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细胞内细胞因子的检测

细胞内细胞因子的检测

细胞因子是可溶性蛋白,在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。研究显示,细胞因子可以具有多重功能,作用于多个细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成,如Th1(IL-2,IFN-γ)与Th2(IL-4,IL-5,IL-10),但这些研究很难推广,因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还不清楚。

活化的T细胞可分泌多种细胞因子至细胞外,而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原,所以应阻断细胞因子分泌至细胞外,方法为破坏高尔基体,因细胞因子(即各种蛋白)在合成后需经高尔基体的加工和转运,才能到达细胞膜,然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径,干扰其分泌。近来,Jung与Picker采用了Brefeldin(BFA)与monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集,蓄积,增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。

胞内细胞因子染色与传统的检测可溶性蛋白的方法如ELISA相比,具有显著优越性。该法从单个细胞水平检测内多个细胞因子的同时,还可标记各种细胞表面分化抗原以及活化分子、趋化因子受体和黏附分子等,从而区分表达特定细胞因子的细胞亚群及其表型特征。使用特定刺激剂研究细胞因子应答是细胞因子研究中的重大进展。早在1986年,Mosmann等应用Th细胞克隆技术和细胞因子产生的不同,发现小鼠CD4细胞是一个不均一的亚群,可分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。后来在人类的CD4细胞群中也发现了Th1和Th2细胞亚群。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等,介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答,参与细胞免疫及迟发型超敏反应,在抗胞内病原菌感染中发挥重要作用;Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10,其主要功能是刺激B细胞增殖并产生抗体,与体液免疫有关。应用该方法,在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化,且这些分化在特定细胞因子增强时可被

逆转。且这些研究清楚地证明,只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子,静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。

本章中,我们以人外周血Th1/Th2细胞因子(IFN-γ/IL-2)的检测为例,介绍细胞内细胞因子染色的一般方法。

1试剂与仪器

1.1 主要试剂:NaN3购自广州化学试剂厂;吐温-20为Invitrogen公司产品;Saponin购自Sigma公司;4% Paraformaldehyde自行配制;BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Kit(包括Fixation and Permeabilization Solution,Cat.No. 554722;Perm/wash Buffer(10×),Cat.No. 554723;BD Golgiplug protein transport inhibit containing brefeldin A);FACS溶血素(BDIS Catalog No.349202)。

1.2 主要耗材及仪器:37℃、5%CO2孵箱(Biotech);FACS流式细胞仪(BD FACS ARIA2)。

1.3 溶液配制:

1.3.1 磷酸盐缓冲液(PBS)配制:准确称量NaCl 8.0g ,Na2HPO4 1.16g,KH2PO4 0.2g,KCl 0.2g,加入到超纯水900mL中,充分混匀,定容至1000mL,调PH 值至7.2-7.4。高压灭菌20分钟,冷却后保存。

1.3.2 流式细胞术缓冲液配制

缓冲液Ⅰ:PBS(PH:7.2-7.4)1000 mL。分装为500 mL/瓶,4℃保存。

缓冲液Ⅱ:PBS(PH:7.2-7.4),加入1% BSA,0.05% NaN3,完全溶解后,分装500 mL/瓶,4℃保存。

缓冲液Ⅲ:PBS(PH:7.2-7.4),加入1% BSA,0.05% NaN3,1% Saponin,完全溶解后,分装500 mL/瓶,4℃保存。

1.3.3 固定液(4%多聚甲醛):准确称量多聚甲醛40 g,加入PBS 1000 mL,加热至完全溶解,冷却后调PH为7.2-7.4,分装50 mL/管离心管内-20℃保存。

1.3.4 试剂的选择、制备、储存:

1)Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)(Sigma Catalog No.P-8139)

a.于DMSO中调节浓度0.1mg/mL

b.分装,-20℃储存,勿反复冻融

c.PMA终浓度20ng/mL细胞悬液。

2)Ionomycin (sigma Catalog No.I-0634)

a. 于乙醇中配制成浓度1mg/mL

b. -20℃储存

c. Ionomycin终浓度1μg/mL细胞悬液

3)布雷菲德菌素A,Brefeldin-A(BFA) (sigma Catalog No.B-7651) 或BD Golgiplug TM(containing brefeldin A, Cat.No.: 555029)

a. 于DMSO中调节浓度10mg/mL

b. 分装,-20℃储存,勿反复冻融

c. 激活最后4-5小时BFA终浓度10mg/mL

d. 检测TNF-α时必须使用BFA来进行阻断

e. BFA抑制CD69在细胞表面的表达,却不会影响它在胞内的表达

f. BFA过度孵育会导致细胞活力下降(不超过12小时)

2 方法

操作流程

制备细胞

刺激细胞,37℃培养

表面分子的染色

固定、破膜*

胞内因子染色

重悬细胞,上机检测分析

注释:*该步骤有两种方法可供选择:1、加入4%多聚甲醛室温固定8分钟后,PBS洗涤细胞两次,加入100μL/管含0.1% saponin的PBS(BufferⅢ)4℃破膜

1小时或过夜,即固定、破膜分两步进行;2、使用商品化试剂如BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Kit,固定、破膜一步完成,即直接加入100μL/管固定破膜液(Fixation and Permeabilization Solution),置于4℃、20min,用Perm/wash Buffer(1×)洗涤两次即可。

2.1 细胞制备

2.1.1全血培养使用肝素钠抗凝真空采血管(BD V ACUTAINER Catalog No.367673),不易采用肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂,血样在8小时内分析,超过8小时会导致活性的损失,一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测,应将真空采血管水平室温放置。全血与等体积RPMI 1640混合,备用。

2.1.2 新鲜分离外周血单个核细胞(PBMCs)用Ficoll液分离PBMCs,调整细胞浓度2×106细胞/mL,重悬于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI-1640。2.1.3 冻存PBMCs 将细胞置于37℃水浴中进行融解,直至剩下豌豆大小的冰片残留;将细胞转移至Falcon管中,将预热的培养液缓慢加入细胞中,室温(24℃)、1800rpm离心8min,弃去上清,并将细胞悬于培养液中,重复离心一次;

培养液重悬细胞,台盼蓝计数液计数,调整细胞浓度,以2×106/mL的浓度放于T-25培养瓶中,37℃、5%CO2孵箱中过夜;第二天首先进行计数,观察细胞存活情况。

2.2 细胞刺激

按实验要求加入刺激剂PMA(20ng/mL)和Ionomycin(1μg/mL),同时设阴性对照,混匀,37℃、5%CO2孵箱中培养1小时后,加入阻断剂BFA,继续培养3-5小时(如果使用多肽进行刺激,由于多肽不需要在内涵体进行加工,因此阻断剂可以在刺激同时加入)。培养结束后,细胞可以在1-9℃冰箱中保存18小时。

2.3 新鲜分离或冻存PBMC的染色

1)培养结束后,将Falcon管取出;

2)4℃、1800rpm离心8min;(要点:每次离心后,要保证有肉眼可见细胞沉积。

如无法看到,再次离心,固定细胞后,细胞团块看起来比较松散,但还是可见)

3)吸弃上清,加入BufferⅡ并混匀,4℃、1800rpm离心8min,重复两次;BufferⅡ

重悬细胞,按实验所需将细胞分至流式管,100μL/管;

4)加入相应表面染色抗体,混匀;

5)4℃、避光孵育20min;

6)加入BufferⅠ并混匀,4℃、1800rpm离心8min,重复两次;

7)吸弃上清,每管中加入500μL 4%多聚甲醛,混匀;

8)室温避光孵育8分钟;

9)加入BufferⅠ并混匀,4℃、2100rpm离心8min,重复两次;

10)吸弃上清,每管中加入100μL Buffer Ⅲ,4℃、至少1小时至过夜;

11)每管中加入胞内染色抗体,混匀;

12)4℃、避光孵育20分钟;

13)每管中加入1mL Buffer Ⅲ、4℃、2100rpm离心8min,重复两次;

14)吸弃上清,将细胞重悬于250μL1%多聚甲醛,将流式管用锡箔避光保存于

4℃直至上机;

15)48小时内检测样本管;

16)使用FlowJo分析样本数据;

注意:步骤7)-10)可以代替为:加入100 μL Fixation and Permeabilization Solution,4℃、避光20min,加入1mL Perm/wash Buffer(1×)洗涤两次

2.4 全血培养细胞的染色

1)加表面染色试剂(CD3 FITC,CD8 PE-Cy7各10ul)于200μL激活的全血中,

混匀,4℃、暗处孵育20分钟

2)加2mL 1×FACS 溶血素,室温、暗处孵育10分钟。

3)离心1800rpm,8min,弃上清,

4)加100μL 破膜剂(Fixation and Permeabilization Solution)4℃、暗处孵育20

分钟。

5)加1mL Perm/wash Buffer(1×),离心2100rpm,8min,弃上清,重复洗涤一

次。

6)加入荧光标记的细胞因子抗体(APC-IL4, PE-IL-17A, FTIC-IFN-r),混匀,

4℃、暗处孵育20min。

7)加1mL Perm/wash Buffer(1×),离心2100rpm,8min,弃上清,加入250μL

1% PFA。

(注意:样本上机分析前可以在4℃避光放置24小时)

2.5 染色条件

1)CD3-FITC,IL-17A-PE,CD8-PE-Cy7,IL-4 APC

2)IFN-r FITC,IL-17A-PE,CD8-PE-Cy7,IL-4 APC

3)CD34

杨昊臻配色方案

CD8A PE-CY7

CD4 PERCP-CY5.5

IL-17A PE

CD3E FITC

IFN-r FITC ?

IL-4 APC

CD34 PE