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大量制备质粒DNA方法

SDS碱裂解法制备质粒DNA:大量制备

用碱和SDS处理可以从大规模(500ml)的细菌培养物中分离质粒DNA,所获得的质粒则可通过柱层析或CsCl-溴化乙锭梯度离心进一步纯化:

材料:

缓冲液和溶液:

碱裂解液I:

50mmol/L 葡萄糖

25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)

10mmol/L EDTA (pH8.0)

(溶液I一次可配制100ml,在15psi[1.05kg/cm2]压力下蒸汽灭菌15min,保存于4摄氏度。)

碱裂解液II:

0.2 N NaOH (从10N贮存液中现用稀释)

1% (m/V)SDS

(溶液II要现用现配,室温下使用)

碱裂解液III:

5mol/L 乙酸钾60ml

冰乙酸11.5ml

双蒸水(去离子水)28.5ml

所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L,乙酸根的浓度为5mol/L。保存于4摄氏度,用时置于冰浴中。)

另需:

乙醇

异丙醇

STE

TE(pH8.0)

溶菌酶(10mg/ml)

现在开始实验:

细胞的制备:

1. 挑取转化细菌的单菌落,接种到30ml含适当抗生素的培养基中。

注:a. 试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大4倍。

b. 试管不宜盖的太紧

c. 应在剧烈振摇下温育

2. 在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚期(OD600约为0.6)。

3. 在含500mlLB、YT或Terrific培养液(预热到37摄氏度)及适当抗生素的烧瓶(2L)中接种25ml对数生长期晚期的菌液,将此培养液在37摄氏度剧烈振摇(300r/min)培养约2.5小

时。

注:最后菌液的OD600值应为0.4。由于不同菌株的生长速度不同,可稍微延长或缩短培养时间,使最终的OD值为0.4。

4. 若质粒为低或中拷贝数的松弛型质粒,在培养液中添加2.5ml浓度为34mg/ml的氯霉素,使其终浓度为170微克/ml。

注:对于高拷贝数的质粒不需要添加氯霉素。

5. 于37摄氏度,以300r/min剧烈振荡再培养12~16h。

6. 取部分菌液(1~2ml)到离心管中,4摄氏度储存。于4摄氏度,以2700g离心15min以收集余下的近500ml培养物。弃上清,倒置离心管使残余的上清流出。

7. 用200ml冰预冷的STE重悬细菌沉淀,按步骤6所述重新收集细菌并贮存于零下20摄氏度。

8. 用步骤6中贮存的1~2ml 菌液提取质粒,采用酶切和琼脂糖电泳分析此小量制备质粒,以确定大量培养菌液中正确的质粒已得到扩增。

注:设置这种对照可能看上去有点过于谨慎,然而它可以避免发生某些可能难以挽回、浪费大量时间的错误。

9、将步骤7中冻存的细菌在室温下放置5~10min使其解冻后,用18ml(10ml)碱裂解液I 重悬。

注:只有步骤4中使用了氯霉素的菌液才应参照括号中的体积数。

10、加2ml (1ml)新配置的10mg/ml溶菌酶。

11、加40ml(20ml)新配置的碱裂解液II。盖上离心管盖,轻轻颠倒数次,彻底混匀,室温下放置5~10min。

注:延长超螺旋DNA暴露于碱的时间会使其不可逆变性,所产生的环状卷曲DNA不能被限制酶内切,而且它在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率为正常超螺旋DNA的两倍,难以被溴化乙锭染色。从细菌中用碱裂解法提取质粒时可能会看到微量的这种DNA。

12. 加20ml (15ml)冰预冷的碱裂解液III。盖上离心管盖,轻轻地但完全地振荡混匀几次(此时应不再有分离的两个液相)。将离心管在冰上放置10min。

注:在放置过程中会出现由染色体DNA、高分子量RNA、钾离子/SDS/蛋白质/细胞壁复合物一起形成的乳白色沉淀。在碱裂解液III中最好使用醋酸钾而非醋酸钠,因为十二烷基硫酸钾盐远比钠盐难溶。

13. 在4摄氏度20,000g离心碱裂解液30min,无须制动,让转头自然停止。将上清轻轻移入量筒中,弃去离心管中的沉淀。

注:不能形成紧密沉淀的原因常常是加入裂解液II时混匀不充分。如果细菌碎片不能形成紧密的沉淀,以20,000g再次离心15min,然后将上清尽量移入干净的离心管中。转移的时候使用四层纱布过滤上清可以除去黏稠的基因组DNA 和蛋白质沉淀残余。

质粒DNA的回收:

14. 量取上清的体积,将其连同0.6倍体积的异丙醇一起移入一只洁净离心管中并将其充分混匀,室温下放置10min。

15. 在室温下以12,000g离心15min回收核酸沉淀。

注:若在4摄氏度下离心会使盐也沉淀下来。

16. 小心弃去上清,将离心管敞开盖,倒置于纸巾上以除去残余的上清。在室温下用70%的宜春涮洗管底及管壁,倒掉乙醇,并用与真空管道相连的巴斯德吸管除去附于管壁的液滴。将离心管开口倒置于纸巾上使剩余的乙醇挥发掉。

注:如果用于干燥器或真空干燥的方法干燥DNA沉淀,在某些情况下它会变得难以溶解并且可

能变性。将沉淀在室温下干燥10~15min 对于乙醇挥发来说是足够了,而且不会引起DNA脱水。

17. 用3ml TE(pH8.0)溶解湿润的核酸沉淀。

18. 粗制质粒DNA的纯化可用柱层析法,聚乙二醇沉淀法或CsCl-溴化乙锭梯度离心法。

19. 用限制酶酶切及凝胶电泳分析确证质粒的结构。