细胞内细胞因子的检测
细胞内细胞因子的检测
细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。研究显示，细胞因子可以具有多重功能，作用于多个细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如Th1(IL-2，IFN-γ)与Th2(IL-4，IL-5，IL-10)，但这些研究很难推广，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还不清楚。
活化的T细胞可分泌多种细胞因子至细胞外，而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原，所以应阻断细胞因子分泌至细胞外，方法为破坏高尔基体，因细胞因子（即各种蛋白）在合成后需经高尔基体的加工和转运，才能到达细胞膜，然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径，干扰其分泌。近来，Jung与Picker采用了Brefeldin(BFA)与monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
胞内细胞因子染色与传统的检测可溶性蛋白的方法如ELISA相比，具有显著优越性。该法从单个细胞水平检测内多个细胞因子的同时，还可标记各种细胞表面分化抗原以及活化分子、趋化因子受体和黏附分子等，从而区分表达特定细胞因子的细胞亚群及其表型特征。使用特定刺激剂研究细胞因子应答是细胞因子研究中的重大进展。早在1986年，Mosmann等应用Th细胞克隆技术和细胞因子产生的不同，发现小鼠CD4细胞是一个不均一的亚群，可分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。后来在人类的CD4细胞群中也发现了Th1和Th2细胞亚群。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应，在抗胞内病原菌感染中发挥重要作用；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，其主要功能是刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫有关。应用该方法，在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被
逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。
本章中，我们以人外周血Th1/Th2细胞因子（IFN-γ/IL-2）的检测为例，介绍细胞内细胞因子染色的一般方法。
1试剂与仪器
1.1 主要试剂：NaN3购自广州化学试剂厂；吐温-20为Invitrogen公司产品；Saponin购自Sigma公司；4% Paraformaldehyde自行配制；BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Kit（包括Fixation and Permeabilization Solution，Cat.No. 554722；Perm/wash Buffer（10×），Cat.No. 554723；BD Golgiplug protein transport inhibit containing brefeldin A）；FACS溶血素（BDIS Catalog No.349202）。
1.2 主要耗材及仪器：37℃、5%CO2孵箱（Biotech）；FACS流式细胞仪（BD FACS ARIA2）。
1.3 溶液配制：
1.3.1 磷酸盐缓冲液(PBS)配制：准确称量NaCl 8.0g ，Na2HPO4 1.16g，KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，加入到超纯水900mL中，充分混匀，定容至1000mL，调PH 值至7.2-7.4。高压灭菌20分钟，冷却后保存。
1.3.2 流式细胞术缓冲液配制
缓冲液Ⅰ：PBS（PH：7.2-7.4）1000 mL。分装为500 mL/瓶，4℃保存。
缓冲液Ⅱ：PBS（PH：7.2-7.4），加入1% BSA，0.05% NaN3，完全溶解后，分装500 mL/瓶，4℃保存。
缓冲液Ⅲ：PBS（PH：7.2-7.4），加入1% BSA，0.05% NaN3，1% Saponin，完全溶解后，分装500 mL/瓶，4℃保存。
1.3.3 固定液（4%多聚甲醛）：准确称量多聚甲醛40 g，加入PBS 1000 mL，加热至完全溶解，冷却后调PH为7.2-7.4，分装50 mL/管离心管内-20℃保存。
1.3.4 试剂的选择、制备、储存：
1)Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)(Sigma Catalog No.P-8139)
a.于DMSO中调节浓度0.1mg/mL
b.分装，－20℃储存，勿反复冻融
c.PMA终浓度20ng/mL细胞悬液。
2)Ionomycin (sigma Catalog No.I-0634)
a. 于乙醇中配制成浓度1mg/mL
b. －20℃储存
c. Ionomycin终浓度1μg/mL细胞悬液
3）布雷菲德菌素A，Brefeldin-A(BFA) (sigma Catalog No.B-7651) 或BD Golgiplug TM（containing brefeldin A, Cat.No.: 555029）
a. 于DMSO中调节浓度10mg/mL
b. 分装，-20℃储存，勿反复冻融
c. 激活最后4－5小时BFA终浓度10mg/mL
d. 检测TNF-α时必须使用BFA来进行阻断
e. BFA抑制CD69在细胞表面的表达，却不会影响它在胞内的表达
f. BFA过度孵育会导致细胞活力下降（不超过12小时）
2 方法
操作流程
制备细胞
刺激细胞，37℃培养
表面分子的染色
固定、破膜*
胞内因子染色
重悬细胞，上机检测分析
注释：*该步骤有两种方法可供选择：1、加入4%多聚甲醛室温固定8分钟后，PBS洗涤细胞两次，加入100μL/管含0.1% saponin的PBS（BufferⅢ）4℃破膜
1小时或过夜，即固定、破膜分两步进行；2、使用商品化试剂如BD Cytofix/Cytoperm Plus Fixation/Permeabilization Kit，固定、破膜一步完成，即直接加入100μL/管固定破膜液（Fixation and Permeabilization Solution），置于4℃、20min，用Perm/wash Buffer（1×）洗涤两次即可。
2.1 细胞制备
2.1.1全血培养使用肝素钠抗凝真空采血管(BD V ACUTAINER Catalog No.367673)，不易采用肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。全血与等体积RPMI 1640混合，备用。
2.1.2 新鲜分离外周血单个核细胞（PBMCs）用Ficoll液分离PBMCs，调整细胞浓度2×106细胞/mL，重悬于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI-1640。2.1.3 冻存PBMCs 将细胞置于37℃水浴中进行融解，直至剩下豌豆大小的冰片残留；将细胞转移至Falcon管中，将预热的培养液缓慢加入细胞中，室温（24℃）、1800rpm离心8min，弃去上清，并将细胞悬于培养液中，重复离心一次；
培养液重悬细胞，台盼蓝计数液计数，调整细胞浓度，以2×106/mL的浓度放于T-25培养瓶中，37℃、5%CO2孵箱中过夜；第二天首先进行计数，观察细胞存活情况。
2.2 细胞刺激
按实验要求加入刺激剂PMA（20ng/mL）和Ionomycin（1μg/mL），同时设阴性对照，混匀，37℃、5%CO2孵箱中培养1小时后，加入阻断剂BFA，继续培养3-5小时（如果使用多肽进行刺激，由于多肽不需要在内涵体进行加工，因此阻断剂可以在刺激同时加入）。培养结束后，细胞可以在1-9℃冰箱中保存18小时。
2.3 新鲜分离或冻存PBMC的染色
1)培养结束后，将Falcon管取出；
2)4℃、1800rpm离心8min；（要点：每次离心后，要保证有肉眼可见细胞沉积。
如无法看到，再次离心，固定细胞后，细胞团块看起来比较松散，但还是可见）
3)吸弃上清，加入BufferⅡ并混匀，4℃、1800rpm离心8min，重复两次；BufferⅡ
重悬细胞，按实验所需将细胞分至流式管，100μL/管；
4)加入相应表面染色抗体，混匀；
5)4℃、避光孵育20min；
6)加入BufferⅠ并混匀，4℃、1800rpm离心8min，重复两次；
7)吸弃上清，每管中加入500μL 4%多聚甲醛，混匀；
8)室温避光孵育8分钟；
9)加入BufferⅠ并混匀，4℃、2100rpm离心8min，重复两次；
10)吸弃上清，每管中加入100μL Buffer Ⅲ，4℃、至少1小时至过夜；
11)每管中加入胞内染色抗体，混匀；
12)4℃、避光孵育20分钟；
13)每管中加入1mL Buffer Ⅲ、4℃、2100rpm离心8min，重复两次；
14)吸弃上清，将细胞重悬于250μL1%多聚甲醛，将流式管用锡箔避光保存于
4℃直至上机；
15)48小时内检测样本管；
16)使用FlowJo分析样本数据；
注意：步骤7）-10）可以代替为：加入100 μL Fixation and Permeabilization Solution，4℃、避光20min，加入1mL Perm/wash Buffer（1×）洗涤两次
2.4 全血培养细胞的染色
1)加表面染色试剂（CD3 FITC,CD8 PE-Cy7各10ul）于200μL激活的全血中，
混匀，4℃、暗处孵育20分钟
2)加2mL 1×FACS 溶血素，室温、暗处孵育10分钟。
3)离心1800rpm，8min，弃上清，
4)加100μL 破膜剂（Fixation and Permeabilization Solution）4℃、暗处孵育20
分钟。
5)加1mL Perm/wash Buffer（1×），离心2100rpm，8min，弃上清，重复洗涤一
次。
6)加入荧光标记的细胞因子抗体（APC-IL4, PE-IL-17A, FTIC-IFN-r），混匀，
4℃、暗处孵育20min。
7)加1mL Perm/wash Buffer（1×），离心2100rpm，8min，弃上清，加入250μL
1% PFA。
（注意：样本上机分析前可以在4℃避光放置24小时）
2.5 染色条件
1)CD3-FITC,IL-17A-PE,CD8-PE-Cy7,IL-4 APC
2)IFN-r FITC,IL-17A-PE,CD8-PE-Cy7,IL-4 APC
3）CD34
杨昊臻配色方案
CD8A PE-CY7
CD4 PERCP-CY5.5
IL-17A PE
CD3E FITC
IFN-r FITC ?
IL-4 APC
CD34 PE
流式细胞仪试验方法
流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1．标本制备： 2．最小化非特异性结合： 二、凋亡 1．凋亡的检测方法：网站和其它 2．PI染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL法 三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA 四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板 五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞 六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病
第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或细胞与正常血清一起培育应选择优先加入第一抗体。在此情况下，即使在随后的步骤中用完所有的抗体分子，FC受体决定的背景影响已不再重要。 5．其它：已标记的抗体和其他一些内在的免疫球蛋白或加入实验系统中的其它物质的交叉反应也可能会有背景影响。为了降低背景，在多重标记过程中，所有的已标记的抗体应被吸附，避免其他种类蛋白的交叉反应。
围术期炎症细胞因子的监测
围术期炎症细胞因子的监测 围手术期是围绕手术的一个全过程，从病人决定接受手术治疗开始，到手术治疗直至 基本康复，包含手术前、手术中及手术后的一段时间，具体是指从确定手术治疗时起，直 到与这次手术有关的治疗基本结束为止，时间约在术前5- 7天至术后7 - 12天。 炎症反应一方面通过致炎因子直接损伤血管内皮，另一方面主要是通过一系列炎症介 质来实现；多数炎症介质通过与靶细胞结合发挥活性，炎症介质作用于细胞后可进一步引起 靶细胞释放次级炎症介质从而放大或抵消初级炎症介质的作用。不管机体遭受何种刺激， 宿主对炎症反应的总体特征非常相似，然而不同的损伤涉及不同类型的细胞，导致不同炎 症介质的产生和释放从而引起系统性和局部性损伤。通常术中的炎症反应与细胞因子的释放有关，细胞因子的作用又进一步加强了手术以及术中缺血再灌注损伤，如此恶性循环终将导致组织损伤而增加手术后临床相关并发症，影响患者的预后。 目前，手术方式以及麻醉方法、药物对恶性肿瘤术后免疫功能的影响逐渐受到重视。细 胞因子是机体免疫及炎症反应中细胞之间交流的信息分子，它们通过效应细胞表面相应的 受体对细胞生长、成熟和修复产生调控作用。创伤、应激、感染等是影响围术期病死率的 重要因素，与机体免疫状态密切相关。本文旨在总结各种炎症因子的特点、围术期使用不同药物和麻醉方式对炎症细胞因子的影响，提高患者围术期安全，从而改善患者的预后。 1. 炎症细胞因子 多达20%的肿瘤源自于慢性炎症，大部分的实体瘤都有炎性渗出物。免疫细胞对肿瘤 的发生、生长和进展有着广泛的影响，并且很多这些效应都是由促炎症细胞因子介导。在所有细胞因子中，TNF和IL-6具有促进肿瘤发生的效应，这一点是可以确定的。TNF和IL-6 作为肿瘤相关炎症和肿瘤形成的主要调节因子，使得它们在癌症的辅助治疗中成为很受欢迎 的研究目标。因此在围术期对患者进行炎症细胞因子的检测具有重要的临床意义。
细胞因子检测的意义及方法比较
细胞因子检测的意义及检测方法比较 摘要：干扰素（interferon, IFN)是1957年发现的细胞因子，最初发现某一种病毒感染的细胞能产生一种物质可干扰另一种病毒的感染和复制，因此而得名。根据干扰素产生的来源和结构不同，可分为IFN-α、IFN-β和IFN-γ，他们分别由白细胞、成纤维细胞和活化T细胞所产生。各种不同的IFN生物学活性基本相同，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用。这里主要利用生物分析法和免疫分析法进行检测。 关键词：干扰素生物分析法免疫分析法 正文： 细胞因子是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，具有调节和血细胞生成、细胞生长以及损伤组织修复等多种功能。细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。众多细胞因子在体内通过旁分泌、自分泌或内分泌等方式发挥作用，具有多效性、重叠性、拮抗性、协同性等多种生理特性，形成了十分复杂的细胞因子调节网络，参与人体多种重要的生理功能。所以细胞因子检测是判断机体免疫功能的一个重要指标，对于疾病的诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治疗监测等都有重要意义。 生物分析法有两种： 1.依赖性细胞株：利用一些肿瘤细胞株必须依赖于细胞因子方能在体外增殖的特性进行检测，但是干扰素的测定利用此法并不简便，所以不当采用。 2.功能检测：利用一些细胞因子的功能特性，可建立相应的活性测定方法。在这里可以利用干扰素的抑制病毒感染效应，对已进行病毒感染的细胞群加入干扰素的特征进行观察，达到检测的目的。 免疫分析法： 1.流式细胞仪检测: 原理：利用Brefeldin(BFA)、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运方法，使得细胞因子聚集、蓄积，增强细胞因子信号，可被流式细胞仪检测。 方法：用抗细胞因子（干扰素）抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。 所需材料：蛋白转运抑制剂：阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内质网内，以利于准确检测细胞产生细胞因子的能力。 2.酶联免疫吸附实验（ELISA） ①间接ELISA（Indirect ELISA）：用于筛检抗体（抗特定抗原成分的特异性抗体）。此法是测定抗体最常用的方法。 ②夹心ELISA（Sandwich ELISA）：用于检测目的抗原的量。其优点是避免了对特异性抗体的直接标记，但增加了操作步骤和测定时间。 ③竞争ELISA（Competitive ELISA）用于确定抗原特异性或待检标本中含交叉反应成分时为了提高实验的特异性而使用的一种方法。根据标记抗原与同种未标记待测抗原与抗体间发生竞争性结合的原理，主要用于测定小分子抗原。 检测方法的进展：高通量细胞因子检测 CBA(Cytometric Bead Array)是一种微珠多用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合来捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养液、EDTA血浆、血清样本中被检测物质的量。其采用夹心法分析策略，与传统的ELISA分析技术相比，此方法可以同时检测多项指标。用已知的标准品
细胞因子的ELISA方法检测
实验报告
1.取已包被抗体并完成封闭的酶标条2条，分别装于酶标架上。在每条酶标条的1~6孔分别加入稀释液100微升。 2.向第6、7孔加入分别加入2000pg/ml PGFβ1标准品100微升。 3.用加样枪吹吸混匀第6孔的液体，注意避免气泡形成。混匀后其浓度约为1000pg/ml。 4.再吸出100微升加入第5孔，吹吸混匀。其浓度变为500pg/ml。以此类推，一直加到第2孔。吸去多余的100微升。 5.向第8、9孔各加入100微升样品1。10、11孔加入100微升样品2. 6.封口膜覆盖酶标板，防止水分挥发。 7.将酶标板置于37℃温箱孵育120min。 8.取出孵育后的酶标板，揭开封口膜，甩去孔中液体，注意甩动方向，避免液体流入相邻酶标孔，造成交叉污染。 9.加入洗涤液，注意不要溢出至相邻孔，造成交叉污染。静置3min后甩去孔中液体，重复以上洗涤过程4次。在吸水纸上拍干孔中液体。 10.每个孔各加入酶标记抗体100微升。封口膜覆盖酶标板，将酶标板置于37℃温箱孵育60min。 11. 取出孵育后的酶标板，揭开封口膜，甩去孔中液体。再加入洗涤液，静置3min后，甩去孔中液体，重复以上洗涤过程4次。在吸水纸上拍干孔中液体。 12. 每个孔各加入底物A 100微升，再加入底物B各100微升。晃动酶标板混匀。将酶标板放入37℃温箱孵育15min显色。 13. 取出孵育后的酶标板，见酶标板孔中液体呈蓝色。 14. 每个孔各加入终止液100微升，可见液体变成淡黄色。 15.用酶标仪在450nm处测OD值。结果如下： 16. 分析结果： 将2组标准品的OD值和标本1、标本2的4个副本的OD值合并得到平均值。根据各自的OD值，在半对数坐标上标出62.5、125、250、500、1000、2000这6个不同稀释度标准品所处的位置，将6个点连线集会成标准曲线。
细胞内细胞因子的检测
细胞内细胞因子的检测 细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。研究显示，细胞因子可以具有多重功能，作用于多个细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如Th1(IL-2，IFN-γ)与Th2(IL-4，IL-5，IL-10)，但这些研究很难推广，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还不清楚。 活化的T细胞可分泌多种细胞因子至细胞外，而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原，所以应阻断细胞因子分泌至细胞外，方法为破坏高尔基体，因细胞因子（即各种蛋白）在合成后需经高尔基体的加工和转运，才能到达细胞膜，然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径，干扰其分泌。近来，Jung与Picker采用了Brefeldin(BFA)与monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。 胞内细胞因子染色与传统的检测可溶性蛋白的方法如ELISA相比，具有显著优越性。该法从单个细胞水平检测内多个细胞因子的同时，还可标记各种细胞表面分化抗原以及活化分子、趋化因子受体和黏附分子等，从而区分表达特定细胞因子的细胞亚群及其表型特征。使用特定刺激剂研究细胞因子应答是细胞因子研究中的重大进展。早在1986年，Mosmann等应用Th细胞克隆技术和细胞因子产生的不同，发现小鼠CD4细胞是一个不均一的亚群，可分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。后来在人类的CD4细胞群中也发现了Th1和Th2细胞亚群。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应，在抗胞内病原菌感染中发挥重要作用；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，其主要功能是刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫有关。应用该方法，在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被
细胞因子6项临床意义
6 项细胞因子检测试剂盒 检测靶标 促炎因子： IL-6、IL-17、IFN-γ、TNF-α、 抑炎因子：IL-4、IL-10、 本项目涵盖由Th1、TH2、Th17、单核/巨噬细胞、树突细胞等多种细胞分泌的细胞因子，可更全面的反映疾病状态下机体免疫系统的改变。 重症疾病 细胞因子水平是早期预警全身炎症反应综合证（SIRS）的灵敏指标，SIRS 发生时IL-6、IFN-γ、IL-10、TNF-α等细胞因子大幅升高，是反映SIRS 的关键细胞因子。对于临床重症患者，如脓毒症、不明原因发热、急性胰腺炎、重症肺炎、围手术期等患者，若发生SIRS 不能及时治疗，则易引发ARDS 和MODS，死亡率高达40-60%，因此，越完善的因子种类更有利于反映患者的细胞因子风暴，进而警醒临床医生及时干预。 IL-4 是机体Th2 细胞特异性分泌的细胞因子，IFN-γ是机体Th1 细胞特异性分泌的细胞因子，临床中多用IFN-γ/IL-4 来反映机体Th1/Th2 漂移水平，Th1/Th2 漂移是评估肿瘤疾病病情的重要指标； 自身免疫性疾病 IL-17 几乎参与所有自身免疫疾病的炎症反应，是自身免疫性疾病炎症损伤 评估的主要指标 感染/炎症相关疾病 IL-6、IFN-γ、TNF-α是感染患者主要升高的促炎因子，IL-4、IL-10 是机体最主要的抗炎因子，检测促炎/抗炎因子变化情况可评估感染病情进展及预后疗效。 细胞因子谱鉴别脓毒症和噬血细胞综合征（HLH） 脓毒症：IL-6 显著升高，IL-10 升高较明显 噬血细胞综合征：IFN-γ和 IL-10 显著升高
革兰氏阴阳性菌细胞因子谱 G-BIRCP：我们将 IL-6、 IL-10 同时高度增高＞10 倍（ X＋S），定义为革兰氏阴性菌感染相关细胞因子谱（ G-BIRCP）G+BIRCP：将 IL-6 为轻度增高＞2 倍甚至>10 倍（ X＋S），但 IL-10 正常或增高值＜10 倍（ X+S）者，定义为革兰氏阳性菌感染相关细 胞因子谱（ G＋BIRCP） 噬血细胞综合征（HLH）细胞因子谱 IFN-γ＞100pg/mL, ，IL-10＞60pg/mL ,且 IFN-γ水平高于 IL-10 水平。该标准对于 HLH 诊断的敏感度和特异性分别达到 88.0%和 98.7%，且阳性预测值和阴性预测值达到了 93.6%和97.5%。 细胞因子在不同类型疾病中的结果解读 1、常见细菌感染/病毒感染相关细胞因子 2、常见自身免疫性疾病相关细胞因子
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 一、简介 随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。 早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T 淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－ )与TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。 近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin 阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。 胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。具有其它方法难以比拟的优点：
乳腺癌相关细胞因子
众所周知细胞因子是由免疫原或其他因子刺激细胞所产生的具有信息传递功能的蛋白质或多肽。它既是机体免疫系统应答的效应成分，又是免疫细胞间进行信息传递的介质。大多数细胞因子对乳腺癌细胞具有抑制生长、促进凋亡的负面作用，同时具有促进生长繁殖、为侵袭转移提供条件的作用。这与细胞因子的浓度，癌细胞的恶性程度，癌细胞生长的微环境等因素有关，这些细胞因子的相互作用及其临床意义值得关注。 在部分地区，乳腺癌的发病率已居于妇女恶性肿瘤发病率首位。细胞因子（CK）是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导免疫效应细胞和相关细胞合成、分泌的，具有生物活性的一类蛋白或多肽。近年来研究表明乳腺癌与细胞因子密切相关。 1 细胞因子对肿瘤细胞的作用 1.1 细胞因子对肿瘤细胞生长的促进作用表现在以下几方面 ①介导乳腺癌细胞逃避免疫监视：研究发现肿瘤细胞招募的调节性T细胞可能在逃避免疫监视方面起着主导作用，从肿瘤中去除Treg细胞后，宿主免疫系统能有效地排斥早晚期肿瘤[1]。 ②促进血管的生成，为肿瘤生长提供营养。 ③促进肿瘤细胞的侵袭与转移。TNF和IL-1促进内皮细胞表达粘附分子，而肿瘤表达的粘附分子受体能使其实现转移。 1.2 细胞因子的抗肿瘤作用 ①对肿瘤细胞的直接杀伤，如TNF-α； ②促进宿主的抗肿瘤免疫； ③影响肿瘤血供，减少营养来源； ④刺激造血形成，解除放疗、化疗对免疫的抑制。 2 乳腺癌相关的细胞因子
2.1 血管内皮生长因子 血管内皮生长因子（VEGF）是目前发现的特异性最高的刺激血管生成的因子。人VEGF基因位于6p21.3，长度大约为14kb。VEGF基因的表达与缺氧、细胞分化、雌激素和细胞因子有关。在乳腺肿瘤的生长过程中，肿瘤细胞产生蛋白水解酶分解原有的血管基底膜，血管内皮细胞在肿瘤细胞产生的VEGF诱导下，形成毛细血管芽向肿瘤方向运动，最后形成毛细血管[2]。但这些新生的毛细血管基底膜不完整，管壁通透性高，利于肿瘤的血行转移。免疫组织化学分析，结果表示VEGF在乳腺癌肿瘤样本中的表达率为39.8%，但是没有在临近的正常组织中表达。值得注意的是，VEGF阳性患者的5年生存率明显低于VEGF阴性患者。 2.2 肿瘤坏死因子 肿瘤坏死因子（TNF）有a、b两型，都具有参与免疫应答、引起恶病变的作用。但TNF-α对肿瘤的作用，存在不同的观点。有学者认为TNF-α起到直接和间接杀伤或抑制肿瘤的作用，其作用机制为TNF-α和癌细胞上的TNF-α受体结合，内移入细胞裂解其DNA。但也有一些学者认为TNF-α对肿瘤有促进作用。其促进作用可能通过以下几种途径： ①促进肿瘤细胞存活，肿瘤细胞产生的TNF通过诱导依赖于NF-κB的抗凋亡分子的表达促进肿瘤细胞存活。 ②促进肿瘤血管的新生：局部大剂量的TNF-α可以破坏肿瘤血管，但小剂量持续的TNF-α可以促进血管生成，有利于肿瘤的生长和扩散。 ③抑制T细胞和巨噬细胞的细胞毒作用而损坏免疫监视。 2.3 转移生长因子-β 转移生长因子-β（TGF-β）是一种丝裂原活化蛋白激酶，将细胞外信号传至细胞内，参与细胞的生长、分化、增殖的调节及恶性转化，与乳腺癌的发生、发展有关。TGF-β对不同时期
细胞因子检测方法综述
细胞因子检测方法综述 细胞因子(cytokine)是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的统称[1]。在免疫应答过程中，细胞因子在免疫调节、炎症应答、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要作用。细胞因子的检测不仅是基础免疫研究的有较手段，同时在临床疾病诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治疗监测方面具有重要价值。 但是，由于细胞因子在体内的含量甚微，给细胞因子的检测带来困维，细胞因子的检测尚未在临床诊断上广泛开展，已知目前采用的细胞因子检测方法均不完善，且不同的检测方法所得的结果差异较大，给临床诊断与治疗带来一定的困难。因此，有必要了解各种检测方法的特性及影响因素[2]。 目前，细胞因子生物学活性检测和浓度测定方法主要有以下几类 一.生物学检测法 生物学检测又称生物活性检测，是根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测法。由于各种细胞因子具有不同的活性，例如IL-2促进淋巴细胞增殖，TNF杀伤肿瘤细胞，CSF刺激造血细胞集落形成，IFN保护细胞免受病毒攻击，因此选择某一细胞因子独特的生物活性，即可对其进行检测[2]。生物活性检测法又可分为以下几类： 1．细胞增殖法 许多细胞因子具有细胞生长因子活性，特别是白细胞介素，如IL-2刺激t细胞生长、IL-3刺激肥大细胞生长、IL-6刺激浆细胞生长等。利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依赖于某种因子的细胞系，即依赖细胞株（简称依赖株）。这些依赖株在通常情况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。例如IL-2依赖株ctll-2在不含IL-2的培养基中很快死亡，而加入IL-2后则可右体外长期培养。在一定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量呈正比，因此通过测定细胞增殖情况（如使用3h-tdr掺入法、MTT法等）鉴定IL-2的含量。除依赖株外，还有一些短期培养的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原刺激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种细胞因子活性。 2．靶细胞杀伤法 是根据某些细胞因子（如TNF）能在体外杀伤靶细胞而设计的检测方法。通常靶细胞多选择体外长期传代的肿瘤细胞株，利用同位素释放法或染料染色等方法判定细胞的杀伤率。 3．细胞因子诱导的产物分析法 某些细胞因子可刺激特定细胞产生生物活性物质，如IL-2、IL-3诱导骨髓细胞合成胺、IL-6诱导肝细胞合成α1-抗糜蛋白酶等。通过测定所诱生的相应产物，可反映细胞因子的活性。 4．细胞病变抑制法 病毒可造成靶细胞的损伤，干扰素等则可抑制病毒所导致的细胞病变，因此可利用细胞病变抑制法检测这类因子。 二、免疫学检测法 细胞因子均为蛋白或多肽，具有较强的抗原性。随着重组细胞因子的出现，可较方便地获得细胞因子的特异性抗血清或单克隆抗体，因此可利用抗原抗体特异性反应的特性，用免疫学技术定量检测细胞因子。尽管细胞因子种类繁多，只要获得了针对某一因子的特异性抗体（包括多克隆抗体或单克隆抗体）均可采用相似的技术开展工作。常用的方法包括ELISA、RIA及免疫印迹法。目前，几乎所有常见细胞因子的检测试
细胞因子检测
细胞因子检测 细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质分泌的蛋白质,在体广泛参与免疫调节及炎症反应、组织修复、刺激造血系统、刺激细胞的增殖与凋亡等重要生理活动,?在抵抗外来病原及维持机体环境平衡中均起重要作用。某些刺激因子也可导致一些细胞因子超量表达,或表达减少,从而参与疾病的发病及病理过程。 1、免疫学检测法其基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。?如免疫斑点法、ELISA法、RIA法和免疫印迹法等均已用于细胞因子的检测。 2.、生物学测定法其原理是根据细胞因子对特定的依赖性细胞株(即靶细胞)?的促增殖作用,以增殖细胞中的DNA的合成或酶活性为指标,间接推算出细胞因子的活性单位,如对IL-1、IL-2等细胞因子活性的检测。亦可根据某些细胞因子对特定靶细胞的杀伤效应或对病毒的抑制作用进行测定,如对肿瘤坏死因子及干扰素的生物活性测定。 3、分子生物学测定法目前采用的技术有各种印迹法、斑点杂交、原位杂交和PCR等。通过检测细胞细胞因子的基因组成或mRNA量,推算出细胞因子的合成量。 . .
一、IL-1的检测(生物活性测定) 产生IL-1的细胞种类很多,其中最主要的为单核-巨噬细胞。IL-1可分为IL-1α(?也称酸性IL-1,pI=5.0)和IL-1β(中性IL-1,pI=7.0)。两者的分子量和生物活性相似,?只能用抗体检测方法才能区别,常用的生物学测定法对两者都适用。IL-1?的生物学活性广泛,其检测方法亦较多,包括有小鼠胸腺细胞增殖法、D10G 4.1细胞增殖法及L929细胞增殖法等。IL-1反应细胞增殖可以通过活性染料染色,显微镜直接计数,3H-TdR或125I-UdR的DNA掺入量或以活性细胞代率为指标来表示。本试验介绍L929细胞增殖MTT比色法。 （一）IL-1的诱生 体外试验可用LPS等有丝分裂原诱导单核-巨噬细胞产生IL-1,或用 P388D1(鼠),THP-1(人)细胞株制备IL-1。本试验以小鼠巨噬细胞制备IL-1。 1、取6～10周龄BALB/c或C57BL/6小鼠,雌雄均可,拉颈处死后用酒精消毒。 2、用带9号针头的5ml注射器腹腔注入5ml冷的含5％小牛血清的Hanks液(5?％?NBS-HBSS),轻揉腹部吸出腹腔液体(含腹腔细胞),反复抽吸几次。 . .
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 点击次数：621 作者：佚名发表于：2008-07-24 15:51转载请注明来自丁香园 来源：51protocol 一、简介 随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。 早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆">克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆">）与TH2（IL－4，IL－5，IL－10），但这些研究很难外推，因为T细胞克隆"克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1（IL－2，IFN－>克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。 近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin（BFA）、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有
流式细胞术胞内因子检测的关键控制因素
前言 由于胞内分析步骤复杂，涉及变异因素多，可能会出现结果不稳定，较难重复等问题。 我们提出这些分析关键因素，希望能帮助大家排除实验过程中一些问题，这些控制因素不仅适用 于细胞因子分析，也可扩展到其他细胞生物学研究领域，如胞内信号传导，凋亡等。 1、刺激与收获细胞 许多胞内与胞外蛋白的表达的调控都与细胞激活有关，细胞因子更为突出，因为通常情况 下，未刺激的白细胞不表达细胞因子或表达量极微无法检测，研究者必须采用体外激活以刺激细 胞因子的表达。多克隆激活剂可以诱导多种细胞因子分泌细胞，这些细胞经荧光染色可在流式细 胞仪上定群检出。使用蛋白转运抑制剂至关重要因为它有助于细胞因子聚集，提高检出率。每个 研究者都应根据实验系统慎重选择激活方法（刺激剂类型、反应时间曲线等）。 ●蛋白转运抑制剂的选择 蛋白转运抑制剂可以通过增强胞内细胞因子聚集因而使胞内染色信号增强。常用蛋白转运抑制剂有两种： Monensin , 一种离子载体，可以破坏跨膜离子梯度。 Brefeldin A ，一种真菌代谢物，可以干扰囊泡自粗面内质网至高尔基体的转运。 研究者应依据研究目的选择适宜的蛋白转运抑制剂。 2、 Fc受体阻断 使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非特异荧光染色。在小鼠可以应用纯化的抗小鼠 CD16/32（Clone2.4G2）直接作用于FcγII/III受体。在大鼠可以用纯化的抗大鼠CD32 直接作用 于Fcγ受体。在人可以用过量的同种无关纯化Ig或血清。 3、细胞表面荧光染色 特异的荧光标记抗体与细胞孵育标记细胞表面抗原,最好用含NaN 3及蛋白（FBS或BSA）的 染色缓冲液稀释抗体。可按 PBS+1%FBS+0.1%NaN 3 pH7.4，配制洗涤缓冲液。 4、细胞固定及通透 细胞胞内染色前必须固定通透，细胞通透同时或之前必须固定以保持细胞结构的完整性。 固定剂主要成分为多聚甲醛，通透剂主要成分为皂素。这是两个比较重要的试剂，实验中最好设 置阳性对照以验证这两个试剂的有效性。 5、荧光结合抗体胞内染色 胞内抗原染色取决于正确选用及确认与固定通透过程相容的特异性单抗，这些可供选择 的单抗有多种形式，FITC，PE，APC，为研究者进行多色分析提供可能。每一抗体都经过特殊测 试确保其对胞内抗原染色最佳适于流式细胞分析。胞内染色的质量极大程度取决于每个荧光标记 抗体的最适反应浓度，应尽量选择预先滴定好的抗体以减少实验操作时间，保证细胞因子的有效 检测。 ●荧光素的选择
细胞因子概述
1促炎细胞因子 1.1 白介素-1(interleukin-1，IL-1) IL-1是一种能激活多种免疫和炎症细胞的前炎性细胞 因子，主要由单核/巨噬细胞、中性粒细胞和内皮细胞分泌. IL-1包括两种由不同基因编码产生的分子质量均为17 ku左右的多肽分子IL-1α(p15.0)和IL-1β(p17.0)，前者为分泌型，而后者则多与细胞结合. IL-1β能通过自分泌或旁分泌刺激其他CK和炎症递质的产生，诱发抗原提呈细胞表面免疫分子的表达，为T淋巴细胞的活化提供第二信号，促进B细胞的增生、分化，介导免疫球蛋白的分泌，由此激活补体，增强细胞免疫和体液免疫介导的组织损伤过程.此外，IL-1β还能促进血管内皮-白细胞黏附分子的表达，趋化中性粒细胞等炎性细胞进入肠道病变部位，从而引起一系列肠道炎症反应和组织破坏，其细胞因子mRNA的表达与UC 的炎症程度成正相关，可作为临床上判断疾病严重程度和疗效的指标[1]. 1.2 白介素-6(IL-6) IL-6主要由活化的巨噬细胞、淋巴细胞及上皮细胞分泌，其生物学效 应类似于IL-1β. IL-6可以通过STAT-3途径激活NK-κB而诱导细胞间黏附分子(ICAM-1)的极化表达，后者是在炎性肠病患者中性粒细胞-上皮细胞间相互作用中起重要作用的一种黏附颗粒.因而，在慢性肠道炎症的发病机制中起至关重要的作用[2]. IL-6在急性炎症反应中的作用主要表现为对多种细胞的促炎作用和诱导肝组织产生急性反应蛋白，故活动期CD患者的血清IL-6水平比健康成人显著升高. 1.3 白介素-8(IL-8) IL-8是一种强而有力的中性粒细胞趋化和活化因子，由单核细胞、上 皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞及T淋巴细胞在IL-1、TNF和外源性因子细菌多糖(LPS)的刺激下产生，主要生物学作用是趋化并激活中性粒细胞，促进中性粒细胞的溶酶体酶活性和吞噬作用，对嗜碱性粒细胞和T细胞也有一定的趋化作用.目前认为TNF、IL-1、IL-6诱发的炎症反应在很大程度上是通过诱导产生以IL-8为代表的趋化因子所介导的.UC患者IL-8水平显著升高，且与病灶的大体炎症程度成正相关，尤其是有大量中性粒细胞浸润的隐窝脓肿的溃疡性结肠炎患者，其mRNA检测可作为临床上判断疾病严重程度和疗效的指标. 1.4 白介素-12(IL-12) IL-12是由一分子质量为40 ku的p40亚基及一分子质量为35 ku 的p35亚基组成的分子质量为70 ku的杂二聚体(p70). p35由T、B、NK细胞及单核细胞等产生，p40主要由活化的单核细胞及B细胞产生. IL-12是最强的NK细胞激活因子，能促进CD4+Th0细胞分化为Th1细胞，刺激NK和T细胞产生多种细胞因子，如IFN-γ、IL-2、TNF-α、GM-CSF、IL-3、IL-8等，再通过这些递质发挥作用.已报道IL-12在IBD患者尤其是CD患者的血清有明显升高. 1.5 白介素-15(IL-15) IL-15与IL-2相似，也是由不同类型的细胞产生.他以IL-2rβ和γ链的 成分作为其信号传导，可结合T细胞、B细胞、NK细胞以及上皮细胞的相应受体，促进这些细胞的活化、增生，抑制其凋亡以及促进前炎性细胞因子的合成，如促进T细胞分泌TNF-α、IFN-γ.中重度活动的UC患者表达IL-15的外周血单核细胞百分比增加，可能是因为体内细胞激活而使血清IL-15释放增加.活动性IBD治疗2 wk内表达IL-15的细胞数下降. 1.6 白介素-16(IL-16) IL-16是趋化因子，可由CD8+T细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、 上皮细胞等多种细胞受刺激而分泌，主要通过CD4途径起作用，但可不依赖CD4作用于靶细胞. IL-16可刺激单核细胞产生IL-6，TNF-α，IL-15等，其具体作用机制还有待进一步的研究. 1.7 白介素-17(IL-17)白介素-17是一相对分子质量为Mr(20-30)×103的糖蛋白，主要由 基质细胞产生. IL-17是T细胞诱导和促进炎症发生过程中的一种重要的可溶性因子.他可促进中性粒细胞的发育成熟，并且刺激上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞及纤维母细胞等产生IL-6、IL-8、粒细胞集落刺激因子和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)等炎症递质，增加纤维母细胞表面ICAM-1的表达.另外，IL-17还可促进补体C3等急性期反应蛋白的产生，在炎症发生过程中起重要的调控作用.UC肠道病变部位的肠黏膜固有层单个核细胞(1amina
细胞因子的分子生物学检测法
细胞因子的分子生物学检测法 细胞因子基因的检测包括对其DNA的检测和mRNA表达水平的检测。特定细胞因子mRNA表达水平的检测有助于判断细胞表达该细胞因子的水平；而细胞因子DNA的检测可以判断该细胞因子基因存在与否及其变异情况。常用的方法有Southern印迹、斑点印迹、PCR，原位杂交及原位PCR等，Northern印迹及RT-PCR。这里简要介绍常见细胞因子mRNA表达水平的检测。 一、斑点杂交法测定培养细胞IL-2 mRNA的含量 本法可用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及半定量分析。该法先将RNA变性后直接点样于硝酸纤维膜上，可用手工操作点样，也可用斑点式点样器点样，再与特异性探针进行杂交。由于其操作比Northern印迹简单、迅速、所需样品量少，且可在同一张膜上同时进行多个样品的检测，故很适合于临床应用。亦可用于DNA的检测。但其缺点是不能鉴定所测基因的分子量。 下面以检测培养细胞的IL-2 mRNA含量的检测，说明斑点杂交法的操作过程。只要改变相应的DNA探针，此方法也适用与其他细胞因子mRNA含量的检测；或者改变RNA的提取方法，也适用于其他类型细胞的检测。 二、原位杂交法测定TNF的mRNA
RNA-DNA原位杂交的原理与分子杂交其它方法的原理相同。但是其它方法都是将RNA提取出来后进行分子杂交，而原位杂交则是在细胞内mRNA原有位置上进行杂交，细胞则尽可能保持原有形态。将细胞以适当方法固定后，除去脂类并适当消化细胞内的蛋白质，增大细胞对大分子物质的通透性，使DNA探针便于出入细胞。与免疫组化相结合，原位杂交可以将显微镜下的组织形态学资料与DNA，mRNA，蛋白质水平的基因活动联系起来。进行分子杂交之后，将玻片上细胞置与显微镜下观察，可确定不同细胞内的基因表达定位情况。 三、反转录PCR(RT-PCR)定量检测细胞因子的mRNA 细胞因子的mRNA寿命短且拷贝数低，因此难以在小量样本中进行检测。RT-PCR?是一种能检测细胞内低丰度特异RNA的方法，其原理是首先以RNA为模板，在逆转录酶的催化下，合成与RNA互补的cDNA。然后以cDNA为模板，用PCR技术对靶序列进行扩增，使微量细胞因子的RNA经放大后检出，常用的细胞因子引物见表 8-1。RT-PCR能检出单个细胞中少于10个拷贝的特异?RNA，如同时放大内参照物（如表8-1中的b-Actin），即可对RT-PCR检出的细胞因子mRNA进行定量。 细胞内（胞浆）细胞因子的免疫学检测法
细胞因子检测
细胞因子检测 细胞因子就是由免疫细胞与某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌得一类生物活性物质分泌得蛋白质,在体内广泛参与免疫调节及炎症反应、组织修复、刺激造血系统、刺激细胞得增殖与凋亡等重要生理活动,?在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中均起重要作用、某些刺激因子也可导致一些细胞因子超量表达,或表达减少,从而参与疾病得发病及病理过程。 1、免疫学检测法其基本原理就是将细胞因子作为抗原进行定量检测。?如免疫斑点法、ELISA法、ＲIＡ法与免疫印迹法等均已用于细胞因子得检测。 2。、生物学测定法其原理就是根据细胞因子对特定得依赖性细胞株(即靶细胞)?得促增殖作用,以增殖细胞中得DNA得合成或酶活性为指标,间接推算出细胞因子得活性单位,如对IＬ-1、ＩL-2等细胞因子活性得检测。亦可根据某些细胞因子对特定靶细胞得杀伤效应或对病毒得抑制作用进行测定,如对肿瘤坏死因子及干扰素得生物活性测定。 3、分子生物学测定法目前采用得技术有各种印迹法、斑点杂交、原位杂交与ＰCＲ等。通过检测细胞内细胞因子得基因组成或mRNA量,推算出细胞因子得合成量、 一、IL-1得检测(生物活性测定)
产生IL—1得细胞种类很多,其中最主要得为单核－巨噬细胞、ＩL—1可分为IL —１α(?也称酸性IL—１,pI=5。0)与IL－1β(中性ＩL－1,pI=7。0)、两者得分子量与生物活性相似,?只能用抗体检测方法才能区别,常用得生物学测定法对两者都适用。ＩＬ-1?得生物学活性广泛,其检测方法亦较多,包括有小鼠胸腺细胞增殖法、D10Ｇ4、1细胞增殖法及L929细胞增殖法等。ＩL-1反应细胞增殖可以通过活性染料染色,显微镜直接计数,3H-TdＲ或125I—ＵdR得ＤＮA掺入量或以活性细胞代谢率为指标来表示。本试验介绍Ｌ929细胞增殖MTT比色法、 (一)IＬ-1得诱生 体外试验可用ＬPS等有丝分裂原诱导单核-巨噬细胞产生IL-1,或用P3８ 8D1(鼠),TＨP-1(人)细胞株制备ＩL－1、本试验以小鼠巨噬细胞制备IL—１。 1、取6~１0周龄BALB/c或Ｃ5７ＢL/６小鼠,雌雄均可,拉颈处死后用酒精消毒、 2、用带9号针头得5ml注射器腹腔注入5ml冷得含5％小牛血清得Hａｎｋs 液(５?％?NＢS—ＨBSS),轻揉腹部吸出腹腔液体(内含腹腔细胞),反复抽吸几次。 3、1500ｒ/min离心8mｉn,洗细胞2次、
细胞因子生物学活性检测
细胞因子生物学活性检测 细胞因子水平测定是细胞免疫功能检测的一个重要组成部分。由于许多细胞因子cDNA 克隆和表达的成功，给细胞因子单克隆抗体制备、生物学功能的鉴定提供必要条件。目前检测细胞因子水平主要包括两类方法：一是生物学活性的检测，这类方法是利用细胞因子某一特定的生物学作用所设计的检测方法，如IL-2维持活化T细胞的增殖，IFN能保护病毒对正常细胞的感染，TNF-α选择性杀某些肿瘤细胞等，因此敏感性也较高；二是定量的检测，常用酶联免疫吸附试验(ELISA)，如多克隆抗体与单克隆抗体，识别不同表位两种单克隆抗体的双抗体夹心法，生物学和定量的检测方法各有优缺点，在必要时可同时进行检测。 一、白细胞介素1(IK-1)生物学活性测定 白细胞介素1是一种重要的细胞因子，主要由单核-巨噬细胞产生，IL-1不仅对多种免疫活性细胞有重要的调节功能，而且与发热、炎症发生以及某些疾病的病理变化有关。目前对IL-1产生水平的检测主要应用生物学活性检测的方法。 ConA刺激小鼠胸腺细胞检测IL-1生物学活性 (一) 原理 小鼠胸腺细胞在丝裂原刺激下表达IL-1受体，在有IL-1同时存在的条件下，IL-1可协同丝裂原促T细胞的增殖作用。根据加入IL-1后增殖水平(３H-TdR掺入率)的增加可计算出样品中IL-1的活性单位，或计算出刺激指数。 (二) 操作步骤 取6～8周龄C57BL16小鼠，拉颈处死，无菌取胸腺 置不锈钢网筛上，用注射器针蕊研磨成细胞悬液 调整细胞数为1.5×10７／ml ↓ 细胞悬液内加入ConA，使终浓度为3μg／ml，在96孔 培养板中加100μl(1.5×10６细胞) ↓ 加入不同稀释度待测样品和IL-1标准品 100μl／孔(ConA终浓度为1.5μg／ml) ↓37℃ CO２孵箱 66h 每孔加３H-TdR 0.5μci ↓37℃ CO孵箱 6h 多头细胞收集仪收获于9999型玻璃纤维纸上 ↓ 烤干，移入液闪瓶中，加适量闪烁液，于液闪仪上测β计数计算: 1. 从IL-1标准曲线上测得IL-1的活性单位
第十五章细胞因子测定及应用选择题
第十五章细胞因子测定及应用 一、选择题 （一）A1 型题（标准型） 1．细胞因子测定的临床应用是（） A. 临床疾病的预防应用 B. 评估机体的免疫状态，判断治疗效果及预后 C. 临床疾病的治疗应用 D. 特定疾病的辅助诊断 E. 以上都是 2．免疫学测定细胞因子哪项是正确的（） A. 特异性高 B. 不能确定生物学活性 C. 操作简便 D. 不能确定其分泌情况 E. 以上都是 3．分子生物学测定细胞因子评价哪项正确（） A. 特异性高 B. 操作简便 C. 测细胞因子基因 D. 敏感性高 E. 定量 4．细胞因子生物学检测的特点是是( ) A. 特异性高 B. 可定量分析 C. 可测测活性 D. 定位 E. 可半半定量分析 5．关于细胞因子下列说法正确的是（） A. 由免疫细胞合成 B. 由非免疫细胞合成 C. 小分子多肽 D. 可调节多种细胞生理功能 E. 以上都是 6．有活化的T 细胞产生的细胞因子是（） A. multi-CSF B. M-CSF C. G-CSF D. SCP E. Epo 7.由肾细胞产生的细胞因子是：（） A.G-CSF B.GM-CSF C.M-CSF D.Epo
E.LIF 8．检测细胞因子最可靠的方法是（） A. 生物学检测法 B. 免疫学检测法 C. 动物体内检测法 D. 分子生物学法 E. 以上都是 9．细胞因子检测最简单、重复性好的方法式（） A. 生物学检测法 B. 免疫学检测法 C. RT-PCR 法 D. 原位杂交法 E. 分子生物学检测法 10.生物学检测法哪项是正确的（） A. 维持细胞生长 B. 刺激细胞增殖 C. 保持细胞活性 D. 抑制细胞生长 E. 以上都是 11．3H-TdR掺入法属于下列哪种检测方法（） A. 免疫学定性 B. 免疫学定量 C. 生物学检测 D. 原位PCR E. 原位杂交 12．细胞毒测定可用于测定（） A. IFN-α B. IFN-β C. IFN-γ D. MTT E. 3H-TdR 13．那种细胞因子有下调作用（） A. IL-1 B. IL-2 C. IL-3 D. IL-4 E. IL-8 （二）A1 型题（否定型） 1. 下列哪项描述是错误的（） A 细胞因子种类繁多 B 多种细胞能可产生同一细胞因子 C 每个细胞因子都有固定的生物学活性 D 新的细胞因子不断发现 E 以上都是