日本沼虾(Macrobrachium nipponense)卵黄蛋白原代谢相关基因的克隆和表达研究

日本沼虾（Macrobrachium nipponense）卵黄蛋白原代谢相关基因的

克隆和表达研究

【摘要】：日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)又名青虾、河虾,是我国重要的经济淡水虾。近年来,随着其自然资源的锐减和养殖规模的扩大,养殖的日本沼虾出现了生产性能下降和种质资源退化的情况,其中虾个体小型化和“性早熟”的现象尤为突出。“性早熟”即雌、雄性个体性腺提前发育,造成了商品虾的规格降低,繁殖性能下降,严重影响了日本沼虾的品质和产值,成为日本沼虾养殖业发展的一大瓶颈。与精巢相比,卵巢发育需要消耗更多的营养,使得雌性个体的“性早熟”对日本沼虾的养殖业产生的负面影响更大。造成雌性个体“性早熟”的原因尚未完全查明,有学者从养殖外部环境条件和营养调控的角度进行了探讨,但均未涉及到卵巢发育提前启动,即雌性“性早熟”的机理,查明虾的卵巢发育机制将为解决这一生产难题提供理论基础参考。甲壳动物卵巢发育过程中最显著的变化是卵母细胞直径的剧烈增大,这主要是由于卵巢内卵黄蛋白(yolkprotein)等营养物质大量积累所致。甲壳动物卵黄蛋白的前体物质卵黄蛋白原(vitellogenin,Vg)在卵子发育之初即启动合成,合成后在体内被水解为卵黄蛋白沉积在卵母细胞中。有关甲壳动物Vg的合成和水解过程的影响和调控机制至今不十分清楚,但卵生脊椎动物这一过程的研究已做了大量细致的工作。卵生脊椎动物Vg的合成受体内外多种激素和多肽的调控,其中热休克蛋白90(heatshockprotein90,HSP90)和环境类雌激素双酚A(BPA)和雌激素

受体结合,诱导体内Vg合成,Vg合成后在水解酶的作用下水解为卵黄蛋白,组蛋白酶L(canthepsinL,CL)和组蛋白酶B(canthepsinB,CB)在这一水解过程中发挥着重要的作用。本研究借助分子生物学和生物信息学手段,首次克隆获得日本沼虾Vg基因cDNA片段、HSP90、CL和CB基因cDNA全长,分别命名为MnVg、MnHSP90、MnCL和MnCB。并测定了上述基因在日本沼虾不同组织中、卵巢发育过程中及不同剂量BPA浸泡暴露下mRNA表达量的变化。研究结果将为阐明日本沼虾“性早熟”的产生过程,以及采取有效的控制手段提供必要的参考。主要研究结果如下：1、克隆获得567bp的日本沼虾MnVg片段,该序列共编码183个氨基酸；这183个氨基酸序列与罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)Vg蛋白的相似性高达95%,与朝鲜长额虾(Pandalushypsinotus)、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)、日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)、刀额新对虾(Penaeusmonodon)Vg蛋白的相似性分别为76%、52%、52%、51%；不同组织实时荧光定量PCR(qPCR)结果显示：MnVgmRNA在日本沼虾鳃、肌肉、血细胞、心脏、胸神经节和肠中均有表达,胸神经节中的表达量最高；卵巢和肝胰腺中Vg 表达量随着卵巢的发育逐步升高,当卵巢发育至次级卵黄发生期(Ⅳ期)时MnVg的表达量达到最大值,而且在卵巢发育过程中肝胰腺内MnVg的表达量显著高于卵巢内的表达量(p0.05)。上述结果表明：日本沼虾MnVg合成既有内源性又有外源性,且以外源性的合成为主,肝胰腺是日本沼虾MnVg的主要合成器官。2、动物受到外界刺激,如热刺激等,体内HSP90会大量合成,但是近年来的研究结果表明,HSP90

不仅与热休克等刺激有关,而且在卵生脊椎动物的卵巢发育过程中也具有重要的作用。雌二醇缺乏时,HSP90和雌二醇受体结合,从而促进Vg蛋白合成。本研究应用简并引物通过RACE法成功克隆了日本沼虾MnHSP90基因cDNA全长序列。该序列全长2,684bp,其中包括126bp5’-UTR,2,199bpORF和359bp3’-UTR(序列号：GU319963),ORF 编码732个氨基酸,该蛋白的分子量为84.3KDa。序列比对结果显示MnHSP90氨基酸序列与其它动物HSP90氨基酸序列具有很高的相似性(72%-79%)。qPCR测定结果显示,MnHSP90基因在日本沼虾胸神经节中表达量最高,显著高于其它组织(肌肉、肠、鳃和血细胞)(p0.05),为其他组织的2-10倍；不同组织中,肌肉、肠、鳃中的表达量均较高,显著高于雌虾和雄虾血细胞中的表达量(p0.05)。卵巢和肝胰腺中的MnHSP90表达量随着卵巢发育逐步升高,分别在初级卵黄发生期(Ⅲ期)和次级卵黄发生期(Ⅳ期)达到最大值。在卵巢整个发育过程中,肝胰腺中的MnHSP90表达量显著高于卵巢(p0.05)。上述结果不仅表明MnHSP90与日本沼虾的卵巢发育有关,而且进一步证明了肝胰腺是日本沼虾卵黄蛋白原主要的合成器官,同时表明胸神经节在日本沼虾卵巢发育过程中发挥着重要的作用。3、在日本沼虾的BPA安全浓度(12.06mg/L)上下范围内,采用等对数的方法设定了5个暴露浓度组：5.01mg/L、7.76mg/L、12.056mg/L、18.62mg/L和28.84mg/L,将日本沼虾分别浸泡暴露于上述浓度的BPA中,19d后测定其卵巢中MnVg 和MnHSP90表达量的变化。测定结果显示MnVg和MnHSP90基因的表达量随着BPA浓度的上升,先增加后降低,12.06mg/L组MnVg和

MnHSP90基因的表达量最高。即低浓度的BPA促进日本沼虾卵巢MnVg和MnHSP90基因的表达,高浓度则抑制日本沼虾卵巢MnVg和MnHSP90基因的表达。4、为了研究日本沼虾卵黄蛋白原的水解过程,本研究在日本沼虾卵巢EST序列的基础上,通过RACE法成功克隆了日本沼虾MnCL和MnCB基因全长cDNA序列。序列分析结果表明,MnCL序列含有31bp的5’-UTR,1029bp的ORF和650bp的3’-UTR(序列号：HM134078)。ORF共编码342个氨基酸,此多肽N端具有18个氨基酸的信号肽和61个氨基酸的前导肽,成熟肽具有253个氨基酸,理论pI为5.25,分子量为37.7KDa。MnCL蛋白与斑节对虾(Penaeusmonodon)、黄粉虫(Tenebriomolitor)和玉米象(Sitophiluszeamais)CL蛋白相似性分别为73%、66%和66%。MnCL 在测定的各组织(胸神经节、心脏、鳃、肠)中的表达量均较高,显著高于雌虾血细胞中的表达量(P0.05)。在测定的各组织中,心脏和肌肉中表达量最高,显著高于其它组织(P0.05)。在卵巢的发育过程中,肝胰腺中MnCLmRNA的表达量始终高于卵巢。卵巢中的MnCLmRNA的表达量随着卵巢的发育逐步升高,当卵巢发育至次级卵黄发生期(Ⅳ期)时,表达量达到最大值。肝胰腺中的MnCLmRNA表达量在卵黄发生前期(Ⅱ期)和次级卵黄发生期(Ⅳ期)时表达量较高,其中卵黄发生前期(Ⅱ期)表达量最高。序列分析结果表明,MnCB序列含有12bp的5’-UTR,996bp的ORF和702bp的3’-UTR(序列号：HM134079)。ORF 共编码331个氨基酸,此多肽N端含有16个氨基酸的信号肽和40个氨基酸的前导肽,成熟肽具有247个氨基酸组成,理论pI为6.36,分子量

为36.5KDa。MnCB蛋白与斑节对虾(P.monodon)、埃及斑蚊(Aedesaegypti)和玉米根叶甲(Diabroticavirgifer)CB蛋白相似性分别为84%、65%和64%。MnCB基因在心脏中表达量最高,肌肉、肝胰腺和胸神经节中表达量次之,肠、鳃和血细胞中的表达量较低。MnCB的表达量在卵巢的发育过程中逐步升高,卵巢发育至初级卵黄发生期(Ⅲ期)MnCB的表达量显著增加,次级卵黄发生期(Ⅳ期)表达量继续增加,但是与初级卵黄发生期(Ⅲ期)表达量相比差异不显著(p0.05)。综上所述,日本沼虾MnVg主要在肝胰腺中合成,在卵巢发育过程中MnVg合成量逐步升高,当卵巢发育至次级卵黄蛋白发生期(Ⅳ期)MnVg合成达到最大值；MnHSP90和BPA对MnVg的合成具有一定的协同促进作用；提示MnCL和MnCB与日本沼虾卵巢发育有关,其作用途径可能是通过参与MnVg的水解过程而发挥作用。【关键词】：青虾肝胰腺卵巢成熟卵黄蛋白原热激蛋白90组蛋白酶L组蛋白酶B双酚A

【学位授予单位】：华东师范大学

【学位级别】：博士

【学位授予年份】：2011

【分类号】：S917.4

【目录】：中文摘要6-9ABSTRACT9-15第一章文献综述15-311卵黄蛋白原(Vg)的性质及热休克蛋白90(HSP90)对其合成调控中的影响15-232卵黄蛋白原(Vg)水解过程的研究进展23-293本论文的研究目的、意义和技术路线29-31第二章日本沼虾卵黄蛋白原(MnVg)基因的克隆及其在卵巢发育过程中的时空表达分析31-461前言31-322材料

与方法32-353结果35-424讨论42-46第三章日本沼虾热休克蛋白90(MnHSP90)基因的克隆及其在MnVg合成过程中的作用46-691前言46-472材料与方法47-513结果51-674讨论67-69第四章双酚A(BPA)对日本沼虾卵巢MnVg和MnHSP90表达量的影响69-801前言69-702材料与方法70-733结果73-774讨论77-80第五章日本沼虾组蛋白酶L(MnCL)和组蛋白酶B(MnCB)基因的克隆及其在MnVg水解过程中的作用80-1091前言80-812材料与方法81-833结果83-1064讨论106-109结语109-110参考文献110-131缩略语表131-133附录133-135致谢135 本论文购买请联系页眉网站。

免疫球蛋白

免疫球蛋白 免疫球蛋白（immunoglobulin）指具有抗体活性的动物蛋白。主要存在于血浆中，也见于其他体液、组织和一些分泌液中。人血浆内的免疫球蛋白大多数存在于丙种球蛋白（γ-球蛋白）中。免疫球蛋白可以分为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五类。 免疫球蛋白分类 免疫球蛋白可分为五类，即免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白D（IgD）和免疫球蛋白E（IgE），IgG，IgA和IgM还有亚类。 IgG，IgD，IgE均为单体，分泌液中IgA（SIgA）是双体，IgM是五聚体。 免疫球蛋白结构 Ig 分子的基本结构是由四肽链组成的，即由二条相同的分子量较小的轻链（L 链）和二条相同的分子量较大的重链（H 链）组成的。L链与H链是由二硫键连接形成一个四肽链分子，称为Ig分子的单体，是构成免疫球蛋白分子的基本结构。现已知5 种免疫球蛋白中IgG、IgA和IgD的H链各有一个可变区（VH）和三个恒定区（CH1、CH2 和CH3）共四个功能区。IgM和IgE 的H链各有一个可变区（VH）和四个恒定区（CHl、CH2、CH3 和CH4）共五个功能区。VL和VH 是与抗原结合的部位，单体由一对L链和一对H链组成的基本结构，只有2 个与抗原结合的位点，如IgG、IgD、IgE、血清型IgA；双体由J链连接的两个单体，有4 个与抗原结合的位点，如分泌型IgA（SIgA），所以SigA结合抗原的亲合力要比血清型IgA高。五聚体由J 链和二硫键连接五个单体，如IgM。五聚体IgM 理论上应为10 个与抗原结合的位点，但实际上由于立体构型的空间位阻，—般只有5 个结合点可结合。 H和L链上都有可变区，同类重链和同型轻链的近N端约110个氨基酸序列的变化很大，其他部分的氨基酸序列相对恒定，据此可将轻链和重链区分为可变区(V)和恒定区(C)。VH和VI。各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序高度变化，称为高变区(HVR)或互补决定区(CDR)，分别为CDRl、CDR2和CDR3。CDR以外区域的氨基酸组成和排列顺序相对不易变化，称为骨架区(FR)。VH和VI。各有113和107个氨基酸残基，组成4个FR(分别为FRl、FR2、FR3和FR4)和3个CDRs。VH和VI-中的各氨基酸可编号，一些保守的氨基酸都有其固定的编号位置，将不同序列和已编号的序列进行对比以后，在某个位置上多出来氨基酸编号为A、B、C等，如27A、27B、27C、106A等。VH和VL 的3个CDR共同组成Ig的抗原结合部位，识别及结合抗原，并决定抗体识别的特异性。 免疫球蛋白轻、重链可变区氨基酸顺序的编号 重链和轻链的C区分别称为CH和CL，不同型别(x或入)CI。的长度基本一致．但不同类别IgCH的长度不一，有的包括CHl～CH3，有的为CHl～CH4。同一种属生物体内针对不同抗原的同一类别Ig的C区氨基酸组成和排列顺序比较恒定，其抗原性是相同的，但V区各有不同。C区与抗体的效应功能相关，可激活补体，介导穿过胎盘和黏膜屏障，结合细胞表面的Fc受体从而介导调理作用、ADCC作用和I型超敏反应。 在Ig分子伸出的两臂和主干之间(CHl与CH2之间)还有个可弯曲的区域，称为铰链区。该区含有丰富的脯氨酸，因此易伸展弯曲，能改变两个结合抗原的Y形臂之间的距离，两臂之间的角度可自0到90变化，这样有利于两臂同时

家蝇卵黄蛋白基因的克隆与结构序列分析

ISS N 100727626C N 1123870ΠQ 中国生物化学与分子生物学报 Chinese Journal of Biochemistry and M olecular Biology 2003年8月19(4):445～450 家蝇卵黄蛋白基因的克隆与结构序列分析 夏平安 1,2) ,　刘维全 3)3 ,　江　禹1),　王本旭1),　刘海鹏1),　牛建强1) ,　殷　震 1) (1)解放军军需大学军事兽医研究所,长春　130062;2)郑州牧业工程高等专科学校,郑州　450008; 3) 中国农业大学生物学院,北京　100094) 摘要　家蝇卵黄蛋白基因编码的卵黄蛋白是家蝇胚胎发育的重要营养来源.根据3种家蝇卵黄蛋白cDNA 保守序列设计引物,用PCR 技术从家蝇基因组DNA 中扩增到大小为768bp 的mdY P1基因 的部分DNA 片段.经地高辛标记成特异性探针,从构建的家蝇基因组文库中筛选出一个阳性克隆,并从该克隆中分离到大小为3991bp 的mdY P1基因组基因.序列分析显示,该基因组序列含有约116kb 的5′2上游区和110kb 的3′2下游区,编码区由一个61bp 的内含子和大小分别为222bp 和1028bp 的2个外显子组成.5′2上游区含有典型的C AAT ΠT AT A 盒.关键词　家蝇,卵黄蛋白基因,克隆,基因组文库,序列分析中图分类号　Q969145318,Q78 Cloning and Sequence Analysis of Musca domestica Yolk Protein G ene XI A Ping 2an 1,2) ,LI U Wei 2quan 3)3 ,J I ANG Y u 1),W ANG Ben 2xu 1) , LI U Hai 2peng 1) ,NI U Jian 2qiang 1) ,YI N Zhen 1) (1)Military Veterinary Institute ,Quartermaster University o f P LA ,Changchun 130062,China ; 2)Zhengzhou Animal and Veterinary College ,Zhengzhou 450008,China ;3) College o f Biology ,Agricultural University o f China ,Beijing 100094,China ) Abstract Musca domestica y olk protein (mdyp )genes encode the major nutritional polypeptides deposited in developing oocytes for subsequent utilization during embry ogenesis.About a 410kb genomic gene encoding Musca domestica y olk protein 1(mdyp1)was cloned by screening Musca domestica genomic library constructed in E M BL3vector with a mdyp1DNA fragment obtained by PCR as probe labeling with Dig oxigen.Sequence analysis revealed that it contained about 116kb 5′2upstream region and about110kb 3′2downstream region.Encoding region was com posed of a 61bp intron ,a 222bp ex on 1and a 1028bp ex on 2.5′2upstream region possesses typical C AAT ΠT AT A boxes. K ey w ords Musca domestica ,y olk protein gene ,cloning ,genomic library ,sequence analysis 收稿日期:2002209225,接受日期:2002212223吉林省科委基金资助(N o.98579) 3 联系人:T el :010*********,E 2mail :weiquanl @https://www.wendangku.net/doc/219595017.html, 夏平安,男,1964年10月生,博士,副教授 Received :September 25,2002;Accepted :December 23,2002 Supported by a grant from the Programs of Science F oundation of Jilin Province 3 C orresponding author T el :010*********,E 2mail :weiquanl @https://www.wendangku.net/doc/219595017.html, 昆虫卵黄蛋白(Y P )是昆虫胚胎发育的重要营养来源,由雌虫的脂肪体大量合成的卵黄蛋白前体(vitellogenin ,vg )被释放到血淋巴中后经发育的卵母细胞摄取、加工而成.对卵黄蛋白或卵黄蛋白前体及其受体的研究是研究卵黄生成过程的重要方面,关系到对昆虫的有效控制[1] .大多数昆虫的卵黄蛋白或卵黄蛋白前体基因(cDNA 或genomic DNA )已被分离出来,并对其编码的氨基酸序列分子结构进行研究,发现大多数昆虫的卵黄蛋白是由其前体(vg )在毗邻β转角(beta 2turn )一个RXXR 位点上近N 端被切成两个大小不同亚基而成 [2～8] .但在高等双翅目, 其前体蛋白质则与脂蛋白脂酶同源 [9] ,由一系列分 子量为50kD 左右的小亚基组成,如果蝇卵黄蛋白的3个小亚基分子量分别为44kD 、45kD 和46kD.有关卵黄蛋白基因表达与调控的研究在果蝇和蚊子上较为深入.在果蝇,编码卵黄蛋白3个亚基的基因

鸡卵黄免疫球蛋白在畜禽生产中的应用前景

鸡卵黄免疫球蛋白在畜禽生产中的 应用前景 Williams等（1962）发现用某种抗原免疫产蛋母鸡，鸡血清中可产生相应抗体，产蛋母鸡又能以产蛋方式将血清免疫球蛋白有效地转移到卵黄中（ROse 和Orlans，1981）。鸡血液中能转移到卵黄中的免疫球蛋白只有免疫球蛋白G （IgG），至今尚未发现卵黄中存在免疫球蛋白A和M（IgA和IgM）（胡清林等，1997）。因此卵黄中的IgG又称为卵黄抗体或卵黄免疫球蛋白（简称1GG ）(Leslie和Clem，1969）。 与哺乳动物的Igh相比，鸡蛋的lgY具有取材方便、提取方法比较简单、产量高等优点。IgY的稳定性较好，可作为口服剂或饲料添加剂用于预防和治疗动物早期的消化道疾病。用禽卵大量制备多克隆抗体是近年来抗体制备技术中新兴的研究领域。本文简介一下IgY的分子结构、功能。特点及分离提纯方法，着重介 绍IgY在畜禽生产中的应用前景。 1 IgY的分子结构与功能 正常鸡的IgY分子量约为180KD，由两条重链和两条轻链组成，分子量分别为67000和2200。IgY的等电点接近5．2.尽管IgY同免疫球蛋白E（IgE）和LgY 有相似的结构特征，但从抗体产生特性及数量来看，IgY与哺乳动物IgG更相似。IgY的基本功能是与特异性抗原结合而发生免疫反应，增强机体的免疫力。 IgY通过口服方式，可用于预防和治疗哺乳动物早期的消化道疾病。 2 IgY的特点 2．l免疫的产蛋母鸡是高效率、高质量的IgY"生产厂"经用特定抗原免疫的

产蛋母鸡，对抗原可产生持久性应答。抗体在卵黄中出现的时间比在血清中约晚一周，一般在母鸡被免疫后15d左右出现，效价可维持数月至一年以上。Hatta 等（1993）报道，经轮状病毒（HRV）免疫成功的母鸡，其所产蛋中的抗HRVIgY 效价可维持一年以上。卵黄中IgY的含量超过哺乳动物血清抗体含量。 每个卵黄中lgY含量可达100～250mg（teslie和CIem，1969）。从一只兔子一个月可提取lgG约200mg，而-只母鸡一个月可提取lgY2000～2800mg（Schade 等，2001）。因此IgY生产效率是哺乳动物lgG的10倍。 2．2 IgY具有良好的稳定性，耐热、耐酸、耐碱较好Shimizu等（1988，1992，1993）研究lgY和哺乳类IgG（牛、山羊、兔）的热稳定性，结果表明IgY与哺乳类（除兔以外则外有着大致相同的热稳定性。发现热（＞75℃）或酸（pH＜3．0）能够降低IgY的抗体活性，温度65℃时IgY活性可保持24h以上，但70℃处理90min 后活性明显下降。Lasson等（1993）将IgY制剂在4℃贮存5年或在室温下放置6个月，经免疫扩散法检测，IgY抗体性仍无明显下降。 IgY对PH值和蛋白水解酶有较好的稳定性。IgY在pH 4．0～11．0时比较稳定，pH值为3．0～3．5时活性迅速下降，pH为12．0时活性也降低。Yolken等（1988）报道，IgY能够抵抗幼龄动物的胃酸屏障，抵抗肠道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化。Hatta等（1993）检测了3种主要消化道酶对抗HRVIgY的影响。将胃蛋白酶和IgY在pH2．0温育l h后，几乎所有IgY丧失；而在pH 4．0温育lh后保持91％的活性，甚至温育10 h后仍有63％的活性。IgY分别与胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶温育8h，活性分别保持39％和41％，这说明IgY对这两种酶的消化在一定时间内有抵抗作用。由于幼畜胃内酸度不会太高，IgY在

蛋黄免疫球蛋白IgY

自古以来，人们一直把鸡蛋看成是滋补身体的营养品，有谁想到鸡蛋还能制成药用于治疗疾病呢! 自从上世纪70年代末期以后，免疫学家就已经开始将一些抗原物质注射到鸡的体内(这就是所谓的免疫)，然后再从免疫母鸡所生的蛋中提取抗体，并用于诊断和治疗疾病的研究，结果出人意料，优点之多超过传统用动物(如马、羊等)血清抗体所制备的诊断和治疗制品。 IgY的诞生 人类生活在自然界中，时时刻刻都受到周围环境中种种病菌的感染和威胁。由于病菌的侵袭，刺激人体产生抗体，这就是人体免疫力的主要部分。人体的免疫抗体共有五种成分，最重要的一种成分称为IgG，它有抵御和杀灭病菌的作用。鸡与人相似，在自然界中受到病菌的侵袭后，同样能产生抗体，但独特的是，在鸡蛋黄中仅有一种抗体成分——IgG。由于鸡蛋黄的英文名称为YOLK，为了与其它动物血液中的IgG相区别，特取第一个字母Y为代表，将鸡蛋黄中的抗体IgG称为IgY。 鸡蛋黄中的IgY是怎样产生的 由上面的介绍可以知道，鸡蛋中的特异性IgY不是天然生成的，而是受到病菌侵袭后产生的。因此，为了大量提取IgY，免疫学家们应用医学免疫学技术，将一些外源物质(抗原)，例如细菌、病毒以及生物的细胞等注射入鸡的体内，鸡的免疫系统中的B淋巴细胞，受到抗原物质的刺激后便转化为浆细胞，再由这些浆细胞产生能与抗原发生特异性结合的抗体。在免疫鸡的血液中有IgM、IgG、IgA等五种成分，但是IgM和IgA等抗体的分子较大，不能渗透过鸡卵黄囊(蛋清和蛋黄之间的一层组织)，当输卵管内卵黄成熟期时，血液中的IgG被选择性地转输至鸡蛋黄中，因此鸡蛋黄中仅有IgY(即血液中的IgG)一种抗体成分，经提取分离便可得到纯正的IgY抗体。 小小的鸡蛋如何能制备成大量的药 也许有人会问，鸡蛋这么小，从中间能提取多少IgY啊，如何投入批量生产呢？ 鸡经过人工免疫后，体内产生的抗体IgY逐渐通过卵黄囊集中到蛋黄中，它的含量大大超过鸡血清中的IgG。研究表明，62个免疫鸡蛋即可提取出130毫克IgY，由于它的效价(一种免疫学计量单位，代表有效物质的浓度)高，可以大量稀释成有效浓度，这样就可以进行大规模的商品化生产了。 IgY有哪些用途 IgY有许多优点，在免疫治疗方面，鸡产生的抗体耐酸，性能稳定，可用于口服预防人类肠道传染病，如轮状病毒性胃肠炎。IgY耐热，像鲜牛奶一样，经巴氏消毒(亦称低温消毒法，即把样品置于62～65摄氏度，持续20～30分钟)后活性依然存在。而且，应用各种病原微生物或其它病原体免疫鸡产生的IgY，对人体是无毒性物质。以上种种，使IgY 经口服途径给药治疗和预防疾病成为可能。最近我国一些药业厂家同国外公司合作，利用这种技术从鸡蛋黄中提取的一种新药，其有效成分就是特异性IgY，这种现代高新技术的产品，对引起急慢性咽喉炎、扁桃体炎的致病菌有特异性杀伤作用。这就是鸡蛋黄IgY实际应用的一个典型例子。相信在不久的将来，它将会为预防和治疗开创一条新途径。

卵黄抗体作用机理

卵黄抗体 科技名词定义 中文名称：卵黄抗体 英文名称：vitelline antibody 定义：从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，是一种具有较强免疫功能的蛋白质，多为IgG。禽类免疫后在其卵黄中产生的大量高纯度IgG，其对某些禽类疫病具有明显治疗和紧急预防作用。 所属学科：免疫学（一级学科）；畜牧免疫（二级学科） 概述 卵黄抗体（yolk antibody, IgY）：通过免疫注射产蛋鸡，即可由其生产的蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预防和治疗，这类制剂称为卵黄抗体。 IgY的性质 IgY的性质与哺乳动物的IgG相似。正常鸡IgY的分子量约为180KDa，由两条轻链(2L)和两条重链(2H)组成，分子量分别为60-70KDa和22-30KDa。其等电点约为5.2。IgY 与一般哺乳动物IgG相比，IgY具有较强的耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶降解能力。在低于75℃条件下，IgY具有良好的热稳定性。IgY制剂在4℃贮存5年或在室温贮存6个月其活性仍无明显变化或下降，65℃时可保持24h以上，70℃时加热90min后其活性才明显下降60℃，30min条件下巴氏消毒不影响IgY；高于80℃，大部分IgY失去活性。IgY 在pH4.0-11.0时比较稳定，pH3.0-3.5时活性迅速下降，pH12时活性亦有所下降。IgY 对胃蛋白酶有较高的抵抗力，但对胰蛋白酶十分敏感。将胃蛋白酶和IgY在pH2.0温育1h 后，几乎所有活性丧失，但在pH4.0时1h后可保持91%的活性，甚至温育10h后仍有63%活性。IgY分别与胰蛋白酶和胰凝乳酶温育8h，活性分别保持39%和41%。 IgY的作用机理 特定病原菌的卵黄抗体能直接黏附于病原菌的细胞壁上，改变病原细胞的完整性，直接抑制病原菌的生长；卵黄抗体可黏附于细菌的菌毛上，使之不能黏附于肠道黏膜上皮细胞；一部分卵黄抗体在肠道消化酶作用下，降解为可结合片段，这些片段含有抗体的可变小肽(Fab)部分，这些小肽很容易被肠道吸收，进入血液后能与特定的病原菌黏附因子结合，使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性，而IgY的稳定区(Fe部分)留在肠内。 IgY在动物疾病防治方面的应用

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)卵黄蛋白原代谢相关基因的克隆和表达研究

日本沼虾（Macrobrachium nipponense）卵黄蛋白原代谢相关基因的 克隆和表达研究 【摘要】：日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)又名青虾、河虾,是我国重要的经济淡水虾。近年来,随着其自然资源的锐减和养殖规模的扩大,养殖的日本沼虾出现了生产性能下降和种质资源退化的情况,其中虾个体小型化和“性早熟”的现象尤为突出。“性早熟”即雌、雄性个体性腺提前发育,造成了商品虾的规格降低,繁殖性能下降,严重影响了日本沼虾的品质和产值,成为日本沼虾养殖业发展的一大瓶颈。与精巢相比,卵巢发育需要消耗更多的营养,使得雌性个体的“性早熟”对日本沼虾的养殖业产生的负面影响更大。造成雌性个体“性早熟”的原因尚未完全查明,有学者从养殖外部环境条件和营养调控的角度进行了探讨,但均未涉及到卵巢发育提前启动,即雌性“性早熟”的机理,查明虾的卵巢发育机制将为解决这一生产难题提供理论基础参考。甲壳动物卵巢发育过程中最显著的变化是卵母细胞直径的剧烈增大,这主要是由于卵巢内卵黄蛋白(yolkprotein)等营养物质大量积累所致。甲壳动物卵黄蛋白的前体物质卵黄蛋白原(vitellogenin,Vg)在卵子发育之初即启动合成,合成后在体内被水解为卵黄蛋白沉积在卵母细胞中。有关甲壳动物Vg的合成和水解过程的影响和调控机制至今不十分清楚,但卵生脊椎动物这一过程的研究已做了大量细致的工作。卵生脊椎动物Vg的合成受体内外多种激素和多肽的调控,其中热休克蛋白90(heatshockprotein90,HSP90)和环境类雌激素双酚A(BPA)和雌激素

受体结合,诱导体内Vg合成,Vg合成后在水解酶的作用下水解为卵黄蛋白,组蛋白酶L(canthepsinL,CL)和组蛋白酶B(canthepsinB,CB)在这一水解过程中发挥着重要的作用。本研究借助分子生物学和生物信息学手段,首次克隆获得日本沼虾Vg基因cDNA片段、HSP90、CL和CB基因cDNA全长,分别命名为MnVg、MnHSP90、MnCL和MnCB。并测定了上述基因在日本沼虾不同组织中、卵巢发育过程中及不同剂量BPA浸泡暴露下mRNA表达量的变化。研究结果将为阐明日本沼虾“性早熟”的产生过程,以及采取有效的控制手段提供必要的参考。主要研究结果如下：1、克隆获得567bp的日本沼虾MnVg片段,该序列共编码183个氨基酸；这183个氨基酸序列与罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)Vg蛋白的相似性高达95%,与朝鲜长额虾(Pandalushypsinotus)、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)、日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)、刀额新对虾(Penaeusmonodon)Vg蛋白的相似性分别为76%、52%、52%、51%；不同组织实时荧光定量PCR(qPCR)结果显示：MnVgmRNA在日本沼虾鳃、肌肉、血细胞、心脏、胸神经节和肠中均有表达,胸神经节中的表达量最高；卵巢和肝胰腺中Vg 表达量随着卵巢的发育逐步升高,当卵巢发育至次级卵黄发生期(Ⅳ期)时MnVg的表达量达到最大值,而且在卵巢发育过程中肝胰腺内MnVg的表达量显著高于卵巢内的表达量(p0.05)。上述结果表明：日本沼虾MnVg合成既有内源性又有外源性,且以外源性的合成为主,肝胰腺是日本沼虾MnVg的主要合成器官。2、动物受到外界刺激,如热刺激等,体内HSP90会大量合成,但是近年来的研究结果表明,HSP90

白蛋白及人血丙种球蛋白

1.什么是白蛋白及人血丙种球蛋白 2..白蛋白及人血丙种球蛋白的生理作用 3.白蛋白及人血丙种球蛋白的提取工艺 4.白蛋白国内外市场分析 5.白蛋白国内外研究和发展趋势 1. 白蛋白（又称清蛋白）是由肝实质细胞合成，在血浆中的半寿期约为15-19天，是血浆 中含量最多的蛋白质，占血浆总蛋白的40%-60%。 2. 3.白蛋白的生理作用 （1）维持血浆胶体渗透压的恒定 白蛋白是血浆中含量最多、分子最小、溶解度大、功能较多的一种蛋白质。血浆 胶体渗透压的维持主要依靠血浆中的白蛋白，胶体渗透压是使静脉端组织间液重 返回血管内的主要动力。当血浆白蛋白因病理条件引起下降时，血浆的胶体渗透 压也随之下降，可导致血液中的水份过多进入组织液而出现水肿。 （2）血浆白蛋白的运输功能 血浆白蛋白能与体内许多难溶性的小分子有机物和无机离子可逆地结合形成易溶 性的复合物，成为这些物质在血液循环中的运输形式。由此可见白蛋白属于非专 一性的运输蛋白，在生理上具有重要性，与人体的健康密切相关 4.救命药白蛋白告急！ 目前，白蛋白的唯一来源是人类血浆，由于血液资源有限，加上艾滋病、肝炎等血液传染病的威胁，白蛋白资源变得越来越紧缺。近几年我国各大主要城市、医院相继出现了白蛋白告急的情况，迫使国家出台了多种限制性措施，同时也导致了救命药白蛋白进入走私和黑市高价交易等畸形现象。随着人们生活水平的提高和血液资源的进一步紧张，白蛋白的紧缺状况将日益严峻。 5.白蛋白：目前白蛋白的价格已经纳入国家法定定价，它有国家发改委来进行制定最高的零 售价格。如国内生产的20G（冻干粉）/瓶人血白蛋白，统一最高零售价格为609 元，白蛋白价格国内生产的10g:50ml/瓶人血白蛋白，统一最高零售价格为360元。 6.人血丙种球蛋白：别名：普通丙种球蛋白、人血丙球、免疫血清球蛋白、丙种球蛋白 7.人血球蛋白的生理作用：本品为专供静脉注射用免疫球蛋白制剂，是以低温乙醇法从健康 人鲜血浆分离制备的制品，可增加机体免疫力，有补充抗体和免 疫调节作用，从而提高机体对多种细菌、病毒的抵抗能力，主要 用于预防麻疹、传染性肝炎、脊髓灰质炎、水痘等，也可用于其 他细菌性、病毒性感染 8.丙种球蛋白的应用 丙种球蛋白中抗体含量随来源人群的免疫状态、身体素质、生活水平、饮食习惯、居住环境、遗传因素的不同而异，其适应证也是有限的，仅对下述疾病的防治有效。１. 预防麻疹自前麻疹疫苗广泛应用以来已很少用丙种球蛋白。 ２. 预防甲型病毒性肝炎在接触具有传染性的患者后７～１４天内注射丙种球蛋白，保护时间４～８周，对已发病者无效，也不能预防乙型肝炎。 ３. 预防脊髓灰质炎由于活疫苗糖丸的普遍应用，已基本不用丙种球蛋白。但对未接受

昆虫卵黄原蛋白功能多效性以蜜蜂为例doc

昆虫卵黄原蛋白功能多效性：以蜜蜂为例 严盈，彭露， 万方浩* （中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京，100081） 摘要：卵黄原蛋白是昆虫卵黄发生的关键物质，随着RNA干扰技术在功能基因研究中的应用和发展，昆虫特别是蜜蜂卵黄原蛋白被发现具有气候适应、激活卵巢、生殖竞争、劳动力分化、行为构建、延长寿命、转化食物等多个功能，因此又被称为多效性蛋白。许多针对蜜蜂卵黄原蛋白功能和调控机制的假说也相继提出，如“交互抑制假说”、“循环反馈机制”、“卵黄原蛋白转化蛋白胨机制”，表明蜜蜂卵黄原蛋白已经由雌虫繁殖过程的一个下游因子上升为高等社会性昆虫主要生命周期的调控子，不仅极大地促进了昆虫社会生物学的研究，对其他具有复杂繁殖行为昆虫的研究也具有重要的参考意义。针对近年来这一领域相继取得的重大突破，本文以蜜蜂为例介绍了昆虫卵黄原蛋白功能多效性的研究进展，包括卵黄原蛋白的理化性质与分子进化、发生与调控、功能多效性及其研究方法等。 关键词：昆虫；蜜蜂；卵黄原蛋白；理化性质；发生；调控；功能多效性 中图分类号：Q966 文献标识码：A 文章编号：0454-6296(2010)03-0000-00 Pleiotropic functions of insect vitellogenin：With honey bee Apis mellifera as an example Y AN Ying, PENG Lu, WAN Fang-Hao* (State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China) Abstract：Vitellogenin is the key factor in vitellogenesis in insects. As RNA interference was applied, pleiotropic functions of vitellogenin in honey bee Apis mellifera, were discovered, including climate adaption, ovary activation, reproductive competition, labor differentiation, behavior formation, life extension and food convertion.Thus, Apis mellifera vitellogenin was called “pleiotropic protein”. Also many theories such as “double repressor hypothesis”, “feedback loop mechanism” and “vitellogenin-to-jelly mechanism”, were proposed to explain the function and regulation of vitellogenin. All these studies suggested that this protein has been upgraded from a downstream factor in female reproductive physiology to a major life cycle regulator in the highly eusocial honeybees. Studies on vitellogenin in honey bee not only promoted the research in insect sociobiology considerably, but also provide a new aspect to study the insects with complex reproductive behavior. Here research progress on pleiotropic functions of insect vitellogenin is reviewed with A. mellifera as an example, including physicochemical properties, molecular evolution, occurrence, regulation, pleiotropic effects and its research methods. Key words: Insect; Apis mellifera; vitellogenin; physical and chemical properties; occurrence; regulation; pleiotropic functions 卵黄原蛋白（vitellogenin，Vg）是一类大分子量的糖脂复合蛋白，广泛存在于卵生脊椎动物和非脊椎动物的血淋巴、肝脏（脂肪体）和卵中。绝大部分昆虫的Vg由雌性脂肪体在激素调控下合成，并转运到血淋巴，被卵母细胞通过Vg特异受体(vitellogenin-specific receptors，VgRs)调节的内吞作用所摄取，并最终转化为卵黄蛋白（vitellin，Vt），为正在发育的胚胎提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生素、磷和硫等营养和功能性物质。作为卵黄发生的关键物质，Vg的功能和调控机理一直是昆虫繁殖生理学最为活跃的领域之一。迄今为止至少有28种昆虫的39个Vg基因一级结构已经被分离和解析，Vg氨基酸序列的某些特点如多聚丝氨酸区、GL/ICG框和DGXR框等在昆虫中高度保守（董胜张等，2008；Tufail and Takeda，2008）。随着研究的深入，人们发现昆虫Vg不仅可作为胚胎的营养来源，而且还具有其他重要的生物学功能，因此又被称为“多效性蛋白”（pleiotropic protein）（Amdam et al.，2003a，2003b；Tufail and Takeda，2008）。 由于其特殊的社会习性、学习行为和经济价值，西方蜜蜂Apis mellifera（本文简称蜜蜂）一直被人们视为最为重要的模式生物和实验生物之一（Seeley，1995；Amdam et al.，2009）。有意思的是，包括蜂王、工蜂和雄蜂在内的各个生物型（social caste）都来自相同的基因组，但它们的生活史却表现出极大的差异。蜂王每天可产2 000粒卵并可存活1~3年；工蜂基本不育，寒冷地区夏季工蜂的寿命只有3~6周；雄蜂与蜂王一样肩负着繁殖的任务，但寿命却接近于工蜂（Corona et al.，2007）。同时当蜂王存在时，蜂巢中的工蜂将依据年龄分担不同的工作[即年龄多态性（age polyethism）]，初羽化1~2周内工蜂担任看护工作，负责饲喂和抚育幼虫、蜂王、雄蜂及其他工蜂， 基金项目：国家重点基础研究发展规划（“973”计划）项目（2009CB119200） 作者简介：严盈，男，1982年3月生，重庆市南岸区人，博士研究生，研究方向为生物安全，E-mail: willeve_yy@https://www.wendangku.net/doc/219595017.html, * 通讯作者Corresponding author, E-mail:wanf h@https://www.wendangku.net/doc/219595017.html, 收稿日期Received: 2009-12-04；接受日期Accepted：2010-02-18

鸡卵黄前体物及其受体对蛋品质的影响

鸡卵黄前体物及其受体对蛋品质的影响 摘要：在雌激素作用下，产蛋鸡肝脏合成卵黄前体物，即极低密度脂蛋白（VLDL）和卵黄生成素（VTG），二者分别为卵母细胞生长发育提供能量和营养物质。血浆卵黄前体物水平与蛋鸡生产性能密切相关。极低密度脂蛋白受体(VLDLR)是卵黄前体物的转运受体，介导VLDL 和VTG 从卵黄膜表面进入卵母细胞并促进卵母细胞的成熟，是影响产蛋数和卵黄质量的关键基因。因此，鸡卵黄前体物及其受体与蛋鸡产蛋性能及蛋品品质密切相关。本文简要阐述鸡卵黄前体物及其受体的结构、功能以及它们对蛋品品质的影响。 关键词：蛋鸡卵黄前体物受体蛋品质 Chicken egg yolk precursor chemicals and receptor effect on egg quality Abstract: Under the effect of estrogen, the layer chicken liver yolk precursor, namely, very low density lipoprotein (VLDL) and vitellogenin (vacations), respectively, for oocyte growth and development to provide energy and nutrients. Yolk precursor plasma levels are closely associated with laying hens production performance. Very low density lipoprotein receptor (VLDLR) is yolk precursor of transport receptor mediated VLDL and vacations from vitelline membrane surface into oocytes and promote the oocyte maturation, is the key factor affecting the quality of egg and egg yolk. Therefore, chicken egg yolk precursor chemicals and receptor and laying hens egg production performance and egg quality are closely related. This paper briefly expounds the chicken egg yolk precursor chemicals and the structure and function of receptors and their effect on egg quality. Key words:Hen Yolk precursor substance Receptor Egg quality

鸡卵黄免疫球蛋白IgY酶联免疫分析

鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用。 检测范围：96T 30 ng/L - 900ng/L 使用目的： 本试剂盒用于测定鸡血清、血浆及相关液体样本中卵黄免疫球蛋白（IgY）含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）水平。用纯化的鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入卵黄免疫球蛋白（IgY），再与HRP标记的卵黄免疫球蛋白（IgY）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的卵黄免疫球蛋白（IgY）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）浓度。 试剂盒组成 标本要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、 待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽

量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 操作程序总结： 计算 以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

47认识人体的免疫球蛋白

免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig） 具有抗体活性的血清蛋白称为免疫球蛋白，又称为抗体。是由机体的B淋巴细胞在抗原的刺激下分化、分裂而成的一组特殊球蛋白。在人体至少有五种免疫球蛋白，即IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。 免疫球蛋白是机体受抗原（如病原体）刺激后产生的，其主要作用与抗原起免疫反应，生成抗原-抗体复合物，从而阻断病原体对机体的危害，使病原体失去致作用。 免疫球蛋白是一组具有抗体活性的蛋白质，主要存在于生物体血液、组织液和外分泌液中，是检查机体体液免疫功能的一项重要指标。IgD和IgE含量很低，常规所测定的Ig主要为lgG、lgA、IgM三项。血清中免疫球蛋白异常，主要可分为三类： 1.几种不同的Ig水平增加：主要见于感染、肿瘤、自身免疫病、慢性活动性肝炎、肝硬化及淋巴瘤等。自身免疫病中，如系统性红斑狼疮(SLE)以lgG、lgA、IgM升高多见，类风湿性关节炎以IgG、IgM升高多见。 2.单一的Ig水平增加：又称为“M”蛋白病，主要见于： 多发性骨髓瘤(MM)，表现为仅有某一种Ig异常增高，而其他种明显降低或维持正常。其中以IgG型MM最常见，

血清中lgG含量可高达70g／L，IgA型次之，IgD型较少见，IgE 型最为罕见。 巨球蛋白血症，是产生IgM的浆细胞恶性增生，血清中IgM可高达20g／L以上。 3.一种或多种Ig水平减少：分为原发性或继发性的，前者属于遗传性，如瑞士丙种球蛋白缺乏症，选择性IgA、IgM缺乏症等。继发性缺损见于网状淋巴系统的恶性疾病、慢性淋巴细胞性白血病、肾病综合征、大面积烧伤烫伤患者、长期大剂量使用免疫抑制剂或放射线照射所致。lgD升高主要见于lgD型MM。流行性出血热、过敏性哮喘、特应性皮炎患者IgD升高。妊娠末期、吸烟者中IgD也可出现生理性升高。IgE升高常见于超敏反应性疾病，如过敏性鼻炎、外源性哮喘、枯草热、慢性荨麻疹，以及寄生虫感染、急慢性肝炎、药物所致的间质性肺炎、支气管肺曲菌病、类风湿性关节炎和IgE型MM等。 人体血清免疫球蛋白的主要成分是IgG ，它占总的免疫球蛋白的70-75%。IgG是初级免疫应答中最持久、最重要的抗体，它仅以单体形式存在。大多是抗菌性、抗毒性和抗病毒抗体属于IgG，它在抗感染中起到主力军作用，它能够促进单核巨噬细胞的吞噬作用（调理作用），中和细菌毒素的毒性（中和毒素）和病毒抗原结合使病毒失去感染宿主细胞的能力（中和病毒）。它是唯一能通过胎盘的Ig，在自然被动免

人卵黄蛋白原(VTG)试剂盒实验原理

人卵黄蛋白原（VTG）试剂盒实验原理 人卵黄蛋白原（VTG）试剂盒实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠内皮素（ET）水平。用纯化的大鼠内皮素（ET）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入内皮素（ET），再与HRP 标记的内皮素（ET）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的内皮素（ET）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠内皮素（ET）浓度。标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。120μg/L5号标准品 150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液60μg/L4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液30μg/L3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液15μg/L2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液7.5μg/L1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品zui终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后

丙种球蛋白自费使用谈话

丙种球蛋白（静脉注射用人免疫球蛋白）自费使用谈话记录 患者姓名：性别：年龄： 住院号：床号： 患者现病情需要使用丙种球蛋白（静脉注射用人免疫球蛋白）进行治疗。 该药主要作用机理： 本品含有广谱抗病毒、细菌或其他病原体的IgG抗体，另外免疫球蛋白的独特型和独特型抗体能形成复杂的免疫网络，所以具有免疫替代和免疫调节的双重治疗作用。经静脉输注后，能迅速提高受者血液中的IgG水平，增强机体的抗感染能力和免疫调节功能。对抗体内存在的异常免疫反应。 该药主要适应症： 1．原发性免疫球蛋白缺乏症，如X联锁低免疫球蛋白血症，常见变异性免疫缺陷病，免疫球蛋白G亚型缺陷病等。 2．继发性免疫球蛋白缺陷病，如重症感染，新生儿败血症等。 3．自身免疫性疾病，如原发性血小板减少性紫癜，川崎病。 4. 重症肌无力、多发性硬化、视神经脊髓炎、格林巴利综合征等具有异常免疫反应的疾病。 该药主要不良反应： 1. 输注时出现一过性头痛、心慌、恶心等不良反应，可能与输注速度过快或个体差异有关。上述反应大多轻微且常发生在输液开始一小时内，因此建议在输注的全过程定期观察病人的一般情况和生命特征，必要时减慢或暂停输注，一般无需特殊处理即可自行恢复。 2. 极个别患者可能出现过敏反应，皮疹、过敏性休克、甚至危及生命。 3. 极个别患者可能出现肾功能损害、甚至肾功能衰竭。 该药使用主要禁忌： 1．对人免疫球蛋白过敏或有其他严重过敏史者。 2．有抗IgA抗体的选择性IgA缺乏者。 主要注意事项： 1．患者使用该药后不能保证一定对现病情治疗有效，甚至可能完全无效。 2．该药使用需要自费，且费用昂贵。 3．该药使用过程中患者出现任何不适需及时通知医护人员，及时判断、处理。 4．该药静脉滴注一般5天为一个疗程，可能需要重复使用多个疗程，方能有明显疗效。 以上该药（丙种球蛋白（静脉注射用人免疫球蛋白））使用的不良反应、风险、注意事项以及需要全自费使用等情况已详细告知患者及患者家属，其表示知情理解，并表示对使用注意事项已充分理解，并经过充分考虑，决定自费使用该药治疗，特签字为证：