不良反应】本品临床试验中的不良事件：与其他溶栓药物相同，本品临床研究中最常见的不良反应是出血，包括颅内出血和其他少量出血不良事件。 【药理作用】本品的性成份是一种糖蛋白，可直接激活纤溶酶。当静脉给药时，其在循环系统中表现出相对非活性状态，与纤维蛋白结合后被激活，诱导纤溶酶原转化为纤溶酶，导致纤维蛋白降解和血块溶解。 【禁忌】【注意事项】等详见说明书。 【保存和运输】2~8℃避光保存和运输。 【包装】本品直接接触药品的包装材料：10ml注射剂瓶，10ml注射剂瓶冻干胶塞。 包装规格：1支/盒。 【有效期】12个月。 【批准文号】国药准字S2*******
重组组织型纤溶酶原激活剂治疗急性心肌梗死
重组组织型纤溶酶原激活剂治疗急性心肌梗死 发表时间：2011-05-27T15:24:25.873Z 来源：《中外健康文摘》2011年第8期作者：潘欣刘亚娟[导读] 目的观察重组组织型纤溶酶原激活剂(rt—PA)治疗急性心肌梗死(AMI)的临床疗效。潘欣刘亚娟（黑龙江省嫩江县人民医院 161400） 【中图分类号】R542.2+2 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085 (2011)8-0089-02 【摘要】目的观察重组组织型纤溶酶原激活剂(rt—PA)治疗急性心肌梗死(AMI)的临床疗效。方法对所选病例在常规治疗的基础上早期使用rt—PA溶栓治疗。结果 rt—PA治疗急性心肌梗死疗效显著。结论 rt—PA治疗急性心肌梗死可降低患者的年并发症，减少病死率，临床上值得推广。 【关键词】急性心肌梗死重组组织型纤溶酶原激活剂血栓 心肌梗死是在冠状动脉粥样硬化基础上，血管内血栓形成或冠状动脉持续痉挛，造成血管内闭塞，使部分心肌发生严重缺血坏死，进而产生一系列严重临床症状和特征。以持续胸骨后疼痛和典型心电图变化为特征，常出现血压降低，各种心律失常、休克、消化道症状，心力衰竭等症状，如不及时抢救可发生死亡。冠脉溶栓、静脉溶栓及PTCA术近年来治疗急性心肌梗死取得突破性进展，但由于条件受限，基层医院无法进行冠脉溶栓、PTCA术，而静脉溶栓术简便、有效、易操作，使其在临床上易于推广。将2004年至2009年应用重组组织型纤溶酶原激活剂(rt—PA)溶栓治疗急性心肌梗死54例报告如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料：2004年至2009年,急诊心肌梗死(AMI)患者54例，其中男30例，女24例，年龄45-75岁，平均63岁。既往冠心病史22例，高血压病史12例，糖尿病史10例，无相关病史12例。发病时间为3—8 h。梗死部位：前间壁24例，前壁18例，下壁10例，下壁+右室2例。均符合以下标准[1]：①持续胸痛I>30 min，含化硝酸甘油不缓解，临床诊断为AMI。②发病时问≤6 h。③两个或两个以上相邻联导联sT段抬高，胸导联≥0．2 m／ii，肢导联I>0.1 ITlln。④血压(BP)≤160／100 mrfl Hg(1 toni Hg：0.133 kPa)。⑤无溶栓禁忌证。 1.2 治疗方法：溶栓前先用肝素5000 U静脉注射后，rt—PA100 mg在90 min内静脉给予：先静脉推注15 mg，继而30 min静脉滴注50 mg，其后60 min内再滴注35 mg，用rt—PA后，肝素改为7500 U皮下注射，每l2小时1次，连续用3-5 d。同时每日口服阿司匹林0.3 g，3 d 后阿司匹林改为50 mg／d，长期服用。 1.3 判断溶栓成功的指标[2]：①电图抬高sT段在溶栓开始后2 h内回落>50％。②胸痛在在溶栓开始后2h内基本消失。③出现再灌注性心律失常：在溶栓开始后2h可出现加速性室性自主心律，房室传导阻滞或束支传导阻滞突然改善或消失，下壁梗死者可出现窦性心动过缓、窦房阻滞。④血清酶峰提前出现，CK—MB酶峰提前增高在16 h内。具备上述四项中两项或以上者判定为再通，但第2项与第3项组合不能成为判定标准。 1.4 观察指标：①胸痛的程度。②心电图改变。③心律的变化。④血清心肌酶的变化。⑤不良反应：出血倾向，变态反应，低血压。 2 结果 54例患者经溶栓治疗2h后，其中42例患者胸痛明显缓解(77.7％)，19例患者抬高的sT回落(70.3％)，14例患者出现再灌注心律失常，36例患者心肌酶高峰出现在10-12 h，2例在>12-16 h，16例在>16-24h，经临床综合判断，46例患者梗死的血管再通，再通率85.2％，54例患者经溶栓治疗后，有20例出现心律失常(包括7例再灌注心律失常)，无致命性心律失常出现。10例患者(18.5％)出现一过性出血症状，均为皮肤黏膜出血。2例患者(3.70％)出现再梗死，4例出现心源性休克(7.37％)，4周后观察，预后良好者44例(81.46％)，死亡2例(3.70％)。 3 讨论 实验研究表明[3]，心肌氧供应停止数小时，心肌细胞会大量死亡，在狗的试验中发现，结扎冠状动脉l5-30 min无灌注区心内膜下心肌细胞开始坏死，并逐渐向外膜扩展，3-6 h波及心外膜下心肌，缺血心肌经早期再灌注能终止这一过程，有效挽救濒死但仍存活的心肌。一些干预性研究表明，溶栓治疗的时间与心肌梗死面积、死亡率具有密切相关性。急性心肌梗死是内科常见的疾病，发病急，变化多样，死亡率高。大部分患者是在冠状动脉粥样硬化的基础上形成血栓，使冠状动脉闭塞而导致心肌发生急性缺血缺氧。目前心肌梗死患者的死亡多是由心肌梗死引起心力衰竭、心律失常或心脏破裂。心肌梗死的范围是决定患者预后的主要因素，限制心肌梗死范围最有效的方法是早期恢复冠状动脉血流。目前治疗心肌梗死的有效方法包括经皮冠状动脉成形术加放置支架和药物溶栓疗法。基层医院由于技术条件的限制多采用药物溶栓疗法。rt—pA对纤维蛋白具有选择特性[4]，它主要溶解已形成血栓的纤维蛋白，而对血浆中的纤维蛋白原作用较弱，故一方面它可以迅速溶解血栓，使阻塞的血管再通；另一方面对整个凝血系统作用轻微，因而不会出现严重的出血倾向。本组用rt—PA溶栓治疗急性心肌梗死54例，再通率85.2％，溶栓效果明显，不良反应较轻，在临床上值得推广。需要提出的是，静脉溶栓1周后，患者病情稳定建议转有条件医院进行冠脉造影，进一步PTCA术，以解决冠脉狭窄，有利于防止心肌再梗死的发生，提高患者的生活质量。参考文献 [1]叶任高,陆再英.内科学[M].6版.北京:人民卫生出版社，2004：294． [2]中华心血管病杂志委员会.急性心肌梗死溶栓法参考方案[J].中华心血管病杂志，1996，24(5)：318-329． [3]赵水平,胡大一.心血管病诊疗指南解读[M].北京：人民卫生出版社，2004：100—103． [4]余巧燕,孙晋民溶栓药物的研究进展[J].医学理论与实践，2009，1：56．
组织型纤溶酶原激活剂及其抑制剂与肺血栓栓塞症
!!作者单位"%%###%沈阳#中国医科大学附属第一医院呼吸疾病研究所 通讯作者"田莉莉 组织型纤溶酶原激活剂及其抑制剂与肺血栓栓塞症 孙秀娜!田莉莉 !!! 摘要"!肺血栓栓塞症%Z .\&的发病与机体的纤溶和凝血系统功能密切相关$组织型纤溶酶原激活物%2W Z R &及其抑制物%Z R P W %&因调节机体的纤溶系统而在静脉血栓形成及栓塞性疾病的发病机制中发挥重要作用#因此#本文对2W Z R 和Z R P W %与Z .\的关系作如下综述$ !关键词"!肺血栓栓塞症’ 组织型纤溶酶原激活物’组织型纤溶酶原激活物抑制剂W %9/"&(#,$’1#32/(;//$(#’’)/3"&’G #$,./$&%(#7&(,0&$*3"&’G #$,./$&%(#7&(,0#$1#2#(,0&$*3)"G ,$&0+(10,G 2,/G 2,"#’G !&I $G +()-,#P C #$L +)?+0C -:5+5(527892:3+4,574;<2=+>+-2#5’2O +4:5"7:3 +5,?#88+?+,52=57@’+-,<2=+>,?I -+M 24:+5;#&’2-;,-.%%###%#@’+-,@7442:37-=+-., (5’74"P C #$L +)?+!42’(0&%("!.7156>5016>1/<@;:4/693C 273/4=/14=/:5?4%Z .\&5?9??/>59210D 527271=9:96>1=12D 116<5=356/:C ?5?960>/9A ;:925/6+R ?931?;:2/<27131A ;:925/656271<5=356/:C 25>?C ?214#2??;1@:9?456/A 169>25892/3%2W Z R &960@:9?456/A 169>25892/35675=52/32C @1%%Z R P W %&@:9C 9654@/329623/:156271@927/A 161?5?/<816/;?273/4=/?5?96014=/:5?4+.7;?#275?31851D5?9=/;227131:925/6?75@=12D 1162W Z R #Z R P W %960Z .\+ !:/+;,0*’"!Z ;:4/693C 273/4=/14=/:5?4’.5??;1@:9?456/A 169>25892/3’Z :9?456/A 169>25892/35675=52/3W % !!肺血栓栓塞症%@;:4/693C 273/4=/14=/:5?4#Z .\&系指来自静脉系统或右心的血栓栓子阻塞肺动脉或其分支引起肺循环和呼吸功能障碍的临床和病理生理综合征$引起Z .\的血栓栓子主要来源于深静脉血栓形成%]S .&#Z .\常为]S .的并发症#二者共属于静脉血栓栓塞症%S .\&$Z .\作为一种涉及医学界诸多学科和领域的常见病(多发病和高病死率的疾病#已被公认是一重要的国际化医疗保健问题$近年来#对Z .\的各项基础与临床研究正在成为医学界的热点之一$ 目前#]W 二聚体已经应用于临床来诊断Z .\$]W 二聚体是血栓形成+纤维蛋白降解过程的最终衍生物之一$当凝血酶激活纤维蛋白原%<5=356/A 16#V A &#纤维蛋白%<5=356#V =&形成时#血浆组织型纤溶酶原激活剂%25??;12C @1@:9?456/A 169>25892/3#2W Z R &水平升高#继而2W Z R 激活血浆纤溶酶原%@:9?456/A 16#Z :A &转变为纤溶酶%@ :9?456#Z :4&#Z :4裂解V =#V =降解产物之一则是]W 二聚体$在血液循环中#通过纤溶酶原激活剂抑制剂W %%Z :9?456/A 169>25892/35675=52/3W %#Z R P W %&抑制2W Z R 及3(W 抗纤溶酶%3(W 9625@:9?456#3(W R Z &抑制游离Z :A 来共同调节纤溶过程$除了血液高凝状态#纤溶系统激活对于]W 二聚体水平的增加也是必要的$纤溶系统激活意味着2W Z R 必须释放到血液中#由此引导探讨临床Z .\患者的纤溶系统激活剂 2W Z R 及其抑制剂Z R P W %的水平)%* $
重组组织型纤溶酶原激活剂早期静脉溶栓对
重组组织型纤溶酶原激活剂早期静脉溶栓对 目的探讨重组组织型纤溶酶原激活剂早期静脉溶栓对急性脑梗死的治疗效果。方法收集我院2014年3月～2015年9月入院的40例急性脑梗死患者按随机数字法分为两组。对照组患者给予常规活血化瘀治疗，实验组患者采取重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）0.8 mg/kg静脉溶栓治疗。结果实验组患者治疗痊愈率明显性高于对照组患者，存在明显性差异，具有统计学意义（P＜0.05）；实验组患者治疗总有效率明显性高于对照组患者，存在明显性差异，具有统计学意义（P＜0.05）；实验组患者治疗后1、7、14 d NIHSS评分分别与对照组行组间比较，显著性低于对照组患者NIHSS评分，存在显著性差异，具有统计学意义（P＜0.01）。结论重组组织型纤溶酶原激活剂早期静脉溶栓对急性脑梗死的治疗效果显著。 Abstract：Objective To investigate the therapeutic effect of early intravenous thrombolysis with recombinant tissue type plasminogen activator in patients with acute cerebral infarction.Methods In our hospital from March 2014 to September 2015，40 patients with acute cerebral infarction were randomly divided into two groups according to the random number method.The control group were treated with routine blood circulation treatment，the patients in the experimental group take of plasminogen activator recombinant tissue type plasminogen activator（RT PA）agent 0.8 mg/kg intravenous thrombolytic therapy.Results Patients in the experimental group treatment cure rate was significantly higher than that of the control group，there was a significant difference，with statistical significance（P＜0.05）；treatment，the patients in the experimental group the total efficiency is obviously higher than that of the control group，there was a significant difference，with statistical significance（P ＜0.05）.After treatment，the patients in the experimental group 1，7，14，NIHSS score respectively and the control group，group，significantly lower than control group patients NIHSS score，there are significant differences，with statistical significance （P＜0.01）.Conclusion Early intravenous thrombolysis with recombinant tissue type plasminogen activator has significant effect on the treatment of acute cerebral infarction. Key words：Recombinant tissue type plasminogen activator；Early intravenous thrombolysis；Acute cerebral infarction 急性脑梗死是由各种原因所致的局部脑组织区域急性血液供应障碍，导致脑组织缺血缺氧性病变坏死，进而产生临床上对应的失神经功能表现，常导致死亡[1]。有研究表明进行溶栓治疗的关键是药物的选择[2]。将我院40例患者进行临床观察，现报道如下。 1 资料与方法 1.1一般资料收集我院2014年3月～2015年9月入院的40例急性脑梗死
纤溶系统之组织型纤溶酶原活化剂t-PA介绍
纤溶系统之组织型纤溶酶原活化剂t-PA介绍近年来，由于血栓性疾病的逐年上升，对溶栓药物的需求量逐年增加，使对溶栓药的研究成为热点，而又以对组织型纤溶酶原激活物（tPA）及其突变体、嵌合体的研究最多。 今天，我们就来一起了解一下什么是t-PA。 t-PA又称纤溶酶原激活因子，是体内纤溶系统的生理性激动剂，在人体纤溶和凝血的平衡调节中发挥着关键性的作用。是人类血液中存在的两种纤溶酶原活化剂之一。血浆中的浓度很低，但几乎所有的组织中都含有数量不等的t-PA，其中以子宫、肺、前列腺、卵巢、甲状腺和淋巴结中的含量最高，但肝中无t-PA。 t-PA合成部位 t-PA主要由内皮细胞合成，与血管性血友病因子vWF一起储存在Weibel-Palade小体中，其他细胞如单核细胞、巨核细胞、间皮细胞、肥大细胞、血管平滑肌细胞、心肌成纤维细胞、神经元也可合成t-PA。许多
药物、物理因素及药物可影响t-PA产生。下肢静脉流体静力压增高时，t-PA的产生减少。 t-PA的半衰期很短，只有5-7分钟，在血浆中很快被清除。游离的 t-PA通过肝脏内皮细胞及肝巨噬细胞的甘露糖受体被清除，与纤溶酶原活化抑制物-1（PAI-l）结合的t-PA是通过肝细胞的低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP）清除。雌激素可诱导甘露糖受体表达，增加t-PA的清除率。 t-PA基因及蛋白结构 t-PA位于8p11-pI2，全长32.7kb，含14个外显子和13个内含子，cDNA含2530bp。 成熟的t-PA是一种含527个氨基酸的糖蛋白，分子量约为68-72kD。分泌至细胞外时，t-PA呈单链（sct-PA），但很容易被纤溶酶在精氨酸275-异亮氨酸276处水解，转化为由二硫键相连的双链t-PA（tct-PA）。二者的结构虽发生转化，但均具有酶切活性。二者生物学特征区别在于： ①单链t-PA与纤维蛋白之间的亲和力比双链高。 ②双链t-PA的纤溶酶原激活能力比单链t-PA高10-50倍。 ③双链t-PA被PAI-11灭活比单链快100倍。 tct-PA氨基端为重链，亦称为A链，竣基端称为轻链或B链。重链依次含有指状结构（Fl）、上皮生长因子（EG）区及两个环饼状区（KRl和KR2），氨基端可以是甘氨酸或丝氨酸。轻链是蛋白酶区，与其他丝氨酸蛋白酶有同源性（指状结构区，由6-43位氨基酸残基构成，此区的功能与t-PA和纤维蛋白结合有关。尿激酶无此结构区，故与纤维蛋白不能结合。如果用蛋白酶将t-PA氨基酸末端除去一个12kD的片段，则较野生型
重组人组织型纤溶酶原激活物使用说明
重组人组织型纤溶酶原激活物使用说明 药品名称（包括商品名、通用名） 重组人组织型纤溶酶原激活物 用法用量 本品在使用前应先用附带的稀释剂临时配制，浓度为1mg/m1。也可用等量的生理盐水或5％葡萄糖液进一步稀释成认0.5mg/ml溶液。静脉输注：成人总量为100mg，开始第1小时静滴60mg（开始1～2min可先静注6～10mg），第2和第3小时再分别静滴20mg。如体重（65kg 者，总量为L25mg/kg，按上述方法在3h内滴完。当剂量>150mg时，颅内出血的危险增加，不宜采用。用本品治疗的病人早期使用肝素并不能使梗塞的血管通畅，因此肝素的使用应推迟到本品治疗后90～120min。 药理作用 本品是通过基因重组技术生产的t-pA，天然组织型纤溶酶原激活物（t-PA）的性能相同，即能激活与纤维蛋白结合的纤溶酶原，使其转化为纤溶酶的作用比激活循环血液中纤溶酶原的作用大得多。主要作用是消化局部纤维蛋白凝块。 适应症 主耍用于发病6h以内的严重心肌梗死病人。 不良反应 本品不良反应较少，可有凝血障碍和出血、血细胞比容及血红蛋白降低：注射部位出血，偶见心律失常、体温升高。罕见血压下降、颅内出血、腹膜后出血、便血、血尿等。 制剂 粉针剂：20mg，50mg，分别附有稀释剂，注意有效期。 注意事项 本品无抗原性，可重复给药。70岁以上老人、出血性疾病、近3个月患消化性溃疡者、2周内进行过手术、口服抗凝药者、主动脉瘤患者、高血压患者、近期内发生过中风等应禁用或慎用。大剂量长时间给予本品，可逆转血循环中的抑制机制，而致全身性纤维蛋白原溶解。用药期间应严密观察病人，一旦发生不良反应或意外，及时抢救处理。
注射用重组人TNK组织型纤溶酶原激活剂说明书
核准日期：2015年1月14日 批准日期：2015年12月18日 注射用重组人TNK组织型纤溶酶原激活剂说明书 请仔细阅读说明书并在医师指导下使用 【药品名称】 通用名称：注射用重组人TNK组织型纤溶酶原激活剂 商品名称：铭复乐? 英文名称：Recombinant Human TNK Tissue-type Plasminogen Activator for Injection （rhTNK-tPA） 汉语拼音：Zhusheyong Chongzu Ren TNK Zuzhixing Xianrongmeiyuanjihuoji 【成份】 本品活性成份是重组人TNK组织型纤溶酶原激活剂，是通过基因工程技术获得的一种基因重组蛋白。 辅料：精氨酸、磷酸、聚山梨酯80和注射用水。 【性状】 白色疏松体，复溶后为无色澄明液体。 【适应症】 用于发病6小时以内的急性心肌梗死患者的溶栓治疗。 【规格】 ×107IU /16mg /支。 【用法用量】 本品应当由具有溶栓治疗经验的医师开具处方。应当在急性心肌梗死的临床症状发生后尽早开始给予本品治疗。 用于ST段抬高型急性心肌梗死的溶栓治疗，单次给药16毫克。将16毫克rhTNK-tPA（1支）用3毫升无菌注射用水溶解后,静脉推注给药，在5～10秒完成注射。 注意：加入无菌注射用水后轻轻摇动至完全溶解，不可剧烈摇荡，以免rhTNK-tPA 溶液产生泡沫，降低疗效。溶解后的本品应单次静脉推注，其注射时间应超过5秒。本品溶解后应立即使用。如果没有立即使用，应避光冷藏保存在2～8oC并在24小时内使用。 合并用药： 肝素：参照相关指南执行。 抗血小板药物：阿司匹林和氯吡格雷的用法参照相关指南执行。 【不良反应】 本品临床试验中的不良事件：
内源性组织型纤溶酶原激活物可对颅脑损伤起保护作用
内源性组织型纤溶酶原激活物可对颅脑损伤起保护作用 来自中国西安交通大学的宋锦宁团队最新研究发现，脑组织中内源性组织型纤溶酶原激活物在大鼠创伤性脑损伤后表达升高，通过立体定向侧脑室注射组织型纤溶酶原激活物抑制剂neuroserpin后，创伤性脑损伤后大鼠神经元凋亡增加，轴索损伤加重，小胶质细胞和星形胶质细胞激活增加，并且加重了创伤性脑损伤后的神经功能缺陷。 组织型纤溶酶原激活物目前被广泛应用于急性缺血性脑卒中的血管内溶栓治疗。内源性组织型纤溶酶原激活物由内皮细胞、神经元、星形胶质细胞及小胶质细胞等产生。除了其纤溶活性外，组织型纤溶酶原激活物参与多种生理病理过程。该研究通过使用组织型纤溶酶原激活物抑制剂neuroserpin，探讨了内源性组织型纤溶酶原激活物在创伤性脑损伤后的大鼠脑内的作用。 宋锦宁等发现，在创伤性脑损伤后，大鼠大脑皮质组织中组织型纤溶酶原激活物的表达升高，在损伤后3d达到高峰。通过立体定向侧脑室注射其抑制剂neuroserpin后，他们发现创伤性脑损伤后神经元凋亡增加，轴索损伤加重，星形胶质细胞及小胶质细胞激活增加。这些结果表明内源性组织型纤溶酶原激活物颅脑损伤中起到了保护作用。这为临床进一步研究内源性组织型纤溶酶原激活物在颅脑损伤中的作用提供了实验依据。 文章发表在《中国神经再生研究（英文版）》杂志2020年4期。 文章摘要：组织型纤溶酶原激活物常用于治疗急性缺血性卒中，但是内源性组织型纤溶酶原激活物对创伤性脑损伤的作用尚不明确。为此，实验设计以重物打击法建立创伤性脑损伤大鼠模型。(1)实验的干预方法：然后以立体定位注射侧脑室5μL组织型纤溶酶原激活物抑制剂neuroserpin （0.25mg/mL）；（2）实验的评估手段：以神经严重性评分评估神经功能，以苏木精-伊红染色和Bielschowsky银染法评估损伤脑组织中神经元和轴突损伤情况，以Western blot分析损伤脑组织中组织型纤溶酶原激活物的表达水平，以免疫组化染色分析损伤脑组织中凋亡标记物c-caspase3、神经元标记物神经丝蛋白轻链、星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白和小胶质细胞标记物Iba-1阳性反应，以免疫荧光双标记检测细胞凋亡的细胞类型，以TUNEL染色检测损伤皮质中细胞的凋亡情况，以Fluoro-Jade B染色检测损伤皮质中损伤的神经元；（3）结果显示：6h时组织型纤溶酶原激活物的表达增加，且在3d时达到峰值；创伤性脑损伤后出现大量的神经细胞凋亡和轴突损伤，且neuroserpin可进一步增加神经细胞凋亡、神经元损伤以及轴索损伤，同时还能激活小胶质细胞和星形胶质细胞。(3)neuroserpin进一步恶化创伤性脑损伤大鼠的神经行为表现；(4)结果表明：抑制内源性组织纤溶酶原激活剂可加重创伤性脑损伤后神经细胞凋亡和轴突损伤，活化小胶质细胞和星形胶质细胞。实验于2015年6月经陕西省动物实验生物医学伦理委员会批准，批准号SYXK[Shaan] 2015-002）。
大鼠纤溶酶原激活物抑制因子(PAI)说明书
大鼠纤溶酶原激活物抑制因子(PAI)酶联免疫分析(ELISA) 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆及相关液体样本中纤溶酶原激活物抑制因子(PAI)的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠纤溶酶原激活物抑制因子(PAI)水平。用纯化的大鼠纤溶酶原激活物抑制因子(PAI)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入PAI，再与HRP标记的羊抗鼠抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的PAI呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠纤溶酶原激活物抑制因子(PAI)浓度。 试剂盒组成： 试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份 封板膜2片（48）2片（96） 密封袋1个1个 酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：900ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存 样本处理及要求： 1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/ 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分