儿童持续性免疫性血小板减少性紫癜患儿滤泡辅助性T细胞改变初探

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临床免疫学?

儿童持续性免疫性血小板减少性紫癜患儿滤泡辅助性Ｔ细胞改变初探

姚鑫　李成荣　王国兵　杨军　李长钢

ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０２５４－５１０１．２０１３．１１．００７

基金项目：深圳市重点科技计划项目基金（２０１２０１００５）作者单位：５１８０２６遵义医学院深圳市儿童医院儿科研究所

通信作者：李成荣，Ｅｍａｉｌ：ｌｉｃｈｅｎｇｒｏｎｇ＿ｓｚ＠１６３．ｃｏｍ，电话：０７５５－８３９３６２７３

【摘要】　目的　探讨滤泡辅助性Ｔ细胞（Ｔｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｈｅｌｐｅｒ，Ｔｆｈ）在儿童持续性免疫性血小板减少性紫癜（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｉｍｍｕｎｅｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａ，ｐＩＴＰ）免疫发病机制中的可能作用。方法ｐＩＴＰ患儿２０例，采用流式细胞术检测外周血循环ＣＤ４＋

ＣＸＣＲ５＋

ＩＣＯＳ

ｈｉｇｈ

ＰＤ－１ｈｉｇｈ

Ｔ（ｃＴｆｈ）细胞比例及

ＣＤ１９＋

Ｂ细胞ＩＣＯＳＬ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｌｉｇａｎｄ）的表达，采用实时荧光定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ）检测Ｂｃｌ－６、ｃ－Ｍａｆ、ＩＬ－２１ｍＲＮＡ及ＣＤ１９＋

Ｂ细胞ＩＣＯＳＬｍＲＮＡ表达，酶联免疫吸附试验检测血浆ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－２１浓度。结果　（１）ｐＩＴＰ患儿ｃＴｆｈ细胞比例明显高于正常对照组［（１７．４５±９．０４）％ｖｓ

（７．５７±２．５７）％，Ｐ＜０．０５］，地塞米松（ＤＥＸ）治疗７ｄ后ｃＴｆｈ细胞比例明显低于治疗前［（５．９３±１．６４）％ｖｓ（１７．４５±９．０４）％，Ｐ＜０．０５］；（２）Ｔｆｈ细胞转录调节因子Ｂｃｌ－６及ｃ－Ｍａｆ表达较正常对照组明显增高（Ｐ＜０．０５）；（３）ｐＩＴＰ患儿ＣＤ１９＋

Ｂ细胞ＩＣＯＳＬ蛋白和基因表达明显增高（Ｐ＜０．０５），ＤＥＸ

治疗后ＣＤ１９＋

Ｂ细胞ＩＣＯＳＬ表达与治疗前相比无明显改变（Ｐ＞０．０５）；（４）Ｔｆｈ细胞相关细胞因子ＩＬ－２１血浓度和基因表达水平明显高于正常对照组（Ｐ＜０．０５），ＤＥＸ治疗后仍显著高于对照组（Ｐ＜０．０５），ＩＬ－２及ＩＬ－６血浆浓度治疗前后与正常对照组相比无明显改变（Ｐ＞０．０５）。结论　ＩＣＯＳＬ和ＩＬ－

２１表达异常所致Ｔｆｈ细胞过度活化可能与ｐＩＴＰ患儿免疫发病机制有关；Ｂ细胞持续高表达ＩＣＯＳＬ和ＩＬ－２１持续高水平可能是导致ｐＩＴＰ患儿病情反复发作的原因之一。

【关键词】　滤泡辅助性Ｔ细胞；Ｂｃｌ－６；ＩＣＯＳＬ；ＩＬ－２１；免疫性血小板减少性紫癜

ＡｌｔｅｒａｔｉｏｎｏｆＴｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｈｅｌｐｅｒｃｅｌｌｓｉｎｃｈｉｌｄｒｅｎｗｉｔｈｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｉｍｍｕｎｅｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａＹＡＯＸｉｎ，ＬＩＣｈｅｎｇ－ｒｏｎｇ，ＷＡＮＧＧｕｏ－ｂｉｎｇ，ＹＡＮＧＪｕｎ，ＬＩＣｈａｎｇ－ｇａｎｇ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌ－ｏｇｙ，ＳｈｅｎｚｈｅｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｅｄｉａｔｒｉｃｓ，ＳｈｅｎｚｈｅｎＣｈｉｌｄｒｅｎ′ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，ＺｕｎｙｉＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ５１８０２６，Ｃｈｉｎａ

Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＬＩＣｈｅｎｇ－ｒｏｎｇ，Ｅｍａｉｌ：ｌｉｃｈｅｎｇｒｏｎｇ＿ｓｚ＠１６３．ｃｏｍ

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｒｏｌｅｏｆＴｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｈｅｌｐｅｒ（Ｔｆｈ）ｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅｉｍｍｕｎｏ－ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｉｍｍｕｎｅｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａ（ｐＩＴＰ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＴｗｅｎｔｙｃｈｉｌｄｒｅｎｗｉｔｈｐＩＴＰ

ａｎｄｔｗｅｎｔｙｈｅａｌｔｈｙｃｏｎｔｒｏｌｓｗｅｒｅｅｎｒｏｌｌｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ．ＴｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＩＣＯＳｈｉｇｈＰＤ－１ｈｉｇｈ

Ｔ

（ｃＴｆｈ）ｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＣＯＳＬｏｎＣＤ１９＋

Ｂｃｅｌｌｓｉｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｏｆｔｈｅｐａｔｉｅｎｔｓａｎｄｈｅａｌｔｈｙｓｕｂｊｅｃｔｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＢｃｌ－６，ｃ－Ｍａｆ，ＩＬ－２１ａｎｄＩＣＯＳＬａｔｍＲＮＡｌｅｖｅｌｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ．ＴｈｅｐｌａｓｍａｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＩＬ－２，ＩＬ－６ａｎｄＩＬ－２１ｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＥＬＩＳＡ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　（１）Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｈｅａｌｔｈｙｃｏｎｔｒｏｌｓ，ｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓｏｆｃＴｆｈｃｅｌｌｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉ－ｃａｎｔｌｙｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｐＩＴＰ［（１７．４５±９．０４）％ｖｓ．（７．５７±２．５７）％，Ｐ＜０．０５］，ｂｕｔｄｅｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（ＤＥＸ）ｆｏｒ７ｄａｙｓ［（５．９３±１．６４）％ｖｓ．（１７．４５±９．０４）％，Ｐ＜０．０５］．（２）ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｃｌ－６，ｃ－ＭａｆａｎｄＩＬ－２１ａｔｍＲＮＡｌｅｖｅｌｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｐＩＴＰｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｈｅａｌｔｈｙｃｏｎｔｒｏｌｓ（Ｐ＜０．０５）．（３）Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｈｅａｌｔｈｙｃｏｎｔｒｏｌｓ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＣＯＳＬａｔｍＲＮＡａｎｄ

ｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓｉｎＣＤ１９＋

Ｂｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｐＩＴＰ（Ｐ＜０．０５），ｗｈｉｃｈｓｈｏｗｅｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｃｈａｎｇｅｓａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＤＥＸ（Ｐ＞０．０５）．（４）ＴｈｅｐｌａｓｍａｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＩＬ－２１ｗａｓｒｅｍａｒｋａｂｌｙｅｌｅｖａｔｅｄｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｐＩＴＰ，ｒｅｇａｒｄｌｅｓｓｏｆＤＥＸｔｒｅａｔｍｅｎｔ（Ｐ＜０．０５）．ＢｕｔｔｈｅｐｌａｓｍａｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＩＬ－２ａｎｄＩＬ－６ｓｈｏｗｅｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｃｈａｎｇｅｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（Ｐ＞０．０５）．Ｃｏｎ－ｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｉｍｍｕｎｅｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａｍｉｇｈｔｂｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｈｙｐｅｒ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＴｆｈｃｅｌｌｓｃａｕｓｅｄｂｙｅｘｃｅｓｓｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＣＯＳＬａｎｄＩＬ－２１．ＴｈｅｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＣＯＳＬａｎｄＩＬ－２１ｍｉｇｈｔｂｅｏｎｅｏｆｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｆａｃｔｏｒｓｒｅｓｕｌｔｉｎｇｉｎｔｈｅｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆｐＩＴＰｉｎｃｈｉｌｄｒｅｎ．

【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】　Ｔｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｈｅｌｐｅｒｃｅｌｌ；Ｂｃｌ－６；ＩＣＯＳＬ；ＩＬ－２１；Ｉｍｍｕｎｅｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａ

免疫性血小板减少性紫癜（ｉｍｍｕｎｅｔｈｒｏｍｂｏｃｙ－ｔｏｐｅｎｉｃｐｕｒｐｕｒａ，ＩＴＰ）是儿童常见的自身免疫性出血性疾病，其病因和发病机制目前尚未完全清楚，体液免疫紊乱、Ｔ细胞亚群功能失调及细胞因子异常分泌等多种免疫功能异常参与其发病。滤泡辅助性Ｔ细胞（Ｔｆｈ）是新定义的一种ＣＤ４＋Ｔ细胞亚群，通过产生ＩＬ－２１辅助Ｂ细胞分化并促进抗体类别转换［１－３］。已报道系统性红斑狼疮（ＳＬＥ）等自身免疫性疾病外周血循环Ｔｆｈ（ｃＴｆｈ）细胞比例增高［４－５］。目前尚无儿童ＩＴＰＴｆｈ细胞改变的系统研究报道，特别是初治后反复发作持续性ＩＴＰ（ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔＩＴＰ，ｐＩＴＰ）患儿，其Ｔｆｈ细胞及调控因子是否参与其发病尚待研究。本研究观察初治后反复发作的ｐＩＴＰ患儿ｃＴｆｈ细胞比例及调控因子变化，进一步探讨儿童ｐＩＴＰ可能的免疫发病机制。

材料和方法

研究对象：ｐＩＴＰ患儿２０例，其中男９例，女１１例，平均年龄６．４岁（２～１２岁），为２０１２年４月至２０１２年１２月在我院住院就医患儿。诊断按２００９年美国血液学会制定标准［６］，ｐＩＴＰ是指确诊３个月至１２个月的ＩＴＰ。本组２０例ｐＩＴＰ患儿均为反复发作次数大于３次但未达慢性标准：其中１３例复发３次，５例复发４次，２例复发５次。本组患儿检测ｃＴｆｈ细胞后平均随访时间６个月（２０１１年６月至２０１２年４月），其中１０例（５０％）患儿又有２～３次复发，４例转变为慢性ＩＴＰ（病程大于１年）。本组研究于发作期及地塞米松（ＤＥＸ）治疗第７天抽血观察相关指标，采血前４周内未使用任何糖皮质激素或细胞毒性药物。同年龄正常对照组２０例，其中男１０例，女１０例，平均年龄５．５岁（２～１２岁），为我院健康体检儿童。上述两组受试者年龄、性别间均无统计学差异。受试者家属对试验均已知情，并经医院学术伦理委员会讨论通过。

ｃＤＮＡ合成：（１）外周血ＣＤ４＋Ｔ细胞和ＣＤ１９＋Ｂ细胞：无菌采取肝素抗凝静脉血２ｍｌ，聚蔗糖（Ｆｉ－ｃｏｌｌ）－泛影葡胺（Ｐ＝１．０７７）密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）。按试剂盒（美国Ｉｎｖｉｔｒｏ－ｇｅｎ公司，１１３．３１）说明，采用免疫磁珠分别分离外周血ＣＤ４＋Ｔ细胞和ＣＤ１９＋Ｂ细胞，锥虫蓝染色判定细胞活力＞９５％，流式细胞术检测细胞纯度＞９７％；（２）总ＲＮＡ提取与定量：分别取已分离外周血ＣＤ４＋Ｔ细胞和ＣＤ１９＋Ｂ细胞，按试剂盒说明书（美国Ｇｅｎｔｒａ公司，００５０Ｃ）步骤分离总ＲＮＡ，紫外分光光度计测定ＲＮＡ含量；（３）ＲＴ－ＰＣＲ：按试剂盒（立陶宛ＭＢＩ公司，Ｋ１６３２＃）说明，经逆转录合成ｃＤＮＡ。取１μｌｃＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ扩增３０～４０个循环，参照ＧｅｎＢａｎｋ中目的基因ｍＲＮＡ序列设计相关引物（引物均由上海基康生物技术有限公司合成）（表１）；（４）ＲＴ－ＰＣＲ产物鉴定：取Ｂｃｌ－６、ｃ－Ｍａｆ、ＩＬ－２１、ＩＣＯＳＬ及β－ａｃｔｉｎ扩增产物１０μｌ在２％琼脂糖凝胶中，９０Ｖ电泳３０ｍｉｎ，回收纯化，并送交上海基康生物技术有限公司测序。测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ中目的基因ｍＲＮＡ序列比较，Ｂｃｌ－６、ｃ－Ｍａｆ、ＩＬ－２１、

ＩＣＯＳＬ扩增产物与ＧｅｎＢａｎｋ中目的基因ｍＲＮＡ序列完全一致。（５）荧光定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ）：采用ＳＹＢＧｒｅｅｎ试剂盒（德国ＱＩＡＧｅｎ公司，２０４１４３），使用罗氏ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ荧光定量ＰＣＲ仪检测，应用ＲｅｌａｔｉｖｅＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｏｆｔｗａｒｅＶｅｒ１．０软件进行分析，结果以待测基因／β－ａｃｔｉｎ的比值表示。具体操作参照试剂说明书。

表１　ｐＩＴＰ患儿表达基因的引物序列（珔ｘ±ｓ）

Ｔａｂｌｅ１．Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ（珔ｘ±ｓ）

组别序列（５′→３′）复性

温度（℃）

产物

长度（ｂｐ）Ｂｃｌ－６正向：ＡＴＧＡＧＧＡＧＴＴ

ＴＣＧＧＧＡＴＧＴＣ５８１７７

反向：ＣＣＴＣＴＴＣＴＧＧ

ＧＡＴＴＧＴＴＴＣＣ

ｃ－Ｍａｆ正向：ＡＣＴＧＧＣＡＡＴＧ

ＡＧＣＡＡＣＴＣＣＧ５８１２１

反向：ＧＣＴＧＡＴＧＡＴＧ

ＣＧＧＴＣＧＧＴＣＴ

ＩＬ－２１正向：ＴＧＴＧＡＡＴＧＡＣＴ

ＴＧＧＴＣＣＣＴＧ５８１１８

反向：ＧＴＴＴＣＣＴＧＴＡＴ

ＴＴＧＣＴＧＡＣＴ

β－ａｃｔｉｎ

正向：ＧＡＧＣＴＡＣＧＡＧＣ

ＴＧＣＣＴＧＡＣＧ５４～６０１２０

反向：ＧＴＡＧＴＴＴＣＧＴＧ

ＧＡＴＧＣＣＡＣＡＧ

流式细胞术检测ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＩＣＯＳｈｉｇｈＰＤ－１ｈｉｇｈＴ细胞（ｃＴｆｈ）亚群及ＣＤ１９＋Ｂ细胞ＩＣＯＳＬ表达：采用全血直接计数法，加入抗人ＣＤ４－ｅＦｌｕｏｒ４５０（美国ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ公司）、ＩＣＯＳ－ＰＥ（美国ｅＢｉｏ－ｓｃｉｅｎｃｅ公司）、ＣＸＣＲ５－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（美国ＲＤ公司）、ＰＤ－１－ＦＩＴＣ（美国ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司）、ＣＤ１９－ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０（美国ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ公司）、ＩＣＯＳＬ－ＰＥ（美国ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司）单克隆抗体染色３０ｍｉｎ。流式细胞仪（美国ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ公司，ＣａｎｔｏⅡ）计数，以光散射与ＣＤ４＋和ＣＸＣＲ５＋组合设门，观察该细胞亚群中ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＩＣＯＳｈｉｇｈＰＤ－１ｈｉｇｈＴ细胞比例，并以此定为ｃＴｆｈ细胞，全部数据经Ｄｉｖａ

Ｖｅｒ６．１．３软件获取分析。

流式细胞术检测血小板相关抗体ＰＡＩｇＡ、ＰＡＩｇＧ、ＰＡＩｇＭ：取清晨空腹ＥＤＴＡ?Ｎａ２抗凝静脉血３ｍｌ分离血小板，调整血小板浓度为２×１０９／Ｌ，经抗人ＣＤ６１－ＰＥ（德国Ｍｉｌｔｅｎｙｉ公司）、抗人ＩｇＭ－ＦＩＴＣ（德国Ｍｉｌｔｅｎｙｉ公司）、抗人ＩｇＧ－ＦＩＴＣ（德国Ｍｉｌｔｅｎｙｉ公司）、抗人ＩｇＡ－ＦＩＴＣ（德国Ｍｉｌｔｅｎｙｉ公司）单克隆抗体染色１５ｍｉｎ。流式细胞仪（美国ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ公司，ＣａｎｔｏＩＩ）计数，全部数据经ＤｉｖａＶｅｒ６．１．３软件获取分析。

酶联免疫吸附（ＥＬＩＳＡ）试验：ｐＩＴＰ患儿及正常健康对照者空腹６ｈ后，取肝素抗凝外周血２ｍｌ，５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，分离上层血浆。采用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ（购自美国Ｂｅｎｄｅｒ公司）检测血浆中ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－２１的浓度，具体操作步骤参见试剂盒说明书。

统计学方法：所有资料处理均用ＳＰＳＳ１３．０软件包进行分析，检测结果以珋ｘ±ｓ表示，经方差齐性Ｆ检验后，采用ｔ检验比较各组间差异（Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义）。相关分析采用Ｐｅａｒｓｏｎ系数ｒ及显著性概率Ｐ值表示。

结果

１．ｐＩＴＰ患儿ｃＴｆｈ细胞比例变化：经流式细胞术观察ｃＴｆｈ细胞变化，结果显示：ｐＩＴＰ患儿ｃＴｆｈ细胞比例与正常对照组相比明显增加［（１７．４５±９．０４）％ｖｓ（７．５７±２．５７）％，Ｐ＜０．０５］，ＤＥＸ治疗后ｃＴｆｈ细胞比例下降，明显低于治疗前［（５．９３±１．６４）％ｖｓ（１７．４５±９．０４）％，Ｐ＜０．０５］，且与正常对照相比无明显差异［（５．９３±１．６４）％ｖｓ（７．５７±２．５７）％，Ｐ＞０．０５］（图１）。比较分析ｃＴｆｈ与患儿血小板计数关系，结果显示：患儿ｃＴｆｈ细胞比例与血小板计数呈负相关（ｒ＝０．７０，Ｐ＜０．０５），进一步探讨ｐＩＴＰ患儿ｃＴｆｈ细胞比例与血小板相关抗体ＰＡＩｇＧ、ＰＡＩｇＡ、ＰＡＩｇＭ的关系，结果显示：ｃＴｆｈ与ＰＡＩｇＧ呈正相关（ｒ＝０．６０，Ｐ＜０．０５），与ＰＡＩｇＭ、ＰＡＩｇＡ无明显相关性（Ｐ＞０．０５）（图２）。

２．Ｔｆｈ细胞调控因子表达失衡：采用ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ检测ｐＩＴＰ患儿ＣＤ４＋Ｔ细胞Ｂｃｌ－６、ｃ－Ｍａｆ基因表达水平，结果显示：患儿Ｔｆｈ细胞转录因子Ｂｃｌ－６及调节因子ｃ－Ｍａｆ过表达［Ｂｃｌ－６：（３．３８±１．２６）ｖｓ（１．１５±０．３２），Ｐ＜０．０５；ｃ－Ｍａｆ：（３．９０±１．５７）ｖｓ（１．８６±０．６４），Ｐ＜０．０５］。ＤＥＸ治疗后，Ｂｃｌ－６及１．２６），Ｐ＜０．０５；ｃ－Ｍａｆ：（２．７２±１．００）ｖｓ（３．９０±１．５７），Ｐ＜０．０５］，且治疗后Ｂｃｌ－６、ｃ－Ｍａｆ分别与对照组相比均无明显差异［Ｂｃｌ－６：（２．１０±０．７８）ｖｓ（１．１５±０．３２），Ｐ＞０．０５；ｃ－Ｍａｆ：（２．７２±１．００）ｖｓ（１．８６±０．６４），Ｐ＞０．０５］（图

３）。

图２　ｐＩＴＰ患儿ｃＴｆｈ细胞比例与血小板计数及血小板抗体ＰＡＩｇＧ相关关系

Ｆｉｇ２．ＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆｃＴｆｈａｎｄｐｌａｔｅｌｅｔｓｃｏｕｎｔｓｏｒＰＡＩｇＧｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈ

ｐＩＴＰ

图３　ｐＩＴＰ患儿外周血ＣＤ４＋Ｔ细胞Ｂｃｌ－６、ｃ－ＭａｆｍＲＮＡ表达变化

Ｆｉｇ３．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＢｃｌ－６ａｎｄｃ－ＭａｆａｔｍＲＮＡｌｅｖｅｌｉｎＣＤ４＋ＴｃｅｌｌｓｆｒｏｍｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｐＩＴＰａｎｄｈｅａｌｔｈｙｃｏｎｔｒｏｌｓ

注：Ａ：ｃＴｆｈ细胞流式示意图；Ｂ：正常组、治疗前、治疗后ｃＴｆｈ细胞比例变化

图１　ｐＩＴＰ患儿ｃＴｆｈ细胞比例变化

Ｆｉｇ１．ＴｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＩＣＯＳｈｉｇｈＰＤ－１ｈｉｇｈＴｃｅｌｌｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｐＩＴＰ

３．ＣＤ１９＋Ｂ细胞ＩＣＯＳＬ表达改变：经流式细胞术观察ＣＤ１９＋Ｂ细胞ＩＣＯＳＬ表达情况，结果显示：ｐＩＴＰ患儿ＣＤ１９＋Ｂ细胞ＩＣＯＳＬ表达明显增高［（４３．０５±１６．２３）％ｖｓ（２３．０７±６．４３）％，Ｐ＜０．０５］，ＤＥＸ治疗７ｄ后ＣＤ１９＋Ｂ细胞ＩＣＯＳＬ表达与治疗前相比无明显改变［（４２．０３±１８．８１）％ｖｓ（４３．０５±１６．２３）％，Ｐ＞０．０５］，治疗后仍明显高于正常对照组［（４２．０３±１８．８１）％ｖｓ（２３．０７±６．４３）％，Ｐ＜０．０５］（图４Ａ、Ｂ）。通过ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ检测ＣＤ１９＋Ｂ细胞ＩＣＯＳＬｍＲＮＡ表达变化，结果显示：ｐＩＴＰ患儿ＣＤ１９＋Ｂ细胞ＩＣＯＳＬ基因表达明显增加［（１２．０６±４．５５）ｖｓ（４．１６±２．２０），Ｐ＜０．０５］，治疗后与治疗前相比改变无统计学差异［（８．８１±３．５１）ｖｓ（１２．０６±４．５５），Ｐ＞０．０５］，治疗后仍显著高于对照组［（８．８１±３．５１）ｖｓ（４．１６±２．２０），Ｐ＜０．０５］，进一步证实ｐＩＴＰ患儿Ｂ细胞ＩＣＯＳＬ过表达（图４Ｃ）。

４．ｐＩＴＰ患儿细胞因子血浓度变化：为探讨血浆细胞因子微环境变化对ｃＴｆｈ细胞分化的影响，本组采用ＥＬＩＳＡ检测ｐＩＴＰ患儿ＩＬ－２、ＩＬ－６及ＩＬ－２１血浆浓度，结果显示：治疗前ＩＬ－２１水平明显高于正常对照组（Ｐ＜０．０５），ＤＥＸ治疗后虽呈下降趋势，但仍明显高于对照组（Ｐ＜０．０５）。与对照组或治疗后相比血浆ＩＬ－２、ＩＬ－６水平无明显改变（Ｐ＞０．０５，表２）。

注：Ａ：外周血ＣＤ１９＋Ｂ细胞ＩＣＯＳＬ表达流式检测示意图；Ｂ：治疗前、后ＣＤ１９＋Ｂ细胞ＩＣＯＳＬ表达水平；Ｃ：ＣＤ１９＋Ｂ细胞ＩＣＯＳＬ表达变化图４　ｐＩＴＰ患儿外周血ＣＤ１９＋Ｂ细胞ＩＣＯＳＬ表达

Ｆｉｇ４．ＦＡＣＳａｎａｌｙｓｉｓｏｆＩＣＯＳＬｉｎＢｃｅｌｌｓｆｒｏｍｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｐＩＴＰａｎｄｈｅａｌｔｈｙｃｏｎｔｒｏｌｓ

表２　ｐＩＴＰ患儿血浆细胞因子浓度检测结果（珔ｘ±ｓ）

Ｔａｂｌｅ２．ＲｅｌａｔｉｖｅｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｌｅｖｅｌｓｉｎｐｌａｓｍａｆｒｏｍｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｐＩＴＰ（珔ｘ±ｓ）

组别例数对照组（ｎ＝２０）治疗前（ｎ＝２０）治疗后（ｎ＝２０）ＩＬ－２１２０２８．０１±１２．８１ａ７１．１８±２１．７０ｃｅＩＬ－２２０９１．６７±２８．３８９４．１３±２８．５１ｂ１０６．６３±３３．９０ｄｆＩＬ－６２０７．５０±２．３４７．１４±３．５１ｂ６．１７±２．６６ｄｆ

注：ａ与对照组比较，Ｐ＜０．０５；ｂ与对照组比较，Ｐ＞０．０５；ｃ与对照组和治疗前组比较，Ｐ＜０．０５；ｄ与对照组和治疗前组比较，Ｐ＞０．０５５．ＣＤ４＋Ｔ细胞ＩＬ－２１表达改变：进一步采用ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ检测ＣＤ４＋Ｔ细胞ＩＬ－２１ｍＲＮＡ表达水平，结果显示：ｐＩＴＰ患儿ＣＤ４＋Ｔ细胞ＩＬ－２１ｍＲＮＡ表达明显增高［（３．１０±０．８９）ｖｓ（０．４２±０．１７），Ｐ＜０．０５］，ＤＥＸ治疗后呈下降趋势，但仍明显高于对照组［（１．６３±０．５３）ｖｓ（０．４２±０．１７），Ｐ＜０．０５］。

讨论

Ｔｆｈ细胞是新近报道的一种Ｔ细胞亚群，其表型为ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＩＣＯＳ＋，在生发中心（ＧＣ）通过其表达的ＩＣＯＳｈｉｇｈ和ＣＤ４０Ｌｈｉｇｈ分别与Ｂ细胞上ＣＤ４０和ＩＣＯＳＬ结合，在Ｔｆｈ自分泌或外分泌的ＩＬ－２１共同作用下，促进Ｂ细胞增殖、分化以及免疫球蛋白的类别转换［３，７－８］。研究发现外周血存在ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＩＣＯＳｈｉｇｈＰＤ－１ｈｉｇｈ细胞，被命名为循环Ｔｆｈ（ｃＴｆｈ），推测可能为外周产生的Ｔｆｈ前体细胞，可通过其表达的ＣＸＣＲ５，快速进入滤泡，具有辅助Ｂ细胞产生抗体的潜在功能［４，９－１０］。已有报道证实ＳＬＥ、类风湿性关节炎和干燥综合症患者外周血ｃＴｆｈ比例增高，ｃＴｆｈ比例与自身抗体密切相关［４－５，１１－１２］，表明ｃＴｆｈ细胞异常表达可能参与自身免疫性疾病的发病。

ＩＴＰ是由自身抗体介导的血小板减少综合征，但导致自身抗体产生的机制尚待澄清。研究发现调节性Ｔ细胞（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈ１７细胞、细胞毒性Ｔ细胞（ＣＴＬ）、单核－巨噬细胞（ＭＣ）等多种免疫活性细胞可能参与ＩＴＰ的发病［１－２，１３－１４］，目前尚无儿童ＩＴＰＴｆｈ细胞改变的系统研究报道。本研究观察到ｐＩＴＰ患儿外周血ｃＴｆｈ比例明显增高，ｃＴｆｈ细胞比例与患儿血小板计数、血小板相关抗体ＰＡＩｇＧ密切相关，提示ｐＩＴＰ患儿ｃＴｆｈ细胞异常增加可能与外周血血小板减少和血小板相关抗体的产生有关。此外，本研究观察到ｐＩＴＰ患儿ＣＤ４＋Ｔ细胞Ｂｃｌ－６、ｃ－Ｍａｆ基因表达明显高于正常对照组，ＤＥＸ治疗后Ｂｃｌ－６、ｃ－Ｍａｆ表达明显降低。Ｂｃｌ－６可促进Ｔ细胞表达ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＣＤ４０Ｌ等细胞因子，ｃ－Ｍａｆ诱导ＩＬ－２１和ＣＸＣＲ５表达，ｃ－Ｍａｆ与Ｂｃｌ－６相互协同可共同促进Ｔｆｈ细胞分化［１５］，进一步支持ｃＴｆｈ异常表达可能是导致ＩＴＰ体液免疫功能紊乱的机制之一。

导致ｐＩＴＰ患儿Ｔｆｈ细胞比例异常增加的机制仍有待研究。已知ＩＬ－２１、ＩＬ－６及ＩＬ－２等细胞因子

微环境影响Ｔｆｈ表达，ＩＬ－２１和ＩＬ－６协同作用促进Ｔｆｈ细胞分化，ＩＬ－２则抑制Ｔｆｈ细胞分化［１６－１８］。本研究观察注意到ｐＩＴＰ患儿血清ＩＬ－２１浓度明显升高、ＩＬ－６和ＩＬ－２血浓度与正常对照无显著差异，提示ＩＬ－２１可能是导致ｐＩＴＰ患儿Ｔｆｈ细胞过表达的主导细胞因子之一。研究已证实Ｂ细胞高表达的ＩＣＯＳＬ与Ｔｆｈ细胞上的ＩＣＯＳ结合后可诱导Ｂｃｌ－６表达，促进Ｔｆｈ分化，使Ｔｆｈ产生更多的ＩＬ－２１等细胞因子，增强Ｂ细胞免疫应答［７，１９－２０］。本研究观察发现ｐＩＴＰ患儿ＣＤ１９＋Ｂ细胞高表达ＩＣＯＳＬ基因和蛋白，ＤＥＸ治疗后ｐＩＴＰ患儿ｃＴｆｈ细胞比例虽明显下降、ＣＤ１９＋Ｂ细胞仍持续高表达ＩＣＯＳＬ，ＩＬ－２１血浓度和基因（ＣＤ４＋Ｔ细胞）表达有下降趋势，但仍明显高于对照组。本组病例为多次复发的ｐＩＴＰ患儿，在平均６个月的随访期，５０％的患儿有多次复发或转变为慢性ＩＴＰ，据此我们推测，Ｂ细胞持续高表达ＩＣＯＳＬ和ＩＬ－２１血浓度持续增加可能是ｐＩＴＰ患儿病情反复发作的原因之一。ＤＥＸ治疗虽然可暂时下调ｃＴｆｈ细胞比例，由于Ｂ细胞持续高表达ＩＣＯＳＬ，可不断提供刺激信号给Ｔ细胞，当感染或环境因素发生改变时，在ＩＬ－２１等细胞因子协同下，机体快速诱导Ｔｆｈ细胞过度分化，促进Ｔｆｈ细胞分化和抗血小板抗体产生，导致反复自身免疫应答。临床研究已证实ＩＴＰ患儿ＩＬ－２１血浓度异常增加，抗ＣＤ２０单抗消除Ｂ细胞治疗顽固性ＩＴＰ可获满意疗效［２１－２２］，亦间接支持Ｂ细胞－Ｔｆｈ细胞－ＩＬ－２１反馈环在ＩＴＰ发病中的作用。因此，进一步探讨ｐＩＴＰ患儿Ｂ细胞持续高表达ＩＣＯＳＬ的机制，可望为探索治疗顽固性ＩＴＰ新疗法奠定理论基础。

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（收稿日期：２０１３－０６－２０）