银杏内酯B对谷氨酸诱导海马神经元损伤的影响

原代海马神经元细胞培养

原代海马神经元细胞培养 溶液的配制： (1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤， 室温保存。 (2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol?l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO4?12H2O，1.7g；KCl， 0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。用0.2μm滤膜过滤，4℃保存。 (3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液 冻存。使用时，用解剖液稀释至0.25%。 (4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。将上述多聚赖氨酸 放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。 (5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP04?7H20，0.18g； KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。 (6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。 (7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。 (8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg?ml-1的母液储存。用0.2μm滤膜过滤，-20℃ 储存。使用时，取6μl母液加入2ml培养液中，终浓度为3μg?ml-1。（根据实验情况调整浓度） 大鼠原代海马神经元细胞的培养 (1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解 剖液的培养皿中。 (2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。在分离出全 部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。 (3) 将培养皿中的海马碎片移入离心管中，去除含胰蛋白酶的液体并用种植液将海马碎 片冲洗2～3遍，终止酶的消化作用。

免疫组化常用标记物[参照材料]

免疫组化常用标记物 免疫组化常用标记物 一、常用标志物 1. CD15(LeuM1)---（阳性部位：细胞膜）。是一种由半乳糖、岩藻糖和N-乙酰葡萄糖组成的碳水化合物抗原，又称半抗原χ，是粒/单核细胞相关抗原。免疫组织化学表达：成熟粒细胞、激活的淋巴细胞（主要是T淋巴细胞）、R-S细胞、大多数腺癌等。 2. 癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）(CD66e)---（阳性部位：细胞膜/浆）。癌胚抗原是表达于胎儿上皮细胞的一种糖蛋白，分子量为180kDa。存于某些恶性肿瘤组织尤其是内胚层来源发肿瘤中，大多数胃肠道（包括胰腺）和肺腺癌均有表达，少量成人上皮细胞和良性肿瘤亦可表达。CEA主要用于标记上皮性肿瘤，尤其是腺上皮来源的腺癌。 3.嗜铬素A（chromogranin A，CgA）---（阳性部位：细胞浆）。嗜铬素是位于神经分泌颗粒内的酸性糖蛋白家族，是一组可溶性酸性蛋白，分子量为76～1 20 kDa，分布广泛。含量最丰富的是嗜铬素A，另两个是嗜铬素B和嗜铬素C。几乎所有的神经内分泌肿瘤中均可检测到嗜铬素。嗜铬素A不仅存在于神经内分泌细胞的分泌颗粒中，也广泛分布于所有含有颗粒的内分泌细胞和神经内分泌细胞来源的肿瘤细胞。此抗体可以识别嗜铬素A抗原羧基末端的片段，而不与氨基末端的片段反应，主要用于标记神经内分泌细胞及其来源的肿瘤。对小细胞癌进行抗原修复可提高检测的敏感性。 4.细胞角蛋白（cytokeratin pan，广谱CK）--- AE1/ AE3（阳性部位：细胞浆）。此抗体可以识别绝大部分酸性细胞角蛋白（Ⅰ型/低分子量）和碱性细胞角蛋白（Ⅱ型/高分子量）。用于标记上皮及上皮来源的肿瘤，特别是对鉴别和判断转移性肿瘤是否为上皮源性具有一定的意义。 5.细胞角蛋白5/6（cytokeratin 5/6，CK5/6）---（阳性部位：细胞浆）。在正常组织中，鳞状上皮和导管上皮的基底细胞以及部分的鳞状上皮生发层细胞、肌上皮细胞和间皮细胞阳性，腺上皮细胞阴性。因此，可用于鳞癌和腺癌、间皮瘤和腺癌的鉴别诊断。支气管上皮基底细胞、间皮；鳞癌、大细胞癌、移行细胞癌、间皮瘤阳性。大多数腺癌为阴性。 6. 细胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）---（阳性部位：细胞浆）。CK7是分子量为54 kDa的一种碱性细胞角蛋白，存在于大多数正常组织的腺上皮和移行上皮细胞中，一般非上皮来源的细胞无表达。在卵巢、乳腺和肺的腺癌呈阳性反应，而胃肠道的腺癌阴性。 7. 细胞角蛋白20（cytokeratin 20，CK20）---（阳性部位：细胞浆）。CK20（46kDa）存在于正常的胃肠道上皮、移行上皮、Merkel细胞及其来源的肿瘤，而乳腺癌、肺癌和神经内分泌肿瘤不表达。CK7positive CK7 negative CK20 positive uninformative colorectum CK20 negative lunguninformative 8. 细胞角蛋白（高分子量）（cytokeratin，HMW）---（阳性部位：细胞浆）。高分子量细胞角蛋白抗体（34βE12）可以识别68kDa、58kDa、56.5kDa和50kD a的细胞角蛋白。

新生鼠海马、皮层神经元原代培养

新生鼠海马、皮层神经元原代培养 实验材料 1. 实验动物 新生Wistar大鼠，当天出生（<12 h）的乳鼠，SPF级。 2. 试剂 Hibernate A Neurobasal A B27 serum-free supplements Papin （木瓜蛋白酶） DNAase I OptiPrep Density Gradient Medium Poly-L-lysine （多聚赖氨酸） L-glutamine （L-谷氨酰胺） Penicillin （青霉素） Streptomycin （链霉素） D-Hank’s solution dd H2O 3. 溶液配制 1. 多聚赖氨酸：取多聚赖氨酸25 mg，用双蒸水溶解并稀释浓度为50μg/ml，用0.2 μm的微孔滤膜过滤，4 °C保存备用。（可配成25×） 2. 解剖液：HA：含0.5mM L-谷氨酰胺的Hibernate A，0.22μm微孔滤膜过滤，4°C保存备用。 3．Papin：用HA配制含Papin 2mg/mL的消化液，37°C孵育20~30min，0.22μm 微孔滤膜过滤，冰上保存至实验。在使用前3h内配制。

4．DNAase I：取DNAase I粉末用D-Hank’s液配制成50μg/mL，0.22μm微孔滤膜过滤。可一次配好，-20°C保存，每次取用。 4．终止消化液：HABG：含2% B27的HA。现用现配，37°C保存备用。 5．Optiprep离心介质：Optiprep medium∶HABG为124∶876，每离心管1~1.5mL。 5．种植液和培养液：Neurobasal-A/B27：含2% B27，0.5mM L-谷氨酰胺的Neurobasal-A。现用现配，37°C保存备用。 4．实验方法 1. 包被培养皿 使用前2 d，在无菌条件下取6孔培养板，加多聚赖氨酸1 mL/孔，放置2 h，吸去多余多聚赖氨酸，自然干燥，灭菌水洗板2次，干燥备用。 2. 组织剥离 取出生12 h以内的Wistar大鼠，用75%乙醇擦拭全身消毒。无菌条件下断头，沿正中剪开皮肤和颅骨，向两边分开，小心取出全脑，浸于冰浴的解剖液。首先切除小脑和脑干部分，然后沿正中切为左右两半球，海马位于半球的腹内侧。分别在解剖显微镜下剥离出海马并置于冰浴的解剖液中，完整的海马（半侧）呈月牙形。用精细镊小心除去中脑、纹状体等非皮层结构，剥离出皮层。 3. 消化和分散 用精细剪将海马剪成1~2 mm3的组织块，在6 cm培养皿中用配好的木瓜蛋白酶在37 °C下消化30 min，4个半皮层或16个半海马/10mL消化液，并加入500 μL DNAase I。消化结束后小心吸去消化液，加入2~3mL HABG，200 μL DNAase I，

胎鼠海马神经元培养及其鉴定

［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究 工作. 昆明医学院学报2011，（5）：17～19Journal of Kunming Medical University CN 53-1049/R 胎鼠海马神经元培养及其鉴定 李玉1），王波1），但齐琴2 ） （1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所，云南昆 明650031 ）［摘要］目的建立胎鼠海马神经元体外培养方法，观察细胞生长情况，免疫组织化学染色鉴定神经元特 异性．方法取胎鼠海马，分裂获得细胞悬液，接种于24孔板，经2h 差速帖壁去除成纤维细胞，将细胞液转移并继续培养，以获娶纯度较高的海马神经元．培养第5、11、15天观察细胞和突起生长情况，用NeuN 抗体以免疫组化SP 二步法染色鉴立神经细胞．结果培养头3d ．细胞生长缓慢，5d 时细胞开始生长，可见突起， 11d 时突起连成网状．经Neun 染色培养细胞呈阳性反应，证明是神经元．结论 本方法获取生长良好，纯度 较高的海马神经元． ［关键词］胎鼠；海马神经元；Neun ；培养 ［中图分类号］Q831.1+1［文献标识码］A ［文章编号］1003－4706（2011）05－0017－03 I dent ificat ion and Cult ur e of Hippocampus Neur ons in Fet al Rat s LI Yu 1），WANG Bo 1），DAN Qi －qin 2 ） （1）Deat.of Neurosurgery ；2）Institute of Neuroscience ，Kunming Medical University ， Kunming Yunnan 650031，China ） ［Abstract ］Objective To establish the protocol for culturing hippocampus neurons in vitro and explore the neuronal growth character istics ．Methods Tissues from hippocampus of fatal rats were harvested ，then digested into cell suspension by using 0.125%trypsin ．After planted into wells for 2hours ，cell suspension was transferred into next well for continuing incubation ．The cell growth was observed at day 5，11and 15．Neurons specific Enolase （NSE ）antibody ，recognized specifically NSE antigen in cultured cells ，was used to identify neurons by SP-two-step staining method ．Results After incubated for 2hours ，transferred suspensions in wells showed some pure neurons ，which is identified by NSE staining ．However ，they grew slowly during 1～3days ，then grew well from 5th day ，with gradual increasing the neuritis outgrowth ．Conclusion Purified neurons with neurite outgrowth states can be acquired by this method. ［Key words ］Fetal rats ；Hippocampus neurons ；NSE staining ；Culture 海马神经元细胞培养是研究神经细胞生物学特性和外源干扰因素作用（细胞因子）的有效细胞模型，其在神经生物学，发育生物学体外实验研究中已被广泛应用[1-3]．然而，要获得纯度较高， 生长状态较好的海马神经元也不是一件易事．本实验长期从事海马神经细胞生物特性及其应用研究，故需建立该细胞模型．鉴于胚胎来源的细胞 生长状态较成年动物来源者好[4，5] ．本实验建立大

氟西汀对海马神经元生长的影响

氟西汀对海马神经元生长的影响 各位读友大家好，此文档由网络收集而来，欢迎您下载，谢谢 【关键词】氟西汀;细胞培养;海马神经元;大鼠 氟西汀是5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除有抗抑郁作用外，尚可治疗其他中枢神经系统疾病。有研究表明，氟西汀对海马的神经保护作用是其发挥抗抑郁效应的机制之一［1］。关于氟西汀对体外培养的海马神经元生长的影响未见报道，本研究初步探讨了氟西汀对原代培养的海马神经元生长的影响。 1材料与方法 新生大鼠海马神经元的分离和培养 技术方法在参考文献［2］基础上加以改进。取出生24h内的新生SD大鼠（东南大学医学院动物实验中心提供），无菌分离出双侧海马，用显微剪剪碎，

D-Hank#39;s液清洗2或3次，将剪碎的海马组织转移至离心管中，加入等量%的胰酶（美国Sigma公司），37℃消化30min，中间振摇1或2次，加入10%的DMEM/F12（美国Gibco公司）5ml，轻轻吹打15次，然后1000r·min-1离心5min，制成单细胞悬液，置于CO2培养箱（德国Heraeus公司产品）中，差速贴壁30min，去除成纤维细胞，吸取未贴壁的细胞，并用200目的不锈钢滤网过滤，收集过滤后的单细胞悬液于培养皿中，然后至离心管中，取一滴单细胞悬液进行计数，并用DMEM/F12将细胞密度调到1×106ml-1，然后接种于200μg·ml-1多聚赖氨酸（美国Sigma公司）包被的6孔培养板中，转移至培养箱内培养，4h后换为无血清培养基，即含2%B27的Neurobasl培养基（美国Gibco公司），以后每3天半量换液1次。使用培养6d的神经元进行染色鉴定。 大鼠海马神经元的鉴定 烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染

神经元轴突标志物

神经元轴突标志物

Tau: Neuro n Type of MAP; helps main tai n structure of the axon 神经元树突标志物Drebrin、MAP SAP102 微管相关蛋白Microtubule-associated protein-2(MAP-2) : Neuron Den drite-specific MAP;prote in found specifically in den dritic branching of neuron 是组成神经元细胞骨架的重要组成成分，包括：MAP5 MAP1.2和MAP1 三种不同类型。在神经系统发育、形成和再生过程的不同时期扮演着重要的角色。其中MAP5为早期微观相关蛋白，在胚胎期和新生动物大脑中有较高表达，并随大脑的逐渐成熟而退化，对神经元突起的生长具有重要的引导作用。MAP2包括三种亚型：MAP2a MAP2I和MAP2c其中MAP21和MAP2(出现较早。随着年龄的增长MAP2被组织蛋白酶D所降解，在不同类型的神经元中表达量存在差异。 神经元早期标志物Tubulin、b-4 tubulin : Neuron Important structural protein for neuron; identifies differentiated neuron Nervous System微管蛋白为球形分子,分为两种类型:a 微管蛋白(a-tubulin) 和B微管蛋白(B -tubulin), 这两种微管蛋白具有相似 的三维结构，能够紧密地结合成二聚体，作为微管组装的亚基，能够聚合并且参与细胞分裂。a和B微管蛋白各有一个GTP结合位点，位于a亚基上的GTP结合位点，是不可逆的结合位点，结合上去的GTP不能被水解，也不能被GDP替换。位于B亚基上的GTP结合位点结合GTP后能够被水解成GDP所以这个位点又称为可交换的位点(exchangeable site,E 位点)-III Tubulin 又名tubulin B -4，是原始神经上皮中所表达的最早的神经元标志物之一。其作为神经元特有标志物，被广泛应用于神经生物学研究。 Noggin: Neuron A neuron-specific gene expressed during the development of n euro ns Neurosphere Embryoid body (E ⑨： ES Cluster of primitive n eural cells in culture of differentiating ES cells; indicates presence of early neurons and glia 星型胶质细胞标志物Astrocyte 、S-100、Microglia Markers Glial fibrillary acidic protein (GFAP) : Astrocyte Protein specifically produced by astrocyte 属于三型中间丝蛋白家族成员，在星型胶质细胞中大量特异性表达。在外周神经系统中的卫星细胞和部分雪旺氏细胞中也有少量表达。神经干细胞也会频繁并大量的表达GFAP因此，GFAP抗体经常被作为星型胶质 细胞的标志物用于神经生物学研究。另外，对于一些来源于星型胶质细胞的脑源性肿瘤，GFAP的表达量也较高。最近研究表明：在位于肝脏的枯否细胞、镜上皮细胞、唾液腺肿瘤细胞和红细胞中亦有GFAP的表达。

神经元细胞培养

神经元细胞培养 1. 孕16 d SD 大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks’平衡盐液中。 2. 在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入37℃孵箱内消化20 min，中间摇晃一次。 3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液(DMEM＋10%FBS)的离心管内终止消化液作用5 min。 4. 用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM＋10%FBS 的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3 次。 5. 将所收集的上清经200 目筛网过滤。 6. 过滤后的细胞悬液于800 rpm 离心5 min，弃上清，管内加入新鲜培养液(DMEM＋20%FBS)并吹打成单细胞悬液。 7. 细胞计数，调整细胞密度按（700000个）1.5×105/cm2 种入6 孔板内，放入CO2 孵箱中培养。 (1)把细胞悬液用(DMEM＋20%FBS)悬浮，种到培养皿上6－12 h 后，全量换成2% B27 的neurobasal 培养基，继续培养，3 d 半量换液。（+0.5mmol/L谷氨酰胺） 鉴定 1.形态学的观察，在DIC下可以很清楚的看到神经元特有的形态，轴突树突以及胞体非常 明显。 2.免疫学鉴定：正如楼上几位所说，NF（神经丝）或者tubulin 或者MAP2等都是目前 鉴定神经元的Marker,不论你好似免疫荧光还还是免疫组化，阳性表达即可！ 3.在进一步你可一做mRNA水平的实验，也就是RT-PCR了。这就更能支持2的阳性表达 了。 4.电生理学的鉴定：测定神经元特有的电生理学也是证据之一啊！ 从以上几个方面去做，应该能证明是神经元了！ 错误之处还请赐教！ TUJ1

小鼠海马神经元细胞使用说明

小鼠海马神经元细胞 小鼠海马神经元细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠海马神经元细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠海马神经元细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠海马神经元细胞产品简介： 产品名称：小鼠海马神经元细胞(Mouse hippocampal neuron cells)组织来源：小鼠海马组织区 产品规格：5×105cells/25cm2 培养瓶 小鼠海马神经元细胞简介： 海马椎体神经元是海马区的主要成分，主要功能是参与近期记忆、情绪及内脏功能调节、是老年性痴呆、癫痫等疾病的主要病灶之一。海马神经元细胞培养是研究神经细胞生物学特性和外源干扰因素作用(细胞因子)的有效细胞模型,其在神经生物学,发育生物学体外实验研究中已被广泛应用。 本公司生产的小鼠海马神经元细胞采用胰酶消化制备而来，细胞总量约为 5×105 个/瓶，细胞纯度可达 80%以上，且不含有 HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定

昆明医学院学报2011，（6）：29～32 CN53-1049/R Journal of Kunming Medical University 成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定 李玉1），但齐琴2），习杨彦彬2） （1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所， 云南昆明650031） ［摘要］目的观察体外培养成年小鼠海马神经细胞生长情况及其形态学变化．方法获取成年海马组织，制成细胞悬液，接种于培养板，分别于1，3，7，10，13，15d观察细胞生长情况，用神经元特异烯醇化酶抗体经免疫组织化学染色技术鉴定神经元．结果成年海马神经元接种后1～3d，有较多的杂质和部分细胞漂浮，贴壁细胞较少量．每隔3d半量换液后，杂质不断减少，但第1周细胞生长缓慢，第7～10d才见细胞生长良好．培养15d后，大部分细胞出现有明显的颗粒等早期退化征象．免疫组化染色证实培养细胞呈现神经元特异烯醇化酶染色阳性染色，免疫阳性产物主要分布于细胞质；证明是神经元．结论体外培养成年海马神经元早期生长缓慢，7～10d才显示良好的生长状态，2周左右细胞则开始退变．提示10d以前的细胞是供体外研究用的理想细胞． ［关键词］大鼠；神经细胞；海马；细胞培养；免疫组化 ［中图分类号］Q813.1+1［文献标识码］A［文章编号］1003－4706（2011）06－0029－04 Cult ur e and Ident ificat ion of Hippocampus Neur ons in Adult Rat s LI Yu1），DAN Qi－qin1），XIYANG Yan－bin2） （1）Dept.of Neurosurgery，The1st Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming Yunnan 650032；2）Institute of Neuroscience，Kunming Medical University，Kunming Yunnan650031，China） ［Abstract］Objective To observe the morphology and characteristics of hippocampus neurons in adult rats in vitro．Method The hippocampus tissues from adult rats were collected，then digested into cell suspension by using0.125%trypsin．Cell suspension was planted into wells and observed at day1，3，7，10，13，and15 after incubation．Neurons specific Enolase（NSE）antibody，recognized specifically NSE antigen in cultured cells，was used to identify neurons by SP-two-step staining method．Results During1-3days，the extensive bodies of floating cells and tissue blocks were seen，but a few cells attached to the bottom of well．The growth of attached cells was also extensively slow，specifically within1week，while it began to grow quickly after7days，and maintained till15days．Amazingly，cells exhibited aging character with more particles in cytoplasm after15 days．NSE staining showed that cultured cells were positive staining by neuronal specific enalose antibody．Conclusion Adult hippocampus neurons grow slowly during the first week，but they are better from7day to15，then begin to degenerate after15days in vitro．This suggests that neurons from hippocampus of adult rats cultured in10days could be better for related neurobiological studies. ［Key words］Adult rats；Hippocampus neurons；NSE staining；Culture ［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究工作.

海马神经元细胞免疫荧光检验

海马神经元细胞免疫荧光检验 神经元鉴定： 一、烯醇化酶鉴定： 培养细胞用100%乙醇固定---10min---PBS漂洗5min×3次---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS 漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min 以减少排特异背景颜色------加第一抗体特异烯醇化酶（chemicon，1:1000），4℃冰箱孵育18~24小时---PBS漂洗5min×3次---加入2步法：PV9000试剂Ⅰ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---PV9000试剂Ⅱ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---DAB显示红棕色；70%，80%，90%，100%I，100%II 梯度酒精透水；二甲苯Ⅰ，Ⅱ透明2次，每次30min---中性树胶灯片---镜下观察。 二、β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ）荧光显示： 培养细胞用预冷PBS液轻柔漂洗3次，4%多聚甲醛固定，1h，4℃---吸去多余甲醛---PBS漂洗5min×3次---0.25%triton，室温，15min---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min以减少排特异背景颜色------弃血清，加入β-tubulinⅢ抗体（1:100稀释），4℃，过夜---PBS漂洗5min×3次---滴加FITC 标记的山羊抗小鼠lgG（体积比1:200稀释），37℃，1h---DAPI复染10min---抗荧光猝灭封片液封片---荧光显微镜观察---选择10个视野，统计学处理。

神经元原代培养

神经元原代培养 一、准备 1. 试剂 1）胎牛血清灭活：血清室温自然融解，摇匀。选用与血清瓶同规格的对照瓶一个，并加入与血清等体积的水。对照瓶内插入1～2支温度计(保证测试温度的准确性)。将血清瓶与对照瓶同时放入恒温水浴箱，待温度计所示温度上升至56℃时，定时30分钟。灭活后分装，10ml/瓶，一瓶放在培养箱做无菌实验，其余-20～-70℃保存。 2）D-Hank’s液(g/L)：NaCl: 8, KCl: 0.4, KH2PO4: 0.06, Na2HPO42H2O: 0.06, NaHCO3: 0.35; 酚红：0.02，超纯水溶解，调节PH至7.2，高压灭菌（购自南方医院临床试验中心）。 3）多聚赖氨酸：避光，用超纯水配制好后过滤，200μl或400μl/tube分装, -20度储存。母液浓度为5mg/ml，工作液浓度为0.1mg/ml（购自Sigma，P2636，100mg）。配置方法：20ml超纯水溶解，分装为1ml/管。用时加入49ml超纯水稀释为0.1mg/ml的工作液。 4）50mM谷氨酸：超纯水溶解，滤过除菌，分装50μl/tube，-20℃保存。使用时需将终浓度调整为25μM（购自Sigma，G8415，100g，分子量：147.13）。配制方法：电子天平称量谷氨酸1.4713g，即0.01mol=10mmol，溶于200ml超纯水中，配制为50mM的谷氨酸母液。 例：500ml的Neurobasal Medium中加入Glutamate母液（50mM）250μl，此时终浓度约为25μM。 5）胰蛋白酶：0.25%（购自Hyclone，SH30042.01，100ml）。 6）阿糖胞苷（AraC）母液：10mM，(阿糖胞苷，1：1000稀释用)（购自Sigma，C1768，100mg，分子量：243.22）；配制方法：100mg/243.22≈0.41mM，加入41ml超纯水溶解，配制成10mM的AraC母液。 AraC工作液：10μM（半量换液，终浓度5μM）； 7）DNAse I（）（购自ROCHE，，100mg，1mg=2000U，用dH2O配成10mg/ml 母液，过滤分装100μl/tube，每次使用50-100μl） 8）培养基 FBS DMEM/F12：购自Hyclone，SH30023.01B，500ml

海马细胞培养与鉴定

3.1海马原代培养操作 准备： 1、取海马：培养皿6个（3对），D-hanks（100ml，提前预冷），75%酒精，眼科镊2把， 小剪刀3把，小镊子4把（三个弯头，一个直头），冰袋3个，中号镊一把。 2、细胞室：小dish，多聚赖氨酸（1个EP），纸抽，细胞剪，胰酶（2个EP），DMEM（10% 胎牛血清+青霉素+链霉素，提前拿出），离心管2个，24孔板1个，细胞筛2个，废液缸1个, D-hanks 3、分装：胰酶：1ml、D-hanks:100ml、青霉素：500ul、链霉素：500ul、胎牛血清：10ml、 DMEM：90ml、B27：40ul、Neurobasal：1.6ml 4、玻璃器皿：移液管，培养皿，24孔板内的玻璃片，泡酸过夜，自来水清洗10遍，一蒸 10遍，三蒸3遍，烤干，高压，再烤干 步骤： 1、培养前30min包被多聚赖氨酸置于培养箱中备用； ↓ 2、75%酒精浸泡鼠，断头取脑（1把中镊，1把中剪） ↓ 3、剥离海马（D-hanks液，冰盒，4把小镊） ↓ 4、去血管、被膜（显微镊2把） ↓（进细胞间） 5、吸去多余D-hanks，剪碎，吸入15ml离心管 ↓ 6、D-hanks：胰酶=1:1，吹打20次 ↓ 7、15-20 min，37℃，期间5min震荡一次 ↓ 8、1:1比例加（DMEM+青链+胎牛血清）终止消化，吹打20次 ↓ 9、配平，1000rpm，5min ↓ 10、弃上清，得沉淀 ↓ 11、加（DMEM+青链+胎牛血清），吹打20次 ↓ 12、100目过筛， ↓ 13、放入15ml离心管，吹打

↓ 14、配平，1000rpm，5min ↓ 15、弃上清，得沉淀，加DMEM，吹打 ↓ 16、200目过筛 ↓ 17、计数（1×106） ↓ 18、500微升/孔（24孔板） ↓ 19、24孔板放入恒温培养箱中，37℃，5%CO2 ↓ 20、第二天换Neurobasal+B27（N:1.6ml，B27:40ul） ↓ 21、隔三天换液 注意事项：1、取海马的操作过程要迅速，提高神经细胞的存活率。 2、从断头处死鼠到胰酶消化前整个过程都要在冰上进行。 3、如果是胎鼠，不要取一个分离一个，而是要快速把所有胎鼠大脑都迅速取出 放到预冷的液体中。 4、一定要尽可能的去掉所有的血管和血管膜。 5、吹打动作要轻柔，以免损伤细胞。 6、种板时密度很重要，过密和过稀都会影响细胞生长。 7、种板后需轻摇晃板，切记！不能圈圈摇晃。应左右平行，上下平行摇晃。 3.2 海马细胞的鉴定： 取培养7-9天的细胞 海马神经细胞特异性抗体：神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋白质2（MAP2）、生长相关换蛋白43（GAP-43） NSE：神经元特异性烯醇化酶，血清NSE是神经元和神经内分泌细胞所特有的一种酸性蛋白酶 GAP-43：GAP-43是一种膜相关的鳞蛋白，与神经纤维生长的调节有关，主要分布于海马神经元的轴突 MAP2：MAP2是一种细胞骨架蛋白，定位于海马神经元的胞体和树突。

免疫组化常用标记物

免疫组化常用标记物 一、常用标志物 1. CD15(LeuM1)---（阳性部位：细胞膜）。是一种由半乳糖、岩藻糖和N-乙酰葡萄糖组成的碳水化合物抗原，又称半抗原χ，是粒/单核细胞相关抗原。免疫组织化学表达：成熟粒细胞、激活的淋巴细胞（主要是T淋巴细胞）、R-S细胞、大多数腺癌等。 2. 癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）(CD66e)---（阳性部位：细胞膜/浆）。癌胚抗原是表达于胎儿上皮细胞的一种糖蛋白，分子量为180kDa。存于某些恶性肿瘤组织尤其是内胚层来源发肿瘤中，大多数胃肠道（包括胰腺）和肺腺癌均有表达，少量成人上皮细胞和良性肿瘤亦可表达。CEA主要用于标记上皮性肿瘤，尤其是腺上皮来源的腺癌。 3.嗜铬素A（chromogranin A，CgA）---（阳性部位：细胞浆）。嗜铬素是位于神经分泌颗粒内的酸性糖蛋白家族，是一组可溶性酸性蛋白，分子量为76～120 kDa，分布广泛。含量最丰富的是嗜铬素A，另两个是嗜铬素B和嗜铬素C。几乎所有的神经内分泌肿瘤中均可检测到嗜铬素。嗜铬素A不仅存在于神经内分泌细胞的分泌颗粒中，也广泛分布于所有含有颗粒的内分泌细胞和神经内分泌细胞来源的肿瘤细胞。此抗体可以识别嗜铬素A抗原羧基末端的片段，而不与氨基末端的片段反应，主要用于标记神经内分泌细胞及其来源的肿瘤。对小细胞癌进行抗原修复可提高检测的敏感性。 4.细胞角蛋白（cytokeratin pan，广谱 CK）--- AE1/ AE3（阳性部位：细胞浆）。此抗体可以识别绝大部分酸性细胞角蛋白（Ⅰ型/低分子量）和碱性细胞角蛋白（Ⅱ型/高分子量）。用于标记上皮及上皮来源的肿瘤，特别是对鉴别和判断转移性肿瘤是否为上皮源性具有一定的意义。 5.细胞角蛋白5/6（cytokeratin 5/6，CK5/6）---（阳性部位：细胞浆）。在正常组织中，鳞状上皮和导管上皮的基底细胞以及部分的鳞状上皮生发层细胞、肌上皮细胞和间皮细胞阳性，腺上皮细胞阴性。因此，可用于鳞癌和腺癌、间皮瘤和腺癌的鉴别诊断。支气管上皮基底细胞、间皮；鳞癌、大细胞癌、移行细胞癌、间皮瘤阳性。大多数腺癌为阴性。 6. 细胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）---（阳性部位：细胞浆）。CK7是分子量为54 kDa的一种碱性细胞角蛋白，存在于大多数正常组织的腺上皮和移行上皮细胞中，一般非上皮来源的细胞无表达。在卵巢、乳腺和肺的腺癌呈阳性反应，而胃肠道的腺癌阴性。 7. 细胞角蛋白20（cytokeratin 20，CK20）---（阳性部位：细胞浆）。CK20（46kDa）存在于正常的胃肠道上皮、移行上皮、Merkel细胞及其来源的肿瘤，而乳腺癌、肺癌和神经内分泌肿瘤不表达。 CK7 positive CK7 negative CK20 positive uninformative colorectum CK20 negative lung uninformative 8. 细胞角蛋白（高分子量）（cytokeratin，HMW）---（阳性部位：细胞浆）。高分子量细胞角蛋白抗体（34βE12）可以识别68kDa、58kDa、56.5kDa和50kDa的细胞角蛋白。 9.上皮膜抗原（epithelial membrane antigen，EMA）(MUC1)---（阳性部位：细胞浆）。上皮膜抗原是一种高分子量（400 kDa）跨膜糖蛋白，广泛分布于各种上皮细胞及其来源的肿瘤。癌细胞过表达MUC1与肿瘤侵袭有关，有意义的免疫反应性为膜阳性，如为纯粹的胞浆着色则为假阳性。此抗体可以用于标记上皮及上皮源性肿瘤，EMA阳性表达的肿瘤包括大多数的癌、间皮瘤、滑膜肉瘤和上皮样肉瘤等，淋巴瘤、黑色素瘤和软组织肿瘤阴性表达。 10.HBME1---（阳性部位：细胞膜）。该抗体与间皮细胞表面的抗原反应，染色方式呈现一种特殊的“厚膜”方式，在鉴别间皮瘤与腺癌时有一定的参考价值：间皮瘤为厚膜型，腺癌为薄膜型或胞浆着色。 11.突触素（synaptophysin，Syn）---（阳性部位：细胞浆）。突触素是分子量为38kDa的糖蛋白，主要存在于神经元突触前囊泡膜，是神经性和上皮性神经内分泌肿瘤的特异性标志之一，用于标记神经内分泌肿瘤。 12.甲状腺转录因子1（thyroid transcription factor-1，TTF-1）---（阳性部位：细胞核）。TTF-1表达于甲状腺腺上皮和肺的上皮细胞中。大多数肺的小细胞癌、腺癌、少部分大细胞癌、大多数非典型神经内分泌肿瘤免疫组化结果显示TTF-1阳性，而肺鳞癌及绝大多数典型类癌TTF-1阴性。

各类神经元细胞的培养方法

体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能 上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下: 一、鸡胚背根神经节组织块培养 主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。 1、材料和方法 （1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。 （2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。 （3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。 （4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。 （5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。 2、结果 鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。 二、新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养 背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数

小鼠海马神经元的培养

小鼠海马神经元的培养 一、实验材料： 1、所有用于细胞培养的器械、器皿剂溶液必须灭菌消毒。 2、多聚赖氨酸铺板以磷酸盐缓冲液(PBS)或蒸馏水溶解多聚赖氨酸（分子量为30-70KD）至1mg/ml。分装储存。临用前稀释至终浓度为20-60mg/ml过滤备用。在培养板或皿中加少量多聚赖氨酸溶液，以覆盖底部为宜，在37℃、CO2孵箱中过夜。次日，用移液管吸取多聚赖氨酸，并用水洗2-3遍，晾干备用，如果培养目的适用于电生理的单细胞记录或者免疫组化和荧光染色，则在培养皿的底部加上盖玻片，多聚赖氨酸铺于盖玻片上，则更易得到强烈的荧光信号。 3解剖液（HEPES平衡盐溶液）取100ml10x平衡盐溶液（Hank’s balance salt solution,HBSS） HEPES 3.9g, NaHCO30.84g， 青霉素104U, 链霉素100mg， H2O800ml。 以1mol/LHCl调节PH至7.2，再加H2O之后总体积为1L，以0.2μm 直径的滤菌器过滤，4℃保存。 4、DMEM培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）DMEM培

养基500ml，加小牛血清和或马血清各10%（血清需经56℃，30min灭活）1%的青/链霉素. 5、无血清培养基最常用的一种无血清培养基为，Neurobasal+2% 的b27+1%抗生素 6、2.5%胰蛋白酶（typsin）溶液临用前以解剖液稀释至终浓度0.125%。 7、台盼蓝(typan blue)溶液终浓度为0.2%-0.4%。 8、阿糖胞苷终浓度为8-10μmol/L。 9、动物妊娠天数的选择通常选择出生24h之内的乳鼠。 二、实验步骤： 1、脱臼处死乳鼠，75%的酒精浸泡3-5min，将清洗完的乳鼠放入含预冷解剖液的培养皿中。 2、用两把尖镊逐个去除鼠的头部皮肤和颅骨，取出全脑，置于另一含预冷解剖液的（PBS）培养皿中，小心剥离并去除脑膜及脉络丛。 3、在中线处用尖镊分离大脑半球，在解剖显微镜下小心去除嗅球、中隔、丘脑及下丘脑，剥离脑膜及脉络丛，在大脑皮层下方小心取出海马，置于含冰冷解剖液的6cm培养皿中。 4、用弯头尖镊把海马剪成小碎片，收集全部海马碎片，置于一含有0.25%胰蛋白酶溶液的培养皿中（该溶液必须在37℃孵箱中预暖）,在孵箱中消化5-7min。 5、收集全部海马碎片，置于10ml预暖的DMEM培养基的试管中（培养基中含有10%的胎牛血清和或马血清各，1%抗生素，以及谷氨酰胺）。