Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂说明书

Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂说明书

产品描述

Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂是一种多用途的脂质体转染试剂，适用于DNA、RNA 和寡核苷酸的转染，对大多数真核细胞具有很高的转染效率。其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，这样可以减少去除血清对细胞的损伤。转染后不需要除去核酸-Hieff Trans TM复合物或更换新鲜培养基，也可在4～6小时后除去。

Hieff Trans TM以无菌的液体形式提供。通常情况下对于 24 孔板转染，每次用1.5μl左右，则1ml Hieff Trans TM约可做660次转染；对于6孔板，每次用6μl左右，则1ml Hieff Trans TM约可做160 次转染；

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。产品4oC保存，一年有效。不可冷冻！

注意事项

1）Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响；如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密度要求较低的转染试剂，不适合用脂质体核酸转染试剂。

2）Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基。但是，制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。另外，要检测所用的无血清培养基与脂质体核酸转染试剂的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 就不相容。

3）转染的时候培养基中不能添加抗生素。

4）使用高纯度的DNA或RNA有助于获得较高的转染效率，质粒中的内毒素是转染的大敌。

5）阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。

6）初次使用应优化DNA浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。DNA 和转染试剂的比例，通常推荐是1:2-1:3，比如24孔板内接种0.5-2×105个细胞，使用0.5 μg DNA 和1-1.5 μl 转染试剂。通过调整DNA/Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂比例优化转染效率，保证细胞密度大于90%，DNA（μg）: Hieff Trans TM（μl）比值在1：0.5-1：5。

操作流程（以24孔板为例，其他培养板加样体积请参考表一）

【注】：转染试剂使用量受细胞类型及其他实验条件影响，建议初次使用时设置梯度进行优化最佳使用量。

贴壁细胞：转染前一天（20-24小时），胰酶消化细胞并计数，细胞铺板（不含抗生素），使其在转染时密度为90-95%（0.5-2 × 105 cells/well for a 24-well plate）。

悬浮细胞：转染当天，配制DNA复合物之前，24孔板中细胞铺板，每500μl生长培养基（不含抗生素）中加入4-8×105 cells。

1. 按照以下体系配制DNA-Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂复合物：

1）对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.5μg DNA。混匀。

2）对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.6-2.5 μl Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂。

Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂稀释后室温孵育5min（在30min内同稀释的DNA 混合，保温时间过长会降低活性）。

【注意】：即使脂质体核酸转染试剂使用OPTI-MEM稀释，细胞也可以使用DMEM 培养。如果DMEM 作为脂质体核酸转染试剂的稀释液，必须在5min内同稀释的DNA混合。

2. 混合稀释的DNA和稀释的脂质体核酸转染试剂（总体积100μl），轻轻混匀，并在室温（15-25℃）孵育20min，使得DNA-脂质体复合物形成。此时溶液可能会混浊，但不会影响转染。

【注意】：DNA-脂质体复合物室温至少稳定保存5h。

3. 直接将100μl DNA-Hieff Trans TM复合物加入到细胞培养板每个孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

【注意】：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为500μl无血清培养基。

4. 37℃，5% CO2培养箱培养24-48h，直至进行转基因表达分析，无需去掉复合物或更换培养基。然而，可能有必要在4-6h后更换生长培养基，不会降低转染活性。

稳转细胞株：转染24h后，按照1：10或更高比例在细胞中加入新鲜生长培养基，转染48h 后加入筛选培养基。

悬浮细胞株：在细胞中加入DNA-Hieff Trans TM复合物后，如果需要可以4h后加入PMA

和/或PHA。对于Jurkat细胞，PHA和PMA的终浓度分别为1μg/ml和50ng/ml，可以提高CMV启动子活性和基因表达。对于K562细胞，只加入PMA足以提高启动子活性。

转染体系的调整

对于不同的细胞培养板，Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂、DNA、细胞和培养基的使用量会有所不同，具体请参考下表（表一）。对于96 孔板培养，不需要提前一天进行细胞铺板，可以直接在平板中制备复合物，然后将细胞悬浮液加入到复合物就可以了，这样进一步减少了转染时间。这种改进步骤已经过293-H，293-F，COS-7L和CHO细胞的试验，同传统方法相比活性稍低。快捷的步骤和蛋白表达细胞系的高效转染使得脂质体核酸转染试剂非常适用于96 孔板的高通量转染，比如cDNA文库的筛选和蛋白瞬时表达。

1 不同厂商提供的细胞培养板表面积可能有所不同；

2 稀释DNA或RNAi所用的培养基体积。

【注】：该表使用量仅供参考，具体使用量还需根据细胞类型及其他实验条件进行优化。使用时DNA（μg）: Hieff Trans TM（μl）比值保持在1:0.5-1:5。

siRNA细胞转染实验操作指南

siRNA细胞转染实验操作指南 siRNA产品的最佳工作浓度、转染后检测时间因不同的细胞类型和研究目的而异。一般推荐的siRNA工作浓度为50nM，检测时间为转染后24~72h。可以通过设置时间梯度和浓度梯度进行组合实验来选择最优的siRNA工作浓度和检测时间。由于siRNA过量会对细胞产生毒性，实验建议的siRNA 工作浓度优化的范围为5~100nM。 下面以Lipofectamine 2000转染24孔板的293T细胞为例，选取50nM的siRNA工作浓度，介绍siRNA转染细胞的操作步骤。若使用其他的转染试剂，请参照对应的产品说明书进行操作。 1.在转染前一天，按1×105~5×105个/孔的量将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中，使次日转染时细胞融合度30-50%为宜。接种时尽量 保证每孔细胞的接种数量一致，使细胞均匀地平铺在生长表面。 注意:降低转染时的细胞密度可延长转染和收样的时间间隔，避免细胞过度生长对实验结果造成影响。可根据细胞特性和实验目的等，调整接种时的细胞密度。 2.每个待转染的细胞样品（每个培养孔），按以下体系配置转染所需的siRNA-Lipofectamine 2000复合物: （1）配制稀释液A:取25pmol siRNA于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀。（*siRNA的用量计算参照表1） （2）配制稀释液B:使用前先将Lipofectamine 2000轻轻混匀，取出1ul于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。注意孵育时间不能超过25min。 （3）孵育完成后，将稀释液A与B轻轻混匀得到siRNA-Lipofectamine 2000复合物，在室温下孵育20分钟。此时溶液可能会浑浊，属于正常现象。 表1 不同细胞培养板siRNA 转染用量参考表 3.将孵育好的siRNA-Lipofectamine 2000复合物分别加到对应的细胞孔中，轻轻混匀。 注意：转染前无需更换新鲜培养基，直接将复合物加到原细胞培养基中即可。如有需要，也可根据情况更换培养基优化该步骤。 4.如果需要进行其他特殊处理，如加药等，可在此时进行。 5.将细胞培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24-72h。具体培养时间根据细胞生长特性、实验目的进行调整。 注意：加入siRNA-Lipofectamine 2000复合物后一般无需更换培养基，但若脂质体类转染试剂对细胞毒性较大，可根据细胞的状态，在转染4-6小时后更换培养基。 6.进行后续总RNA提取、蛋白提取、细胞活性分析等实验。

Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂(亲手整理)

Hieff TransTM 脂质体核酸转染试剂 产品描述 Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂是一种多用途的脂质体转染试剂，适用于DNA 、RNA 和寡核苷酸的转染，对大多数真核细胞具有很高的转染效率。其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，这样可以减少去除血清对细胞的损伤。转染后不需要除去核酸-Hieff Trans TM 复合物或更换新鲜培养基，也可在4～6小时后除去。 Hieff Trans TM 以无菌的液体形式提供。通常情况下对于 24 孔板转染，每次用1.5μl 左右，则1ml Hieff Trans TM 约可做660次转染；对于6孔板，每次用6μl 左右，则1ml Hieff Trans TM 约可做160 次转染； 运输与保存方法 冰袋（wet ice ）运输。产品4oC 保存，一年有效。不可冷冻！ 注意事项 1）Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响；如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密度要求较低的转染试剂，不适合用脂质体核酸转染试剂。 2）Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基。但是，制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA 和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。另外，要检测所用的无血清培养基与脂质体核酸转染试剂的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 就不相容。 3）转染的时候培养基中不能添加抗生素。 4）使用高纯度的DNA 或RNA 有助于获得较高的转染效率，质粒中的内毒素是转染的大敌。 5）阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。 6）初次使用应优化DNA 浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。DNA 和转染试剂的比例，通常推荐是1:2-1:3，比如24孔板内接种0.5-2×105个细胞，使用0.5 μg DNA 和1-1.5 μl 转染试剂。通过调整DNA/Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂比例优化转染效率，保证细胞密度大于90%，DNA （μg ）: Hieff Trans TM （μl ）比值在1：0.5-1：5。 操作流程（以24孔板为例，其他培养板加样体积请参考表一） 【注】：转染试剂使用量受细胞类型及其他实验条件影响，建议初次使用时设置梯度进行优化最佳使用量。 贴壁细胞：转染前一天（20-24小时），胰酶消化细胞并计数，细胞铺板（不含抗生素），使其在转染时密度为90-95%（0.5-2 × 105 cells/well for a 24-well plate ）。 c c l 整 理

脂质体转染的实验原理与操作步骤大全

脂质体转染的实验原理与操作步骤大全 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n， n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 一、脂质体(liposome)转染方法原理 脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体((Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。 中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 二、脂质体转染操作步骤 1、操作步骤[方法一]： (1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。 (3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。

siRNA说明书

产品以冻干粉的形式，常温运输。收到产品后，请于-20 C?-80 'C保存，冻干粉可以稳定保存一年。 使用前请瞬时离心，用RNase-freeH 2O或者灭菌ddH20，配制成20gM储存液，分装保存，避免反复冻 融（尽量不超过5次）。 表120 gM储存液的配置参考 使用前须知 为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。 实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20 C~-80 C小心保存。 细胞实验方法 为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验可靠性和可重复性，一般建议： a. 转染实验中每个转染样品至少设置3个以上复孔； b. 接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。 1. 转染浓度： siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。推荐初始转染浓度为50nM，转染后检测时 间为24?72h。最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5~100nM。 2. 转染步骤： 以Iipofectamine2000（简称Iipo2000）转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染 请参考表2。 1）转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞 密度能够达到30~50%（不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验）。注意: 转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，降低细胞的转染效率。 2）对于每个转染样品，请按以下步骤准备siRNA-Iipo2000混合液： a. 稀释siRNA :用50 g 不含血清培养基Opti-MEM I （v1）稀释g I20 gM siRNA储存液，轻轻混匀，室温孵育5min ; b. 稀释Iipo2000 :用50 g不含血清培养基Opti-MEM I （v1）稀释1 g Ilipo2000，轻轻混匀并室温孵育5min ; c. 将a与b轻轻混匀，室温孵育20min（溶液可能会有浑浊，但不会影响转染）。 注意：稀释好的Iipo2000长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在25min之内与稀释好的siRNA 混合。另在混合试剂时，请勿剧烈吹打或振荡，手指轻弹管壁即可，过度用力可能会破坏脂质体的结构， 甚至影响siRNA-lipo2000 混合物的形成。 3）将siRNA-Iipo2000混合液加入含有细胞的400 gl培养基（v2）的培养孔中，轻轻混匀； 4）（可选）培养4?6h后，将孔中含siRNA-Iipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜培养基； 5）（可选）进行其他必要的特殊处理（如加药处理）；

Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂说明书

Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂说明书 产品描述 Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂是一种多用途的脂质体转染试剂，适用于DNA、RNA 和寡核苷酸的转染，对大多数真核细胞具有很高的转染效率。其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，这样可以减少去除血清对细胞的损伤。转染后不需要除去核酸-Hieff Trans TM复合物或更换新鲜培养基，也可在4～6小时后除去。 Hieff Trans TM以无菌的液体形式提供。通常情况下对于 24 孔板转染，每次用1.5μl左右，则1ml Hieff Trans TM约可做660次转染；对于6孔板，每次用6μl左右，则1ml Hieff Trans TM约可做160 次转染； 运输与保存方法 冰袋（wet ice）运输。产品4oC保存，一年有效。不可冷冻！ 注意事项 1）Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响；如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密度要求较低的转染试剂，不适合用脂质体核酸转染试剂。 2）Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基。但是，制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。另外，要检测所用的无血清培养基与脂质体核酸转染试剂的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 就不相容。 3）转染的时候培养基中不能添加抗生素。 4）使用高纯度的DNA或RNA有助于获得较高的转染效率，质粒中的内毒素是转染的大敌。 5）阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。 6）初次使用应优化DNA浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。DNA 和转染试剂的比例，通常推荐是1:2-1:3，比如24孔板内接种0.5-2×105个细胞，使用0.5 μg DNA 和1-1.5 μl 转染试剂。通过调整DNA/Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂比例优化转染效率，保证细胞密度大于90%，DNA（μg）: Hieff Trans TM（μl）比值在1：0.5-1：5。

转染步骤及经验(精华)

转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血

锐博siRNA产品说明书

siRNA使用说明（2009-08） 名称： 常规化学合成siRNA。 产品简介： 常规化学合成siRNA为21-25nt，带有2nt的3'端悬垂的双链小RNA（3'端悬垂通常为dTdT或者UU，也可以选择其他的碱基作为3'端悬垂）。 产品剂量经过严格测算，以摩尔数标明。产品剂型为冻干粉，即用型的siRNA已经经过去保护、退火、纯化等处理，只要用灭菌的ddH2O或者RNase-free water溶解并配制成20μM液体即可直接用于细胞转染及其他实验。 保存和使用： 保存： 液体剂型，siRNA的贮存浓度一般为20μM，-20℃或-70℃保存半年以上； 冻干粉剂型，-20℃或-70℃保存一年以上。开盖前，请先稍稍离心，将粉末收集管底，再用灭菌的ddH2O或者RNase-free water，配制成20μM的液体剂型。 例如：20nmolsiRNA冻干粉，需要加入1ml水溶解（其他剂量可以按照比例计算加水量）。 注意：（1）液体剂型产品，应避免反复冻融（尽量不要超过5次），建议溶解后的产品分装保存。（2）如果近期不做实验，产品需要长期放置，最好以冻干粉形式保存。 使用： 产品使用时（转染过程），siRNA最好冰上放置，使用完毕，请于-20℃或-70℃小心保存; 整个实验过程，要求无RNA酶环境，枪头、EP管都要经DEPC处理； 特别提示：荧光标记siRNA要求避光。 使用方法： 1. siRNA的转染浓度：推荐的siRNA转染浓度是50nM，客户可根据实验具体情况优化转染浓度，优化的范围可以是10～150nM。 （siRNA及转染试剂的建议用量，请参照“实验指导”）。 2. 使用lipofectamine2000（Invitrogen）转染siRNA的步骤（仅供参考）： (1) 转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，使转染时的细胞密度能够达到30～50％（不同细胞生长速度不一样， 因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验），请使用无抗生素的培养基。 注意：转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，从而降低细胞的转染效率。而细胞密度过低则可能达不到生长的要求，也会因此影响转染效率。 (2)对于每个转染样品，按如下步骤准备siRNA- lipo2000混和液（试剂的用量和体积，请参照“实验指导”）： a. 稀释转染试剂lipofectamine2000（以下称lipo2000）：使用前，将lipo2000转染试剂轻轻摇匀，然后取适量，用不含血清 的优化培养基（Opti- MEMⅠ）稀释，轻轻混和，室温孵育5min； b. 稀释siRNA：用不含血清的Opti -MEMⅠ稀释siRNA，轻轻混和； c. 稀释好的lipo2000经过5min的孵育后，将之与上述（b）稀释好的siRNA轻轻混和，室温培养20min以形成siRNA-lipo2000 混和物，溶液可能会有浑浊，不过不会影响转染。 注意：稀释好的lipo2000，如果长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在30min之内与稀释好的siRNA混和。 (3) 将siRNA-lipo2000混和液加入含有细胞以及培养液的细胞培养板中，轻轻摇晃，使之混和； (4)将培养板置于37 ℃的CO2培养箱中培养至检测时间（24～96h）。沉默效率的检测一般建议的时间为24～72h。 可选操作（并非必要的操作）：转染操作完成，经过37℃培养4～6h后，可以将孔里含有siRNA-lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜的生长培养基，这样也不会影响转染的效率。 注意：如果转染时使用的是不含血清的培养基（即血清饥饿的条件下进行转染），4～6h后必须换成完全培养基（含血清、含抗生素），以确保细胞生长。 3. mRNA 水平的检测：siRNA的作用机理在于其引起靶mRNA的降解，因此mRNA的降解水平是siRNA沉默效率的最直接指标。 一般在siRNA转染后24h即可以检测到靶mRNA水平的降低。检测方法一般采用RT-PCR（半定量）或Real-time PCR（定量）。 4. 蛋白水平的检测：蛋白水平的检测一般需要借助抗体（针对靶基因蛋白质的抗体或针对融合蛋白的抗体）或报告基因系统检 测，检测手段一般有Western-blot、免疫组化等。一般说来，检测时间受细胞内蛋白质表达量、蛋白质本身的半衰期等因素的影响，一般从48h开始检测，在36、48、72、96h，甚至更长时间之后多点采样。

脂质体转染实验原理与操作步骤总

脂质体转染的实验原理与操作步骤大全 日期：2012-06-25 来源：互联网作者：青岚点击：3644次 摘要： 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 找产品，上生物帮>> >> 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n，n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 一、脂质体(liposome)转染方法原理 脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体((Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。 中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 二、脂质体转染操作步骤 1、操作步骤[方法一]：

翻译好罗氏公司Tel试剂盒操作说明书

罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书 (In situ cell death detection kit-POD法) 一、原理： TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。 二、器材与试剂 器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等； 试剂：试剂盒含： 1号（蓝盖）Enzyme Solution 酶溶液：TdT 10×、 2号（紫盖）Label Solution标记液：荧光素标记的dUTP 1×、 3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP； 自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、

siRNA 中文操作手册(lipo2000)

THE RNAi COMPANY RNAi 产品使用手册 上海吉玛制药技术有限公司 Shanghai GenePharma Co.,Ltd.

Ⅰ. RNAi 简介 1 A. RNAi 实验原理 B. RNAi 实验流程 C. RNAi 实验所需试剂 D. 上海吉玛 RNAi 相关产品 Ⅱ. siRNA设计7 A. 哺乳动物siRNA设计 B. 上海吉玛 siRNA 产品特性 C. siRNA oligo 技术数据 Ⅲ. siRNA 对照9 A. 普通阴性对照 B. 荧光标记的阴性对照 C. siRNA阳性对照 D. 转染试剂对照 E. 避免off-target对照 Ⅳ. siRNA 转染10 A.siRNA 转染的方法 B.Lipofectamin2000 转染试剂 C.Lipofectamin2000适用的细胞类型 D.转染前细胞培养 E.Lipofectamin：siRNA/DNA比例 F.贴壁细胞转染程序 G.悬浮细胞siRNA转染程序 H.DNA和siRNA共转染细胞程序 I. 体内siRNA导入方法 J. siRNA转染常见问题与建议 Ⅴ. mRNA水平RNAi效果监测15 A. siRNA细胞转染条件优化 B. Real-Time PCR RNAi 效果检测 C. Real-Time PCR 结果分析 Ⅵ. 蛋白质水平RNAi效果监测20 A. western-blot原理 B.western-blot操作步骤 w C.estern-blot上样液的制备 D.western-blot常用试剂的配制 Ⅶ. RNAi实验常见问题解答22

Ⅰ. RNAi 简介 A. RNAi实验原理 RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。

脂质体转染实验原理与操作步骤总(精)

脂质体转染的实验原理与操作步骤大全 日期:2012-06-25 来源:互联网作者:青岚点击:3644次 摘要: 细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等, 本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。 找产品,上生物帮 >> >> 细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等,本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。 脂质体 (lipofectin regeant, LR 试剂是阳离子脂质体 N-[1-2, 3-Dioleyoxy , Propyl]-n, n , n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA和 Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE的混合物 [1:1(w/w]。它适用于把 DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中 ,是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高,优于磷酸钙法,比它高 5~100倍,能把 DNA 和 RNA 转染到各种细胞。 用 LR 进行转染时, 首先需优化转染条件, 应找出该批 LR 对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批 LR 都要做:第一,先要固定一个 DNA 的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间, DNA 可从1~5μg和孵育时间 6小时开始,按这两个参数绘出相应 LR 需用量的曲线,再选用 LR 和 DNA 两者最佳的剂量,确定出转染时间 (2~24小时。因 LR 对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过 24小时为宜。

jetPRIME转染试剂说明

Polyplus-transfection S.A. - Bioparc - 850 Bd S. Brant - 67400 Illkirch - France - Phone: +33 3 90 40 61 80 - Fax: +33 3 90 40 61 81 Polyplus-transfection Inc. - 1251 Ave of the Americas - 34th fl. - New-York - NY 10020 - USA https://www.wendangku.net/doc/262027192.html, jetPRIME? in vitro DNA & siRNA transfection reagent PROTOCOL DESCRIPTION jetPRIME? is a novel powerful molecule based on a polymer formulation manufactured at Polyplus-transfection?. jetPRIME? ensures effective and reproducible DNA and siRNA transfection into mammalian cells. jetPRIME? is extremely efficient on a wide variety of cell lines. This powerful reagent only requires low amounts of nucleic acid per transfection, hence resulting in very low cytotoxicity . 1 Transient DNA transfection protocol (2) 1.1 Cell seeding .......................................................................................................................................... 2 1.2 DNA transfection protocol ................................................................................................................... 2 1.3 Virus production in adherent cells ....................................................................................................... 5 1.4 Optimization guidelines (5) 2 siRNA transfection protocol (6) 2.1 Cell seeding .......................................................................................................................................... 6 2.2 siRNA transfection protocol .. (7) 3 DNA & siRNA cotransfection protocol (7) 3.1 Cell seeding .......................................................................................................................................... 7 3.2 DNA & siRNA cotransfection protocol . (8) 4 Transfection of CRISPR/Cas9 ..................................................................................... 9 5 Stable DNA transfection ............................................................................................. 9 6 Troubleshooting ....................................................................................................... 10 7 Product information (11)

脂质体转染的几个实验方法

脂质体转染的几个实验方法 关键词：脂质体转染2013-08-28 14:32 来源：互联网点击次数：731 实验原理 脂质体(LR)试剂是阳离子脂质体DOTMA和DOPE的混合物(1：1)。它适用于把DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方面的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需要优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做。先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1-5ug和孵育时间6h，开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24h为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 实验步骤 1. 操作步骤(方法一)： 1) 取6孔培养板，向每孔中加入2ml含(1-2) x 10 5个细胞的培养基，37℃、18% CO 2培养基40%-60%汇合时。 2) 转染液制备：在聚苯乙烯管中制备以下两液(为转染1个空细胞所用的量)。 A液：用不含血清培养基稀释DNA使浓度为1-10ug，终量100ul。 B液：用不含血清培养基稀释LR，使终浓度为2-50ug，终量100ul。 轻轻混合A液、B液，室温中置10-15min，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 3) 转染准备：用2ml不含血清培养基漂洗2次，再加入1ml不含血清培养基。 4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养基中，摇匀，置37℃温箱中6-24h，吸除无血清转染液，换入正常培养基继续培养。 5) 其余处理：如观察、筛选、检测等与其他转染法相同。 6) 注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。 2. 快速脂质体转染法操作步骤(方法二)： 1) 将细胞以5 x 105个/孔接种于6孔板中培养24h，使其达到50%-60%板底面积。 2) 在试管中配制DNA-脂质体复合物。 a. 在1ml无血清DMEM中稀释PSV1-neo质粒DNA或供体DNA。 b. 旋转1s，再加入脂质体悬液，旋转。 c. 室温下放置5-10min，使DNA结合在脂质体上。 3) 弃去细胞中的旧液，用1ml无血清DMEM洗细胞1次后弃去，向每孔中直接加入1mlDNA-脂质体复合物，37℃培养3-5天。 4) 再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM，继续培养14-24h。 5) 吸出DMEM-DNA-脂质体混合物加入新鲜含10%胎牛血清的DMEM，2ml/孔，再培养24-48h。 6) 用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。

细胞转染的操作步骤

细胞转染的操作步骤 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X10⁶个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

CK-MB试剂盒说明书(罗氏)

the MB isoenzyme of creatine kinase，CK-MB 11821598 322 100测试 主要用途 用免疫学方法定量测定人血清或血浆中肌酸 激酶同工酶MB含量。 电化学发光免疫测定试剂，适用于罗氏 Elecsys和cobas e免疫测定分析仪。 临床应用1、2、3 肌酸激酶（CK）是一种二聚体酶，它有四种不 同的形式：线粒体同工酶和胞浆同工酶CK-MM （肌型）、CK-BB（脑型）和CK-MB。 血清中CK-MB的测定值是诊断心肌缺血（例如 急性心肌梗塞、心肌炎等）的重要指标。CK-MB 在心脏症状出现3－8小时后即可检出并且可 持续较长时间，这取决于病情经过。 CK-MB还可出现在其它临床条件下，例如横纹 肌溶解症和中风。实验室诊断方面，测定总体 CK、肌钙蛋白T和/或肌红蛋百有助于鉴别这些 临床疾病。 CK-MB测定的灵敏度与取样时间有关。因此跟 踪测定非常有意义。 Elecsys Ck-MB测定法采用了两种不同的直接 对抗人CK-MB的单克隆抗体。 检测原理 双抗体夹心法，总检测时间：18分钟 ●第一次孵育：15μl标本、生物素化的抗 CK-MB单克隆抗体和钌（Ru）a标记的CK-MB 特异性单克隆抗体一起反应生成抗原抗 体夹心复合物。 ●第二次孵育：添加包被链霉亲和素的磁珠 微粒后，该复合物通过生物素和链霉素之 间的反应结合到微粒上。 ●将反应液吸入测量池中，通过电磁作用将 磁珠吸附在电极表面。未与磁珠结合的物 质通过ProCell被去除。给电极加以一定 的电压，使复合体化学发光，并通过光电 倍增器测量发光强度。 ●仪器自动通过2点校正的定标曲线计算得 到检测结果。 a)Tris(2,2’-bipyridyl) ruthenium(II)- complex (Ru(bpy){ 2 3 }三联吡啶钌 试剂－工作溶液 M 包被链霉亲和素的磁珠微粒（透明瓶 盖），1瓶，6.5ml；包被链霉亲和素的 磁珠微粒，0.72mg/ml；防腐剂。 R1 生物素化的抗CK-MB抗体（灰盖），1瓶， 10mL：生物素化抗CK-MB单克隆抗体（小 鼠）1.2mg/L；磷酸盐缓冲液100mmol/L， pH值7.0；防腐剂。 R2 Ru(bpy)32+标记的抗CK-MB抗体（黑盖）， 1瓶，10mL；钌标记的抗CK-MB单抗 1.2mg/L；磷酸盐缓冲液100mmol/L，pH 值 7.0；防腐剂。 警告和注意事项 仅用于体外诊断。 在使用本试剂盒时必需遵循所有试验室试剂 操作的注意事项。 所有废弃物必需按照当地法规进行处置。 专业人员可要求获得安全数据报告。 避免试剂和样本（样本、定标液和质控品）产 生气泡。 试剂处理 试剂盒为即用型，不能分开使用。 试剂相关信息可以通过试剂条形码阅读获取。 储存及稳定性 存放于2－8℃。 请垂直摆放Elecsys CK-MB试剂盒，确保使用 前仪器通过自动搅拌能够完全混匀磁珠微粒。 样本的采集和准备 仅以下罗列的样本通过检测要求。 血清样本须用标准试管或有分离胶的真空管 收集。 肝素锂、肝素钠、K3-EDTA和枸橼酸钠抗凝的 血浆都适用。使用枸橼酸钠抗凝的血浆时，结 果必须按＋10％校正。 标准：回收率在血清值的90-110%以内或斜率 0.9-1.1＋截距<±2×分析灵敏度（LDL）＋相 关系数>0.95。 稳定性：18-23℃保存4小时，2-8℃保存8小时， -20℃保存3个月。 样本只能冰冻一次。