pmd18-Tvector ta克隆方法

TaKaRa Code：D101A

pMD

?18-T Vector

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●制品说明 1 ●制品内容 1 ●保存 1 ●纯度 1 ●用途 1 ●pMD?18-T Vector的结构 1 ●实验操作 2 ■Control DNA片段的克隆实验 2 ■一般DNA片段的克隆实验 2 ■一种可供选择的快速克隆法 3 ●相关说明 4 ●使用注意 4 ●Q&A 5

● 制品说明

pMD ?18-T Vector 是一种高效克隆PCR 产物（TA Cloning ）的专用载体。本载体由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I 和Sal I 识别位点之间插入了Eco R V 识别位点，用Eco R V 进行酶切反应后，再在两侧的3’ 端添加“T ”而成。因大部分耐热性DNA 聚合酶进行PCR 反应时都有在PCR 产物的3’ 末端添加一个“A ”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR 产物的连接、克隆效率。

由于本载体以pUC18载体为基础构建而成，所以它具有同pUC18载体相同的功能。此外，本制品中的高效连接液Solution I 可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。本制品中的Control Insert （500 bp ）还可以用于Control 反应。

● 制品内容

pMD ?18-T Vector

（50 ng/μl ） 20 μl×1支 Control Insert （50 ng/μl ） 10 μl×1支

● 保 存： -20℃

● 纯 度

■ Control Insert 经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA 片段。

● 用 途

■ 进行TA 克隆，克隆PCR 产物。

■ 对克隆后的PCR 产物使用Bca BEST TM Sequencing Primers 、M13 Primers 进行DNA 测序。

● pMD ?18-T Vector 的结构

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pMD ?18-T Vertor

(2,692 bp)

?

●实验操作

■Control DNA片段的克隆实验

A）操作方法

1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 μl。

2）加入5 μl（等量）的Solution I。

3）16℃反应30分钟。

注）①室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。

②5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。

4）全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。

5）42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。

6）加入890 μl SOC培养基，37℃振荡培养60分钟。

7）在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。

8）挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。

B）结果

使用Control Insert时的连接/转化结果如下，使用的感受态细胞的转化效率为：1.5×108 cfu/μg pUC19 DNA。

* 效率是指白色菌落中的目的DNA Insert片段的连入效率。

■一般DNA片段的克隆实验

1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 μl。

2）加入5 μl（等量）的Solution I。

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3）16℃反应30分钟。

注）①室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。

②5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。

③长片段PCR产物（2 kbp以上）进行DNA克隆时，连接反应时间请延长至数小时。

4）全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。

5）42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。

6）加入890 μl SOC培养基，37℃振荡培养60分钟。

7）在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。

8）挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。

■一种可供选择的快速克隆法*4

1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 μl。

2）加入5 μl（等量）的Solution I。

3）16℃反应30分钟。

注）①室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。

②5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。

③长片段PCR产物（2 kbp以上）进行DNA克隆时，连接反应时间请延长至数小时。

4）取2 μl上述连接液（10 ng Vector DNA）加入到microcentrifuge tubes中，冰上冷却2 min。

5）取50 μl E.coli JM109 Competent Cell加入到上述microcentrifuge tubes中，混匀并冰浴5 min。

6）在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养（平板使用前需要在37℃预热30分钟），形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。

*1 pMD?18-T Vector的使用量

取0.5 μl实验也可得到满意的结果。实际操作时，可按实验需要确定T载体的使用量。pMD?18-T Vector 1 μl（50 ng）的摩尔数约为0.03 pmol。

*2 Control Insert

Control Insert为500 bp的3′末端带有A碱基的PCR产物，Control Insert 1 μl（50 ng）的摩

尔数约为0.15 pmol。

*3 Insert DNA的使用量

在进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为：1：2～10。

*4 快速克隆法

该克隆方法的效率会有所下降，但此方法操作简单、迅速，是一快速克隆DNA片段的方法，可

以满足一定客户的需求。

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●相关说明

1. 感受态细胞的选择。

转化时请使用高效的热转化感受态细胞（转化效率≥1×108 cfu/μg pUC19），这样才可能得到比较理想的阳性克隆。如果需要进行蓝白筛选时，宿主细胞必须具有正确的基因型（F’ 编码的［LacZ△M15］）产生ωFragment，才可能和载体DNA产生的LacZα多肽相结合，表现出β-半乳糖苷酶活性（α-互补性）。

2. Insert DNA的要求。

Insert DNA应该进行切胶回收的纯化处理后才进行载体连接，尽量避免引物等其它杂质的存在。切胶回收时可使用TaKaRa凝胶回收试剂盒（TaKaRa Code：D301或DV805A）。

3. Insert DNA使用量的计算方法。

进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比一般为1：2～10，我们可以根据自己的实验情况选择合适的Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比。Insert DNA使用量的计算方法如下：

Insert DNA的使用量（ng）=nmol数×660×Insert DNA的bp数

本载体1 μl（50 ng）的摩尔数约为0.03 pmol。

4. 阳性克隆的检测。

DNA片段成功插入至pMD?18 Vector中后，一般情况下β-半乳糖苷酶的表达将受到破坏，重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的DNA片段插入载体时，基因的读码框有可能正好与LacZ的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。有报道称，2 kbp的DNA片段插入到载体中后，重组克隆体仍显示了蓝色。所以，当我们没有得到白色菌落时，可以试着检测蓝色菌落。进行阳性克隆检测时，我们建议使用PCR的方法，扩增用引物可以使用Bca BEST TM Sequencing Primers，可以对菌体直接进行PCR扩增。

5. 阳性对照实验。

为了确认实验操作的正确性以及实验试剂的有效性，我们建议进行阳性对照实验。按照实验操作方法，使用试剂盒中提供的Control Insert，可以进行10次阳性对照实验。

6. 转化效率的计算。

取0.1 ng的pUC19 Plasmid DNA加入至100μl的热转化感受态细胞中后，再加入900 μl的SOC培养基（0.1 ng DNA/ml），将上述培养液稀释10倍后（0.01 ng DNA/ml）取100 μl涂布平板（0.001 ng DNA/100 μl），记录菌落数。以得到200个克隆体为例计算转化效率，此时的转化效率=200 cfu/0.001 ng=2×105 cfu/ng=2×108 cfu/μg pUC19 DNA。

●使用注意

1. Solution I请于冰中融解。

2. 克隆时使用的Insert DNA片段（PCR产物）建议进行切胶回收纯化，否则PCR产物中的短片段

DNA（甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物等杂质都会影响TA克隆效率。

3. 按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过20 μl。当要转化的DNA量较大或准

备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化DNA后再进行转化。进行乙醇沉淀时使用核酸共沉剂（TaKaRa Code：D605A）可以提高DNA的回收率。

4. 连接反应请在25℃以下进行，温度升高（>26℃）较难形成环状DNA。连接效率偏低时，可适当延长

连接反应时间至数小时。

5. 本制品来源于pUC18载体，因此，适合pUC18载体的感受态细胞都可以使用，如：JM109等。

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●Q&A

Q-1怎样提高连接转化效率？

A-1 1. 确认Insert DNA片段的3’ 末端是否带有“A”尾。大部分的高保真DNA聚合酶（如：TaKaRa Pyrobest、KOD、Pfx、Pfu等）扩增的PCR产物是平滑末端，不能直接进行TA克隆。

2. 纯化PCR产物。最好使用切胶回收的PCR片段，以除去PCR产物中的非特异性片段和引物等杂

质。进行切胶回收时可以使用TaKaRa凝胶回收试剂盒（TaKaRa Code：D301或DV805A）。

3. 请使用转化效率大于108 cfu/μg pUC19 DNA的感受态细胞。

4. DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下，大片段DNA的克隆效率

（连接效率与转化效率）偏低，此时可以延长连接反应时间，或采用电转化方法。

5. 进行切胶回收纯化DNA片段时，不要使DNA片段在紫外线下暴露时间过长。

6. Solution I应尽量避免反复冻融。

7. 建议使用新配制的平板培养基。

Q-2 转化后的菌落全为蓝色，但有目的DNA片段的插入，为什么？

A-2 插入的DNA片段较短（小于500 bp），且插入片段没有影响LacZ基因的读框，此时平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色（或淡蓝色）。

Q-3 欲对克隆DNA片段进行测序时，使用何种引物？

A-3 本载体来源于pUC18载体。因此，用于pUC18载体测序的通用引物都可以使用。

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宝生物工程（大连）有限公司

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