cDNA文库构建原理以及技术路线
CDNA文库
1. CDNA文库中重组DNA片断得原始供体来源与细胞中表达出得mRNA,将某一特定类型细胞表达得mrna经反转录酶催化形成与之互补得CDNA，重组克隆后得到得CDNA文库有各自不同得适合范围。CDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组得表达状态以及表达基因得功能鉴定方面具有特殊得优势，从而使它在个体发育，细胞分化，细胞周期调控
2. CDNA文库得质量
（1）文库的代表性
CDNA文库的代表性是指文库中包含得重组CDNA分子是否能完整地反映出来原细胞中表达地全部信息（即mrna种类），它是体现文库质量地最重要标本。文库地库容量，它是指构建建出地原始CDNA文库中包含地独立地重组子克隆数。具备完全好代表性地CDNA文库需要满足地库容量取决与来源细胞中表达出地基因序列地总复杂程度。具体来就是来源细胞中表达出地mrna种类和每种MRNA序列地拷贝数
N=ln(1-p)/ln(1-n/t)，P为文库中包含细胞中任何一种mrna序列信息地概率，通常设为99％，N为文库中P概率出现细胞中任何一种mrna序列理论上应具有地最少重组克隆数，n为细胞中最稀少地mrna序列地拷贝数，t为细胞中表达出地所有mrna地总拷贝数，以人类细胞为列，人类基因组携带地遗传基因总数约为100000种，具体到某一特定类型地细胞中，表达出地基因种类仅为基因组全部基因地15％。因此对于巨大部分地人类细胞，每个细胞内具体表达地mrna种类约为15000种，全体mrna序列地总拷贝约为500000个，而细胞中稀少地mrna种类地拷贝数平均为8个。因此，用人类细胞来构建CDNA文库时候，要以99％概率保证文库中包含有细胞表达地任何一种mrna地序列信息，构建出地原始CDNA文库理论上应具有地最少独立克隆数为
N=ln(1_99%)/ln(1-8/500000)=2.9*10(5)
一个具有完好代表性地CDNA文库至少具有10（6）以上的库容量
3．MRNA是由5‘端非编码区，中间地编码序列和3’端非翻译区。非翻译区地序列特征对基因地表达具有重要地调控作用，其中编码产生地蛋白质产物都具有在结构上相对独立地结构域，存在与同一分子上地结构域对体现出蛋白产物在细胞中所行使地生物学功能。因此要从CDNA文库中分离获得目的基因完整地序列信息和功能信息，要求文库中地重组CDNA片断应尽可能完整获得目的基因结构
4．构建文库的载体系统
（1）入噬菌体载体系统是在CDNA文库构建中最早使用地载体系统，在载体本身地设计方面已经相当成熟，其主要优点是插入片断地装载容量大，适合与全长CDNA地克隆。重组子经专门地体外包装系统包装成有感染力地噬菌体颗粒，对宿主大肠杆菌地转染效率高，通常1ugCNDA构建出地CDNA文库，转染宿主菌后，都可以得到10（6）－10（7）以上地原始库容量，同时对重组克隆是否含有CDNA文库地插入片断地实际情况，有较好地质量控制指标，因此用这类载体地系统构建地CDNA文库质量高，代表性好，此外这类载体系统构建出地CDNA文库以重组噬菌体颗粒形式存在，这些重组噬菌体颗粒地感染活性在4度环境比较稳定，非常适合长期保存，但是可以采用地文库筛选方法很有限，文库中地CDNA 片断在宿主细胞无法功能性表达。
（2）质粒载体系统
可以功能性筛选：利用基因在体内体现其生物学活性所依据地生化基础，从文库中分离鉴定
出目的基因地一种文库筛选策略，基础就是蛋白质－蛋白质，蛋白质－核算，相互作用，可以使用任何一种生物分子作为耙分子，通过从表达地CDNA文库中检测出与耙分子发生相互作用地编码产物，就能从文库中分离出这一功能地目的基因，并对于如何鉴定和开发利用这一基因地功能（1）文库中CDNA编码序列能在宿主细胞中功能表达，产生具有天然构想地编码产物。（2）检测出目的功能表形地同时，能直接获得编码这一表型地基因型。缺点：库容量小，1ug双联DNA构建出地质粒文库，原始克隆数只有10（6）以下
5．构建CDNA文库地主要步骤
（1）制备MRNA样品
其3端具有长度20－250个腺甘酸组成地poly(A)尾巴，通过偶联与固相介质地olige(dt)寡核甘酸退火，RNA中地MRNA成分通过其3端poly(A)与olgo(dt)互补杂交固定在固相介质上地MRNA地其他成分分离，再次洗脱下来
（2）合成第一条联：
1． Oligo(dt)引导地CDNA合成方法：由12－20个脱氧胸腺嘧啶核甘酸组成地人工合成地寡核甘酸片断，与mrna3末端地poly(A)退火后，即可用做引物，引导翻转录以MRNA为模板合成互补CDNA，用oligo(dt)核甘酸做引物好处就是翻转路反应基本限定以MRNA为模板，因此混有少量地RRNA没有什么严重，缺点是只能从模板mrna3端起始引发CDNA合成，所以用oligo(dt)引导会缺少5端序列信息，为了减少对于poly尾巴的合成，一种方法就是锚锭的oligo引物，这种oligo引物3端倒数1－2位是随机型的，合成的3端随机的混合引物群体，引发特定位置的反转录
2，随机引物合成，优缺点相反
(2)双联DNA的转换合成
1，自身引导合成法：
反转录酶催化的反转录结束以后，通常会合成出新的单联CDNA3端反转录形成的具有部分双联结构的发夹环形式，利用这一特点，在完成CDNA第一条联很成并与模板MRNA分离以后，就利用发夹环中双联部分继续作为引物，引导DNA聚合酶以CDNA为模板，合成出互补的第二条联CDNA，反映结束以后，用S1核酸酶讲解去除发夹环的单联部分，即可得到双联形式的CDNA片断，缺点S1核酸酶对发夹环要求严格，很少用
2．联置换法
首先利用大肠杆菌RNAaseH将杂交双联中MRNA模板联在内部发生随机降戒，形成多段短的仍与CDNA第一联保持互补杂交的RNA片断，这些互补RNA片断可以被大肠杆菌DNA聚合酶用做引物，引导合成出与CDNA第一条联互补的第二条联CDNA，这种合成反映在第一条联CDNA模板多处引发，随着合成引物延伸，除了5端RNA引物以外，所有RNA片断均被新合成的互补联所置换，通过DNA连接酶的作用，降模板上分段合成互补联连接成一条完整的DNA联，最后通过分离去除残留的5端RNA片断，并用T4聚合酶削平3端突出的单联形式DNA，就可以得到一个双联形式的CDNA片断，缺点：得不到来源MRNA5端信息
(4)CDNA克隆
提高文库片断与载体的连接效率，通常做法是给平端的双联DNA片断添加衔接头，衔接头是人工合成含有某种限制型内切酶位点的短的DNA的片断或是一端为某种限制酶黏性末端的双联DNA片断。为了避免CDNA片断内部出现可能的酶切位点，在添加衔接头之前，文库CDNA应该甲基化处理，以修饰内部可能出现的酶切位点。
采用普通添加衔接头，CDNA文库与载体的插入方向是随机的，这种克隆对于非表达型CDNA文库筛选没有影响，但是对于表达文库，只有1/6的插入片断具有正常的表达可
能型，，克服这一问题就是采用CDNA文库定向克隆策略。一种做法是在引导CDNA第一条联合成的寡核甘酸引物5端预先设计一种酶切位点，在双联CDNA合成完成以后，再次添加另一种限制型内切酶酶切位点的衔接头，采用两种酶进行双酶切以后就可以使得CDNA 文库得到不同黏性末端。另外设计特定序列衔接头
（5）入如何构建全长CDNA文库
1．Olgo(dg)引导CDNA第二联合成
在第一条联反转录完成以后，可以利用核甘酸末端转移酶在MRAN－CDNA杂交体的CDNA 联3端添加上多个DC残基，产生出一段oligo(dc)序列，通过碱性蔗糖密度剃度离心，使得MRNA－CDNA杂交双联分离，并回收单联CDNA加入过量的oligo(dg)作为引物，通过olgo(dg)与CDNA第一条联3端的oilgo(dc)序列退火杂交，从而引导完整的CDNA第二条联3．载体引导合成
4．首先用平端限制酶使得克隆载体线性化，利用核甘酸末端转移酶在载体链条联的3端分别加上一段oligo(dt)序列，处理后的载体与MRNA退火，载体的oligo(dt)和MRNA的POLY(A)互补，作为反转录酶的引物，引导合成出CDNA第一条联，并通过末端转移酶在CDNA3端添加一段oilgo(dg)序列，讲解去除模板mrna，，经碱性蔗糖密度分路回收质粒两条联，这两条联的3端都连上一条新的合成的CDNA第一条联。分别用这两种单联DNA，与分子数绝对过量的，3端加入有olgo(dc)序列，经变性处理的同一载体DNA混合退火，通过载体间的互补联以及oligo(dg)/oilgo（dc）杂交，形成环状，带有大缺口（相应应对CDNA第一条联部分）的双联DNA分子，最后使用klenow酶将缺口填补的同时，合成CDNA第二条联，形成完整的环状双联重组载体，可以直接转化大肠杆菌，