免疫共沉淀实验原理及方法

免疫共沉淀实验原理及方法

免疫共沉淀（CoIP）概述及原理

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，属于免疫沉淀技术的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。

免疫共沉淀的优势：

与其他研究蛋白质相互作用技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相比，免疫共沉淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合，避免了人为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋白可信度更高。

免疫共沉淀的局限性和注意事项：

1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到；

2. 由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使用某一种pull-down抗体，无论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来，如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CoIP；

3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋白复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大；

4. 如果使用Western Blot的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白，则需要在试验前进行预测，具有一定的冒险性；当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事，并且成本较高；

5. CoIP鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用，进一步区分还需要进行GST-Pull down等实验检测；

6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使用复合物的任一成员进行CoIP都会得到其他所有成员[1]

免疫共沉淀的一般操作流程（中英文对照）：

1.用预冷的PBS洗涤细胞两次；

2.Carefully wash cultured cells with pre-chilled PBS for 2 times.

3.

4. 2. 加入预冷的RIPA裂解缓冲液（107细胞加入1ml）；

5.Add in cold RIPA lysis buffer (1ml for 107cells).

6.

7. 3. 用预冷的细胞刮将细胞从培养介质上刮离，并转移到干净的管中。并置于低速摇床，

4℃缓慢晃动15min；

8.Scrap cells off to clean eppendorf tubes with a clean, cold scraper. Put them

on a low-speed rotating shaker for 15 mi n at 4°C.

9.

10.4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中

11.Centrifuge at 14,000 g 4°C for 15min, transfer the supernatant to new tubes

immediately.

12.

13.5. 将Protein A/G-agarose微球用PBS 洗两遍，用PBS配制成50%的protein

A/G-agarose工作液；

14.Wash protein A/G-agarose beads for 2 times with PBS and make a 50% protein A/G

agarose working solution (in PBS)

15.

16.6. 在样品中以每1ml中加100μl的比例，加入50%的Protein A/G agarose工作液。

水平摇床4℃摇动10min（该步骤的目的是去除非特异性结合的蛋白）

17.Add in 50% protein A/G agarose with ratio of 100μl for a 1ml sample solution.

Shake on horizontal shaker for 10min, 4°C (This step aims to eliminate non-specific binding proteins)

18.

19.7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除protein A/G-agraose

微球；

20.Centrifuge 14,000g at 4°C for 15min, transfer the supernatant to new tubes and

discard protein A/G-agraose beads

21.

22.8. 使用BCA法或者其他方法测定总蛋白的浓度

23.Quantify total protein with BCA assay or other methods.

24.

25.9. 用PBS将总蛋白稀释到1 μg/μl以降低裂解液中去垢剂的浓度。如果你觉得你的

目的蛋白的浓度低了，你可以将总蛋白浓度提高到10 μg/μl（假设浓度够的话）

26.Dilute the total protein to 1μg/μl with PBS to decline the concentrations of

detergents. If you feel the concentration of your target protein is low, you can dilute the total protein to 10μg/μl. (if it’s high enough)

27.

28.10. 加入一定体积的一抗，至总体积约为500μl；

29.Add in appropriate amount of primary antibody to approximately 500μl total

volume.

30.

31.11. 用摇床缓慢摇动抗原抗体混合物，4℃过夜

32.Slowly shake antigen-antibody complex on rotating shaker at 4°C for overnight.

33.

34.注意：如果如果下游用于激酶或磷酸酶的酶活测定，则最好将11步改为室温孵育2h；

35.Note: if downstream experiment is enzyme activity assay for kinase or phosphatase,

it’s better to change step 11 to a 2h incubation at roo m temperature.

36.

37.12. 14000g离心5s，收集沉淀，并且用预冷的洗涤缓冲液（或者预冷的PBS）洗涤3

遍（每次加入800μl）

38.Centrifuge 14,000g for 5s, keep the pellet and wash with pre-chilled washing

buffer (or cold PBS) for 3 times. (800μl each)

39.

40.13. （用合适体积的上样缓冲液重悬）收集上清，用于进一步的下游SDS-PAGE，

western-blot或者质谱分析

41.Collect the supernatant to proceed to SDS-PAGE, western-blot, or mass spectra

analysis.

42.

43.注意：该CoIP操作步骤是将抗体先结合到Protein A/G-argarose微球上，然后再与抗

原混合。相对其他方法，最终的得率较低，但避免了抗体共洗脱的问题。如果你希望获得高纯度的目的蛋白，而不考虑非特异性结合的话，你可以将抗体和蛋白样品在加入Protein A/G-argarose微球之前进行混合，这样最后抗体也会和目的蛋白一同被洗脱下来，从而可能会对western blot检测造成干扰。

44.Note: This Co-IP protocol is to bind antibody to the Protein A/G-argarose beads

and then mix with the antigen. It gives lesser yield than the other one and avoids the problem of co-elution of antibodies. If you want to yield high purity of target protein regardless of non-specific binding, you can mix antibody with protein sample prior to addition of Protein A/G-agarose beads, thus in the end the antibodies are also co-eluted with target protein and interference might occurs in western blot detection.[2]

参考资料：

1. 1. Immunoprecipitation-wikipedia;

2. 2. Co-Immunoprecipitation (Co-IP) Background&Protocol;

医学免疫学实验教学大纲

《医学免疫学》实验教学大纲 实验名称：医学免疫学 学时：6学时 学分： 适应专业：护理学专业 执笔人：边藏丽 审定人：王恺兵 一、实验目的与任务 实验教学是医学免疫学教学的重要组成部分，通过实验教学加深对基础理论知识的理解，了解常用的免疫学检查方法，掌握免疫学基本实验技术（试管凝集、玻片凝集、对流免疫电泳、免疫细胞形态观察、淋巴细胞分离、ELISA等），培养学生严谨求实的科学态度以及观察、分析、综合能力、创造思维能力和初步的科研能力。 二、教学基本要求 医学免疫学实验对象多为具有传染性的材料，要求学生在实验教学中严格遵守实验室规则，牢固树立无菌观念，认真操作与观察实验结果，实事求是的记录实验结果，并对实验结果进行认真分析和讨论。 四、实验教学内容及学时分配 实验一凝集反应（试管凝集、玻片凝集） 3学时 1．目的要求 掌握体外抗原抗体反应的特点和影响因素；掌握凝集反应原理、方法和用途。 2．方法原理 颗粒性抗原与相应抗体在一定条件下特异性结合而出现肉眼可见的凝集现象。 3．主要实验仪器及材料 试管、玻片、水浴箱、吸管、伤寒杆菌“H”“O”诊断菌液、大肠埃希菌、大肠埃希菌

诊断血清等。 4．掌握要点 掌握凝集反应原理、方法和用途；血清效价；凝集现象的观察。 5．实验内容： （1）玻片凝集（抗原定性试验） （2）试管凝集（抗体定量试验） 实验二对流免疫电泳、血型鉴定 2学时1．目的要求 掌握沉淀的反应原理、方法和用途；了解对流免疫电泳的操作步骤，结果观察；掌握血型鉴定的反应原理、方法及结果判断。 2．方法原理 对流免疫电泳是将经典沉淀反应与电泳技术结合而设计的一项实验。沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在一定条件下发生结合并出现肉眼可见的沉淀物的一种血清学反应。 带电的胶体颗粒可在电场中移动，其移动方向与胶体颗粒所带电荷有关。抗原在的缓冲带负电荷，将抗原加于琼脂板阴极端的小孔中，由阴极向阳极移动；抗体为球蛋因电渗作用而流向阴极。当抗原抗体在两孔间相遇时，在两者比例适当处形成白色沉淀线。此种在双向琼指扩散基础上加电泳的方法，称为对流免疫电泳。 血型鉴定属直接凝集反应。将已知标准抗A和抗B血型抗体分别与待测红细胞混合。如果抗原与抗体相对应，则引起红细胞凝集，反之则不凝集，据其凝集现象可判断血型。 3．主要实验仪器及材料 标准的抗A和抗B单克隆抗体（抗A为蓝色，抗B为黄色）、酒精棉球、采血针、载玻片、待测血清、甲胎蛋白诊断血清，肝癌病人阳性血清， L巴比妥缓冲液，琼脂对流免疫板、打孔器、加样器、电泳仪等。 4．掌握要点 （1）对流免疫电泳的操作步骤，结果观察； （2）血型鉴定的方法及结果判断。 5．实验内容： （1）讲述沉淀的反应原理、方法和用途；对流免疫电泳的操作步骤，结果观察；血型鉴定的反应原理、方法及结果判断； （2）对流免疫电泳的操作及结果观察； （3）血型鉴定的操作及结果观察； 实验三小鼠吞噬细胞及转化细胞形态观察 2学时 1.目的要求 观察吞噬细胞的吞噬现象；了解机体的非特异性免疫功能。观察转化细胞、淋巴母细胞的形态了解机体的特异性免疫功能。 2．方法原理 巨噬细胞可吞噬异种或异体细胞等体积较大的异物，中性粒细胞可吞噬多种细菌。观察这两类细胞的吞噬现象，可计算出吞噬异物的细胞数和吞噬细胞中吞入的异物数，用以评价机体的免疫状态。 淋巴细胞，在受抗原的刺激后，可转化为淋巴母细胞，淋巴细胞转化率的高低可反映机体细胞免疫水平。

免疫共沉淀步骤

United States/Canada 800.662.2566Asia Paci?c +1.650.919.7300Europe +33.(0)1.3904.6880Japan +81.(0)77.543.6116Clontech Laboratories, Inc.A T akara Bio Company U s e r M a n u a l Antibodies Protocol Guide PT3407-1 (PR99224) Published 14 September 1999

Antibodies Protocol Guide Table of Contents I. Introduction 3 II. Materials Required 3 III. Western Blotting 4 A. Preparation of Cell Lysate and Electrophoresis 4 B. Western Blotting 5 IV. Immunoprecipitation 6 A. Preparation of Cell Lysate 6 B. Immunoprecipitation 7 V. Immunofluorescence and immunocytochemistry 8 A. Sample Preparation 8 B. Immunofluorescence 9 C. Immunocytochemistry 9 VI. ELISA 11 VII. References 12 Notice to Purchaser Clontech products are to be used for research purposes only. They may not be used for any other purpose, including, but not limited to, use in drugs, in vitro diagnostic purposes, therapeutics, or in humans. Clontech products may not be transferred to third parties, resold, modified for resale, or used to manufacture commercial products or to provide a service to third parties without written ap-proval of Clontech Laboratories, Inc. Clontech, the Clontech logo and all other trademarks are the property of Clontech Laboratories, Inc. Clontech is a Takara Bio Company. ?2006

免疫学实验指导

实验一免疫球蛋白的粗提（盐析法） 一、实验目的 1、学习免疫球蛋白的粗提方法 2、实践IgG分离纯化过程 3、了解分离纯化抗体的原理 二、实验原理 随着免疫学的发展和需要，免疫球蛋白的纯化和其成分的提纯成为必不可少的手段。纯化的方法很多，有单一法，常用盐析法、凝胶柱层析、离子交换剂层析以及免疫亲和层析等技术对血清抗体进行分离纯化。但大多数采用二步法以上相结合的方法，特别是以硫酸铵提纯为基础，再经过透析或层析柱的方法来提高免疫球蛋白及其各成分的纯度最为常用。硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来（称为盐析）。不同浓度的硫酸铵盐析蛋白成分不同，利用这一原理提取所需的免疫球蛋白成分。盐析只能粗提，为了获得纯化的免疫球蛋白成分，必须进一步采用层析的方法进行分离。 水膜与同性电荷的排斥作用是蛋白质胶体稳定的基础，在蛋白质胶体溶液中加入一定量的（NH4）2SO4或Na2SO4盐类，使溶液中大部分自由水分子转变为离子水化分子，降低蛋白质极性基团与水分子的相互作用，破坏蛋白质水膜，蛋白质溶解度也随之降低。蛋白质由于分子质量和携带的电荷不同，可在不同浓度的高盐溶液内分级析出。33% （NH4）2SO4为沉淀IgG的最适饱和度。

二、实验材料与试剂配制 1．人全血清（购买商品） 2．硫酸铵饱和溶液 硫酸铵800g~850g H2O 1 000ml 加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH 调pH至7.0（不调pH值也可以）。 注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。 3．0.01Mol/L pH7.4 PBS液 A液：0.10Mol/L NaH2PO4液 NaH2PO4·2H2O 15.60g

免疫共沉淀实验原理与方法

免疫共沉淀实验原理及方法 免疫共沉淀（CoIP）概述及原理 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，属于免疫沉淀技术的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。 免疫共沉淀的优势： 与其他研究蛋白质相互作用技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相比，免疫共沉淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合，避免了人为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋白可信度更高。 免疫共沉淀的局限性和注意事项： 1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到； 2. 由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使用某一种pull-down抗体，无论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来，如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CoIP；

3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋白复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大； 4. 如果使用Western Blot的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白，则需要在试验前进行预测，具有一定的冒险性；当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事，并且成本较高； 5. CoIP鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用，进一步区分还需要进行GST-Pull down等实验检测； 6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使用复合物的任一成员进行CoIP都会得到其他所有成员[1] 免疫共沉淀的一般操作流程（中英文对照）：

免疫药理学方法与技术简介

第六节免疫药理学实验方法与技术简介 免疫药理学是介于免疫学和药理学间的边缘学科，主要研究药物对机体免疫系统和免疫功能的作用及其机制，为某些疾病药物治疗提供理论基础。 免疫药理学方法一般是采用体外的试管内研究和体内的整体研究相结合，体外试验研究可澄清药物对免疫应答某一特定环节如T细胞增殖、细胞因子等产生的具体影响，而整体研究则可探讨药物对抗原介导的的免疫应答、正常的体液免疫及细胞免疫功能、同种异体移植排斥反应、异常免疫应答如超敏反应和自身免疫病以及初次及再次免疫应答等的影响。在未来免疫药理学的研究领域中，基因工程、基因治疗、细胞因子治疗以及其它各种生物治疗的研究和应用将是研究的热点和前沿区域。 一、免疫细胞的分离与纯化 体内外的免疫药理学实验研究都需要从动物或人的血液或淋巴组织中分离免疫细胞，获得高纯度的免疫细胞是进行本研究的最基本的前提条件。 外周血中白细胞的分离常用自然沉降法和高分子聚合物沉降法；外周血单个核细胞（peripheral mononuclear cells，PMNC）分离多采用密度梯度离心法。 从淋巴组织中分离淋巴细胞悬液---制备脾细胞悬液、淋巴结细胞悬液、胸腺细胞悬液。 淋巴细胞的分离纯化包括：①分离PMNC中的淋巴细胞和巨噬细胞常用方法有玻璃粘附法、磁铁吸引法、羰基铁乳胶分层液法、补体溶解法及葡聚糖凝胶过滤法等。②T细胞、B 细胞及T细胞亚群的分离纯化常用技术：E花结分离法、Percoll非连续性密度梯度离心分离法、洗淘法（panning）、补体细胞毒法、尼龙毛分离法、磁性激活细胞分离器（magnetic activated cell sorter，MACS）分离技术及流式细胞术（flow cytometry，FCM）。 二、药物对免疫系统功能影响的实验技术简介 1、对免疫细胞表面抗原分子的影响对细胞表面的CD（cluster of differentiation，分化簇）抗原的检测与分析可通过细胞毒法、葡萄菌体蛋白A法、免疫细胞化学法和免疫荧光染色分析法等，借助流式细胞仪进行的免疫荧光染色分析法使该项技术的标准化、定量化和自动化水平大大提高，体内外药理试验均可采用之。 2、对免疫细胞功能的影响常用：3H-TdR掺入试验、固相抗CD3单克隆抗体诱导细胞增殖的检测、混合淋巴细胞反应、抗原刺激的T细胞增殖反应、预激淋巴细胞对抗原的增殖反应等。 3、淋巴细胞功能的体内实验小鼠接触性超敏反应、移植物抗宿主反应（graft-versus-host disease，GVHD）、迟发性超敏反应（delayed-type hypersensitivity，DTH）、体内检测T H细胞活性。 4、对B细胞影响的体内外实验血清中IgG、IgA、IgM的测定（单向免疫扩散法、散射比浊法）；抗体生成细胞检测（溶血空斑试验、溶血分光光度法）。 5、对单核巨噬细胞功能的影响实验巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、白色念珠菌3H葡萄糖掺入实验、单核巨噬细胞对肿瘤细胞的细胞毒反应测定、单核因子测定等。 6、对超敏反应影响的体内外实验总IgE水平测定：酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、放射免疫单扩散法（radioactive single radial diffusion，RSRD）、免疫斑点法（dot immunobinding assay，DIBA）、反向被动血凝法（reversed passive hemagllutination assay，RPHA）、纸片放射免疫吸附试验（paper radio immunosorbent test，PRIST）。特异性IgE抗体测定：ELISA、放射过敏原吸附试验（radioallergosorbent test，RAST）、P-K试验、被动皮肤过敏反应（passive cutaneous anaphylaxis，PCA）、皮内试验（intradermal test）。人外周血单个核细胞体外合成IgE的测定：微量固相放射免疫测定法（microtiter solid-phase

免疫共沉淀中文使用说明书(Pierce26149)

Pierce? Co-Immunoprecipitation (Co-IP) Kit（26149） 中文说明书 介绍： Thermo 公司的Pierce?免疫共沉淀试剂盒，可通过将铆钉抗体固定在琼脂 糖支撑物上，从裂解液中或其他复杂混合物中，分离出天然蛋白复合物。Co-IP 是一种研究蛋白与蛋白相互作用通用的方法，该方法使用一种诱饵蛋白与抗原 进行免疫沉淀反应，然后可通过免疫共沉淀任何与诱饵蛋白具有相互作用的猎 物蛋白。传统的Co-IP方法使用蛋白A或G共同洗脱抗体的重链和轻链，这很 可能导致将相关的蛋白一起洗脱下来，掩盖一些重要的结果。Pierce?免疫共沉 淀试剂盒通过将共价结合抗体固定在一个胺类活性反应树脂上解决了这一问题。该试剂盒包含足够的用于蛋白结合和恢复的缓冲液，完成对照试验的高校离心 柱和收集管，这些产品进一步缩短了操作实验的时间。 重要产品信息： 略 Co-IP实验步骤： A.抗体固定 注意：以下试验步骤是针对用无胺和其他载体蛋白稀释的10-75μg亲和纯 化抗体（参考重要产品信息一节）。根据实际使用比例参考这一协议步骤。参 考重要产品信息节表1中的建议抗体用量和树脂体积用量。 1.室温平衡胺连接耦合树脂（AminoLink?Plus Coupling Resin）和试剂； 2.为每个Co-IP反应准备2ml 1×Coupling Buffer（超纯水稀释20×Coupling Buffer）；

3.轻轻涡旋混匀装有AminoLink?Plus Coupling Resin的瓶子，使其处于悬浮状态。使用大口径（或剪掉一段枪头端），添加50μl树脂悬液到Pierce提供的离心柱中，将离心柱放入微量离心管中，1000g离心1min，弃滤液； 4.添加200μl 1×Coupling Buffer 清洗树脂2次，离心弃滤液； 5.将离心柱放于纸巾上，轻巧离心柱底部，去除剩余的液体，插上底塞； 6.准备10-75μg亲和纯化抗体用于结合蛋白，调整体积至200μl，使用足够的超纯水和20×Coupling Buffer来制备1×Coupling Buffer。例如：添加10μl 20×Coupling Buffer，180μl超纯水和10μl浓度为1μg/μl。可直接添加含有超纯水、20×Coupling Buffer、亲和纯化抗体的树脂在离心柱中。 7.在通风厨中，每200μl反应体系，添加3μl氰基硼氢化钠溶液； 注：氰基硼氢化钠属剧毒物质，操作时要小心并穿戴防护服。 8.拧紧离心柱上螺帽，室温涡旋孵育90-120min，确保浆体在孵育过程中处于悬浮状态； 9.握紧底塞，拧开并拿走螺帽，将离心柱置于收集管中离心，保存滤液以便验证抗体耦合； 10.打开螺帽，添加200μl 1×Coupling Buffer，离心弃滤液，重复此步骤1次； 11. 向离心柱中添加200μl Quenching Buffer，离心弃滤液； 12. 将离心柱放于纸巾上，轻巧离心柱底部，去除残留液体，插上底塞。在树脂上添加200μl Quenching Buffer； 13. 在通风厨中，添加3μl氰基硼氢化钠溶液，拧紧螺帽；轻轻摇动并孵育15min； 14.取出底塞，拧开螺帽，将离心柱置于一收集管中，离心弃滤液； 15.打开螺帽，采用200μl 1×Coupling Buffer洗脱树脂，离心。再次重复此步骤； 16.用150μl Wash Solution洗脱树脂6次，每次洗脱后离心； 17.不管是进行细胞裂解、Co-IP，还是储存树脂，都需要继续进行下列步骤； 18.用200μl 1×Coupling Buffer洗脱树脂2次，每次需离心；

微生物免疫学实验报告

1实验内容： 2显微镜油镜的使用与保护。 3细菌的形态与结构的观察。 4实验目的： 5学会显微镜的使用，重点掌握油镜的使用与保护。 6进一步认识细菌的形态，明确细菌的大小与测量单位。 7熟悉细菌的特殊结构。 8实验材料： 显微镜、擦镜纸、液体石蜡、消毒液、细菌的基本形态标本、细菌的特殊结构标本。 4实验方法： (1)显微镜油镜的使用与保护 显微镜是一种贵重的光学仪器，而油镜又是显微镜的最精密部分，是观察细菌最重要的 工具。因此，要求大家必须熟练地掌握显微镜的使用和保护，尤其是油镜，避免损坏。 1识别油镜：95╳、100╳、HI、OeL。 2对光：自然光用平面反光镜，人工光用凹面反光镜；先用低倍镜对光，次用高倍镜。对好光源后，染色标本将聚光器升高，光圈放开。 3、调节焦距：选一张细菌染色标本置于载物台上，用推进器固定，用低倍镜先找准物象，再用高倍镜看清物体，于标本上加镜油一滴。 ⑴用眼从侧面观察，转动粗螺旋调节器，将油镜头徐徐下降浸入其中，切不可用力过猛，以免损坏油镜。 ⑵用左眼从接目镜观察，徐徐向上转动粗螺旋调节器，见模糊物象后，再用细螺旋调节器，直到物象完全清晰为止。 4、显微镜的保护： ⑴所有的光学部分结构都不能用手指、普通布擦拭，用过的油镜头应立即先用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭，再用干擦镜纸擦去二甲苯，以防二甲苯镜头上的固定胶，致使镜片脱落。 ⑵显微镜的光学部分应避免日光直射。避免接触强酸、强硷、氯仿、酒精。 ⑶显微镜用毕，将物镜转成品字形并下降集光器和镜筒，用软布擦拭各部件后覆盖于接目镜上，双手端平送入镜箱内。置于干燥处，以防受潮。 (二)细菌形态观察

1、细菌的基本形态；球菌：肺炎球菌、脑膜炎球菌、葡萄球菌、链球菌杆菌：大肠杆菌、炭疽杆菌、结核杆菌、白喉杆菌弧菌：霍乱弧菌 2、细菌的特殊结构： 荚膜：肺炎球菌、产气荚膜杆菌 鞭毛：水弧菌（周毛菌） 芽胞：破伤风杆菌（芽胞位于菌体顶端，呈鼓槌状）

免疫共沉淀详细顺序

精心整理 免疫共沉淀详细步骤 实验原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互白质Y beads ）蛋1.RIPABuffer 配制： 基础成分： Tris-HCl （缓冲液成分，防止蛋白变性） NaCl （盐份，防止非特异蛋白聚集）

NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液） 去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存） 注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。 RIPA蛋白酶抑制剂 EDTA RIPA 激活的 NaF（ 2. 配制 1) 直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4 2)加10ml10%的NP-40 3)加2.5ml10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清 4)加1ml100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存

5)理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂各100μl；PMSF，Na3VO4，NaF各500μl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。 各种成分在工作液中的终浓度： 预冷PBS，RIPABuffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机 1.用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS； 2.加入预冷的RIPABuffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶， 0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)； 3.用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）；

免疫学实验报告

免疫实验—抗血清制备及抗体效价检测 摘要：用具有抗原性的物质牛血清白蛋白（BSA)注入到健康动物例如鼠、兔的 机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。抗血清，是指含有免疫蛋白的血清。抗体效价指抗体的物理状态及其在体内滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。此次实验主要是进行小鼠的牛血清白蛋白（BSA)抗血清的制备过程，并通过酶免疫吸附试验（ELISA）对其进行抗体效价检测。 关键字：牛血清白蛋白（BSA) 抗血清抗体效价免疫 实验过程： 本次实验一共分为三个分实验： 实验一：免疫 实验二：抽血、放血，分离抗血清 实验三：ELISA测定抗体效价 实验一：免疫 一、抗血清制备的原理 用具有抗原性的物质注入到健康动物的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。二、目的 制备高效价的抗血清 三、实验仪器、材料和试剂 实验仪器：1mL 注射器，酒精棉球，剪刀 材料：家兔，小鼠 试剂：3％～5％苦味酸溶液或80％～90％苦味酸，牛血清白蛋白（BSA) 三、方法和步骤 1、动物编号 左前腿上部为1，左腰部为2，左后腿为3，头部为4，背部为5，尾基部为6，右侧从前至后依次为7、8、9。红色表示十位数,用黄色表示个位数。免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。

如下图所示抓取目标动物 家兔为300～600 μg/次（400），每次不超过2mL；小鼠为10～100 μg /次（10-20，20~40 μg / ml），每次不超过0.5mL。 小鼠腹腔注射 以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推 0.5～1.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液， 为避免伤及内脏，可使动物处于头低位，使内脏移向上腹。

组织免疫共沉淀方法(试题学习)

论坛里发的都是关于细胞的免疫共沉淀的实验方法,这是我做组织时用到的方法,希望能给大家有点帮助 实验方法如下: 第一步：制备组织裂解物 1. 把组织剪切成细小的碎片。 2. 融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。 3. 按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。) 4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。 5. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。 6. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。 或 1. 使用洁净的工具用最快的速度切取待测组织。最好在冰上操作。以防止蛋白降解 2. 将组织放入圆底离心管中，浸入液氮以达到“snap freeze”. 如果马上裂解则将组织冰浴，否则将组织保存-80°C以备后用。 3. 每5mg组织加入300ul裂解液，使用玻璃匀浆器匀浆，直至充

分裂解。 4. 用300ul裂解液冲洗刀片两次，然后将组织液在4°C缓慢摇动2小时 5. 12000rpm 4°C.离心20分钟。轻轻的将离心管取出冰浴，将上清吸出到新的预冷的离心管中（保持冰浴），弃沉淀。 裂解液的体积要根据组织量来确定。蛋白提取物不能太过稀释一方面避免蛋白的损失，另一方面也减少后续电泳的上样量（如果需要的话）。蛋白的合适浓度为1-5 mg/ml ，最低不能少于0.1 mg/ml。第二步：预纯化裂解物 使用无关抗体或血清可以将裂解物非特异性结合Ig的蛋白去除，随后加入的agarose beads一方面将裂解物中非特异结合agarose 或sepharose beads的蛋白去除，另一方面也将加入的无关抗体和血清蛋白去除。经过处理的裂解物所得试验结果背景更低、信噪比更好。但如果最后是使用WB来检测的话，预纯化就不是特别的必要了。 主要步骤： 1. 每1ml裂解物加入50ul和IP抗体来源及亚型相同的无关抗体（例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG）或者正常血清（常用兔血清），冰浴1小时 2. 加100 μl Preotein A/G agarose beads，4°C缓慢摇动10-30分钟 3. 14,000 x g 4°C离心10分钟 4. 取上清，弃沉淀

免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法

免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法 一、基本概念 免疫沉淀（immunoprecipitation）是利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。 免疫共沉淀（coimmunoprecipitation）是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。与酵母双杂交技术不同，免疫共沉淀技术所利用的是抗原和抗体间的免疫反应，是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法。 不难看出，免疫共沉淀与免疫沉淀技术所使用的原理与方法大致相似，所不同的是，在免疫共沉淀中，对靶蛋白的结合与沉淀由另一个与之发生相互作用的蛋白替代。在免疫共沉淀或免疫沉淀的基础上，通过进一步与其它技术的结合，如聚丙烯酰胺凝胶电泳，还可进一步对靶蛋白的的分子量等特性进行鉴定。 二、抗体的选择 （一）多克隆抗体 多克隆抗体因其制备相对简单，可与靶蛋白分子的多个位点结合，所形成的抗原抗体复合物较稳定因而应用的最为广泛。但多克隆抗体的缺点在于非特异性结合较多，常会导致反映本底（是否是背景）升高和一定的假阳性结果。 （二）单克隆抗体 与多克隆抗体相比，单克隆抗体往往只结合一种抗原表位，具有单一结合特异性，所以发生非特异结合的机会少，可被用于确定靶蛋白上某一部位的特殊结构，甚至可被用于区分相同靶蛋白的不同形式如构象变化和修饰。但反过来，单克隆抗体仅与单一表位结合的特性也会引起具有同一表位的不同靶蛋白间的交叉反应。 三、免疫沉淀方法 免疫沉淀的靶蛋白一般来自细胞裂解液，可以是被同位素标记的也可以是未被标记的。若为前者，免

免疫学实验整理

免疫学实验整理 一、凝集试验、吞噬试验 （一）凝集试验 1、直接凝集反应（ABO血型鉴定） 2、间接凝集反应（类风湿因子测定） 3、金黄色葡萄球菌协同凝集试验 （二）吞噬试验（示教） 1、中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬） 2、巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬） 名解： 1.免疫学检测技术：利用免疫学原理来检测抗原、免疫分子（抗体、补体、细胞因子和粘附分子等）及免疫细胞等免疫学研究对象的实验过程。如凝集反应可用于检测抗原抗体，吞噬十堰可用于检测免疫细胞等。 2.凝集反应（agglutination reaction）:在一定浓度的电解质溶液中，颗粒性抗原与相应抗体结合后，出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。 3.直接凝集反应（direct agglutination reaction）:细菌、细胞等颗粒性抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝集反应。 4.间接凝集反应（indirect agglutination reaction）：将可溶性抗原或抗体先吸附于适当大小的颗粒性载体表面（这种载体与免疫无关），然后与相应抗体或抗原结合，在适量的电解质存在下，出现特异性凝集现象，称为间接凝集反应。 5.协同凝集实验（coagglutination）：利用金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）能与人和多种哺乳动物IgG的Fc段结合而不影响其Fab段功能的特性，将已知的特异性抗体吸附于金黄色葡萄球菌上，与相应的抗原发生的凝集反应即为协同凝集试验。 6.滴度（titer）、效价：The maximum dilution that gives obviously visible agglutination (++) is called the titer. 实验及注意点： 1、检测抗原抗体的基本原则：根据抗原抗体结合反应的高度特异性，用已知抗体（抗原） 检测未知抗原（抗体），有现象则说明有相应抗原，无现象则无相应抗原。

医学免疫学实验设计例子

《医学免疫学》实验设计 期别:xxx 班级:xx 学号:xxxxxxxx 姓名:OOO IL-35对小鼠Ⅰ型糖尿病的治疗效果及免疫机制 【立题依据】 自身免疫性疾病(Autoimmune diseases)是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。如今越来越多的自身免疫性疾病被不断发现和认识,也越来越引起人们的关注。Ⅰ型糖尿病(T1DM 自身免疫性胰腺炎)就是其中的一员,在全球大约有2000万患者,中国至少有100万的患者,但是Ⅰ型糖尿病常常在幼儿和青少年时期发生且为一种多基因遗传病有较高的遗传度(75%),表现为明显的家族遗传性。同时,Ⅰ型糖尿病患者如治疗不善将引发严重的并发症,如失明、肾衰竭、心脏病、截肢等。因此如果能正确了解Ⅰ型糖尿病的免疫学机制,并探索更加有效治疗及预防方案,对于患者本身乃至整个家族的身体和生活质量的提高意义重大。 Ⅰ型糖尿病的免疫学发病机制是体内除了抗原提呈细胞(APC)和活化的T淋巴细胞外正常细胞几乎不表达MHC-Ⅱ类分子,研究表明IFN-γ转基因小鼠的胰岛β细胞分泌IFN-γ,由于IFN-γ刺激MHC-Ⅱ分子的表达这种小鼠的胰岛β细胞高表达MHC-Ⅱ类分子,这样以来免疫细胞就会结合并识别胰岛β细胞然后对其进行攻击,使其丧失胰岛素分泌活性,最终导致体内胰岛素缺乏。调节性T细胞(Treg)是一些CD4+T cell还可高表达IL-2受体的α链(CD25)分子,胞质中表达Foxp3转录因子的T细胞分化亚群。它的主要功能是通过抑制CD4+ Tcell 和CD8+ Tcell的活化与增殖从而达到免疫的负调节作用。通过协调Treg水平来调节Ⅰ型糖尿病患者的免疫功能可能成为新的治疗手段。 白细胞介素-35(IL-35)是2007年新发现的一种独特的具有免疫抑制功能的调节因子,属于IL—12细胞因子家族,IL-35为异源二聚,主要由活化的Treg分泌,对

免疫学实验

实验一、免疫细胞的形态观察 一、实验目的 1、掌握微量采血及血涂片的制作方法。 2、在光学显微镜下观察免疫细胞。 二、实验原理 血涂片是临床化验中最常规的技术，也是血液学研究中的最基本技术。将血液样品制成单层细胞的涂片标本，经瑞氏（Wright）染液染色后，不同免疫细胞中的颗粒可以呈现不同的颜色。根据细胞中颗粒的颜色大小及多少，再结合细胞的大小及细胞核的形态，就可以将免疫细胞进行分类计数。 三、实验器材 1、器材：医用一次性采血针、酒精棉球、经脱脂洗净的载玻片。 2、试剂：瑞氏（Wright）染液，瑞特氏染料0.1克溶于60mL甲醇中，过滤。贮藏褐色瓶中备用。（配制时，要先将瑞特氏染料置研钵内边研磨边滴加甲醇，使染料溶解的更好。） 四、实验步骤 1、采血 采血前用75%酒精棉球消毒人的指腹或耳垂，干后用采血针刺破指腹或耳垂的皮肤；动物采血时先将耳部剪毛，酒精消毒后刺破动物耳部皮肤，挤去第一滴血不要（因含单核细胞较多）。 2、涂片 挤出第二滴血置于载玻片的一端，再取另一张边缘光滑的载玻片，斜置于血涂片的前缘，先向后稍移动轻轻触及血滴，使血液沿玻片端展开成线状，两玻片的角度以30~40度为宜（角度过大血膜较厚，角度小则血膜薄），轻轻将载玻片向前推进，即涂成血液薄膜（如图），推进时速度要一致，否则血膜成波浪形，厚薄不匀。

3、染色 待涂片在空气中完全干燥后，滴加数滴瑞氏染液盖满血膜为止，染色1~3min。然后滴加等量的缓冲液（pH6.4）或蒸馏水冲去染液，吸水纸吸干，镜检。 4、封片 经染色的涂片完全干燥后，用中性树胶保存。 5、观察 分别用低倍、高倍和油镜观察血涂片，分辨不同的血细胞类型。 五、实验结果 拍摄血细胞照片，标出并分析比较各种免疫细胞类型和形态特征。

免疫共沉淀操作步骤

免疫共沉淀操作步骤 具体步骤： 1. 细胞用预冷的PBS液洗涤2次，最后洗涤完成后吸干PBS液。 2. 加入预冷的RIPA Buffer（1ml/107个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶）。 3. 刮留细胞：用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶中上刮下，将悬液转入 1.5mlEP 管中，EP管插冰上，置于水平摇床上缓慢晃动15min。 4. 4℃，14000g离心15min。 5. 立即将上清液转移到一个新的离心管中。 6. 准备Protein A琼脂糖，用PBS液洗两遍珠子，然后用PBS液配制成50%浓度。 *为避免操作中破坏琼脂糖珠，减掉移液器枪头的尖部分。 7. 每ml总蛋白中加入100ul Protein A琼脂糖珠（50%），EP管插冰上，置于水平摇床上4℃摇晃10min。 *目的是去除非特异性杂蛋白，可降低背景。 8. 4℃，14000g 离心15min，将上清转移到一个新的离心管中。 9. 测定蛋白浓度，可选用Bradford法做蛋白标准曲线。 10. 蛋白定量，分装，-20℃保存，可保存1个月。 11. 用PBS液将总蛋白稀释至约1ug/ml。 12. 加入500ul稀释好的兔抗到总蛋白中。 13. 于摇床上4℃缓慢摇动抗原抗体混合物，可选择过夜或室温放置2h。 14. 加入100ul Protein A琼脂糖珠用以捕捉抗原抗体复合物，摇床4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或者室温孵育1h。 15. 14000rpm瞬时离心5s，去上清，收集琼脂糖珠-抗原抗体的复合物。 16. 用800ul预冷RIPA buffer冲洗3遍。

17. 用60ul 2倍上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻敲打混匀。 18. 将上样样品煮5min。 19. 14000g离心，收集剩余琼脂糖珠。 20. 将上清电泳，电泳前应再次煮5min变性。 21. 上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳。 基础成分 （1）Tris-HCl（防止蛋白变性的缓冲液成分） （2）NaCl（防止非特异性蛋白聚集的盐分） （3）NP-40（用H2O配置成10%储存液。NP-40为非离子去污剂，用于提取蛋白） （4）去氧胆酸钠（用H2O配置成10%储存液；提取蛋白用离子去污剂；避光保存） *因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失，准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠。

关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结

关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结 ChIP实验原理 在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 可以利用ChIP研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）的关联性。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。 一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。 ChIP实验步骤 第一天：

（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。 1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml） 2、37摄氏度孵育10min。 3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。 450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。 4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。 6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。 假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。 将2管混在一起，共800ul。 7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。当然，如果实验室有Bioruptor这种神器的话那就轻松了。 （二）、除杂及抗体哺育。 8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。去除不溶物质。 留取300ul做实验，其余保存于－80度。 300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul 加入4ul 5M NaCl （NaCl终浓度为0.2M），65度处理3h解交联，跑电泳，

常用免疫学检验技术的基本原理

常用免疫学检验技术的基本原理 免疫学检测即是根据抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原。由于外源性和内源性抗原均可通过不同的抗原递呈途径诱导生物机体的免疫应答，在生物体内产生特异性和非特异性T 细胞的克隆扩增，并分泌特异性的免疫球蛋白（抗体）。由于抗体－抗原的结合具有特异性和专一性的特点，这种检测可以定性、定位和定量地检测某一特异的蛋白（抗原或抗体）。免疫学检测技术的用途非常广泛，它们可用于各种疾病的诊断、疗效评价及发病机制的研究。 最初的免疫检测方法是将抗原或抗体的一方或双方在某种介质中进行扩散，通过观察抗原－抗体相遇时产生的沉淀反应，检测抗原或抗体，最终达到诊断的目的。这种扩散可以是蛋白的自然扩散，例如环状沉淀试验、单向免疫扩散试验、双向免疫扩散实验。单向免疫扩散试验就是在凝胶中混入抗体，制成含有抗体的凝胶板，而将抗原加入凝胶板预先打好的小孔内，让抗原从小孔向四周的凝胶自然扩散，当一定浓度的抗原和凝胶中的抗体相遇时便能形成免疫复合物，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正比。 利用蛋白在不同酸碱度下带不同电荷的特性，可以利用人为的电场将抗原、抗体扩散，例如免疫电泳试验和双向免疫电泳。免疫电泳首先将抗原加入凝胶中电泳，将抗原各成分依次分散开。然后沿电泳方向平行挖一直线形槽，于槽内加入含有针对各种抗原的混合抗体，让各抗原成分与相应抗体进行自然扩散，形成沉淀线。然后利用标准的抗原－抗体沉淀线进行抗原蛋白（或抗体）的鉴别。上述的方法都是利用肉眼观察抗原－抗体反应产生的沉淀，因此灵敏度有很大的局限。比浊法引入沉淀检测产生的免疫比浊法就是利用浊度计测量液体中抗原－抗体反应产生的浊度，根据标准曲线来计算抗原（或抗体）的含量。该方法不但大大提高了检测的灵敏度，且可对抗原、抗体进行定量的检测。

免疫学实验61977

实验四免疫学实验 一、机体体液免疫功能测定 （一）凝集反应 【目的】 了解玻片凝集试验、试管凝集试验及胶乳间接凝集抑制试验的操作过程、结果分析和实际应用。 【原理】 颗粒性抗原(细菌、细胞等)与相应抗体在一定电解质存在的条件下发生特异性结合并出现肉眼可见的凝集块的现象称为凝集反应。凝集反应既可用已知抗体检查和鉴定未知的抗原(如鉴定细菌)，也可用已知抗原检查血清中相应的抗体；既可用作定性检测，又可用于定量检测。 凝集反应分两种。一种是颗粒性抗原与抗体直接结合出现的凝集现象，称为直接凝集反应；另一种是将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关的载休颗粒表面，再与相应的抗体结合而出现的凝集反应，称为间接凝集反应。如将抗体吸附于载体颗粒表面，再与相应的抗原结合而出现的凝集反应则称为反向间接凝集反应。 1、玻片凝集反应 【材料】 伤寒诊断血清、伤寒沙门菌及大肠埃希菌培养物、载玻片、生理盐水等。 【方法】 ①取载玻片1张，左侧加生理盐水1滴，中间及右侧各加伤寒诊断血清1滴； ②用接种环取伤寒沙门菌培养物少许，分别与盐水及中间的伤寒诊断血清混匀。同法取大肠埃希菌培养物与右侧伤寒诊断血清混匀； ③轻轻摇动玻片1～2min后，观察结果； ④观察后，将玻片直接投入消毒缸，不要冲洗，以防污染。 【结果】 出现凝集物者为阳性反应，均匀混浊无凝集物 者为阴性反应。 【注意事项】 玻片凝集反应 ①用接种环取一种试剂前后均需进行烧灼，不可有杂菌污染以及前一试剂残留。 ②用接种环取细菌时应先烧灼灭菌，待冷却后方可挑取细菌。 ③用接种环加细菌于血清中后，应先烧灼接种环，再取细菌加入另一血清中。 【结果分析】 左： 中：