皮肤细胞培养影响因素的探究
皮肤细胞培养影响因素的探究
陕西师范大学朱影，张瑞，李晓，张晓，张秀秀
（1.朱影陕西师范大学理工科基础教学部陕西省西安市 710062；
2.张瑞张晓张秀秀李晓陕西师范大学理工科基础教学部陕西省西安市 710062；）
指导老师：吴民耀副教授
【摘要】：近年来,随着成体干细胞研究的不断深入,人们己能在体外分离纯化、鉴别,扩增和培养多种组织干细胞,其中包括从皮肤表皮基底层分离的表皮干细胞、以及从毛囊隆突处分离的毛囊干细胞等皮肤类干细胞。皮肤类干细胞具慢周期、聚集性的特点,能维持和修复皮肤组织损伤的功能。然而影响干细胞培养的因素很多，本实验分别从不同消毒处理对细胞培养的影响、不同培养基对细胞培养的影响、不同血清浓度对细胞培养的影响等方面对影响干细胞培养的多个因素进行了探究。
【关键词】：大鲵干细胞培养
1.皮肤类干细胞的来源
目前,上皮干细胞、表皮干细胞,角质化细胞,角阮干细胞,皮肤类干细胞,皮肤类干细胞,毛囊干细胞(英文名称主要有Epidermal stem cell、Keratinize stem cell、Skin Stem cell及Hair follicle stem cell)等虽然名称不一,但都源于皮肤组织,所以我们将其统称为皮肤类干细胞。对于皮肤类干细胞的来源,科学家们从各自的实验证据提出了不同的观点:一种认为毛囊处存在可供毛囊再发生的干细胞,在很长一段时间内,毛球部区域被认为是毛囊干细胞存在的部位,但近年来又有人提出“隆突激活假说”,认为毛囊上皮干细胞位于毛囊外根鞘部的隆突部。Taylor等认为毛囊是角阮干细胞(keratinize stem cell)主要来源,毛囊干细胞不仅能形成毛发,而且可以形成表皮。Oshima等指出,存在于小鼠触须毛囊外根鞘部的多能干细胞能分化产生构建表皮、皮脂腺和毛囊等所需的各种类型的细胞。另一种观点认为,哺乳动物及人的表皮基底层细胞具有干细胞特性。20世纪70年代末提出的“表皮增殖单位”学说认为,构成表皮细胞柱基底层有8~10个有分裂能力的细胞,其中央有一个原始干细胞,由这个干细胞产生这个柱的所有细胞。
Bickenbach(1981)首次利用3H一TdR标记了鼠皮肤中的这种细胞,证明这种细胞是一种细胞标记滞留细胞,在体内表现为慢周期性,这一传统的标记方法一直被研究毛囊干细胞和表皮干细胞的学者应用。Slacken以为成年哺乳动物及人类上皮组织中均有多能干细胞存在。关于毛囊千细胞与表皮干细胞是否同源是近年来科学家们所关注的焦点。Laver等指出,毛囊和表皮两种结构中只有一种根本的表皮干细胞,它具有形成皮肤和毛发的功能。因没有系统的鉴定方法,还不能明确指出这类干细胞的确切来源。
2.皮肤类干细胞的生物学特性
目前研究较为深入的皮肤类干细胞是表皮干细胞。根据细胞的不同分裂增殖能力.表皮干细胞存在三种状态:干细胞(keratinocyte stem cell KSC)、短暂扩增细胞(transit ampilifying cell T A细胞)和分化细胞(postmitotic differentiating cell PMD细胞)。干细胞属于不对称分裂细胞,具有无限增殖分化能力;短暂扩增细胞是干细胞的子细胞,经过几代分裂后便形成分化细胞;分化细胞属成熟细胞。正常情况下,每肴、表皮千细胞进行不对称分裂,产生干细胞和短暂扩增细胞,维持皮肤的正常功能。于细胞、短暂扩增细胞和终末分化细胞分布于表皮不同的空间结构中,形成一定的空间结构,称为表皮增殖单位(Epidermal proliferation unit EPU)并呈现出一定的梯度变化,即表皮干细胞一T A细胞一终末分化细胞。在表皮组织受损伤时,干细胞则可对称分裂,分裂一次可产生两个干细胞或两个祖细胞,从而可大量增加干细胞以及分化细胞的数量,更好地适应机体的需要。
表皮干细胞具有两个明显的特征:慢周期性和高度的增殖潜能。慢周期性体现在进行体内细胞周期标记试验时表现为标记物保留细胞LRCS,增殖潜性能则体现为体外培养时呈克隆性生长。在显微镜下,表皮干细胞形态较为原始,体积小,核大,核浆比例大,用流式细胞仪分析,体内的表皮干细胞多处于G0\G1期,其分裂增殖活动相对静止。在活体内注射H3标记的脱氧胸普或澳化脱氧尿普后,其标记可在表皮干细胞中长期保持不变,而其
他如T A细胞等随着细胞的不断分裂增殖其标记很快被稀释并逐渐消失。表皮干细胞的另外一个特点是对基底膜具有茹附性。在体内,表皮下细胞在整合素、连接素等表面茹附因子的介导下通过半桥粒茹附在基底膜上,离体只,大多数表皮干细胞在10min之内即勃附到胶原等细胞外基质上,而大多数T A细胞的勃附则发生在20一60min,所以可以根据干细胞的豁附性来进行鉴定。表皮干细胞相对数量很少,Kolodka等研究表明,人和鼠的皮肤中,约有10%的基底层细胞为表皮干细胞。但最近的研究表明将能快速粘附到Ⅳ型胶原上的10%的基底细胞仅仅有40%的细胞可以形成大克隆,表明基底细胞中仅有4%为表皮干细胞。
表皮干细胞属于全克隆细胞,在组织损伤或体外培养等条件下表现出持久的增殖能力和强大的克隆形成能力,一个干细胞形成的克隆细胞数可达5000以上,而T A细胞则为部分克隆细胞,多数T A细胞克隆数少于32个细胞。表皮干细胞形成的克隆明显大于短暂扩增细胞的克隆。在体内呈慢周期性,体外培养呈克隆性生长是分离鉴定皮肤类干细胞的最经典的方法,一直沿用至今。
3、不同消毒处理对细胞培养的影响
皮肤直接与外界接触,一般在野外进行采样,易污染;加之一般是活体采样,对象多为育种价值高或珍贵稀有的动物,为了减少采样造成的应激、降低对其健康状况和应用价值的影响,所取的组织块都很小;所以为了提高培养的成功率,一般采用组织块法进行原代培养。本试验以小鼠尾尖皮肤组织为研究对象作为预实验，比较不同消毒处理及培养方法的优缺点,选择合适的消毒处理及培养方法。以免消毒处理不当，对珍贵的大鲵皮肤实验材料造成浪费。
3.1试剂
OEME(高糖);新生牛血清(NCS);0.25%胰蛋白酶;0.1%胶原酶;
1%新洁尔灭;1‰新洁尔灭;75%乙醇;70%乙醇;乙醚;
双抗:青霉素8×104IU?ml -1链霉素1×105 IU?ml -1
3.2试验方法
①采样前的消毒处理:
用乙醚将小鼠进行麻醉后,用清水擦洗尾部并刮毛后,采用75%乙醇或l%新洁尔灭溶液擦洗多次,然后进行碘酒消毒、75%乙醇脱碘。
②采样
用无菌剪刀剪断鼠尾,置无菌培养皿中,转移至无菌操作台上。
③采样后的消毒处理
在无菌操作台上,进行消毒处理,主要方法有:A.70%乙醉浸泡30s;B.70%乙醇浸泡5min;C 1‰.新洁尔灭浸泡5min;D.双抗浸泡10min。
④接种培养
消毒处理后,用PBS洗涤4~5次,将皮肤与软骨分离开,将皮肤组织剪成约1mm3的小块,自然沉降洗涤2次,然后进行组织块培养,观察消毒效果。
表1不同消毒效果的无菌效果比较
Comparison of asepsis effect of different disinfectant methods
组别Group
消毒处理Disinfectant methods 消毒效果Effect of disinfection
洗涤
W ashing
浸泡
Marinate
浸泡时间
Time of
marinate
感染
Infection
无菌
Disfection
细胞生长情
况Grouth of
cell
1 75%乙醇75%乙醇30s
5min 5
1
1
1
无细胞长出
无细胞长出
2 75%乙醇1%新洁尔灭5min
3 无细胞长出
3 75%乙醇双抗10min 2 有细胞长出
但生长不良
4 1%新洁尔灭1%新洁尔灭5min 4 生长良好
5 1%新洁尔灭双抗10min 7 生长良好
3.3不同消毒处理的效果
从表可见联合使用乙醇与碘酒、双抗的消毒效果不理想,消毒不彻底或细胞生长不良;新洁尔灭与碘酒、双抗联合使用的消毒效果比较好,消毒彻底,且细胞生长良好,对时间要求不严格,操作简单方便。要配制不同抗生素含量的PBS,在洗涤皮肤组织块时也需要不停更换PBS,操作比较繁琐。本试验结果表明,采用高浓度双抗浸泡10而n或1%o新洁尔灭浸泡5min,均能达到较好的消毒效果,且对细胞的损伤较小,细胞生长良好。该消毒方法能克服乙醇浸泡对时间要求的紧迫性,简化了操作步骤,又可省去配制和使用含不同抗生素浓度的PBS 的繁琐,值得推广和应用。
4四种不同培养基对细胞的影响
用四种不同的基本培养液培养细胞,在培养的第6天消化收集细胞进行计数,,
①培养液准备
根据试验用四蒸水配制以下培养液
I:TCM199+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素+100IU/ml两性霉素;
11:DMEM+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素+100IU/ml两霉素;
111:DMEM/F12+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素+100IU/ml两性霉素;
IV:Fl2+100IU/青霉素+100IU/ml链霉素+100IU/ml两性霉素。
取第四代长成单层的细胞用消化液消化后,将细胞悬液分为相同的I、Ⅱ、Ⅲ、IV四个部分,分别离心10min,弃去上清液。四部分分别用基本培养液I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ调整浓度为4x104cells·ml-1。接种24孔培养板,每孔1mL,共接三孔,37℃，5％CO，饱和湿度下静置培养,24h后分别换与原接种培养液相同的培养液一次,以后每两天换液一次,于培养的第六天收集细胞进行计数。
表2
基础培养液TCM199 DMEM DMEM/F12 F12
计数器1 17.08 19.5 17.10 16.05
计数器2 16.95 19.85 16.80 15.90
计数器3 17.20 19.29 16.75 15.98
接种细胞数(D0) 2.45 2.45 2.45 2.45
群体倍增值（X） 2.857 2.997 2.785 2.706
5.血清浓度对细胞生长的影响
在添加5mM Hepes的DMEM基本培养液中,分别添加10％、15％、20％的胎鼠血清,分组培养纯化皮肤成纤维细胞。培养的第六天,用台盼蓝染色,在血球计数板上进行细胞计数,以各组细胞的平均值评估其作用。以低糖DMEM为基本培养液,在添加血清、Hepes的同时添加不同剂量的EGF、IGF一l,分组培养,在培养的第六天各取三瓶进行计数,以细胞生长倍增值为准,评估生物活性因子对皮肤成纤维细胞生长的影响。
以DMEM为基础培养液,分别添加不同浓度的血清,培养皮肤成纤维细胞,培养后第6天进行细胞计数,结果表明,添加10%,15%,20%FCS对细胞生长的影响是,随着血清浓度升高细胞生长呈渐增趋势,但无显著差别(P＞0.05)。
6、EGF、IGF-1对细胞生长的影响
以低糖DMEM为基本的培养液,在添加血清、双抗和Hepes的同时分别添加不同剂量的EGF、IGF-1分组
培养,在培养第六天各取三瓶进行计数,以细胞生长群体倍增殖为准,评估生物活性因子对皮肤成纤维细胞生长的影响。结果表明EGF和IGF-1对细胞生长均有明显促进效果(b:a p<0.05;e:a,p<0.05),其中IGF-1的促生长作用强于EGF,且EGF与IGF-1具有协同作用(d:cl:bl,p<0.05)
7、组织块培养与消化分散培养
皮肤成纤维细胞原代培养一般采用组织块法和酶消化分散细胞法两中方法进行培养。
7.1实验方法
采用1%新洁尔灭洗涤,采样后皮肤组织用1%新洁尔灭浸泡5min进行消毒处理,PBS洗涤多次,获得的皮肤组织块采用下列方法进行培养,目的在于选择合适的培养方法。
7.1.1 组织块培养
直接将组织块接种到培养瓶(50ml)底部,每瓶置约15块,均匀铺开,翻瓶,加5mlDMEM(10%NCS)培养液,培养2~4h,翻瓶,使培养液浸润组织块,继续培养。培养条件为37℃、饱和湿度、5%CO2,以下相同。
7.1.2 0.25%胰蛋白酶消化后组织块培养
皮肤组织块先用0.25%胰蛋白酶37℃消化30min,弃酶液,加DMEM(10%NCS)培养液终止消化,稍吹打,进行组织块培养,方法同上。
7.1.3 0.25%胰蛋白酶消化分散细胞培养
皮肤组织块用0.25%胰蛋白酶在37℃下消化30min,弃酶液,加入培养液终止消化,反复吹打,100目纱网过滤,1000r·min一1,,离心5min,计数,调整细胞浓度106cells·min-1,,每瓶接种2ml,添加培养液至5ml,培养48h后,换液,继续培养。
表3
组别Grope
培养方法
Culture method
细胞出现时间（天）
Time of cell appear
传代培养(第天)
Time of subculture
细胞生长情况
Growth of cell
1 组织块法7-10 15-20 上皮细胞先生长成
纤维细胞后生长
2 0.25%胰酶消化组织
块法2-5 10-15 细胞顺序同上
细胞生长快
3 0.25%胰酶消化分散
组织块法2-3 14-20 贴壁细胞少
杂质多、生长慢
消化培养法常采用胰蛋白酶进行消化,因酶的消化作用受pH值、温度、组织的硬度以及酶浓度的影响。因此,消化时间和消化液浓度较难掌握,时间过长或浓度过高都会使细胞受损,时间过短或浓度过低则达不到分散的目的,培养效果极不稳定。而且分散细胞在体外培养时经历的生长环境变化大,难以存活和生长。此外,消化法培养过程中要进行过滤、离心等过程,易增加污染机会。本试验中也发现,采用0.25%胰蛋白酶消化皮肤组织虽然获得了大量细胞,但接种后贴壁生长的细胞较少,培养效果不好,可能与胰蛋白酶的生物学特性有关。胰蛋白酶是从动物体中提取的一种水解酶,主要用于消化细胞间质。与胶原酶相比,胰蛋白酶对细胞的损害较大,常与鳌合剂乙二胺四乙酸钠(EDT A一Na)、柠檬酸钠、构梅酸钠等联合使用,或进行冷消化来降低对细胞的损害,提高消化效果。若组织较硬、胶原成份较多时,胰蛋白酶解离细胞的效果较差,可用胶原酶来代替。贴壁依赖性细胞的细胞膜表面附着一些由细胞分泌物形成的粘蛋白膜,使细胞粘附于支持物的表面,有利于细胞贴壁生长。
当胰蛋白酶将细胞分泌的粘蛋白膜水解后若还没有终止,则胰蛋白酶就有可能进攻细胞内的某些蛋白质,造成它们的解离,从而诱发细胞调亡。用于细胞核移植供体的对象多为育种价值高或珍贵稀有的动物,为了减少采样造成的应激、降低对其健康状况和应用价值的影响,所取的组织块都很小,所以为了提高培养成功率,一般采用组织块法进行原代培养。
组织块培养法获得细胞比较整齐,成纤维细胞与上皮样细胞分块生长,且这两种细胞对酶的敏感程度不同,所需的消化时间不同,因此便于分离和收集细胞,培养动物的成纤维细胞多采用这种方法。但组织块法培养存在
原代细胞生长慢、获得传代细胞时间长的缺点。
为缩短组织块法培养获得传代细胞的时间,提高培养效果,本试验对组织块进行酶消化处理后进行组织块法培养,结果表明细胞开始游离生长和获得传代细胞的时间比不经酶处理提前3一5天。酶消化处理后,组织块内细胞之间相互分离,但又没有完全脱离,在一定程度上保持了在体内时的相互作用,所以细胞容易游离并生长。该培养方法即缩短了获得传代细胞的时间,提高了培养成功率。
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细胞培养的方法与步骤
细胞培养的方法与步骤 1．开紫外灯前先擦超净台，台内紫外30分钟，室内紫外10分钟。同时将放在4℃内的培养液提前放置到室温。（可放在抽屉中，防止紫外照射） 换液 2．先将培养液打开（开一层烧一层），放置在酒精灯旁。 3．将细胞从培养箱中拿出，进超净台前先要喷酒精。 4．打开培养瓶，烧瓶口，而后弯脖朝后，倒液，注意瓶口不要残留液体，若有残液要用纱布擦净。 5．倒培养液（之前要烧瓶口），注意量（5ml）不要再瓶口有残留液体是烧瓶口，否则碳化的培养液会对细胞的生长有毒害作用。 6．倒一瓶封一瓶，迅速放平，培养瓶口拧紧后再松一下，放入培养箱中。 传代 2．拿出细胞，开口，烧，倒液。 3．（5ml大枪加3ml）用PBS洗2~3遍（洗净血清，放置血清钝化胰酶）。 4．胰酶消化，37℃5分钟（时间可自控）。消化程度是细胞不能滑落，要吹落。500微升胰酶（4×，1%）+1.5mlPBS→工作浓度0.25%（此时要用大枪）。 5．（大枪）加入3mlDMEM完全培养液终止消化，用吸管缓慢吹打壁上的细胞（不要让吸管的嘴端接触到瓶壁） 6．将混合物吸入离心管，加封口膜，离心500g 5分钟（此时洗去胰酶）在此期间PBS 洗培养瓶3遍，PBS一定要吸净，否则加入培养液后会产生沉淀（培养瓶要重复使用，至少100次） 7．倒掉上清，此时动作要轻或用大枪吸，加入3mlDMEM完全培养液重悬细胞，用吸管吹掉（再洗，清除胰酶）。 8．离心完毕，加入3ml新鲜培养液，再次吹打（约50~100下，视细胞情况而定），防止起泡沫，至细胞单个，圆球状为宜。 9．在培养瓶中加入新鲜培养液4ml，将吹打起来的细胞分配至各培养瓶中（量依需要而定）。80微升，100微升都可以。 冻存 8．在冻存管中加入200微升冻存液，在离心管中加入1000微升冻存液，吹打（防止起泡），移入冻存管中，此段时间不宜过久（DMSO对细胞伤害很大）。 9．封口膜封紧冻存管，可多封几层，用胶布缠紧，只缠一层就行，然后写字。 10．放在4℃30分钟。 11．放在冰水混合物中10分钟。 12．-20℃中放置1~2小时（经验值是不超过1.5小时） 13．-70℃中过夜，（最多可存放7~8个月） 14．放入液氮。 注意：传代前一天换液（可换可不换） 冻存前一天换液（必换） 血清灭活: 56℃30分钟水浴。
细胞培养的操作步骤
传代细胞培养的视频拍摄脚本 一、实验准备 器材 液氮冷冻灌、恒温培养箱、电冰箱、高压灭菌锅、磁力搅拌器、离心机、分析天平、倒置显微镜、超净工作台、弯头吸管（1个）、胶头滴管（9个）、离心管（9个）、带塞培养瓶（不定个）、试管架、量桶、烧杯、酒精灯、抽滤瓶、G6型号细菌过滤漏斗、带塞小玻璃瓶，大三角瓶、无菌冻存管、液氮瓶（一）、器皿 1玻璃器皿的清洗灭菌： 种类：小玻璃瓶、弯头吸管、滴管（3个）、培养瓶、量桶、烧杯、抽滤瓶、大三角瓶，细菌过滤器接口管 药品：5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml （1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。 （镜头一：实验人员将器皿放进加有5％盐酸溶液的盆内，并以字幕和配音的形式显示浸泡或煮沸时间和浸泡目的） （2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干 （镜头二：实验人员刷洗器皿，使用正规的清洗方法，并烘干，只示范其中2--3种即可，实验人员必须介绍操作示范烘干箱的使用方法和相关数据的设置方法） （3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作
用，操作过程需戴防护用具。 （镜头三：带好橡胶手套将清洁液加入到盆中，让后进行酸浸，并以字幕的形式显示浸泡时间） （4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次 将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。 （镜头四：自来水冲洗，蒸馏水清洗，烘干一起完成，在这个过程中可在装器皿的盘中放入一定量的玻璃器皿，只对其中一种进行自来水冲洗、蒸馏水清洗，洗好后就将所有仪器放入烘干箱中烘干，并在每一个步骤中以字幕或语音的形式显示相关操作次数和时间） （5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。 （镜头五：实验人员对实验器皿中的1—2种进行包装示范，然后将其他包装过的器皿一起放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌） （实验人员必须示范操作高压灭菌锅和恒温干燥箱的用法，示范操作步骤，只示范一次即可，在下面的不同灭菌温度和不同灭菌时间可以字幕的形式显示）2、橡胶制品清洗消毒 种类：玻璃瓶橡胶塞、培养瓶瓶塞、皮管、滴管头 新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备
浅析细胞体外培养的影响因素及防控策略
摘要 动物细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术。近年来，动物细胞培养技术已从单纯的实验操作扩展到生命科学、生物医药学等多个学科的研究和生产领域，成为广泛采用的技术手段，许多生物技术科学研究都离不开细胞培养。本文从细胞培养的基本操作方法入手，介绍了动物细胞体外培养的主要影响因素，以及对细胞实验室无菌环境的防控策略。 关键词：细胞体外培养；影响因素；无菌环境；防控策略
目录 摘要 ................................................................................................................................................... I 1引言 .. (1) 2基础理论概述 (1) 2.1细胞培养的概念 (1) 2.2原代细胞培养的概念 (1) 2.3传代细胞培养 (2) 3影响细胞体外培养的因素 (2) 3.1细胞分离方法 (2) 3.1.1直接分离法 (3) 3.1.2酶消化法 (3) 3.2细胞培养温度 (3) 3.3细胞培养基的成分 (3) 3.3.1天然培养基 (3) 3.3.2合成培养基 (3) 3.4接种密度 (4) 3.5培养基的pH值 (4) 3.6细胞的冻存与复苏 (4) 3.6.1细胞冻存 (4) 3.6.2细胞复苏 (5) 4细胞实验室无菌环境的防控策略 (5) 4.1无菌室的彻底消毒 (5) 4.2培养用品的清洗和消毒灭菌 (6) 4.2.1清洗 (6) 4.2.2消毒灭菌 (6) 4.3培养试剂的分装与保存 (7) 4.4对操作者的要求 (7) 5结语 (8) 参考文献 (9) 致谢 (10)
细胞培养方法
细胞株(系)细胞复苏 (1)戴手套，从液氮罐中取出冷冻管。 (2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。 (3) 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。 (4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为106，则稀释10倍使细胞达到105即可。 注意事项 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。 细胞换液 （1）贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液） 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。
细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏
细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。
皮肤细胞培养影响因素的探究
皮肤细胞培养影响因素的探究 陕西师范大学朱影，张瑞，李晓，张晓，张秀秀 （1.朱影陕西师范大学理工科基础教学部陕西省西安市 710062； 2.张瑞张晓张秀秀李晓陕西师范大学理工科基础教学部陕西省西安市 710062；） 指导老师：吴民耀副教授 【摘要】：近年来,随着成体干细胞研究的不断深入,人们己能在体外分离纯化、鉴别,扩增和培养多种组织干细胞,其中包括从皮肤表皮基底层分离的表皮干细胞、以及从毛囊隆突处分离的毛囊干细胞等皮肤类干细胞。皮肤类干细胞具慢周期、聚集性的特点,能维持和修复皮肤组织损伤的功能。然而影响干细胞培养的因素很多，本实验分别从不同消毒处理对细胞培养的影响、不同培养基对细胞培养的影响、不同血清浓度对细胞培养的影响等方面对影响干细胞培养的多个因素进行了探究。 【关键词】：大鲵干细胞培养 1.皮肤类干细胞的来源 目前,上皮干细胞、表皮干细胞,角质化细胞,角阮干细胞,皮肤类干细胞,皮肤类干细胞,毛囊干细胞(英文名称主要有Epidermal stem cell、Keratinize stem cell、Skin Stem cell及Hair follicle stem cell)等虽然名称不一,但都源于皮肤组织,所以我们将其统称为皮肤类干细胞。对于皮肤类干细胞的来源,科学家们从各自的实验证据提出了不同的观点:一种认为毛囊处存在可供毛囊再发生的干细胞,在很长一段时间内,毛球部区域被认为是毛囊干细胞存在的部位,但近年来又有人提出“隆突激活假说”,认为毛囊上皮干细胞位于毛囊外根鞘部的隆突部。Taylor等认为毛囊是角阮干细胞(keratinize stem cell)主要来源,毛囊干细胞不仅能形成毛发,而且可以形成表皮。Oshima等指出,存在于小鼠触须毛囊外根鞘部的多能干细胞能分化产生构建表皮、皮脂腺和毛囊等所需的各种类型的细胞。另一种观点认为,哺乳动物及人的表皮基底层细胞具有干细胞特性。20世纪70年代末提出的“表皮增殖单位”学说认为,构成表皮细胞柱基底层有8~10个有分裂能力的细胞,其中央有一个原始干细胞,由这个干细胞产生这个柱的所有细胞。 Bickenbach(1981)首次利用3H一TdR标记了鼠皮肤中的这种细胞,证明这种细胞是一种细胞标记滞留细胞,在体内表现为慢周期性,这一传统的标记方法一直被研究毛囊干细胞和表皮干细胞的学者应用。Slacken以为成年哺乳动物及人类上皮组织中均有多能干细胞存在。关于毛囊千细胞与表皮干细胞是否同源是近年来科学家们所关注的焦点。Laver等指出,毛囊和表皮两种结构中只有一种根本的表皮干细胞,它具有形成皮肤和毛发的功能。因没有系统的鉴定方法,还不能明确指出这类干细胞的确切来源。 2.皮肤类干细胞的生物学特性 目前研究较为深入的皮肤类干细胞是表皮干细胞。根据细胞的不同分裂增殖能力.表皮干细胞存在三种状态:干细胞(keratinocyte stem cell KSC)、短暂扩增细胞(transit ampilifying cell T A细胞)和分化细胞(postmitotic differentiating cell PMD细胞)。干细胞属于不对称分裂细胞,具有无限增殖分化能力;短暂扩增细胞是干细胞的子细胞,经过几代分裂后便形成分化细胞;分化细胞属成熟细胞。正常情况下,每肴、表皮千细胞进行不对称分裂,产生干细胞和短暂扩增细胞,维持皮肤的正常功能。于细胞、短暂扩增细胞和终末分化细胞分布于表皮不同的空间结构中,形成一定的空间结构,称为表皮增殖单位(Epidermal proliferation unit EPU)并呈现出一定的梯度变化,即表皮干细胞一T A细胞一终末分化细胞。在表皮组织受损伤时,干细胞则可对称分裂,分裂一次可产生两个干细胞或两个祖细胞,从而可大量增加干细胞以及分化细胞的数量,更好地适应机体的需要。 表皮干细胞具有两个明显的特征:慢周期性和高度的增殖潜能。慢周期性体现在进行体内细胞周期标记试验时表现为标记物保留细胞LRCS,增殖潜性能则体现为体外培养时呈克隆性生长。在显微镜下,表皮干细胞形态较为原始,体积小,核大,核浆比例大,用流式细胞仪分析,体内的表皮干细胞多处于G0\G1期,其分裂增殖活动相对静止。在活体内注射H3标记的脱氧胸普或澳化脱氧尿普后,其标记可在表皮干细胞中长期保持不变,而其
影响因素分析汇总
影响因素分析汇总
高三地理复习材料（影响因素分析汇总）1.影响太阳辐射强弱的因素: ①太阳高度角(纬度决定)；②大气状况(天气、气候)；③海拔高低（主要是大气密度）。 2.影响气温高低的因素： ①纬度位置（太阳辐射）；②地形地势（海拔？ 闭塞？背风坡？迎风坡？对气流阻隔？）；③ 大气环流；④海陆位置及海陆分布（海洋性？ 大陆性？）；⑤洋流；⑥下垫面热容量，反射 率等（植被状况）。 3.影响降水多少的因素： ①大气环流（气压带、风带；季风环流；大气 活动中心）；②地形（迎风坡？背风坡？气流 阻隔？）；③海陆位置（离海远近？离岸风、 向岸风？）；④洋流。 4.影响气压大小的因素： ①地势（海拔）→气压随高度增加而降低；②气温→同一高度气温高气压低。 5.影响气候的因素： ①纬度位置（太阳辐射）；②大气环境（降水）； ③下垫面（海陆位置，地形，洋流，地表状况 等）；④人类活动（影响小气候和全球变暖）。6地表形态的影响因素： ①内力作用：地震，火山，变质作用；②外力作用：风化，侵蚀，搬运，沉积，固结成岩。 7.影响海水温度的因素： ①太阳辐射（热量收支）←纬度；②洋流； ③陆地气候。 8.海水盐度大小的影响因素： ①降水量、蒸发量（气候、纬度）；②洋流； ③结冰、融冰；④河流径流的注入；⑤与外界 海水交换状况（海域是否闭塞）。 9.影响潮汐大小的因素： ①地形条件（是否呈口大内小喇叭状开口）； ②气象条件（风向）；③天文条件（日、月、 地位置）。 10.影响水资源多少的因素： ①降水量、蒸发量（河川径流量大小）；②水循环活跃程度。 11.影响渔场形成因素： ①大陆架：海水深浅及获得阳光多少；②径流： 营养物质多少；③纬度：温带水域；④洋流： 寒暖流交汇或上升流。 12.影响降水形成的因素： ①有充足水汽、有凝结核、有上升气流；②大气环流；③地形；④洋流。 13.影响暴雨形成的因素： ①源源不断水汽供应；②强烈上升气流；③形成降水的天气系统持续时间长。 14.影响地震烈度的影响因素： ①地震本身的震级和震源深度；②地表状况 （震中距大小）；③地质构造情况（断层发 育？）；④地面建筑物抗震程度。 15.农业发展的区位因素： ①自然条件：气候、地形、水源、土壤；②社 会经济因素：市场、劳动力、交通、政策、科 技、农业机械。 16.乳畜业发展的区位条件： ①自然：气候适宜种植牧草和饲料作物；②市 场：城市众多，人口密集，市场需求大；③交 通：交通便利；④科技：先进的科技。 【高三地理复习材料第 2 页共 13 页】
常规细胞培养方法
常规细胞培养方法（原代培养和传代培养）初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒 初代消化培养法
1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3 0~60分钟。 4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500 ~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7. 4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHC O3调整。 8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1.剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm 3块为止。 2.摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一2 5ml培养瓶底可摆布20~30块。 3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4.培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液
探究影响电阻大小因素实验报告
实验名称：探究导体的电阻与导体的材料、横截面积、长度是否有关。实验目的：收集证据证明猜想。 实验仪器：电流表，小灯泡，导线，电源，开关，电阻丝。 实验电路图： 电阻丝： 实验方法：转换法: 电阻转换为电流示数和小灯泡亮度。横截面积转换成直径（圆电阻丝）控制变量法: 因变量：电阻R，自变量：导体材料，不变量：导体长度和横截面积。 因变量：电阻R，自变量：导体长度，不变量：导体材料和横截面积。 因变量：电阻R，自变量：导体横截面积，不变量：导体长度和材料。 实验步骤： 1.电流表调零，断开开关，按照电路图组装电路，a、b间接入A1、A2康铜丝，闭合开关， 观察电灯泡亮度并读出电流表示数记为I，并讲数据及现象记录入表格，断开开关。 2.a、b间改接入B1、B2碳钢丝，闭合开关，观察电灯泡亮度并读出电流表示数记为I，并 讲数据及现象记录入表格，断开开关。
3.a、b间改接入C1、C2镍铬丝，闭合开关，观察电灯泡亮度并读出电流表示数记为I，并 讲数据及现象记录入表格，断开开关。 4.用铜片将C2、D2连接起来，a、b间改接入C1、D1镍铬丝，闭合开关，观察电灯泡亮度 并读出电流表示数记为I，并讲数据及现象记录入表格，断开开关。 5.用铜片将C2、D2连接起来、C1、D1连接起来，a、b间改接入C1、D1镍铬丝，闭合开关， 观察电灯泡亮度并读出电流表示数记为I，并讲数据及现象记录入表格，断开开关。 7.结论： ①、导体的电阻与导体的材料有关。 ②、导体的电阻与导体的长度有关。 ③、导体的电阻与导体的横截面积有关。 8.评价：如果我想知道导体的电阻与电阻的长度和横截面积如何有关，我该怎么办？ 问题如何提出? 收集几组数据？ 引申： ①、小明在完成以上实验后，他认为“导体连入电路后有电阻，不接入电路则没有电阻”，你觉得他的说法对吗？ ②、导体的电阻还与温度有关，观看视频理解。
细胞培养操作步骤
培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：DMS018ml+胎牛血清2ml。 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套（2.5小20 d、200 pl> 1ml）,酒精灯1盏，液器1台，斜架1台， 酒精喷壶 1 个，酒精棉球缸 1 个，污缸 1 个， 常规耗材：培养瓶（50 cm 2）,定量移液管（5ml、10ml）,枪头（1ml、200小 10 d）,培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管 所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO,胰酶，苯扎溴氨，75% 酒精…… 实验前准备： 所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min 后开始实验操作。 首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37C的温水放于液氮罐旁边，待 细胞株取出后留上端1/3于37C水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若 种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。 实验步骤 一、原代细胞的培养 1. 紫外消毒30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的 双手。 2. 将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒 精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3. 取1 个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶 口和瓶盖2-3 次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3 后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml 移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2 次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。 4. 拿出1 支高压后的5ml 定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上， 再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3 次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml 培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3 次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。 5. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试 剂及污缸等，关闭超净工作台。 6?将培养瓶放于28C,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。 在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。 、培养液的更换
细胞培养中常见的污染
细胞培养中常见的污染情况总结如下: 1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。 仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理 2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差， 用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。 CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。 其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。 预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作 3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。 用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。 4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。 5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。 6、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所
如何探究动能大小的影响因素
如何探究动能大小的影响因素 陕西张怡 例1如图1所示的装置进行“探究动能大小的影响因素”实验。用两根细绳将小球悬挂起来，拉起小球，当细绳与竖直方向成θ角后松手，小球撞击水平木板上的木块，记下木块移动的距离s。改变角度θ的大小，重复实验。 （1）利用如图1所示的两根细绳悬挂小球，而不用一根细绳，其好处是 （2）本实验探究的问题是物体的动能大小与的关系。 （3）利用上述实验，同时还可以探究的问题是。 解析（1）用两根细绳悬挂小球，小球不容易左右摆动，能更好地控制小球的撞击方向。（2）细绳与竖直方向的夹角θ越大，小球撞击木块时的速度越大。所以，通过改变θ角的大小，本实验可探究物体的动能大小与速度的关系。 （3）由于小球撞击木块时的速度大小取决于细绳与竖直方向的夹角θ，也就是小球的高度。而小球从释放到撞击木块的能量转化是重力势能转化为动能，因此本实验还可探究物体重力势能大小与高度的关系。 答案（1）能更好地控制小球的撞击方向（2）速度（3）物体的重力势能大小与高度的关系 例2（2019丽水）在做了“物体动能大小与哪些因素有关”的实验后，有些同学对“质量不同的钢球从同一光滑斜面、同一高度由静止开始沿斜面滚下，刚到达底部时的速度大小相等”有疑惑，小衢设计了如图2甲所示的实验：让质量不同的钢球A、B同时从同一高度由静止开始沿光滑斜面滚下，观察和比较两球相对运动情况，若B球相对于A 球，就可以说明任一时刻两球的速度大小相等。 小丽肯定了小衢的实验方案后，对实验又提出了两个建议： 建议一：因为钢球在斜面上滚下的时间很短，不利于观察和比较钢球的运动情况，不改变钢球在斜面上的位置，不改变球与斜面的粗糙程度，为了延长钢球在斜面上滚下的时间，可采用的方法是； 建议二：为确保钢球滚下时不偏离斜面，可在斜面上增设两个相同的光滑小凹槽（如图乙所示）。从有利于观察和比较两球的相对运动情况的角度考虑，图中两个小凹槽的间距L应。 解析根据运动的相对性可知，若B球相对于A球静止，就可以说明任一时刻两球的速度大小相等。
细胞培养基本操作
细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细 胞的过程。细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。 一、实验前准备 实验开始前，水浴箱调节至36度恒温。取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。 消毒双手和超净台。取约1ml 细胞完全培养基放于15ml 离心管中。 水浴箱调节至40度恒温，由液氮中取出冻存的细胞，迅速将冻存管投入到已经预热到40度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。整个解冻过程最好在1分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约1min后冻存管内液体完全溶解，用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。 注：解冻到0度时（即冻存管里还有最后一点冰）立刻转移到含培养基的离心管中。然后用5ml的热培养基以0.5ml的加入量逐步将细胞内的DMSO渗透出来，之后补全生于的培养基到细胞瓶中。 二、制备细胞悬液 吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，吸取1ml培养液加入冻存管，将剩余细胞全部吸入离心管中。上下吹打5次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中DMSO 的浓度，减轻细胞损伤。 离心：1000rpm，室温离心3min。 注：细胞复苏后最好等几分钟再离心，因为冻存前加了胰酶消化，对细胞造成一定损伤，复苏后立即离心对细胞造成损伤较大。 三、细胞培养 离心后，倒掉上清液，缓慢操作，不要倒掉底部的细胞沉淀。向离心管内的细胞沉淀加入1ml 细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液。培养瓶内加入4ml 完全培养基，细胞悬液加入培养瓶内，左右前后轻轻摇动培养瓶，把细胞摇均匀，将培养瓶放入37℃，5％CO2 的培养箱中培养。24-48 小时后换液或传代继续培养，换液传代的时间由细胞情况而定。 四、注意事项 1、解冻速度要快 在常温下，冻存液中的DMSO 对细胞的毒副作较大，因此，必须在一到两分钟内使冻 存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤。 2、一次复苏细胞不宜过多 细胞在解冻时，需要迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。并且一次复苏细胞过多，容易忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。 3、培养瓶上注明细胞类型，日期，人名。
细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法
细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法 细胞培养中常见的污染情况总结如下: 常见的污染如下： 1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。 仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！ 可在培养液中加相应的抗生素处理 2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差， 用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。 CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。 其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。 预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作 3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。 用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。 4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。 5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。
影响因素作用原因研究
1.1影响因素作用原因研究 研究表明，随着有机质含量和有效土层厚度的增加，灌溉和排水条件的改善，耕地质量也随之提高；伴随着地形坡度的增加变剖面构形的复杂化和土壤盐碱化程度的加深，耕地质量明显降低。农业机械化程度和生产投入的增加促使农作物产量的提高，同时改善项目区耕地质量状况。 土地整治与耕地质量存在正相关关系。对项目区耕地质量变化影响较大的因素主要有有机质含量、土壤pH 值、排水条件、灌溉保证率。土地整治项目工程对耕地的基础建设条件改善比较明显。通过相关性分析和多元回归分析得出土壤pH值是制约项目区耕地质量发展的主要因素。减少酸性化肥施用量，增加有机肥料即可提高土壤有机质含量，又能改善土壤盐碱度。 。 通过单因素和多因素分析得出土壤pH值是制约耕地质量发展的因素之一。减少化肥施用量，增加有机肥料提高土壤有机质含量，改善土壤盐碱度。推广测土配方施肥，形成合理的肥料施用结构，以充分发挥综合肥效，平衡土壤pH值和养分供给。 本研究通过耕地质量等别的变化及影响因素分析来研究土地整治项目对耕地质量的影响。通过判别构成耕地自然质量的稳定因素和变化因素，对变化因素进行更新，增加土地利用修正，结合项目工程实际情况选取路网密度、田块规整度、有效灌溉面积指数、旱涝分布情况为土地利用修正因素，根据农用地分等方法、思路来确定整治前后耕地质量等别。 上高县土地整治项目使耕地自然等别评价提升0.25 等，利用等别评价提升1.35 等，对耕地质量变化影响较大的因素主要有有机质含量、土壤pH 值、排水条件、灌溉保证率、田块规整度、路网密度。土地整治项目工程对耕地的基础建设条件改善比较明显，在今后的耕地利用与管理保护中要通过增施有机肥、减少偏酸化肥的使用等措施改善耕地土壤的酸碱环境。评价结果符合耕地质量真实情况，可作为衡量土地整治项目绩效评价的依据之一。 土地整治与耕地质量存在一定正相关关系 因此，土地整治通过土地整理，土地开发，土地复垦三类项目，可以有效地推动田、水、路、林、村综合整治，改善农村生产条件和生态环境，能有效提高耕地质量，增加农业基础设施。土地整治中各指标对耕地质量影响的影响方向，作用程度及显著性水平存在差异。其中，土地整理项目中耕地质量主要受 此，土地整治对耕地质量影响应区分不同土地整治项目类型。应把高标准农田建设、土地复垦作为未来土地整治的重点类型，强化培肥和地力建设提升措施。 在农用地分等定级的基础上对阿勒泰市耕地质量影响因素进行研究，得出制约耕地质量发展影响因素，同时提出改善耕地质量的措施。 通过耕地质量与影响因素相关性分析，得出土地利用系数、有效土层厚度、表层土壤质地、
2020年中考物理实验专题复习——探究影响导体电阻大小因素的实验(答案解析)
2019年中考物理实验专题复习—— 探究影响导体电阻大小因素的实验 答案解析 1．（2018?乌鲁木齐）某实验小组的同学用铅笔芯探究导体的电阻与长度的关系，如图所示是该实验的电路图。 （1）闭合开关，向右移动铅笔芯上的滑片P1，电路中的电流不变 （选填“变大”“变 小、”或“不变”）。 （2）如果滑片P1滑动到铅笔芯最右端时，电压表示数很小，应该将滑动变阻器的滑片P2向右移动。 （3）移动铅笔芯上面的滑片P1，记录铅笔芯AP1之间的距离和电压表的示数，数据如下： AP1/m m 0 30. 60. 90. 120. 150. 180. U/V 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 通过数据反映出的规律和欧姆定律可以推出导体的电阻与导体的长度成正比的结论。若图示位置时电压表示数为0.9V，滑片P2向右移动一段距离，电压表示数变为1.2V，滑片P2再向右移动一段相同的距离，电压表示数为 1.8 V。 【分析】（1）闭合开关，向右移动铅笔芯上的滑片P1，不能改变电路中的电阻，利用欧姆定律分析电路中的电流变化； （2）如果滑片P1滑动到铅笔芯最右端时，电压表示数很小，说明滑动变阻器分压太大，应该减小滑动变阻器两端的电压，减小滑动变阻器连入的电阻；
（3）由表中数据可知，可得铅笔芯AP1段两端的电压随AP1长度的增大而增大，并且成倍数的最大，可得铅笔芯AP1段两端的电压与AP1长度成正比；根据欧姆定律可知铅笔芯AP1段两端的电压与AP1间电阻成正比；最后得出导体的电阻与导体的长度的关系。 图示位置时电压表示数为0.9V，利用“通过铅笔芯的电流等于总电流”和欧姆定律得出等式；同理当滑片P2向右移动一段距离，设滑动变阻器连入电阻减小值为△R，利用欧姆定律列出等式；两等式相比得出R0+R1=4△R；当滑片P2再向右移动一段相同的距离，滑动变阻器连入电阻减小值为2△R，再利用欧姆定律列出等式，和第一个等式相比得出最后电压表的示数。 【解答】解： （1）由图知，铅笔芯和滑动变阻器串联，电压表测滑片P1左侧部分铅笔芯的电压，因电压表在电路中相当于断路，所以可知整个铅笔芯连入电路，则向右移动滑片P1时，不能改变电路中的电阻，电源电压不变，由欧姆定律可知，电路中的电流不变； （2）如果滑片P1滑动到铅笔芯最右端时，电压表示数很小，说明滑动变阻器分压太大，应该减小滑动变阻器两端的电压，减小滑动变阻器连入的电阻，即应该将滑动变阻器的滑片P2向右移动； （3）由表中数据可知，电压表的示数（即铅笔芯AP1段两端的电压）随AP1长度的增大而增大，并且成倍数的增大，所以铅笔芯AP1段两端的电压与AP1的长度成正比； 电路中电流不变，由U=IR可知，铅笔芯AP1段两端的电压与AP1的电阻成正比； 由此可以推出：导体的电阻与导体的长度成正比。 图示位置时电压表示数为0.9V，设电源电压为U、整个铅笔芯的电阻为R0、与电压表并联部分的电阻为R0左、此时滑动变阻器连入电阻为R1， 串联电路的电流处处相等，由欧姆定律可得此时电路中电流：
细胞培养常见问题的原因及对策
细胞培养常见问题的原因及对策细胞培养中的注意事项 1 冷冻管应如何解冻？ 取出冷冻管后，须立即放入37 C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。 2 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？ 除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 6 培养细胞时应使用5 %或10% CO2？或根本没有影响？ 一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5% CO2培养细胞。 7 何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。 8 培养基中是否须添加抗生素？ 除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。 9 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度？应如何处理？ 一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53m MEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20 C，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。 10 悬浮性细胞应如何继代处理？ 一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。