乙酰丁香酮在植物转基因研究中的作用_董喜才
中国农学通报2011,27(05):292-299 Chinese Agricultural Science Bulletin
0引言
植物基因工程是一门新的分子育种技术。自20世纪80年代诞生以来，得到了很大发展，取得了丰硕的成果。但是，目的基因转化频率不高是这个技术广泛推广和应用的制约性因素。许多科学家对目的基因转化过程的各个环节进行了深入细致的研究，特别是双子叶植物分泌的酚类物质乙酰丁香酮能极大地提高转化率尤其受到关注，因此对乙酰丁香酮的作用机理及提高转化率的研究具有重要的意义。
乙酰丁香酮，化学名为3',5'-二甲氧基-4'-羟基苯乙酮，分子式：HOC6H2(OCH3)2COCH3；英文名Acetosyringone(AS)，英文化学式4'-Hydroxy-3', 5'-dimethoxyacetophenone，分子量196.20，分子结构见图1。
乙酰丁香酮（AS，以下同）根据其在实验研究中所
处理对象的不同，其使用溶液的配制方法也有所差异：
（1）用于愈伤组织的侵染，是用少量甲醇溶解后，再用
蒸馏水定容，之后过滤除菌。（2）用于侵染其他组织，配
第一作者简介：董喜才，男，1973年出生，山西省运城市，助研，硕士，研究方向：玉米遗传育种，育成‘晋单56’、‘晋单64’和‘运单668’新品种。通信地址：044000运城市黄河大道118号山西省农业科学院棉花研究所，Tel：0359-*******，E-mail：dxcemail@https://www.wendangku.net/doc/202831552.html,。
通讯作者：王安乐，男，1955年出生，山西省运城市，研究员，本科，研究方向：玉米遗传育种，生理栽培及玉米的病虫害防治技术；育成‘晋单39’、‘晋单46’、‘晋单56’、‘晋单64’和‘运单668’新品种。通信地址：044000运城市黄河大道118号山西省农业科学院棉花研究所，Tel：0359-*******，E-mail：dxcemail@https://www.wendangku.net/doc/202831552.html,。
收稿日期：2010-11-10，修回日期：2010-12-21。
乙酰丁香酮在植物转基因研究中的作用
董喜才1，杜建中2，王安乐1，魏国英1，陈朝辉1
（1山西省农业科学院棉花研究所，山西运城044000；2山西省农业科学院生物技术研究中心，太原030031）
摘要：分析了从20世纪80年代到2007年间大量的有关乙酰丁香酮对植物遗传转化的影响的文献，涉及范围包括乙酰丁香酮对转化对象的影响方式、对转化率大小的影响以及与其它转化方法等的协同作用等等。此文介绍了受转化对象的基因型、转化方法、加入时机、加入量以及培养基pH值等对乙酰丁香酮的作用效果的影响。得出乙酰丁香酮可提高转化频率、如酸性条件下更有利于乙酰丁香酮发挥作用等结论。分析结果证明乙酰丁香酮在植物遗传转化中起着重要的作用。
关键词：乙酰丁香酮；植物；转化；转化率
中图分类号：Q81文献标志码：A论文编号：2010-3251
Role of Acetosyringone in Plants Transformation Researcher
Dong Xicai1,Du Jianzhong2,Wang Anle1,Wei Guoying1,Chen Zhaohui1
(1Cotton Research Insititute,Shanxi Agricultural Science Academy,Yuncheng Shanxi044000;
2Agricultural Biotechnology Research Center,Shanxi Agricultural Science Academy,Taiyuan030031) Abstract:The papers has been published between the1980’s and2007in relation to the effect of acetosyringone(AS)on plant genetic transformation,for example,the effect of AS on transformed plants and transformation frequency as well as the interaction between AS and transformation methods,were analysed. Here we discussed the effects on the action model of AS by genetypes of transformed objects,transformation methods,the time and dosage of AS which was added and the pH value of medium used for transformation. From that we can become a conclusion that AS could enhance transformation frequency,acidic cultures also favoured the function of AS,et al..Based on above,we can indicated that AS plays an important role during plants genetic transformation.
Key words:acetosyringone;plant;transformation;transformation frequency
董喜才等：乙酰丁香酮在植物转基因研究中的作用
制使用的溶剂则为二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide ，DMSO ），一般母液为100mmol/L 。
20世纪80年代植物基因工程技术诞生以来，针对不同植物或同一植物的不同组织创建了许多转化方法，并在此基础上不断进行改良，其目的都是在提高转化材料的转化频率及转基因在转基因材料中的稳定遗传和表达。不过，直到目前为止，关于如何能尽可能地提高转化频率仍然是有待深入研究的课题。AS 是在这个研究领域大家公认的可提高转化率的试剂。关于AS 可促进农杆菌对植物基因的转化已经有过很多报道[1]
。1984年，Shaw 等[2]
试验表明，农杆菌对酚类化合物具有趋化性；1985年，Stachel 等[1]
观察到叶子的受伤部分与非受伤部分对比有明显的诱导作用。1988年Owens 等[3]
混合农杆菌菌株与酚类化合物转化大豆细
胞，发现酚类化合物的加入能够提高大豆细胞的转化率。中国学者许耀等[4]在国内首次证明受AS 等创伤诱导分子激活的vir 区基因的活化和高效表达是农杆菌Ti 质粒向宿主细胞转移所必需的，并能提高其转化频率。随后赵东利等[5]
为了了解AS 和超声波处理在提高转化率方面是否存在协同作用，结果证明AS 的存在可使子叶和下胚轴的转化率在原来的基础上又分别提高了9.9%和7.6%，表明二者在提高发根农杆菌对苦豆子的转化率方面具有明显的协同作用。陈丙春等
[6]
在蓝猪耳遗传转化研究中发现，AS 浓度对转化芽诱导率有显著影响。苏绍坤等[7]
在双子叶植物黄瓜的转化研究中，发现不加入AS 时转化率比加入AS 时的转化率低约50%，证明加入AS 对双子叶植物的转化也有促进作用。刘明志[8]以悬浮细胞为遗传转化受体，研究了酚类化合物（AS 及其他酚类复合物）对农杆菌转化胡萝卜的影响，结果表明，农杆菌经酚类化合物预处理后，悬浮细胞转化率提高8.5~12倍，而Wurtele 等[9]所进行的类似研究，发现AS 对胡萝卜转化没有促进作用。
有关乙酰丁香酮对提高基因转化率虽然有不少报道，但众说不一，信息也不够系统。为了使读者能够对AS 在植物遗传转化研究中的作用有较系统和深入的了解，作者根据20多年来已发表的部分文献，对有关AS 在转基因研究中的作用予以讨论。
AS 是双子叶植物细胞壁合成的前体，通常单子叶植物在转化过程中不产生AS ，所以在转化过程中人为添加AS 是必需的，而且可以促进根癌农杆菌感染单子叶植物，而双子叶植物由于外植体受创伤后就会有酚类物质形成，因而不必外加酚类物质就可以产生转化，不过加入适量的AS 会提高转化率。
根瘤农杆菌是一种土壤菌，它可诱导许多双子叶植物产生冠瘿瘤。而冠瘿瘤形成又涉及农杆菌中Ti 质量粒的T-DNA 区向植物细胞的转移并最终整合到植物染色体DNA 上[10]，由T-DNA 编码的植物激素基因在植物细胞中表达，导致在没有外源植物激素补充情形下发生无序的细胞增生[11]。虽然关于冠瘿瘤形成整个过程已经积累了大量的信息，但有关这个过程的早期步骤，包括T-DNA 转移和整合，了解的还不够详细。
转座子诱变和核苷酸系列分析的结果表明，T-DNA 上除了植物激素基因外，Ti 质粒上还有两个DNA 区是冠瘿瘤形成所必需的：T-DNA 左、右边缘处的25bp 重复区[12]和毒性（vir ）区[13]。这些区域是转化细胞中T-DNA 转移和整合所必需的，而不仅仅是维持这些细胞中肿瘤的状态。25bp 重复区极有可能参与了Ti 质粒上T-DNA 的切除[14]并整合到植物DNA 上的过程[15]。毒性（vir ）区包含约35kb 碱基，其中至少有6个互补基因，virA 到E 和G [16]。Vir 区恰巧与肿瘤形成有关。除了Ti 质粒区外，农杆菌的染色体毒性区（chv ）也是肿瘤形成所必需的。这个区域在农杆菌中通常只是组成型表达，担负农杆菌向植物细胞的特异附着的使命[17]。
虽然T-DNA 转移的机理还不十分清楚，不过已经了解到有关这个过程中，在植物细胞影响下发生在农杆菌细胞中的3个分子事件。首先，Stachel 等[16]证明，当农杆菌与受伤的或活跃生长的植物细胞或组织一起培养时，vir 基因就会高水平表达，而且证明这个过程显然是受到植物细胞分泌的可扩散因子的诱导。公认的这种酚类化合物包括：AS 和catechol [18]。其次，在与植物原生质体或植物因子共培养时，农杆菌细胞内可以产生一个环状的T-DNA 分子[19]，业已证明，vir D 基因直接负责这个环化事件[20]。再次，在AS 或植物细胞存在时，共培养的农杆菌细胞中出现了一个单链T-DNA 分子[21]。
环状/单链T-DNA 分子的形成具有一些共同的特点，它们的合成需要表达virD 基因的植物因子的诱导[22]。进一步研究证明这两种分子的形成是在T 两侧25bp 边缘的重复序列发生重排的结果。环状T-DNA 是通过边缘区或双链切割区与再连接在一起的边缘区间发生重组而形成的[19]。最近，有报道认为这种T-DNA 边
图1乙酰丁香酮化学结构式
O O
HO
·
·293
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缘重复区内部的切割也是农杆菌细胞与原生质体共培养中的一个特殊诱导事件，virD基因产物介导到这个切割反应中[23]。单链T-DNA是在重复区内进行单链切割而形成的[24]。很有可能这两种形式的T-DNA或其中一种是T-DNA转移的中间产物。
AS等物质之所以能够提高外植体的转化频率，是因为vir区的活动产物可以将T-DNA区从T两侧25bp 边缘序列中切割下来，促进了DNA的转移[24]，所以，vir 区的活化被认为是发根农杆菌向植物基因组转移的一个关键步骤。农杆菌与植物共培养时，AS与质粒上virA蛋白结合，使virG蛋白磷酸化结构改变，激活毒性区其他基因，从而促进T-DNA转移。
关于AS激活vir区、促进T-DNA复制和转移的具体步骤可参考王关林[25]的《植物基因工程》根瘤农杆菌Ti质粒介导基因转化章节。
2AS用于转化研究的进展
1984年，Shaw等[2]试验表明，农杆菌对酚类化合物具有趋化性；1985年，Stachel等[1]观察到叶子的受伤部分与非受伤部分对比有明显的诱导作用。1988年Owens等[3]混合农杆菌菌株与酚类化合物转化大豆细胞，发现酚类化合物的加入能够提高大豆细胞的转化率。根据酚类化合物的作用原理，人们普遍认为，在单子叶植物，酚类物质（包括AS）是农杆菌介导的遗传转化所必需的，但对双子叶植物而言，由于外植体受创伤后就会有酚类物质形成，因而不必外加酚类物质就可以产生转化。目前，对AS在单子叶和双子叶植物上的作用已进行了大量的研究，进展很快。Catlin[26]、James[27]等在芹菜和草莓的转化研究中，发现共培养时加入AS可促进外植体的转化。中国学者赵东利等[5]为了了解AS和超声波处理在提高转化率方面是否存在协同作用，将苦豆子子叶和下胚轴外植体浸人到含终浓度为100μmol/L AS的发根农杆菌诱导液中之后，超声波处理25min，结果证明，AS的存在可使子叶和下胚轴的转化率在原来的基础上又分别提高了9.9%和7.6%，表明二者在提高发根农杆菌对苦豆子的转化率方面具有明显的协同作用。陈丙春等[6]在蓝猪耳遗传转化研究中发现，AS浓度对转化芽诱导率有显著影响。在根癌农杆菌菌液中加入AS（终浓度为100μmol/L），共培养培养基不加AS时，转化芽诱导率达到12.1%，而在根癌农杆菌菌液和共培养培养基中都不加AS，转化芽诱导率仅为5.76%，说明根癌农杆菌经AS的活化预处理，其毒性基因得到高效表达。若在共培养培养基中也加入AS20μmol/L，效果更好，转化芽诱导率可达27.2%。姜属单子叶植物，对农杆菌不敏感，李庆芝等[28]在姜的农杆菌介导的遗传转化研究中证明，AS在姜遗传转化中是必不可少的，不加AS，转化率几乎为0，AS浓度为50μmol/L时，少量外植体可分化出抗性芽，AS浓度达到100μmol/L时，可获得较高的转化率。苏绍坤等[7]在双子叶植物黄瓜的转化研究中，发现不加入AS，转化率不加入AS时的转化率低约50%，证明加入AS对双子叶植物的转化有促进作用。但Santarem等[29]发现，AS对通过农杆菌进行的黄瓜转化没有明显影响。
总之，AS在促进植物转化率方面，不同的植物或相同植物的不同植株或不同组织间，其促进作用不近相同。究其原因，除了AS浓度不同、植物基因型差异和农杆菌菌株致毒力强弱外，植物个体差异也会给研究结果产生很大影响，包括个体发育时期、发育状态及当时的环境条件。另外许多研究还证明，AS的作用大小与其使用环境的pH值关系极大。
2.1
AS对根生成、苗再生等的影响
人们对AS在植物转化上的作用的研究不仅仅局
限于转化率方面。而是将AS在各种转化体系中的相
关领域都进行了较系统的探索。1992年Sarmento等[30]
报道AS具有促进发根生成的作用。蓝海燕等[31]在油
菜转化研究中发现当农杆菌被收集并重悬后，在菌液
中加入200μmol/L的AS，对外植体的分化有一定的效
果；李雅丽等[32]用农杆菌Ri诱导蒙古黄芪，培养基中
添加AS可以使蒙古黄芪下胚轴诱导发根率由15.7%
提高到28.6%；高秀清等[33]用发根农杆菌15834与茶树
外值体共培养后,分别转入含有AS（300mg/L）和不含
AS的培养基中培养，统计发根的叶片数和毛状根总数
的结果证明乙酰丁香酮对茶树叶片毛状根的产生具有
明显的促进作用；张东向等[34]在研究AS对黄芩毛状根
诱导的影响时，在菌液中或培养基中添加AS，发现毛
状根诱导率得到提高；此外高月等[35]在阔叶猕猴桃遗
传转化的研究中看到共培养时培养基中添加AS，外植
体的死亡率明显降低。胡忠等[36]用A4菌株感染枸杞
不同外植体，添加AS可以使枸杞无菌苗叶片切段上
发状根形成的频率，由22.7%提高到48.9%。而用添加
AS活化的菌液感染同一苗龄的茎切段，对其发状根形
成频率影响也较显著，由4.7%上升到13.6%，同时他还
发现发状根出现的时间要迟些。
以上研究证明，AS对植物外植体培养时根和苗的再
生具有促进作用，其作用不仅仅局限于提高转化率方面。
2.2AS对植物转化率的影响
如何提高植物遗传转化的效率，是关系到能否成
功转化的关键因素。对培养基中各种激素的配伍，·
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董喜才等：乙酰丁香酮在植物转基因研究中的作用
AgNO3、脯氨酸、酚类化合物的加入与否、加入量、及加入时机等的研究，都是旨在提高转化效率。本文仅乙酰丁香酮在植物转化中作用予以叙述。
Vigaychandra等[37]报道水稻组织可诱导vir基因的表达，加入AS后，可是这种诱导能力大大增强。不过，Hiei等[38]在经AS预处理，成功获得转化水稻植株后认为添加AS是诱导农杆菌成功转化水稻的关键。其后他应用同样的方法在玉米[39]和小麦[40]上的转化也取得了成功。Michielse等[41]研究发现AS浓度越高对转化越有利，但是浓度过高会致使T-DNA以多拷贝的形式整合进真菌的基因组中，从而给实验分析造成一定的困难。在杨树转化研究方面，石超等[42]发现在共培培养基中未加入AS时，转化率为6.3%，而加入AS 时的转化率为10.1%，转化率明显提高；诸葛强等[43]证明，实验所用菌株是章鱼碱型根癌农杆菌LBA4404，属于宿主范围较小、毒力中等的菌株，对杨属植物敏感性不强[44]，但共培养培养基中添加AS，转化频率比对照提高了近4倍，而侵染菌液中添加AS，转化频率仅稍高于对照，足显AS加入时机的重要性。同样在大白菜转化研究方面，杨广东等[45]发现，在共培养基中附加200μmol/L AS，对转化频率有一定的促进作用，但差异并不明显，相反在侵染前附加200μmol/L AS时，转化频率反而降低；与此相反的是朱常香等[46]证实AS不能提高大白菜的转化频率，反而会降低转化频率，即在菌液和共培养基中添加4mg/L或10mg/L的AS，抗芜菁花叶病毒转基因大白菜的抗性芽的转化频率大幅度地降低，仅为不加AS的1/5~1/6。Ezura等[47]发现AS的使用能显著提高辣椒的转化率，Kim等[48]使用AS将辣椒的遗传转化效率提高到95%以上。Nishbayashi等[49]研究发现在共培养中添加AS可以明显提高黄瓜下胚轴外植体遗传转化频率。Chalabarty[50]、Zhang[51]等在芸苔属植物上的研究认为，AS能够有效提高转化率。李梅兰等[52]在诱导培养基和共培养基中不加AS，外植体GUS染色百分率为60%，而且染色点数较少，平均每个外植体1~2个点；而附加不同浓度的AS，外植体GUS 染色百分率为90%~100%，而且染色的点数较对照明显增加。说明在蓝猪耳（Torenia fourn ieri L inden）的转化过程中AS促进转化的作用是不可缺少的。邸宏等[53]玉米转化研究时发现，在感染液中不加入AS，幼胚中检测不到GUS瞬时表达活性；在感染液中加入AS能在一定程度上提高幼胚的GUS瞬时表达频率。
不同植物、同一植物的不同基因型、不同外植体、不同培养基成分等对AS反应的敏感程度不同[54]，表现结果为AS对转化效率的提高程度不同。这也是为什么植物的转化研究如此之难，植物基因工程技术的研究任重而道远。
2.3不同浓度AS溶液对转化的影响
许多学者发现邻苯二酚、没食子酸等40多种酚类物质对pRi质粒vir区的vir G基因都有活化作用vir A 基因和vir G基因的活化是提高农杆菌转化频率的至关重要的因素。这也正是遗传转化过程中AS被广泛使用的原因。不同的物种在遗传转化的过程中，最适宜的AS浓度也大不相同。大剂量的AS浓度会对农杆菌产生毒性作用，不仅不利于提升转化频率，反而会对农杆菌产生毒性作用[55]。
杨至德[56]在对发根农杆菌诱导牡丹生根的研究中发现加入35μmol/L的AS可显著提高其转化率。王越华[57]在对川黄柏遗传转化研究中发现在菌液中加入60μmol/L的AS其转化率最高。周伟等[58]在对丹参遗传转化研究中发现400μmol/L的AS最有利于提高转化率。郝彦玲等[59]在向日葵转化中发现，生理状态基本一致的茎尖，经相同的农杆菌菌液处理后分别置于添加0、50、100、150、200μmol/L AS的GBA共培养培养基上，用相同的方法筛选，结果为当培养基中AS的含量为100μmol/L时，茎尖外植体在抗性培养基上培养7天，gus基因的整合率达到32.8%，但是当浓度过低或过高时，则转化率明显下降。因此，向日葵遗传转化共培养基中AS的最适浓度为100μmol/L。王晓春等[60]用农杆菌侵染基因型‘东农L13’的体细胞胚块，3个月以后，按产生抗性体细胞胚块占接种块数的百分率表示转化频率，方差异分析结果表明AS和农杆菌浓度对转化率有明显影响，差异达到显著水平；多重比较结果表明，农杆菌浓度以OD600=0.5~0.7为宜。项艳等[61]认为玉米转化时在感染液和共培培养基中都加入100μmol/L的AS提高转化率的效果更加明显。李茂福等[62]将萌发5~7天的垦农18的子叶节用相同OD600而含不同浓度的AS菌液（AS的浓度分别为0、50、100、200、400μmol/L）浸染30min后，分别放入含有AS的固体培养基上（AS的浓度分别为0、50、100、200、400μmol/L）暗培养3天，然后放在含有除草剂的筛选培养基上诱导不定芽再生。结果显示，适宜浓度的AS 对转化确实有影响，并发现这个结论与Godwin等[63]的研究结果相近。刘小琳等[64]研究后发现，在AS浓度相同和外植体来源不同的情况下，当再在菌液中加入0mg/L、10mg/L或20mg/L的AS时，抗性愈伤出愈率没有明显的变化，约3.0%左右；但当AS浓度提高到20mg/L 以上时，抗性愈伤率明显降低，说明外植体的转化受到了抑制。所以，他们认为在紫花苜蓿的遗传转化过程
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中国农学通报https://www.wendangku.net/doc/202831552.html,
中，农杆菌菌液可以不添加AS。王丽等[65]用农杆菌侵染薯片，2天共培养，在添加不同浓度AS的抗性分化培养基上进行芽的分化，结果发现，AS的添加与否对薯片抗性芽产生的数量没有影响，表现为各个处理间差异不显著。薛仁镐等[66]在研究紫花苜蓿转化体系时，在共培养基中分别添加0、50、100、200、400μmol/L的AS，共培养3天，GUS染色分析，统计子叶节部位的蓝色斑点数依次为：1.8、3.9、6.4、7.6、4.9个。证明在共培养基中添加AS可以明显提高农杆菌介导大豆转化效率。
植物遗传转化中AS浓度不同，会是转化率变化很大。故在特定植物的转化过程中，不能一味追求别人加多少AS，而应自己筛选适宜的AS加入浓度和时机，即便是研究的对象相同也应如此。
2.4AS与其他处理方法的协同性
植物的转化是一个包含多步骤、多变化的复杂过程。在提高转化效率方面，仅靠机械单一的研究方法是行不通的。高效遗传转化体系的建立，包括其中的多方法结合、各种处理的协同性分析也是研究的重点。外植体在含有外源激素的培养基上进行预培养，可以诱导DNA合成和细胞分裂高峰期的出现，从而更易于整合外源DNA[67]。Huang等[68]研究指出,菌液浓度影响AS加入时的转化效果。当菌液浓度较高（1:25）稀释时，加入AS并不能促进转化频率的提高，甚至不加AS时的转化频率比加入AS转化频率还高。但当菌液1:50稀释时，加入25μmol/L和50μmol/L AS时转化频率分别为51%和30%，显著高于不加AS或加入75μmol/L和100μmol/L的处理，说明所用菌液浓度与加入AS浓度间具有某种协同性。
陈志等[69]研究认为，在预培养阶段，AS的使用有利于转化效率的提高，最佳条件是AS浓度100mg/L，预培养4天。而在共培养阶段，AS的使用和延长共培养时间并不能显著提高杂交鹅掌楸的遗传转化效率。郑树松等[70]也认为在预培养和共培养时添加AS可以显著提高棉花下胚轴的抗性愈伤组织的诱导率，而在摇菌时添加AS会降低抗性愈伤组织的诱导率。进而龙朝钦等[71]研究证明，预培养时加入AS与否对转化效率差异并无统计学意义（P>0105）。共培养时加入AS，随着共培养时间的延长，转化效率相应增加，差异具有统计学意义（F=284.563，P=0.000，rs=1.00，P= 0.05）。沈革志等[72]比较了AS不同处理的5个组和未处理组中产生抗性愈伤组织的频率、获得抗性转基因植株和反义蜡质基因阳性植株的频率。实验结果显示：产生抗性愈伤组织的频率，未处理组为49.2%，5个不同处理组的转化频率均略高于未处理组。5个不同处理组中，转化频率最高的为70.2%，是直接浸泡愈伤组织方式；最低的为52.8%，是AS添加在AAM培养基的方式。未处理组的转基因绿苗分化频率为5.2%，各处理组的分化频率与其相差不多。其中，频率最高是愈伤组织直接浸泡于AS的方式，为6.5%；最低是AS 添加在共培养培养基中的方式，为3.3%；未处理组3株绿苗中，有2株为反义蜡质基因PCR检测为阳性；而处理组25株绿苗中，有6株为阳性。赵东利等[5]为了了解AS和超声波处理在提高转化率方面是否存在协同作用，将子叶和下胚轴外植体浸人到含一定量终浓度为100μmol/L AS的发根农杆菌诱导液中之后，超声波处理25min。结果显示AS的存在可使子叶和下胚轴的转化率在原来的基础上又分别提高了9.9%和7.6%，表明二者在提高发根农杆菌对苦豆子的转化率方面具有明显的协同作用。此外，徐勤青等[73]转化花生时发现，在活化农杆菌时加入AS浓度为50μmol/L和100μmol/L时对提高花生基因转化效率的影响不明显，加入AS浓度为150μmol/L和200μmol/L时，转化效率又明显下降。在共培养的培养基中加入AS对转化效率无明显提高作用。孔政等[74]还利用直观分析法，即利用每个实验因素在各个水平上实验值的平均数，根据极差的大小来判断哪些因素对实验过程有显著影响。结果显示各因素对转化植株分化率的影响顺序为：AS浓度>菌液OD值>侵染时间>共培养时间。这表明，AS浓度对转化植株分化率的影响最为显著，其他因素的影响相对较小。
2.5pH值对AS作用效率的影响
AS归根结底是一种化合物，其分子结构决定了它的物理和化学性质，在不同pH值溶液中，理化性质会有所不同。因此，AS在促进植物转化效率方面也随着其作用的溶液的pH值有所变化。
Godwin等[63]用3种野生型的根癌农杆菌侵染5种植物，研究共培养培养基（pH5.8）中AS和pH对转化的作用，发现3种类型的菌株对烟草叶盘的侵染能力没有显著区别，AS也无促进作用；章鱼碱型农杆菌Ach5在无AS条件下对其他4种植物也都无致瘤能力。而pH5.2时添加AS200μmol/L可使Ach5扩展宿主范围至金鱼草（Antirrhinum majus L.）。Horford等[75]研究影响拟南芥转化的因素，发现在共培养培养基加入200μmol/L AS，产生的瘤组织数量提高一倍。同时还发现，酚类物质AS和羟基乙酰丁香酮的诱导效果与pH值有关。当加入AS时，pH以5.2时转化效果较好。这可能与pH值较低时容易诱导vir基因表达有关；他还在研究转化金鱼草的影响因素时发现，在共培
··
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董喜才等：乙酰丁香酮在植物转基因研究中的作用
养培养基中加入AS时，pH以5.2时外植体转化效果较好。而在培养基中加入羟基乙酰丁香酮时，pH在5.8时转化效果较好。Alt-Moerbe[76]、Shaw等[2]外植体与根农杆菌共培养是获得转化植株的主要途径，培养基的pH以及共培养基中附加酚类物质、糖类及胭脂碱等物质，可以提高转化频率。郝贵霞等[77]在研究毛白杨的遗传转化时发现，在共培养培养基中加入200μmol/L AS，pH仍为5.8时，对转化效果的影响不显著。将pH 调至4.8~5.0，不加入AS时，对转化效果的影响也不显著。只有将pH调至4.8~5.0，同时加入200μmol/L乙酰丁香酮时，才使转化频率大大提高。凌键等[78]研究结果表明，在培养基中加入AS，而pH仍为5.8时，对转化的效果影响不显著。而将pH调至5.0，加入25~ 75mg/L的AS可促进转化。特别是当AS的浓度为25mg/L时，Kanr芽获得率由对照的7.1%提高到35.7%，转化率大大提高。说明AS的诱导效果与pH 值有关，较低的pH值容易诱导vir基因表达。这与前人的报道相一致[68]。
综上所述，影响AS作用效果的因素很多，受体基因型差异、AS加入时机、AS浓度、所采用转化方法、培养基的酸碱度对AS作用效果的影响已有定论，是否还有其他影响因子，甚至是关键因子影响AS作用效果，仍需进一步探索。复杂多变的转化过程需要人们不断去探索和完善。
3乙酰丁香酮应用展望
有些实验证明，有比AS更有效的诱导物质。Bolton等[18]研究认为羟基乙酰丁香酮（AS前体）比乙酰丁香酮诱导vir基因能力更强。吴迪等[79]比较酚类物质对葡萄遗传转化效率的影响，发现阿魏酸能显著提高农杆菌介导葡萄遗传转化的转化效率，效果优于AS，且价格低廉，可以作为替代AS的首选添加物。
不过，直到目前，真正在植物转化研究方面能够广泛替代AS的添加物还不多，即便个别添加物在个别转化事件中使用效果比AS好，而且AS在某些植物上对转化效率的提高还有限或无作用，但仍然缺乏有效的证据这些物质可全面应用于植物基因工程研究。
在最近几年或更长远一些，AS的使用范围和其作用的研究深度仍无东西可以替代。特别是AS的作用原理和分子机制仍将是今后一端时间内研究的重点。
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