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原位杂交操作流程

原位杂交操作流程
原位杂交操作流程

原位杂交操作流程

1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天

1)二甲苯于37℃脱蜡2次,每次15分钟;

2)无水乙醇浸泡2次,每次3分钟;

3) 95%乙醇浸泡2次,每次3分钟;

4) PBS清洗3分钟;

5) 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟;

6) PBS清洗10分钟;

7)加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育15分钟;

8) PBS清洗2次,每次3分钟;

9) 0.2N的HCl孵育30分钟;

10)PBS清洗2次,每次3分钟;

11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟;

12)PBS清洗2次,每次5分钟;

13)预杂交缓冲液孵育30分钟;

14)准备核酸探针混合物:使用预杂交缓冲液稀释探针,85℃加热5分钟,置于冰块中10分钟;

15)杂交;第二天

16)将玻片置于SSC中2次,每次5分钟以去除封片;

17)PBS清洗3分钟;

18)RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中),37℃孵育30分钟;

19)PBS清洗5分钟;

20)室温,2×SSC清洗10分钟;

21)37℃,1×SSC清洗10分钟;

22)37℃,0.5×SSC清洗10分钟;

23)缓冲液A孵育10分钟;

24)缓冲液A(1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟;

25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液,来自Boehringer Mannheim),37℃孵育3 小时;

26)缓冲液A清洗2次,每次10分钟;

27)缓冲液B清洗2次,每次5分钟;

28)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟,显微镜下进行观察,如果背景尚佳,显色时间可延长到16小时;29)停止缓冲液B的反应,用水进行简单的清洗;

30)固红,脱水以及封片进行核的复染。

2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天

1)二甲苯于37℃脱蜡2次,每次15分钟;

2)无水乙醇浸泡2次,每次5分钟;

3) 95%乙醇浸泡2次,每次5分钟;

4) PBS清洗5分钟;

5) 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟;

6) PBS清洗5分钟;

7)加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育10分钟;

8) PBS清洗2次,每次5分钟;

9) 0.2N的HCl孵育30分钟;

10)PBS清洗2次,每次5分钟;

11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟;

12)PBS清洗5分钟;

13)预杂交缓冲液孵育30分钟;

14)准备寡核苷酸探针混合物:使用预杂交缓冲液稀释探针;

15)杂交;第二天

16)将玻片置于SSC中以去除封片;

17)室温,2×SSC清洗10分钟;

18)37℃,1×SSC清洗10分钟;

19)37℃,0.5×SSC清洗10分钟;

20)缓冲液A孵育10分钟;

21)缓冲液A孵育30分钟;

22)加入抗地高辛抗体37℃孵育3小时;

23)缓冲液A清洗2次,每次5分钟;

24)缓冲液B清洗2次,每次5分钟;

25)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟,显微镜下进行观察,如果背景尚佳,显色时间可长到16小时;26)停止缓冲液B的反应,用水进行简单的清洗;

27)固红,脱水以及封片进行核的复染。

FISH步骤

1、脱蜡:

1)二甲苯脱蜡3次,每次5min;

2)100%酒精两次,每次2min;

3)移出酒精,斜置切片,标记末段向下,空气干燥。

2、蛋白酶处理:

1)每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液,配制方法如下:2×SSC 40ml倒人Facal管,在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内,摇动直到酶溶解。

2)37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。

3)×SSC在室温下漂洗切片3次,每次1min。

4)梯度酒精脱水(-20℃预冷)。

3、变性:

1)每一个立式染色缸配制40ml变性溶液;

2)78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸;

3)78℃孵育8min;

4)即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min,再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内,每缸2min;

5)空气干燥。

4、杂交:

1)准备探针;

2)取一个较大的湿盒,交叉放置切片;

3)滴10μl探针在切片的组织上,加盖玻片;

4)盖上湿盒盖,37℃孵育12h~16h。

杂交后的水洗:

5)镊子小心去除盖玻片;

6)43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min;

7)2×SSC(37℃)洗两次,每次10min;

8)切片放人染色缸的1×PBS内待检测,勿使切片干燥。

检测:

9)从1×PBS中取出切片,除去过多的水分,避免标本干燥。把切片放入湿盒内,同时处理4张切片。10)每张切片使用30μl~60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素,室温下孵育20min;

11)去掉塑料盖膜,把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次,每次2min。

扩增:

12)从1×PBS中取出切片,斜置切片使液体排出;

13)每张切片滴30μl~60μl抗-卵白素抗体,加塑料盖膜,室温孵育20min;

14)去掉塑料盖膜,把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次,每次2min;

15)从1×PBS中取出切片,斜置切片使液体排出;

16)每张切片滴30μl~60μl抗-卵白素抗体,加塑料盖膜,室温孵育20min;

17)1×PBS室温下洗3次,每次2min。

5、细胞核染色:

1)张切片加10μl~20μl DAPI,覆盖盖玻片并在室温下孵育2~5ml;

2)尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。

地高辛标记寡核苷酸探针

1.组织处理

(1)冷冻切片:厚10~20μm,贴于事先经清洁处理及涂有粘附剂的切片上。切片保存于-80℃,在应用于杂交实验前,使迅速回升到室温,干燥,固定于3%多聚甲醛-PBS溶液中,pH7.4。PBS漂洗5min×3,孵育在2×SSc 10min。

(2)石蜡包埋切片:浸入二甲苯10min移除石蜡,以100%乙醇10min ×2,空气干燥10min,从高到低梯度乙醇(95%,80%,70%)1min/每个浓度。PBs 5min×3,孵育在2×SSc 10min。

(3)离心细胞涂片:将细胞先以4%多聚甲醛固定,应用离心沉淀法,将沉淀物涂于有粘附剂的载片上,应用PBS(含5mmol/l MgCl2)5min×3漂洗。在0.1mol/L三乙醇胺含0.25%(V/V)乙酸酐10min。在0.2mol/l Tris –HCl 含(0.1mol/L甘氨酸)pH7.410min。孵育在2×SSc 10min。

2.探针准备35pmol的寡核苷酸(oligo -)探针,3’ 终末标记以地高辛-11–dUTP。

3.预杂交和杂交加约300μl预杂交液(配制法见附录)在每张载片上,室温孵育1h。如为鲱鱼精子DNA,在应用前须在沸水浴中加热10min,而对酵母tRNA可不用加热变性。

(1)应用预杂交液稀释地高辛标记的Oligo-探针,探针理想工作浓度根据于待测核苷酸含量和实践的结果。如对于检测大鼠垂体的前促黑激素(proopiomelanocortin,POMC)mRNA的Oligo –探针,其理想工作浓度为342ng/ml(0.342ng/μl)。

(2)预杂交后以2×SSC漂洗,以吸水纸拭干切片周围水份,加30μl杂交液在切片上,加硅化盖玻片,在37℃过夜。如探针大于36碱基则杂交温度为42℃。次日室温2×SSC液漂洗切片1h,1×SSC漂洗切片1h(室温),0.5×SSc 37℃洗半小时,0.5×SSC室温漂洗半小时。

4.地高辛显示。

地高辛标记cRNA探针

1.组织前处理在组织制片中以冷冻切片(厚10~30μm)最佳。切片贴在预先清洁,高温处理并涂以粘附剂载玻片上,先在37℃预干燥4h,然后置于37℃烤箱中过夜。经过上述处理的切片如在-20℃可保存2~3

周,在-70℃可保存数月之久,有报告可保存数年之久的。但仍以新鲜制片为好。如为石蜡包埋切片,应脱蜡经梯度酒精入水。一般不提倡浸入二甲苯溶液。但在细胞内mRNA含量高时应用二甲苯脱蜡后仍能显示。经水洗后入37℃烤箱4h或过夜,然后进行杂交前处理。

在烘烤及低温保存时,为防尘埃及空气中RNA酶的污染,宜用锡箔纸(foilpaper)包被,内加少许干燥剂(变色硅胶)。

下列步骤所需玻璃器皿均需消毒,操作者需戴手套。

(1)PBS洗2×3min。

(2)选择少数几张切片作为“RNA酶对照片”。

其它切片暂放于PBs 内。

RNA酶对照片处理方法:加RNA酶(100μg/ml)在预热37℃的溶液内。放在潮湿的盛有少许2×SSC 塑料盒或蒸发皿内。在每张切片上覆以过量的RNA酶溶液,在37℃孵育30min后用2×SSC冲洗,2×3min,然后与其它保存在PBS的切片一起进行下列处理。

(3)蛋白酶K消化:将组织切片放在0.1mol/l Tris/50mmo/L EDTA pH8.0,内含蛋白酶K1μg/ml,孵育15~20min。消化时间应根据组织的种类,厚度反复试验调整。时间过短探针不易进入,过长影响细胞或组织的形态结构。

(4)0.1mol/L甘氨酸/PBs 5min终止蛋白激酶K反应。0.25%乙酸酐(0.1mol/l 三乙醇胺配制)10min。

(5)在4%多聚甲醛/PBS3min。

(6)以PBs 漂洗2×3min。

(7)浸入新鲜配制的0.25%乙酸酐(0.1mol/L三乙醇胺配制)10min,以封闭非特异性结合部位。

(8)2×SSC漂洗15min。

2.杂交以含cRNA探针(0.5ng/ml)的杂交液,按每张切片10~2μl的量覆盖切片。地高辛配基标记的cRNA核酸探针保存浓度为2.5ng/ml,用前稀释备用。覆以硅化盖玻片或塑料蜡膜,置于盛有少量2×SSC 温盒内在42℃,16~18h或过夜。

3.显示

(1)用缓冲液1冲洗杂交后的载片2×3min。

(2)在缓冲液1中10min,室温以封闭非特异性结合部位。

(3)拭干切片周围的载片,注意保持切片湿润。加数滴抗地高辛抗血清(工作浓度1:500,以缓冲液1稀释),孵育2h,室温。

(4)缓冲液1漂洗3×3min。

(5)浸入缓冲液210min室温。

(6)浸入底物中孵育10~30min(或更长时间,视需要而定),底物内含显色BCIP/NBT,室温。最好用锡箔纸包裹反应盒,使显色在黑暗中进行。定期取出切片在显微镜下检测反应强度。根据反应强度决定延长或终止反应。反应颜色为紫蓝色。

(7)将切片浸入缓冲液3以终止反应。

(8)复染,可用1%伊红、1%苏木精、1%亮绿或5%的焦宁(又称派咯宁丫)(pyronin 丫)10~30s。

(9)流水洗5~10min,直至水无色为止。

(10)在切片未干前,以PBS/甘油封固切片,如要永久保存,可以用DPX在盖片四周封固。为去除水份,在封固前可进行梯度酒精脱水,透明,DPX封固,但每步时间仅需几秒钟,时间过长易致褪色。

原位杂交实验步骤

1质粒的转化和扩增

1.1制备XL1-Blue感受态细菌

1.取400uL XL1-Blue菌种加入到含200ml LB培养基的锥形瓶中,37 ℃、100rpm培养4h,离心,倒置,以冰冷的0.1 mol/L CaCl_2重悬细菌,冰浴30 min,离心,弃上清,倒置,再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌,分装(200 μ/tube),-80 ℃保存。

2.转化:在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻,将浓度为2ng/μ1的质粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。

3.轻轻摇匀,冰浴30 min。

4.42 ℃热激9O秒,然后迅速冰浴2 min。

5.加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml,在37 ℃,100转/min水浴孵育60 min。

6.取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的 LB-氨苄青霉素50 mg/

ml,1μl/ml培养基),待菌液全部被吸收后,倒置平板于37 ℃培养12-16h。

1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落

1.用无菌牙签挑取单菌落,接种到10 ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中,于37 ℃,200转/分培养2h,取1 ml之一Eppendorf离心管,加50μl10mmol/L EDTA(pH 8.0)。

2.加入50μl新配置的0.2mol/L NaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后,振荡3O秒。

3.在70 ℃温育5 min,然后冷却到室温。

4.加1.5μ14mol/L KCl和0.5μ1含0.4%溴酚兰染液,振荡3O秒后,冰浴5min。

5. 12000g,4 ℃离以 3 min,以除去细菌碎片。

6.制备1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml),取50μl上清液加入到样品孔中,其中一孔加入中等分子量DNA Marker。恒压50V,进行电泳。

7.当溴酚兰迁移到凝胶全长的2/3-3/4时,停止电泳,在紫外灯下检查质粒DNA分于量的大小是否与转入质粒相符。

1.3质粒的扩增和纯化

1.用无菌牙签分别挑取单个白色菌落移入含30ml LB-氨苄青霉素(50μg/ml)培养液的聚丙烯管中,于37 ℃,200转/分培养3h。

2.将菌液转入含70 ml LB-氨苄青霉素培养液的250ml锥形瓶中,37 ℃,200转/分培养过夜(12-16h),细菌浑浊。

3. 菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇,100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液,终浓度为170 μ/ml)。

37 ℃,200转/分培养12-16h。

4. 将培养的细菌倒入50ml的离心管中,6000rpm,4 ℃离,th,15 min,沉淀细菌。

5. 弃净上清夜,用2ml预冷的溶液I,悬浮菌体沉淀,剧烈振荡,于室温静置5 min

6. 加入新配制的溶液II 4ml,快速用手晃动10秒,颠倒数次后,于室温静置10 min。

7. 加入预冷的溶液III 3ml,温和振荡l0秒,于冰上静置10 min,出现白色絮状沉淀。

8. 6000rpm,4 ℃离心15 min,保留上清。

9.将上清(若带细菌残片,则再次离心)移入另一50ml的离心管中,加入O.6倍体积的异丙醇混匀,于室温静置10 min。(或-20 ℃4h,或4 ℃过夜,可便核酸沉淀)

10.12000 rpm,4 ℃离心15 min,回收核酸。小心弃去上清,倒置离心管使残兼上清液流尽。

11.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁,室温12000 rpm离心,15 min,充分弃去乙醇,于室温将离心管倒置在纸巾上,使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。

12.用500μl TE(pH8.0)溶解核酸沉淀,转移至1.5 ml Eppendorf管中。

13.加入用冰预冷的5mol/L的LiCl溶液600μl,充分混匀。12000 rpm,4 ℃离心15 min,以沉淀高分子量的RNA。

14.将上清转移到另一1.5 ml Eppendorf管中,加等量异丙醇,充分混匀,于室温静置10min。

15.12000 rpm,4 ℃离心15 min,回收核酸。小心弃去上清,倒置离心管使残余上清液流尽。

16.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁,室温12000 rpm离心,15 min,充分弃去乙醇,于室温将离心管倒置在纸巾上,使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。

17.400μl含无DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀,将溶液转移到另-1.5 ml Eppendorf管中,室温放置1.5ml Eppendorf管中30min。

18.加入400μl 13%(v/v)的PEG 8000-NaCl(1.6 mol/L),混匀,4 ℃ 12000rpm离心5 min以回收质粒DNA,弃去上清。

19.加入400μl TE缓冲液(pH 8.O)溶解沉淀,再分别用等体积的Tris饱和酚、酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、和氯仿各抽提一次。

20.将水相(上清)移入另一1.5ml Eppendorf管中,加入O.1体积(约50μ13M的醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积(大约1 ml)的无水乙醇,充分混匀后于4℃放置30 min。

21.于4 ℃ 12000 rpm离心5 min回收沉淀的质粒DNA。尽可能弃去上清,敞开管口,置工作台上使残留的痕量乙醇蒸发殆尽。

22.加入400 μl处于4 ℃的70%乙醇,稍加振荡,漂洗沉淀,4 ℃ 12000 rpm离心2 min。

23.吸去上清,室温敞开管口,直到乙醇完全挥发。

24.用100μl TE缓冲液(pH 8.0)溶解沉淀。

25.取4μl溶液1:100稀释后,测定其OD260、OD280,以确定质粒DNA的纯度和浓度(OD260/D280>1.8。OD260/OD280对DNA而言其值大约为1.8,高于2.0则可能有RNA污染,低于1.8则有蛋白质污染。;DNA 浓度=OD260 X 0.05 X稀释倍数(μg/μl)。

26.质粒DNA溶液于-20 ℃保存待用。

二、cRNA探针的标记

1.将质粒DNA,用相应的限制性内切酶线性化,通过琼脂糖凝胶电泳以确保完全线性化。

2.线性化后的DNA按“质粒的纯化”步骤19-24进行纯化,作为cRNA探针标记的模板,用相应的RNA聚合酶合成地高辛标记的反义和正义RNA探针。

3.进行体外转录,步骤如下:

4.在冰上将各试剂加入一1.5 ml无RNA酶的Eppendorf管中。

DEPC处理的三蒸水8μl

质粒DNA模板 0.05μg/μl 1μl

10 x NTP地高辛标记混合物 1 x 2μl

0.1 M DTT溶液 10 mM 2μl

5 x转录缓冲液 1 x 4μl

RNAse抑制剂 2U/μl 1μl

RNA聚合酶 2U/μl 2μl

反应体系总体积 20μl

5.加入上述各试剂后,混匀,简短离心后在37 ℃孵育2h。

6.加入2μl无RNA酶的DNA酶I(10U/μ1),37 ℃孵育15 min降解模板DNA。

7.加入0.2M EDTA(pH 8.0)溶液2μl终止反应。

8.加入2.5μl的4 M Licl和7.5μl冷的无水乙醇,混匀,-20 ℃放置2h。

9. 12000g下离以 15 min,弃上清,小心地用50 μl冷的70%乙醇洗涤沉淀。

1O.室温下稍干燥,溶于100μ1 DEPC处理过的三蒸水中,混匀分装,-20 ℃下保持备用。

三、原位杂交

3.1冰冻切片与杂交前预处理

1.将子宫样品从-80 ℃取出,用OCT包埋,在-23 ℃(切片机腔体温度)平衡至少30 min。将包埋好的样品固定在样品头上,切10μm厚的连续组织切片,平铺于涂有多聚赖氨酸(1mg/m1)的玻片上(玻片预先经180 ℃干烤6小时),保存于-70 ℃冰柜备用。

2.冰冻切片经室温干燥10 min后,在4%的多聚甲醛-PBS(pH 7.4)固定lOmin。

3.活跃的DEPC-PBS(未高压的0.1%DEPC-1XPBS溶液)洗2次,每次5 min。

4.在0.2M的盐酸作用中作用10 min后,重复步骤4)。

5.在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg/m1),37 ℃孵育15 min,重复步骤4)。

6.经0.1M TEA(三乙醇胺)作用5min后,再在新配制的0.25%AA/0.1M TEA (乙酸酐/三乙醇胺,pH 8.0)中乙酰化10 min。

(在大多数实验中,步骤4,5,6省略)

7. 5 x SSC中平衡15 min。

3.2杂交

8.在脱水后的玻片上滴加预杂交液(约100 μl/玻片),置于放有湿盒液(50%甲酰胺v/v;0.3 M NaCl;1Mm EDTA;10 mM Tris-Cl,pH 8.O)的湿盒中,55~58 ℃下的烘箱中预杂交2 h。

9.甩掉预杂交液,地高辛标记的反义或正义cRNA探针(浓度1-2ng/μl)经70 ℃变性1O分钟,置冰上1 min,玻片上滴加预杂交液(约60μl/玻片),覆盖parafilm膜,放湿盒中在48~58 ℃下杂交18-30 h。

3.3杂交后处理

1O.取出玻片,小心去掉Parafilm膜,甩掉杂交液,用52 ℃预热的5×SSC洗30 min。

11.在无DNA的RNA酶A(20μg/ml)溶液中37 ℃下孵育30 min。

12.分别依次用52 ℃预热的2 X SSC,1 X SSC和O.1 X SSC洗2次,每次30 min。

3.4杂交信号检测

13.在缓冲液A(0.1M Tris-HC 1 pH 7.5,0.15M NaC1)中平衡5min。

14.在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(1:500~1:2000稀释于含0.5%阻断液的缓冲液A中),室温反应2h。

15.用缓冲液A洗2次,每次15 min。

16.在缓冲液B(0.1M Tris-HCl;0.1M NaCl;0.05M MgCl_2,pH 9.5)中平衡5min。

17.硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸盐(BCIP)溶于缓冲液B中,每ml缓冲液B含有4.5μ1 NBT和3.5μ1 BCIP。在玻片上滴加混合染液在湿盒中显色过夜。

18.充分显色后,用EDTA(1 mM EDTA,pH 8.0)洗15 min终止反应。

19.在95%乙醇中洗l h以除去非特异的背景。

20.用蒸馏水洗15 min除去可能存在的结晶体。21.脱水、透明,用中性树胶封片。

22.充分干燥后在显微镜下观察、照相。

DNA实验技术:原位杂交实验要求及步骤

原位杂交组织(或细胞)化学(In situ Hybridization Histochemistry,ISHH)简称原位杂交(In Situ Hybridization),属于固相分子杂交的范畴,它是用标记的DNA或RNA为探针,在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同,原位杂交可分为DNA-DNA杂交,DNA-RNA杂交和RNA-RNA 杂交三类。 根据探针的标记物是否直接被检测,原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交,杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针,最后通过免疫组织化学法对半抗原定位,间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。 原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记(如35S,3H,32P等)仍然广泛使用,但非同位素标记探针的迅速发展(尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针),更引起科技工作者的极大兴趣。 一、基本要求 1. 组织取材:组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快,所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。 2. 固定目的是: (1)保持细胞结构; (2)最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平; (3)使探针易于进入细胞或组织。 最常用的固定剂是多聚甲醛,与其它醛类固定剂(如戊二醛)不同,多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接,因而不会影响探针穿透入细胞或组织。 3. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性: (1)稀酸处理和酸酐处理:为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合,以降低背景,杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min,经乙酸酐处理后,组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl处理10 min,稀酸能使碱性蛋白变性,结合蛋白酶消化,容易将碱性蛋白移除。 (2)去污剂处理:去污剂处理的目的是增加组织的通透性,利于杂交探针进入组织细胞,最常应用的去污剂是Triton X-100。注意:过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构,而且还会引起靶核酸的丢失。

原位杂交自己整理

一、DEPC水是用DEPC(diethyl pyrocarbonate,焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水。经检测不含杂质RNA、DNA和蛋白质。 物理性质分子式:C6H10O5 分子量:162.1 外观:无色液体折射率:1.398(20°C)密度:1.12g/ml 摩尔浓度:6.9M DEPC气味芳香浓烈,强挥发性,有毒,需在通风橱中操作。 化学性质DEPC对湿气和酸碱敏感,在乙醇和二氧化碳的水溶液中缓慢分解,在155°C自行分解。DEPC 在氨水中特别不稳定,生成一种致癌的聚氨酯胶的物质。DEPC对核酸酶有积极地抑制作用。(主要是对含有-NH,-SH,-OH活性部位的酶起作用)。 使用要点:DEPC水可以用于RNA沉淀的溶解,含有RNA的各种反应体系如反转录、siRNA的退火等,以及其它各种要求无RNase、DNase和proteinase的反应体系。通常使用0.1%的DEPC水溶液使Rnase 失活,即1ml DEPC溶于1L纯净水中。溶解时,DEPC不会很快溶解,开始时以小球的形式存在于溶液中,因此要在搅拌器中搅动直到小球消失为止。DEPC自行分解成乙醇和二氧化碳很慢,可以通过高压灭菌处理破坏DEPC或水溶液中煮沸15分钟以上。 注意事项保存:避光干燥密闭容器于2-8°C 注:使用时要戴乳胶手套和口罩。如果不慎溅到皮肤或眼睛,应立即用大量清水冲洗,如果感到不适,就医。 二、DEPC处理枪头: 1、用去离子水配制0.1%的DEPC,避光; 2、将枪头和EP管放入0.1%的DEPC内,保证枪头和EP管内都充满0.1%的DEPC(看自己的操作习惯了,本人是用左手拿住镊子夹住枪头或者EP管,右手使用移液器吸取0.1%的DEPC,将枪头或者EP管内充满0.1%的DEPC); 3、避光、静置、过夜 4、装枪头和EP管的盒子不需要用DEPC浸泡,将枪头或者EP管内的DEPC水大致去除干净后,装起,包好 5、121摄氏度,30min 6、180摄氏度,干燥数个钟头(三个左右吧,这个时间具体记得不是很清楚了),用前拿出来 注意:处理DEPC时需要戴乳胶手套、口罩! 三、 使用甲酰胺和二甲亚砜(DMSO)一般不会导致高背景。在杂交液中加入30%二甲亚砜可使T2噬菌体DNA的Tm值比原先降低14℃,而使用酰胺甚至可使DNA在室温下变性和

原位杂交原理及具体操作

原位杂交原理及具体操作

原位杂交实验原理与方法 一、目的 本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。 二、原理 原位杂交组化(简称原位杂交,in situ hybridization histochemistry;ISHH)属于分子杂交的一种,是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交,再应用标记物相关的检测系统,在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下,使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位,并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。 当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补,所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序(即某种程度的同源性)就可以形成杂交双链。 探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。目前,大多数放

射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中,常用的同位素标记物有3H、35S、125I 和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高,背底较为清晰等优点,但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害,近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。 探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。cDNA 探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。 菌落原位杂交(Colony in situ hybridization)菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸 纤维素滤膜上,然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将NDA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交,放射自显影检测菌落杂交信号,并与平板上的菌落对位。 组织原位杂交(Tissue in situ hybridization)组织原位杂交简称原位杂交,指组织或细胞的原位杂交,它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA,然后进行杂交。而原位

原位杂交组织化学技术的基本方法

原位杂交组织化学技术的基本方法 一、核酸分子杂交技术 1961年Hall开拓了液相核酸杂交技术的研究,其基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序,通过碱基对之间非共价键的形成,出现稳定的双链区,形成杂交的双链。自此以后,由于分子生物学技术的迅猛发展,特别是70年代末到80年代初,分子克隆">克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功,核酸自动合成仪的诞生,大大丰富了核酸探针的来源,新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种:液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中,而固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜,其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等),另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交有菌落原位杂交(colony in situ hybri dization)、斑点杂交法(Dot blot)、Southern印迹杂交(Southern blot)、Northern印迹杂交( N orthern blot)和组织原位杂交(Tissue in situ hybridization),即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等。 二、原位杂交组织化学技术的由来及发展 原位杂交组织(或细胞)化学技术简称原位杂交(In situ hybridization),如上所述,属于固相核酸分子杂交的范畴。但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。菌落杂交系细菌裂解释放出DNA,然后进行杂交。Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段,而Norhtern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交,确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时,Buongiorno– Nardell i和Amaldi, John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位,从而创造了原位杂交细胞或组织化学技术。Orth(1970)应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交,首次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位,但当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞,探针均采用同位素标记。 由于同位素标记探针具有放射性既污染环境,又对人体有害,且受半衰期限制等缺点,科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。Bauman(1981)等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交,然后用荧光显微镜观察获得成功。Shroyer(1982)报道用2,4二硝基苯甲醛(DNP)标记DNA探针,使该DNA探针具有抗原性,然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针,最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。这两种方法至今仍有采用,但因敏感度不够高,应用不够普遍。 Pezzella(1 987)创建了用磺基化DNA探针来做细胞或组织原位杂交的方法,其基本原理是使DNA探针的胞嘧啶碱基磺基化,利用单克隆">克隆抗体识别磺基化探针,再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体,从而对杂交结合的探针进行定位。本法的优点是磺基化DAN探针标记简便,不需作缺口平移标记,敏感度也较高。但自生物素和高辛标记探针技术建立后,已有取而代之的趋势。生物素标记探针技术是Brigat(1983)首先建立的,它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒DNA,通过生物素与抗生物素结合,过氧化物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位。生物素标记探针技术目前已被广泛应用,特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。这种生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。另一种叫光促生物素标记核酸技术,该技术是用光敏生物素(Photobiotin)标记核酸。目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素生物素,它们都是由三个部分组成:光敏基团、连结臂和生物素(图20-1)。在强光下,不需酶反应,光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。光敏生物素标记核酸,方法简单,灵敏度也不低,但标记效率不高,每100~150个碱基才能标记一个生物素,对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用,以免因标记数过少而影响灵敏度(Forster et al 1985)。 近年来,地高辛(Digoxigonin)标记技术引起科技工作者的极大兴趣。Boeringer Mannhem Bio-ch emisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。和其它非放射性标记物一样,地高辛较放射性标记系统安全,方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越,可以检测出人基因组DNA中的单拷贝基因。地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色(标记碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色系统),有较好的反差背景。 核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。根据探针的核酸性质不同可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针等。DNA探针还有单链DNA(Single st randed, ssDNA)和双链DNA(Double stranded, dsDNA)之分(详见十九章)。早期应用的主要是DNA探

原位杂交实验操作步骤

原位杂交实验操作步骤 一质粒制备 1质粒的转化和扩增 1.1制备XL1-Blue感受态细菌 1.取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mlLB培养基的锥形瓶中,37℃、100rpm 培养4h,离心,倒置,以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重悬细菌,冰浴30min,离心,弃上清,倒置,再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌,分装(200μ/tube),-80℃保存。 2.转化:在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻,将浓度为2ng/μ1的质粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。 3.轻轻摇匀,冰浴30min。 4.42℃热激9O秒,然后迅速冰浴2min。 5.加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml,在37℃,100转/min水浴孵育60min。 6.取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨苄青霉素50mg/ml,1μl/ml培养基),待菌液全部被吸收后,倒置平板于37℃培养12-16h。 1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落 1.用无菌牙签挑取单菌落,接种到10ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中,于37℃,200转/分培养2h,取1ml之一Eppendorf离心管,加 50μl10mmol/L EDTA(pH8.0)。 2.加入50μl新配置的0.2mol/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后,振荡30秒。 3.在70℃温育5min,然后冷却到室温。 4.加1.5μ14mol/LKCl和0.5μ1含0.4%溴酚兰染液,振荡3O秒后,冰浴5min。 5.12000g,4℃离以3min,以除去细菌碎片。 6.制备1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml),取50μl上清液加入到样品孔中,其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒压50V,进行电泳。 7.当溴酚兰迁移到凝胶全长的2/3-3/4时,停止电泳,在紫外灯下检查质粒DNA 分于量的大小是否与转入质粒相符。

原位杂交技术步骤

1.For each probe (control and experimental), set up a separate 100-ml PCR in a 0.5-ml sterile tube, as tabulated below. Either.cDNA inserted in plasmids or genomic DNA can be used as templates for the PCR (see REAGENT SETUP for details on primer design). 每个探针(实验组和对照组),在0.5 -ml无菌管设立一个独立的100毫升PCR,正如下面的表。另外。互补脱氧核糖核酸插入到基因组DNA质体或可用作模板PCR(见试剂设置有关底漆设计)。 **注意关键: 1.很多版本的实验反义核酸探针可以作为一种控制背景染色(见试剂设置)。然而,我们相信最好的方法来演示特异性是获取相同的空间限制表达模式使用不同的非重叠探测器相同的基因。 2.小心不要污染pcr.使用无菌试管和过滤器的技巧和戴手套 3.另外,PCR扩增,cDNAs质粒中可以使用约束线性化酶,独特的站点位于5¢(反义核酸探针)或3¢(对感官探测)来插入。净化的线性DNA可以通过苯酚/氯仿萃取乙醇沉淀紧随其后。 2| Run the PCR using the conditions tabulated below. 使用下面列出的条件运行PCR **暂停点:把扩增好的pcr产品放4℃降温和在-20℃贮藏几个星期。 3| Add the 100-ml PCR to a Microcon YM-50 column and add 400 ml of sterile water. Centrifuge for 15–20 min at 1,000 g at room temperature. 加入100毫升PCR到Microcon YM-50列并加入400毫升的无菌水。在室温下1000g离心15 - 20分钟。 **注意关键:膜应该是干的。如果没有再离心 4|Place the Microcon column into a new microfuge tube (provided in the kit), add 20ml of sterile water, vortex briefly and then turn the Microcon column upside down. Spin for 1 min at 1,000 g at room temperature to recover the DNA. 把小层析柱放在一个新的离心管(在这个工具包中提供),增加20毫升的无菌水、短暂离心,然后颠倒层析柱。自旋1分钟1000 g在室温下恢复了DNA **注意关键:离心的步骤应该快速。离心机1分钟只是为了避免样本太干。 5|Check the quality, quantity and size of the PCR amplification product by loading 1/20 of the preparation on a 1% (wt/vol) agarose gel in 1 TBE buffer. DNA should appear as a band and not as a smear. The 1/20 of the preparation should contain at least 40 ng of DNA. 通过装载1/20的稀释液在1*的TBE buffer缓冲液中的1% (wt/vol)的琼脂糖凝胶检查PCR的扩增产物的质量

原位杂交操作流程

原位杂交操作流程 1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天 1)二甲苯于37℃脱蜡2次,每次15分钟; 2)无水乙醇浸泡2次,每次3分钟; 3) 95%乙醇浸泡2次,每次3分钟; 4) PBS清洗3分钟; 5) 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟; 6) PBS清洗10分钟; 7)加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育15分钟; 8) PBS清洗2次,每次3分钟; 9) 0.2N的HCl孵育30分钟; 10)PBS清洗2次,每次3分钟; 11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟; 12)PBS清洗2次,每次5分钟; 13)预杂交缓冲液孵育30分钟; 14)准备核酸探针混合物:使用预杂交缓冲液稀释探针,85℃加热5分钟,置于冰块中10分钟; 15)杂交;第二天 16)将玻片置于SSC中2次,每次5分钟以去除封片; 17)PBS清洗3分钟; 18)RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中),37℃孵育30分钟; 19)PBS清洗5分钟; 20)室温,2×SSC清洗10分钟; 21)37℃,1×SSC清洗10分钟; 22)37℃,0.5×SSC清洗10分钟; 23)缓冲液A孵育10分钟; 24)缓冲液A(1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟; 25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液,来自Boehringer Mannheim),37℃孵育3 小时; 26)缓冲液A清洗2次,每次10分钟; 27)缓冲液B清洗2次,每次5分钟; 28)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟,显微镜下进行观察,如果背景尚佳,显色时间可延长到16小时;29)停止缓冲液B的反应,用水进行简单的清洗; 30)固红,脱水以及封片进行核的复染。 2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天 1)二甲苯于37℃脱蜡2次,每次15分钟; 2)无水乙醇浸泡2次,每次5分钟; 3) 95%乙醇浸泡2次,每次5分钟; 4) PBS清洗5分钟; 5) 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟; 6) PBS清洗5分钟; 7)加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育10分钟; 8) PBS清洗2次,每次5分钟; 9) 0.2N的HCl孵育30分钟; 10)PBS清洗2次,每次5分钟; 11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟;

原位杂交的方法

原位杂交 1 探针的设计与合成 1)根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列,用premier primer5.0设计引物p81和p82, 以卤虫cDNA为模板,PCR扩增得到346bp的产物,用Takara胶回收试剂盒回收纯化。引物编号引物序列长度 p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bp p82 GCTCAAACAGTGA TGCCAGT 20 bp 2)目的片段克隆 a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分,载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8,根据凝胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下: 目的PCR片段 5 μl pGM-T载体(约50ng/uL) 1 μl 10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μl T4 DNA Ligase(3U/uL) 1 μl 无菌去离子水 3 μl 总体积10 μl b. 轻轻弹动离心管以混合内容物,短暂离心。置于PCR仪中16℃过夜连接,反应结束后将离心管置于冰上。 c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入16 μl的IPTG(50mg/ml)、40 μl的X-gal (20mg/ml),使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开,避光置于37℃培养箱1-3小时,使溶解X-gal的二甲基甲酰挥发干净。 d. 将10 μl的连接产物加到100 μl DH5 感受态细胞中,轻弹混匀,冰浴半小时,将离心管置于42℃水浴90秒,取出管后立即置于冰浴上放置2-3分钟,其间不要摇动离心管。向离心管加入500 μl 37℃预热的LB(不含抗生素)培养基,150rpm摇床37℃振荡培养45分钟。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。将菌液于4000g下离心10分钟,去掉上清,加入100 μl培养液重溶并加入到配制好的LB固体培养基上,用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后,倒置平板,37℃培养12-16小时。 e. 挑取白色菌落直接进行PCR检测,筛选转化子。 f. 将转化子接种于LB液体培养基中培养24小时,吸取1mL菌液送至大连宝生物公司进行序列测序。 3)重组质粒的线性化 取6 μl以测序的重组质粒,选取NcoI内切酶37℃酶切4h。酶切反应体系为20 μl: 质粒 6 μl 10xK Buffer 2 μl NcoI酶 1 μl 0.1% BSA 2 μl 灭菌水9 μl 终体积20 μl 取酶切前后的质粒各4 μl,经1%琼脂糖电泳检测,确认酶切完全,将酶切产物用Takara胶回收试剂盒回收纯化,作为探针合成的模板。 4)探针合成 按罗氏DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)试剂盒使用指南,标记反义RNA探针。 使用的所有试剂和器皿均经去RNase处理,合成方法如下:先准备反应体系。冰上向RNase-Free的微离心管中顺序加入下列试剂:

原位杂交技术的操作详解及小贴士

原位杂交技术的操作详解及小贴士 原位杂交技术应用于染色体、细胞和组织切片等样品中进行核酸特异性检测,与免疫组化技术的结合应用,能将DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性与样品的显微拓扑信息结合起来。1969年Pardue和Gall将放射性标记的探针直接应用于纯化核酸的杂交,此后得益于分子克隆技术的发展,及不同探针标记系统和检测系统的应用,大大增加了原位杂交检测的应用灵活性和检测灵敏度。 多种探针标记检测系统 基于地高辛、生物素和荧光标记分子的标记和检测系统是常见的原位杂交检测方法。 荧光标记检测常为直接探针标记方法,如在dUTP/UTP/ddUTP上连接Fluorescein后进行核酸标记。由于标记在核酸上的荧光分子必须经受杂交和洗脱过程中的考验,以及荧光分子易于衰减,其检测灵敏度受到一定的影响。但对荧光分子的直接检测呈现的背景较低。 间接标记的方法中应用了报告分子标记的探针,报告分子通过亲和酶促的方法进行显色。常用的报告分子如地高辛,生物素。结合地高辛抗体或链霉亲和素上耦联的酶系统进行间接的底物反应检测。地高辛标记核酸的历史可追溯到1987年,由于地高辛是洋地黄的花和叶中特有的成分,检测时使用的地高辛抗体不会结合于其他的生物分子。这是相较于生物素标记系统的优势。地高辛抗体上可耦联碱性磷酸酶、过氧化酶,及荧光分子和胶体金等,根据不同的应用需求,呈现高信噪比的核酸检测结果。但需注意,由于引入了免疫检测反应,在放大检测灵敏度的同时,应注意样品内源性酶的灭活,以降低检测背景。 通过不同标记方法的联合应用,还可在同一样本中实现染色体不同区域或细

胞样本中不同RNA序列的多重检测。 原位杂交中探针的选择 DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针均能通过不同的酶促分子反应进行标记。寡核苷酸探针的长度较短,因此避免了探针内部退火的问题,在杂交时的渗透能力也更好,探针与靶标的接触这是影响原位杂交是否成功的重要因素之一。DNA 探针、RNA探针在合成时需要控制探针片段长度,通常300-1000bp左右,能覆盖到较长片段的靶核酸序列,增加检测的灵敏度。 就DNA探针和RNA探针的比较,DNA探针在杂交过程中会出现探针双链之间退火的可能,也更倾向于在溶液中形成大分子的探针聚合体,从而影响其渗透能力。而RNA 探针的应用,将提高DNA-RNA杂交子的热稳定性。 Tips:RNA探针因其单链、高分子结合力、可适应高温杂交的特性,其检测特异性和灵敏度均优于DNA探针。常用的RNA探针标记方法为构建质粒后进行转率合成。通过PCR扩增的方法,可以更方便地进行RNA探针的制备;RNA探针合成后,还需验证其对目标片段检测的灵敏度和特异性。具体实验流程和注意事项可参考技术文章:A Method for High Quality Digoxigenin-Labeled RNA Probes for In Situ Hybridization 原位杂交检测步骤 原位杂交涉及的步骤:玻片的准备和样品固定,细胞或组织的预渗透处理,靶DNA变性(DNA原位杂交),探针制备,原位杂交过程,杂交后洗涤,探针(显色)检测。 1. 玻片的准备和样品固定 对于染色体涂片,1:1的乙醇/醚处理的载玻片已能符合要求。对于组织切片的原位杂交,为了在实验过程中不丢失组织样品,可使用多聚赖氨酸或铬矾

原位杂交实验操作步骤

原位杂交实验操作步骤 撰写人:范为民 一、实验原理 原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法,在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生,发展和调控等根本性问题的有力工具。 二、试剂盒 本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒,此试剂盒分为两种,一种为过氧化物酶(POD)检测(MK1030型),一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统(MK1032型),用于mRNA的杂交。过氧化物酶(POD)检测的最终信号为棕黄色,而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色,因后者信号比较突出,所以一般采用后一种检测方法。两种检测方法的实验步骤相差不多,所用洗脱缓冲液也大同小异。用于杂交的探针也可以分为两种,一种是DNA探针,即是用DNA与组织中的mRNA杂交,另一种是RNA 探针,即用RNA与组织中的mRNA杂交。DNA探针处理操作简单,但杂交信号一般不如RNA探针强烈,所以条件允许的话一般采用RNA探针。下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒,采用RNA作为探针的操作步骤。 三、实验步骤 原位杂交实验主要包括三大部分,即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。 (一)组织冰冻切片 1. 实验准备 (1)原位杂交专用载玻片:用多聚赖氨酸处理后的载玻片,使切片紧密粘附在玻片上,可以用于后面的洗脱。一般一张载玻片上可以贴至多十张切片(可以是不同组织的切片),所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买,目前价格是每片2.2元,玻片有一面的一端是毛玻璃,用于标记组织名称等,切片应该贴在此面,切勿贴到反面。 (2)缓冲液配备 1.1器具准备 剪刀、镊子各三把,开壳钳一把,100ml量筒一个,磁力搅拌子一个;100ml试剂瓶一个,250ml试剂瓶三个。以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。 1.2 溶液配制 0.1M PB缓冲液:Na2HPO4?12H2O 5.8021g,NaH2PO4?2 H2O 0.5928 g,加入200ml ddH2O溶解于之前准备的250ml试剂瓶中,再加入200ūl DEPC,充分摇匀后过夜,高压灭菌。以上溶液配制两份,其中一份瓶中放入磁力搅拌子。

原位杂交组织化学技术的基本方法及操作规程

原位杂交组织化学技术的基本方法及操作规程 一、核酸分子杂交技术 1961年Hall开拓了液相核酸杂交技术的研究,其基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序,通过碱基对之间非共价键的形成,出现稳定的双链区,形成杂交的双链。自此以后,由于分子生物学技术的迅猛发展,特别是70年代末到80年代初,分子克隆">克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功,核酸自动合成仪的诞生,大大丰富了核酸探针的来源,新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种:液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中,而固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜,其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等),另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交有菌落原位杂交(colony in situ hybri dization)、斑点杂交法(Dot blot)、Southern印迹杂交(Southern blot)、Northern印迹杂交( N orthern blot)和组织原位杂交(Tissue in situ hybridization),即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等。 二、原位杂交组织化学技术的由来及发展 原位杂交组织(或细胞)化学技术简称原位杂交(In situ hybridization),如上所述,属于固相核酸分子杂交的范畴。但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。菌落杂交系细菌裂解释放出DNA,然后进行杂交。Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段,而Norhtern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交,确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时,Buongiorno– Nardell i和Amaldi, John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位,从而创造了原位杂交细胞或组织化学技术。Orth(1970)应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交,首次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位,但当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞,探针均采用同位素标记。 由于同位素标记探针具有放射性既污染环境,又对人体有害,且受半衰期限制等缺点,科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。Bauman(1981)等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交,然后用荧光显微镜观察获得成功。Shroyer(1982)报道用2,4二硝基苯甲醛(DNP)标记DNA探针,使该DNA探针具有抗原性,然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针,最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。这两种方法至今仍有采用,但因敏感度不够高,应用不够普遍。 Pezzella(1 987)创建了用磺基化DNA探针来做细胞或组织原位杂交的方法,其基本原理是使DNA探针的胞嘧啶碱基磺基化,利用单克隆">克隆抗体识别磺基化探针,再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体,从而对杂交结合的探针进行定位。本法的优点是磺基化DAN探针标记简便,不需作缺口平移标记,敏感度也较高。但自生物素和高辛标记探针技术建立后,已有取而代之的趋势。生物素标记探针技术是Brigat(1983)首先建立的,它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒DNA,通过生物素与抗生物素结合,过氧化物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位。生物素标记探针技术目前已被广泛应用,特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。这种生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。另一种叫光促生物素标记核酸技术,该技术是用光敏生物素(Photobiotin)标记核酸。目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素生物素,它们都是由三个部分组成:光敏基团、连结臂和生物素(图20-1)。在强光下,不需酶反应,光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。光敏生物素标记核酸,方法简单,灵敏度也不低,但标记效率不高,每100~150个碱基才能标记一个生物素,对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用,以免因标记数过少而影响灵敏度(Forster et al 1985)。 近年来,地高辛(Digoxigonin)标记技术引起科技工作者的极大兴趣。Boeringer Mannhem Bio-ch emisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。和其它非放射性标记物一样,地高辛较放射性标记系统安全,方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越,可以检测出人基因组DNA中的单拷贝基因。地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色(标记碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色系统),有较好的反差背景。 核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。根据探针的核酸性质不同可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针等。DNA探针还有单链DNA(Single st

荧光原位杂交(FISH)实验步骤

仪器设备 1、医用微波炉; 2、水浴锅; 3、OLYMPUS BX51荧光显微镜; 4、OLYMPUS DP11数字显微照相机。 FISH试剂 (1)1×PBS:由10×PBS溶液稀释而成,储存于4℃; (2)20×SSC(); (3)2×SSC,由20×SSC溶液稀释而成; (4)25mg/ml蛋白酶K消化液。 (5)变性液(70%甲酰胺+2×SSC,:4ml 20×SSC;8ml蒸馏水;28ml甲酰胺。每次新鲜配制。 (6)杂交后洗涤液:20×SSC 4ml;蒸馏水16ml;甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH 前升至室温。 实验步骤 1、脱蜡: 1)二甲苯脱蜡3次,每次5min; 2)100%酒精两次,每次2min; 3)移出酒精,斜置切片,标记末段向下,空气干燥。 2、蛋白酶处理: 1)每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液,配制方法如下:2×SSC 40ml倒人Facal管,在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内,摇动直到酶溶解。 2)37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。 3)×SSC在室温下漂洗切片3次,每次1min。 4)梯度酒精脱水(-20℃预冷)。 3、变性: 1)每一个立式染色缸配制40ml变性溶液; 2)78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸; 3)78℃孵育8min; 4)即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min,再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内,每缸2min; 5)空气干燥。 4、杂交: 1)准备探针; 2)取一个较大的湿盒,交叉放置切片; 3)滴10μl探针在切片的组织上,加盖玻片; 4)盖上湿盒盖,37℃孵育12h~16h。 杂交后的水洗: 5)镊子小心去除盖玻片; 6)43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min; 7)2×SSC(37℃)洗两次,每次10min; 8)切片放人染色缸的1×PBS内待检测,勿使切片干燥。 检测:

原位杂交原理及具体操作

原位杂交实验原理与方法 一、目的 本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。 二、原理 原位杂交组化(简称原位杂交,in situ hybridization histochemistry;ISHH)属于分子杂交的一种,是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交,再应用标记物相关的检测系统,在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下,使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位,并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。 当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补,所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序(即某种程度的同源性)就可以形成杂交双链。 探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。目前,大多数放射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中,常用的同位素标记物有3H、35S、125I和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高,背底较为清晰等优点,但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害,近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。 探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。cDNA探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。 原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。 菌落原位杂交(Colony in situ hybridization)菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上,然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将NDA烘干固定于膜上与32P 标记的探针杂交,放射自显影检测菌落杂交信号,并与平板上的菌落对位。 组织原位杂交(Tissue in situ hybridization)组织原位杂交简称原位杂交,指组织或细胞的原位杂交,它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA,然后进行杂交。而原位杂交是经适当处理后,使细胞通透性增加,让探针进入细胞内与DNA或RNA 杂交。 (一)探针的选择 根据不同的杂交实验要求,应选择不同的核酸探针。在大多数情况下,可以选择克隆的DNA 或cDNA双链探针。但是在有些情况下,必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和RNA探针。例如,在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针,在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针(通过克隆人M13噬菌体DNA获得)或RNA探针,寡核苷酸探针也可。长的双链DNA探针特异性较强,适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体,但不适宜于组织原位杂交,因为它不易透过细胞膜进入胞内或核内。在这种情况下,寡核苷酸探针和短的PCR标记探针(80~150bp)具有较大的优越性。 在选用探针时经常会受到可利用探针种类的限制。如在建立DNA文库时,手头没有筛选特定基因的克隆探针,这时就可用寡核苷酸探针来代替。但必须首先纯化该基因的编码蛋白,并测定6个以上的末端氨基酸序列,通过反推的核苷酸序列合成一套寡核苷酸探针。如果已有其它动物的同种基因克隆,因为人类和动物间在同一基因的核苷酸顺序上存在较高的同源性,因此可利用已鉴定的动物基因作探针来筛选人类基因克隆。对于基因核苷酸序列背景清楚而无法获得克隆探针时,可采用PCR方法扩增某段基因序列,并克隆人合适的质粒载体中,

荧光原位杂交技术原理及操作步骤

1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用,提高了定位的准确性。20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交,即FISH技术。1981年Harper 成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上,标志着染色体定位技术取得了重要进展。20世纪90年代,随着人类基因组计划的进行,由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要,FISH 技术得到了迅速的发展和广泛应用。 1.原理 FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的,二者经变性-退火-复性,即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛,可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应,经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。2.实验流程 FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。 3.特点 原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高,可以通过延长曝光时间加强信号强度,故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足,这就是FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系,具有以下优点:1、荧光试剂和探针经济、安全;2、探针稳定,一次标记后可在两年内使用;3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确;4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列,其灵敏度与放射性探针相当;5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列;6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化,也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。 缺点:不能达到100%杂交,特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。 4.应用 该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位,而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。 荧光原位杂交FISH操作规程 一、主要试剂 1变性液20SSC 4mlddH2O 8ml甲酰胺28ml 2PBD液1000ml 20SSC中加入1.25gTween20 二、操作流程 1 硅化玻片切片烤片60过夜 2 脱蜡入水斜置切片空干 3 2SSC洗涤三次每次5min下简写为35 4 0.2M HCl处理室温10接步骤3 5 0.25mg/ml 蛋白酶K处理室温1530接步骤3 6 切片入20梯度酒精脱水各2空干 7 切片入85变性液8 8 迅速入20梯度酒精脱水各2空干 9 杂交液85变性50冰浴10滴加至切片加盖玻片37过夜 10 反应体系中加入等体积的甲酰胺4510

EBER原位杂交过程

预先准备的试剂 胃酶浓缩液:将胃酶中加入 4 毫升的蒸馏水或去离子水,充分溶解后可根据使用量分装,冻存(-20 °C)。 胃酶稀释液:石蜡切片:将试剂瓶中的1NHCl 用蒸馏水或去离子水10 倍稀释,即成0.1NHCl 溶液 PBS配制:将一袋PBS粉末溶于1000毫升双蒸水,彻底溶解后加入Tween205 滴,混匀后使用。 DAB工作液配制:在1毫升5A中加入50微升的5B,临用前配制,未用完的液体应弃去。也可按照上述比例,根据实际需要量配制。 胃酶消化工作液的配制 每1cm2的切片按照300-400微升准备胃酶消化工作液,必须现用现配,未用完的胃酶工作液应弃去。 石蜡切片:将上述已分装好的胃酶浓缩液用已稀释至0.1N的HCI溶液100倍稀 释,例如可将15微升的分装胃酶浓缩液加入到1.5ml的0.1NHCI溶液中,混匀后备用。 所有的孵育步骤均应在密闭的湿盒中进行,避免试剂蒸发。一旦杂交程序开始,玻片不能干燥。 样品的收集和预处理 石蜡切片: 常规福尔马林缓冲液固定,时间不宜超过12 小时。石蜡包埋的温度不宜超过 65C。4-6微米的石蜡切片,56-60C烤片2-16小时。处理好的切片可以立即使用,也可放置于室温条件下保存(至少可保存3个月以上)。在做原位杂交之前,切片需经新鲜二甲苯脱蜡(10分钟X 2)。脱蜡后的切片在新鲜100%乙醇中放置5分钟后,经空气干燥5-10分钟即可进行酶处理。 酶处理(避免RNA 酶污染,带手套操作) 将切片放置于37C中,每张切片加入300-400微升新鲜配制的胃酶工作液孵育。石蜡切片孵育30分钟。弃去胃酶工作液后,逐级酒精脱水(70%、95%和100%),每个梯度放置 1 分钟。空气干燥后杂交。 杂交程序(避免RNA 酶污染,带手套操作) 杂交: 混匀探针溶液,在每张切片上加10-20微升适量的探针(试剂3),加盖盖玻片(注意防止气泡!)。湿盒中37C孵育2小时,杂交过夜效果更好。 冲洗: 将切片浸入PBS缓冲液中10分钟,直到盖玻片自然脱落,用PBS缓冲液冲洗切片2分钟X3次,取出切片,擦干多余的缓冲液。 检测和显色程序 切片上加入适量辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体(试剂4), 37C孵育30 分钟,PBS冲洗1分钟X 3次(期间可摇动容器数次),用蒸馏水或去离子水冲洗切片1分钟X 1次。 擦净切片边缘的水分,加入适量配制好的DAB 工作液。显色5-15分钟,注意光镜下观察显色情况。用蒸馏水或去离子水冲洗切片1分钟X3次后,即可进行封片或复染。 复染程序

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