BPG 层析柱标准装柱流程规范

操作标准

目得:为了使BＰG3００层析柱装柱过程可重复,并能够得到较好得柱效,故建立此操作规范。

范围:配合?KTA prｏcｅsｓ系统进行有效得蛋白质纯化操作。

责任人:层析工序操作人员

标准操作程序:

1基本术语概念

填料因子(PackｉｎｇFａｃtor, PＦ):指在在装柱过程中,用低流速(如６0ｃ

m/h)对填料进行沉降压缩得到得调料高度与最后装柱完成时填料高度(柱高)得

比值,

GＥHC生产得各种常见填料得PF参见《GEＨC ＡxiＣhroｍ300－10０0columns UseｒＭanuａl 28-95６２—89 Ｅｄiｔiｏn AＡ》;

线性流速(liｎeａr flow ratｅ):单位时间内液体流经得直线距离,常用cm／h

表示;

体积流速(volume floｗratｅ):单位时间内液体流经得空间容积,常用ml/mｉ

ｎ表示;

换算:

２准备工作

2.１检查层析柱得完整性,所带配件,就是否水平(用水平仪矫正),就是否清洁(如有污染应进行清洗)、

2、２确定所用填料及其特性、浓度等

以DＥAE ＳｅpｈaroｓｅFast Flｏw填料为例,其填料因子(PF)为1.１５,新填

料(slｕｒｒy)浓度为75％(保存于2０%乙醇中),耐压3bａｒ。

2。3 确定放大后得工艺参数

以ＸX生化制药股份有限公司得放大工艺为例,

中试工艺参数:

柱高h＝10ｃm;体积流速v1=3mｌ/min;柱内径d=１、６cm、

即,线性流速v ２=v1/s 柱=3/(3、14×0。82) cm/mi ｎ=1.５ cm ／min;

样品与填料接触时间t ＝h ／v2=１０/1、5min ＝6。67mi ｎ;

在工艺得线性放大中h 、ｖ2与t 均不变,则可保证样品出峰得位置(洗脱时间)与形状不变、

使用ＢP Ｇ３００层析柱进行放大得工艺参数:

装柱体积V 柱= S 柱h=3。1４×1、52×１L=7Ｌ;

装柱需要sl ｕr ｒｙ体积V ｓｌurry =Ｖ柱×PF/C sl ｕr ｒy

以ＤE ＡE Sepharo ｓe Fast F ｌow 为填料,

则,V slur ｒｙ＝7×1。15/0、７５Ｌ＝10。7３L;

装入柱中得slur ｒy 高度Ｌsl ｕr ｒｙ=V slurry /S 柱＝１0、73/(3。1４×1。52)dm=1.５2

ｄm=15。2cm 。

３管路安装

３、１ 层析柱管道与配件安装

３。1、1卸下柱子顶部与底部得盲堵垫圈,旋松密封调节器,用纯水或2０%乙醇充分浸润柱内壁与柱头O 型圈;

３.1。2 用扳手对称卸下支持杆连接到法兰得螺丝,并通过旋转高度调节手柄将柱头旋至最高处,在柱头顶部依次安装压力表与四路二通阀,在柱底安装四路二通阀;

3。1、３在顶部四路二通阀上横向连接一根细管,另一端连至?ＫＴA pro ｃe ｓs 上端连接口C ＯLUMN TOP,同时从柱底四路二通阀横向接出一根细管至?ＫTA pr ｏｃe ｓs 得下端连接口CO ＬU ＭＮ ＢＯTT ＯM 、

图1、ＢP Ｇ３０0层析柱安装示意图

３。2层析柱下端筛网排气泡

3.2.１连接两根足够长得细管到?K ＴA ｐr ｏcess 进样泵得A1与Ｂ1进口,两管另一端均放入纯水中;

3。2、2从A1泵入纯水:打开UNI ＣORN 软件,在ｓys ｔｅm co ｎtrol 窗口点击man ｕal →va ｌves →ＩnletA,选择inletA1,ins ｅｒｔ;I ｎletB,选择clos ｅd,i ｎ

sert;Column,选择uｐflｏｗ,iｎｓeｒt;Ｐump→Ｆloｗ,设定流速60L/h,点击ｅx ｅcｕte运行程序充水至BPG柱中2-3cm左右,ｐause,清除下端筛网中得空气,用注射器吸出筛网中残留得气泡。

4装填料

4、1准备填料

所用填料为DＥＡＥ Sephaｒose Fast Ｆｌow ,装置得就是保存于２０％乙醇中得新slurry;

４、2卸下柱头,用搅拌棍引流加入混匀得sｌurｒy至15、2cｍ处,再加入纯水至40cm左右,充分搅拌混匀,同时避免挤压筛网与柱壁,静置使填料界面至少低于38ｃm;

4、3在system control窗口点击manual→vａlvｅs→InlｅtA,选择iｎlｅｔＡ1,i ｎsｅrｔ;ＩnlｅｔＢ,选择ｃlosｅｄ,iｎｓert;Ｃoｌumn,选择dｏwｎflow,insert;Pump→Flow,设定流速60L／h,点击exeｃute运行程序将柱头上端筛网充满水以除去气泡,再装上柱头,用密封调节器固定柱头,拧紧螺丝;

４、4在sｙｓtem cｏntrol窗口点击manｕａl→Pumｐ→Flow,设定流速为4２L/ｈ(6０cm/h),进行填料得沉降,待填料高度降至14cm左右,将密封调节器旋至全松,将柱头快速调至距离填料3—4cｍ处,将密封调节器旋至半松,将柱头快速调至滤网距离填料1-2ｃm,旋紧密封调节器,再设定高流速(如１50Ｌ／ｈ),继续压缩填料,最后再调节柱头至１0cｍ、整个过程一直有流速,泵速不能停。

5 柱效测定

图2、柱效测定示意图

5.１平衡

将Ａ1接口细管放入0。4M NａＣl溶液中,将柱顶端四路二通阀调至管路与大气相连状态,在ｓystem ｃｏntｒｏl窗口点击mａnual→valves→InletA,选择inletＡ１,ｉnｓerｔ;InｌetB,选择clｏseｄ,insｅrt;Colｕmn,选择dowｎflow,ｉns ｅｒt;Pumｐ→Floｗ,再设定高流速(如１５0L/h),点击ｅｘｅcute运行,排气泡,再将阀调至管路与柱头相连状态,平衡3—5个柱体积至电导曲线稳定,点击ＥND;

5。2上样

5、２、1将B1接口细管放入2M NaCl溶液,柱顶端四路二通阀调至管路与大气相连状态,在sｙsｔem contrｏl窗口点击manuaｌ→valｖes→InlｅtＡ,选择Ｃloseｄ,inserｔ;InｌｅｔB,选择InｌeｔB1,ｉnsｅrt;Cｏｌｕｍn,选择dowｎflｏｗ,insｅrt;Pｕmp→Fｌｏw,设定高流速(150L/h)点击ｅxｅcute运行,排气泡,pause;

5、２。２在syｓtem contrｏｌ窗口点击manual→Ｏtｈer→End_Ｔimer,选择Ａcc、 Volumn, Timeout 设上样量为70mL(1％柱体积);Ｐump→Ｆlow,设定上样流速60Ｌ／h,点击ｅxecｕte得同时将柱顶端四路二通阀调至管路与柱头相连,完成上样;

5。3 洗脱

5.3。1将柱顶端四路二通阀调至管路与大气相连状态,在systeｍcontrol窗口点击ｍanual→ｖａlｖes→InｌetA,选择ｉnletA1,inserｔ;InｌetB,选择cｌosed,ｉnｓert;Ｃｏlumn,选择downfｌow,insｅrt;Pｕｍｐ→Fｌow,设定高流速(150L／h)点击ｅxeｃｕte运行,排气泡,同时将管路充满0。4M ＮaCｌ溶液,调流速至２1L/h(30ｃm/h);

５.3、2 待流速稳定后,在ｓystem control窗口点击mａnual→ｖalvｅs→Ｉnjectｉon Mark,ｉｎsｅrt,点击exeｃute得同时将柱顶端四路二通阀调至管路与柱头相连,开始洗脱,在一个柱体积左右,电导检测下将产生目得峰。

5.４测柱效

在Evaluａｔion窗口中,选择实验保存得结果,在结果图中点击鼠标右键,选择Prｏｐerties,点击Clear,并选中Cond_102,点击OK。回到Evaｌuaｔion窗口,选择积分按钮,在弹出窗口中,选择Cond_１０2,peａk wiｎｄow中调整积分得范围,并在Rｅｊｅct Peaks中,填Peａk ｍusｔ be one of1lａｒgｅst;确定后,在积分结果窗口,点击右键,选择Ｐroperｔies,在pｅaｋtable选项中,勾选Plａte Heｉght(HＥTP)与Aｓymｍetry。确定后即可计算得到计算理论塔板高度HE ＴP与对称因子Ａs。

1 Whｅn calcｕlaｔing the amounｔof ｍｅdia ｔo be paｃkeｄ usｅthe p ｒessｉoｎＦａctor 1。1 iｎsｔead of the Pacｋiｎg Factｏｒ above whicｈｉs useｄ durinｇｐacｋing。

柱效

液相色谱柱柱效的提高和测算 液相色谱柱柱效的提高和测算 摘要本文通过对如何提高液相色谱柱柱效的阐述,介绍了几种国际上流行的测量和计算柱效值的方法。 关键词液相色谱柱谱峰扩宽柱效值理论塔板数 一、提高液相色谱柱柱效的方法 我们知道色谱峰的扩宽与移动相在热力学的分配过程、移动相和固定相中传质阻力所引起的不平衡有关,谱峰扩宽(非平衡)的程度是流速对传质速率的直接函数。要提高液相色谱的效率可从以下几方面入手。 (1)降低移动相的流速,但会使分析时间延长。 (2)减少固定相的量,但色谱柱中样品的负载量也随之减小。 (3)减小固定相的颗粒度,但不能过分,过分后色谱柱的渗透率也会减小。 (4)选用低粘度的移动相,以利于快速传质,但却不利于多组份分析。 (5)适当提高柱温,可降低移动相的粘度,但柱效和分离度也随之降低。 (6)尽量减小停滞移动相的体积,但却加快了移动相的流速。 从以上介绍可看出,在色谱分析过程中,各种因素是互相联系和制约的。只有通过对柱效值的跟踪测算,对自己分析方法不断的研究和实践,才能找到最佳的工作条件。 二、对柱效值进行跟踪测算应注意的问题 我们也应记住柱效值即塔板数只表示该色谱柱装填的好坏,只用柱效值并不足以预测在所有条件下的柱性能,因为在这些条件下,柱性能主要表示动力学过程对色谱柱谱带加宽的量。其他一些影响峰宽的因素,如柱外效应和热力学因素(通常表现为峰拖尾),在理想情况下对于确定柱效值并不起重要作用。因为任何一个柱性能的定义都必然与用此色谱柱所做的分离相联系,所以依据一个单独的数字来评定柱性能是不切实际的。对大多数色谱工作者来说,柱性能指的是色谱柱用于特定分离的能力,而仅仅有高柱效并不能保证这种分离能力。 不管用什么特定的测试方法,都会有几个参数影响柱效的测定。这些参数包括:洗脱液的成分和粘度及其线流速,测定塔板数所用的溶质,温度,柱长,填料装填方式,颗粒度,还有所选用的测量和计算方法。尽管大多数柱效测算没有设法消除液相色谱仪器系统各部件对表观峰宽的影响,但只要仪器是正常使用的,这些影响是次要的。而测量和计算方法对柱效值的确定起着极大的作用。 三、几种测量和计算柱效值的方法 因为色谱峰是假定样品浓度在移动相和固定相中呈正态分布而得到的样品谱带分布,故常常把色谱峰型看作正态曲线来计算理论塔板数。因此计算柱效(以理论塔板数n为单位)的公式习惯上定义为: 式中tR为色谱峰的保留时间; σ2是以时间为单位测量色谱峰的偏差;a是和峰高(从测峰宽的基线量起)有关的常数, ωb是峰宽,表示由色谱峰顶点与色谱峰两侧拐点处做切线与峰底基线相交两点间的距离。图1所示为正态峰轮廓所测量峰宽处的峰高与7种可能的测定n的方法所对应的常数a值之间的关系。

层析柱装柱流程

层析柱装柱流程标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]

层析柱装柱流程 装柱材料 层析柱：BXK层析柱装柱仪器：?KTA 装柱器 装柱溶液 20%乙醇 匀浆的准备 精确计算所需介质的量（这对固定柱高的层析柱尤其重要）。1L填充柱所需的介质量大约是1.15L自然沉淀匀浆的量，于干净烧杯中，取 100%沉降胶（静止放置一天以上，倾去20%乙醇后的胶为100%沉降胶）与等体积20%乙醇混合备用。 安装层析柱 1.?检测层析柱的各个部件，确保干净、完整，拧上下端堵头，拧紧膨胀圈，然后 将层析柱垂直固定在铁架台上。 2.?将装柱器安装在层析柱上端。 3.?往层析柱中加入适量的20%乙醇，打开下端口，重力流，排除下筛网中滞留的气 泡，在液面低至1-2cm高度时关闭层析柱下端出口。 装柱 1.?用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将摇匀的介质加入到层析柱中，这可以减少气泡 的产生。迅速用20%乙醇填满柱子和装柱器，装上装柱器盖子，连接到?KTA 上。 2.?打开层析柱下端，开始以30cm/h流速装柱，直至柱床界面平稳。停止装柱。 3.?打开装柱器盖子，用虹吸法去除界面上端的液体，去掉装柱器，然后小心的用 20%乙醇封满柱子剩余部分。 4.?将上端转接头一端连上?KTA，打开机器，以装柱流速用装柱液排出转接头管路 中及筛板中残留的气泡，然后将转接头另一端装到层析柱上，使转接头下端刚好接触胶界面。(装柱流速约为70-100%的最大流速） 5.?拧紧膨胀圈，继续用装柱流速压柱，至少保持3个柱体积，以界面不变为主， 在界面处做上记号。

6.?关闭泵，并关闭柱子下端出口，使层析柱上端和泵断开（转接器上接口是打开 的），略拧松膨胀圈，缓慢向下转动调节杆，到记号处停止，然后再拧紧膨胀圈，关闭上接口。 7. 检测柱效

柱层析与TLC

柱层析与TLC 柱层析关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当。而淋洗剂的选择则是通过TLC 确定。这里要指出的一点是：TLC的作用除了跟踪反应进程，检测试剂和原料纯度外，一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。 首先谈柱层析： 装柱子（添硅胶）时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm 左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。 湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂“走柱子”，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。 干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂“走柱子”，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于“走柱子”时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。 解决的办法是：第一、硅胶一定要天结实；第二、一定要用较多的溶剂“走柱子”，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。 也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。 上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量芗洗涤后，再加入。湿法较方便，熟手一般采用此法。 上样完毕后，接着即用淋洗剂淋洗。淋洗剂一般采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。由于层析柱和薄板的不同，即使两者使用的硅胶都相同，但是在把TLC

层析柱使用方法

层析柱使用方法 层析柱使用方法柱层析和TLC是有机化学工作者必须下苦功夫的两项实验技术。这两项技术掌握与否，对于提高实验的效率至关重要。常见的例子是：在柱层析时，由于层析柱中的硅胶填料装得不均匀（没有填严实），使得柱子在淋洗过程中就因为出现太多气泡变花，导致分离效果不好。更常见的例子是：层析柱虽然装得不错，但是由于淋洗剂选择不恰当，结果导致几十毫克产品，用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离。分离同样的东西，熟手可能只需要半个小时，而一个层析技术不过关的人可能半天都不能得到纯品。由此可见，这两项技术掌握与否，对于提高工作效率，减轻工作量，减少有机溶剂的使用，从而对身心健康和环境保护都有明显的作用。柱层析关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当。而淋洗剂的选择则是通过TLC确定。这里要指出的一点是：TLC的作用除了跟踪反应进程，检测试剂和原料纯度外，一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。 首先谈柱层析： 1：装柱子（添硅胶）时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。 湿法装柱：是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂“走柱子”，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。 干法装柱：则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂“走柱子”，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于“走柱子”时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是，一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了。解决的办法是：第一、硅胶一定要天结实；第二、一定要用较多的溶剂“走柱子”，一定要到柱子的下端不再发烫，恢复到室温后再撤去压力。也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂，防止添加溶剂的时候，使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要。 2：上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量溶剂洗涤后，再加入。湿法较方便，熟手一般采用此法。上样完毕后，接着即用淋洗剂淋洗。淋洗剂一般采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。由于层析柱和薄板的不同，即使两者使用的硅胶都相同，但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释一倍，但又不能稀释太多，否则成了靠扩散作用来分离，效果也不会好。 谈TLC，需要切记的是： 第一、某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时，多尝试几种比例不同，成分不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开，极性太大，也分不开.一般以目标产物的Rf值在0.3左右为最佳。 第二、点不能点得太浓,否则容易重叠,不易判断,因为如果两个点相近的话,一浓就变成一个点第三、板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关，只有两者比较合适了，才能有一个交好的分离效果。 选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油迷

柱层析分离的实验方法和技巧

柱层析分离的实验方法和技巧 常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。 一：柱子可以分为：加压，常压，减压 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。 加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 二：关于柱子的尺寸 应该是粗长的最好。柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。 现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm ×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。

高效液相色谱柱柱效测定及分离条件考察

高效液相色谱柱柱效测定及分离条件考察 一、实验目的 1．了解高效液相色谱仪的基本结构和工作原理 2．学习高效液相色谱仪的使用 3．学习、掌握液相色谱柱柱效测定方法 4．考察流动相配比对分离情况的影响 二、基本原理 高效液相色谱法是以液体作为流动相的一种色谱分析法，它亦是根据不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的差异来对混合物进行分离的。气相色谱中评价色谱柱柱效的方法及计算理论塔板数的公式同样适合于高效液相色谱，即： 2 22/11654.5??? ??=???? ??=Y t Y t n R R 式中：t R 为组分的保留时间 Y 1/2为色谱峰的半峰宽度 Y 为色谱峰的峰底宽度 影响高效液相色谱分离的因素很多，其中，流动相的种类及配比是最重要的参数。 三、仪器和试剂 1．仪器：Agilent 1200 高效液相色谱仪（紫外检测器） 2．50μL 微量进样器 3．试剂：苯、萘、联苯、甲醇均为分析纯；纯水为重蒸的去离子水。 配制成含苯、萘、联苯各30μL/ml 的甲醇溶液。 四、实验条件 1．色谱柱 长15cm ，内径 4.6mm ，装填5μm 的C-18烷基键合固定相 2．流动相 组成1：甲醇:水（95:5）；组成2：甲醇:水（85:15）；流量均为0.8ml/min 3．紫外光度检测器 波长254nm 4．进样量 5μL 五、实验步骤 1．设定流动相为“组成1”的比例，按照标准操作步骤将仪器调节至进样状态，待仪器流路及电路系统达到平衡，且色谱基线达到平直时，开始进样。 2．吸取5μL 苯、萘、联苯的甲醇溶液进样，在此条件下用色谱工作站记录色谱数据。 3．改变流动相比例至“组成2”，待平衡后重复步骤2操作。 4．用色谱工作站之“数据处理”系统处理数据文件并记录所需数据。 六、数据记录及处理 1．记录实验条件。 （1）色谱柱与固定相 （2）流动相及其流量、柱前压 （3）检测器波长 （4）进样量 2．分别记录三个组分色谱峰的保留时间t R 和相应色谱峰的半峰宽Y 1/2。 3．分别计算苯、萘、联苯在两种流动相组成条件下的理论塔板数n ，并比较流动相组成改变前后色谱分离的差异。 七、思考题 1．由本实验计算出的各组分理论塔板数说明什么问题？ 2．紫外光度检测器是否适用于检测所有有机化合物，为什么？ 3. 试分析流动相条件改变后保留时间及分离度的差异，并阐明原因。

硅胶层析柱的填装方法

硅胶层析柱的填装方法 硅胶层析柱所用的硅胶是试剂级，100-200目，在实验前将10g左右的硅胶放在托盘中，130℃真空干燥箱内活化16h，活化后放在干燥器中冷却，待用。 将无水硫酸钠盛装在托盘中，在450℃马弗炉中活化2h，后取出放在干燥器中冷却，待用。 一、装柱过程： 1、取40ml烧杯4个，100ml量筒2个（分别倒取二氯甲烷100ml，正己烷90ml），40cm玻璃棒1个，250ml烧杯1个（盛装废液用），铁架台1个，层析柱1个（长350mm，内径20mm），不锈钢铁勺1个，20ml注射器（带针头）2个（以上仪器均干净）。 2、拌硅胶。将活化过的硅胶倒入40ml烧杯中，用另一个20ml烧杯盛取二氯甲烷并缓慢倒入硅胶中，同时用玻璃棒不断搅拌，赶走硅胶中的气泡。 3、倒硅胶。用少量二氯甲烷淋洗层析柱，玻璃棒引流；之后将上述拌好的硅胶沿着玻璃棒倒入层析柱，倒完后缓慢抽出玻璃棒。 4、敲柱子。用橡皮管敲击柱子，赶走层析柱硅胶中的气泡，然后打开活塞，流出洗脱液，让硅胶自然沉降；在此期间，用不锈钢小勺舀取一勺无水硫酸钠，倒入层析柱中；等到柱子快干是关闭活塞（二氯甲烷的液面在无水硫酸钠的表面以上）。 5、走柱子。柱子装好后用20ml二氯甲烷冲洗层析柱2次，注意用玻璃棒引流，缓慢倒下二氯甲烷，并打开活塞，使洗脱液缓慢流下，确保液面保持在硫酸钠表面以上，不能流干；再用40ml正己烷冲洗层析柱，待液面在硫酸钠以上些许时关闭活塞。 6、层析柱至此装好，待用。 二、样品走柱子过程： 1、将样品液转移到装好的层析柱中后，用1-2ml正己烷清洗鸡心瓶，并转移到层析柱内，流出液弃去。 2、用25ml正己烷洗脱层析柱，弃去流出液，关闭活塞。 3、将盛装废液的烧杯移去，将K-D浓缩瓶接在层析柱下，再用30ml二氯甲烷/正己烷淋洗液（体积比2:3）洗脱层析柱，以2-5ml/min流速接收流出液于K-D 浓缩瓶中。 仪器名称规格数量 烧杯40ml 4个250ml 1个 量筒100ml 2个玻璃棒40cm 1个铁架台1个层析柱350mm×20mm 1个不锈钢小勺1个注射器20ml 2个

硅胶柱层析的操作方法

硅胶柱层析 一、硅胶柱层析的原理 利用吸附原理，即利用硅胶对中药混合物中各种成分吸附能力的差异，而使混合物中各成分得以分离的色谱方法。 二、硅胶柱层析的操作方法及注意事项 1、装柱 操作要点：装柱前柱底要垫一层脱脂棉以防吸附剂外漏。有干法装柱和湿法装柱两种方法 （1）干法装柱：将硅胶通过漏斗装入柱内，中间不应间断，形成一细流慢慢加入管内。也可用橡皮槌轻轻敲打柱硅胶柱使硅胶装填连续均匀、紧密。柱装好后，打开下端活塞，然后倒入洗脱剂洗脱以排尽柱内空气，并保持一定液面。（2）湿法装柱：将最初准备使用的洗脱剂装入柱内，打开下端活塞，使洗脱剂缓慢流出。然后把硅胶慢慢连续不断地倒入柱内（或将硅胶与适量洗脱剂调成混悬液慢慢加入柱内，），硅胶依靠重力和洗脱剂的带动，在柱内自由沉降，此间要不断把流出的洗脱剂加回柱内保持一定的液面，直至把硅胶加完并在柱内沉降不再变动为止。然后在硅胶上面加一小片滤纸或少许脱脂棉。根据加样量控制洗脱剂液面至一定高度。 匀浆法：搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过

柱。 2、上样 将欲分离的样品溶于少量装柱时用的洗脱剂中，制成体积小、浓度高的样品溶液，加入层析柱中硅胶面上。如样品不溶于装柱时用的洗脱剂，则将样品溶于易挥发的溶剂中，并加入适量硅胶（不超过柱中硅胶全量的1/10）与其拌匀，除尽溶剂，将拌有样品的硅胶均匀加到柱顶（始终保持洗脱剂有一定的液面），再覆盖一层硅胶即可。上样时注意沿着柱内壁慢慢加入，始终保持硅胶上端表面平整；上样量为硅胶的1/60~1/30。 3、洗脱 洗脱剂的选用可通过薄层色谱筛选，一般TLC展开时Rf 值为0.2~0.3的溶剂系统是最佳的洗脱系统，采用梯度洗脱法洗脱。先打开柱下端活塞，保持洗脱剂流速1~2滴/秒。上端不断添加洗脱剂（可用分液漏斗控制添加速度与下端流出速度相近）。如单一溶剂洗脱效果不好，可用混合溶剂洗（一般不超过三种溶剂），通常采用梯度洗脱。洗脱剂的洗脱能力由弱到强逐步递增。 4、收集处理 等份收集洗脱液，每份收集量大概与所用硅胶的量相当。每份洗脱液采用薄层定性检查，合并含相同成分的洗脱液。经浓缩、重结晶处理往往可得到某一单体成分。如仍为几个单体成分的混合物，不易析出单体成分的结晶。则需要进一步层析或用其他方法分离。 注：(1)柱色谱分离能力比薄层分离能力强，效果更好，尤其对结构相似、性质接近、采用薄层难以分离的成分分离效果好。 (2) 洗柱子能不用含水的混合溶剂，就尽量不要用。

柱层析的一些心得

常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分离的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。 １．吸附剂 常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等：吸附剂一般要经过纯化和活性处理，颗粒大小应当均匀。对吸附剂来说粒子小、表面积大，吸附能力就高，但是颗粒小时，溶剂的流速就太慢，因此应根据实际分离需要而定。供柱色谱使用的氧化铝有酸性、中性和碱性3种。酸性氧化铝是用1％盐酸浸泡后，用蒸馏水洗至氧化铝的悬浮液pH为4，用于分离酸性物质；中性氧化铝的pH约为7．5，用于分离中性物质；碱性氧化铝的pH约为10，用于胺或其它碱性化合物的分离。 因硅胶略带酸性，只能用于对酸不敏感的化合物的分离。常用300-400目的柱硅胶或H 硅胶。若化合物的R f值相差较大，则可考虑使用２00-３00目硅胶以加快层析速度。 另：因吸附剂的比表面较大，天气潮湿时或长期放置中吸附的水分会对分离效果产生极大的影响（相当于大大增加了固定相的极性导致样品分不开），因此应将吸附剂放入９０～１００度烘箱内烘２小时后，取出在干燥器中冷却后再使用。使用的硅胶，不用时一定要密封，防止吸潮。TLC所用的硅胶板一定要保存在干燥器里面，或使用前在红外烘箱里干燥一段时间。 2．溶质的结构与吸附能力的关系 化合物的吸附性与它们的极性成正比，化合物分子中含有极性较大的基团时，吸附性也较强，氧化铝对各种化合物的吸附性按以下次序递减： 酸和碱>醇、胺、硫醇>酯、醛、酮>芳香族化合物>卤代物、醚>烯>饱和烃 ３．柱子可以分为：加压，常压，减压。 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。 加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球是常用的手动加压的方法。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 体会：过柱时是否加压要具体分析，通常情况下直径比较粗的柱子用常压即可，因其横截面积的缘故淋洗剂的流速已足够快。通常控制柱子下端液体流速大约在0.5~1滴每秒的范围比较合适。 减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。一般不推荐使用。 ４．柱子的尺寸 从理论上讲应该是粗长的好。柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了。

柱层析知识总结

柱层析知识总结 柱层析 利用层析柱将混合物各组分分离开来的操作过程称为柱层析。柱层析是层析技术中的一类，依据其作用原理又可分为吸附柱层析、分配柱层和离子交换柱层析等。其中以吸附柱层析应用最广。以下只介绍吸附柱层析的相关问题，其操作方法也可作为其他类型柱层析的参考。 1.吸附柱层析的器材 (1)层析柱 实验室中所用的玻璃层析柱有两种形式：一是下部带有活塞的玻璃管，活塞的芯最好是聚四氟乙烯制作的，这样可以不涂真空油脂，以免污染产品。如果使用普通的玻璃活塞，则真空油脂要小心地涂薄涂匀。另一种是将玻璃管下端拉细，套上一段弹性良好的管子。这段管子必须是不能被淋洗剂溶解的，普通橡皮管一般不可充作此用，因为橡皮易被氯仿、苯、THF等溶剂溶胀，而聚乙烯管子对大多数溶剂是惰性的，所以常常使用。用一只螺旋夹控制流速，此外，薄膜塑料柱因使用方便、节省淋洗剂、减少蒸发量等优点，应用日趋广泛。薄膜塑料柱总是以扁平成卷保存的，两侧常有很深的折痕。使用前需将裁取的一段薄膜管一端扎紧，另一端套在一段玻璃管上并用棉线扎紧。将这段玻璃管穿过一个单孔塞。然后将薄膜管放进一根又粗又长，下端拉细了的玻璃管内，使塞子塞紧大玻璃管的口。用水泵自大玻璃管下端抽气，薄膜柱即因内部压强大于外部而自行展圆。待装入吸附剂后在其下部扎几个小孔即可使用。 层析柱的尺寸根据被分离物的量来确定，其直径与高度之比则根据被分离混合物的分离难易而定，一般在1∶8到1∶50之间。柱身细长，分离效果好，但可分离的量小，且分离所需时间长；柱身短粗，分离效果较差，但一次可以分离较多的样品，且所需时间短。如果待分离物各组分较难分离，宜选用细长的柱子，如果要处理大量的较易分离的或对分离纯度要求较低的混合物，则可选用粗而短的柱子。最常使用的层析柱，直径与长度之比在1∶8 到1∶15 之间。 (2)吸附剂 柱层析中最常使用的吸附剂是氧化铝或硅胶。其用量为被分离样品的30～50倍，对于难以分离的混合物，吸附剂的用量可达100倍或更高。对于吸附剂应综合考虑其种类、酸碱性、粒度及活性等因素，最后用实验方法选择和确定。 市售氧化铝有酸性、碱性和中性之分。酸性氧化铝是用1%盐酸浸泡后，用蒸馏水洗到其浸出液的pH值为4，适用于分离酸性物质；碱性氧化铝浸出液的pH值为9～10，用以分离胺类、生物碱及其他有机碱性化合物。中性氧化铝的相应pH值为7.5，适合于醛、酮、醌、酯等类化合物的分离以及对酸、碱敏感的其他类型化合物的分离。硅胶没有酸碱性之分，可适用于各类有机物的分离。 柱层析所用氧化铝的粒度一般为100～150目，硅胶为60～100目，如果颗粒太小，淋洗剂在其中流动太慢，甚至流不出来。 氧化铝和硅胶的活性各分五个等级。哪个活性级别分离效果最好，要用实验方法确定，而不是盲目选择高的活性级别，最常使用的是Ⅱ～Ⅲ级。如果吸附剂活性太低，分离效果不好，可通过“活化”来提高其活性。所谓“活化”就是指用加热的方法除去吸附剂所含的水分，提高其吸附活性的过程。通常是将吸附剂装在瓷盘里放进烘箱中恒温加热。“活化”的温度和时间应根据分离需要而定。氧化铝一般在200℃恒温4h，硅胶在105～110℃恒温0.5～1h。“活化”完毕，切断电源，待温度降至接近室温时，从烘箱中取出放进干燥器中备用。有的样品在活性高的吸附剂中分离效果不好，可将吸附剂放在空气中让其吸收一些水分，分离效果反而好一些。 此外，一些天然产物带有多种官能团，对微弱的酸碱性都很敏感，则可用纤维素、淀粉或糖类作吸附剂。活性碳是

离子交换层析柱的装填及处理

离子交换层析柱的装填及处理 一、原理： 有些高分子物质含有一些可以分离的基因，例如-SO3H，-COOH等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应。如：R-SO3H＋M+ R-S3M＋H+ 或R-NH3OH＋CL－— R-NH3CL＋OH －这类高分子物质通称离子交换剂，其中使用最普遍的是离子交换树脂。由于一定的离子交换剂对不同离子的亲和力不同，因此在洗提过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后得到分离。 二、目的与要求： 本实验是采用Zerolit225型阳离子交换树脂所装的柱，选以特定的PH缓冲洗脱液来分离含有两个性质不同的氨基酸溶液。通过实验要求掌握装柱、上样、洗脱、收集等离子交换柱层析技术的要点。 三、仪器与装置： 玻璃层析柱：长19cm，内径1、2cm，3# 砂芯。H L-2型恒流泵。H D-4型电脑核酸蛋白检测仪。B S-100A自动部份收集器。 250ml烧杯。 1ml吸管。 水浴锅。 72型（或721型）分光光度计。

四、试剂与药品： 树脂：Zerolit225型阳离子交换树脂。 洗脱液：0、45N，PH5、3柠檬酸缓冲液，取285g柠檬酸 （C6O7H8?H2O）；186g97℅NaOH；105ml浓硫酸溶于水中稀释至10升。 样品液：0、005M ASP和LYs的0、02N HCL混合溶液。 显色剂：显色剂列出两种可任选一种。 显色剂（Ⅰ）茚三酮-TiCL3溶液。 10g茚三酮溶于500ml乙二醇甲醚，再加入0、85 ml TiCL3（15%）显色剂（Ⅱ）：茚三酮-KCN溶液。 0、1M KCN:0、1628g KCN溶于水中稀释至250ml A、将1、25g茚三酮溶于25ml乙二醇甲醚，配成5%（W/V）浓度的溶液。B 、将2、5ml 0、01M KCN溶液与125ml乙醇甲醚混合。将A和B合并置棕色瓶中过夜即可使用。此溶剂用时， A、B两溶液在前一天合并，配好的溶液仅能在1-2天内使用，过时失效须重配。 五、方法与步骤： 1、树脂的处理： 关于市售新树脂的处理见 7、，本实验采用处理好的树脂。 2、装柱：将层析柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约1cm高的柠檬酸缓冲液。

柱层析方法经验归纳汇总

1、选柱子：有玻璃柱和不锈钢柱两种，实验室常用玻璃柱。径高比一般在1:5-10。 根据吸附剂用量（体积)确定柱子大小，一般吸附剂应填充到柱子体积的1/4～1/5。 柱子可以分为：加压，常压，减压。 压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。 其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结)，以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长)。 加压柱是种比较好的方法，与常压柱类似，只是外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或小气泵。特别在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 柱子的尺寸为粗长的最好。柱子越长，相应的塔板数就越高。柱子越，上样后样品的原点就越小（反映在柱子上就是样品层比较薄)，这样相对的减小了分离的难度。 无水无氧柱适用于对氧、水敏感，易分解的产品。可以湿柱，也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅胶饱

和时放出的热量有可能是产品分解，毕竟要分离的是敏感的物质，小心不为过。因为分离的物质比较敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至于是加压、常压、减压，随需而定。因为是schlenk操作，所以点板是个问题，如果样品是显色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色，只好准备几十个schlenk瓶，一瓶一瓶的点，不过几次之后就知道样品在哪，也就可以省些了。 无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外，很容易是样品分解，特别是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝有碱性、中性和酸性的，选择余地比较大，但比硅胶要贵些。听说有个方法，就是用石英做柱子，然后用HF254做固定相，这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了，没有验证过。 2、选择吸附剂：200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶。干硅胶的视密度在左右，所以要称40 g硅胶，用烧杯量100 ml也可以。 书中写硅胶量是样品量的30-40倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分Rf在，杂质相差以上)，就可以少用硅胶。 用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出。这样就会发生，后面的点先出，而前面的点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。 常用吸附剂的种类：氧化铝、硅胶、聚酰胺、硅酸镁、滑石粉、氧化钙（镁)、淀粉、纤维素、蔗糖和活性炭等。

GE中低压层析柱-柱效测定方法-详解

GE中低压层析柱柱效测定方法 柱效测定是一项经常使用的操作，对于定量表征层析柱的工作状态是否良好， 工艺的验证具有重要的意义。但是实际工作中很多朋友都遇到不会测柱效或者 测出来注销过低的状况，不知道如何解决。所以今天我就给大家详细介绍一下 柱效的正确测定方法，以及经常遇到的问题如何解决。 本方法适用于所有GE公司中低压液相色谱的预装柱及自己填装的层析柱。 介绍分为5个部分，测前准备、试剂选择、测柱效操作、测试结果积分、经常 发生的问题。 1. 测前准备： ⑴?KTA层析设备。要求设备的型号与层析柱大小匹配，从上样阀门到紫外和电 导检测器之间的体积要做到最小（管路内径尽量细，管路尽量短），这对于准确测量实验室小层析柱的柱效非常重要。 ⑵测试平衡溶液及样品。这个部分在试剂选择中单独细说。 ⑶装填好的层析柱。使用平衡缓冲液在测柱效的流速下至少平衡1.5 CV（柱体积），平衡方向与测柱效方向必须一致 ⑷样品环。容积大于1%柱体积。 2. 试剂选择 测柱效主要有两种测试系统：1 NaCl 测试系统；2 丙酮测试系统。只要操作正确，两个系统测出来的结果是基本一致的。但是要注意：各试剂的浓度不能随意改变，否则影响测试结果。 ⑴NaCl测试系统 对于所有种类的柱子和填料，都可以使用氯化钠系统测柱效 平衡液： 0.4 M NaCl水溶液 样品： 0.8 M NaCl水溶液 3. 测柱效操作 测柱效全程使用30 cm/h线性流速。平衡层析柱至少1.5 CV，将1% CV的样品（NaCl或丙酮）注射进入层析柱，使用平衡液冲洗直至电导或紫外280nm出 现响应峰。 4. 测试结果积分 以UNICORN6版本为例演示给大家看如何操作（各UNICORN版本操作基本一致）。以NaCl系统测柱效的所有操作针对电导曲线，以丙酮系统测柱效的所有操作 针对UV 280曲线（手头没有测柱效结果，所以随便找了一个图，里面有两个峰。大家测柱效的结果只有一个峰） 1) 在Evaluation窗口中打开测柱效结果文件，在Curve窗格中点击右键，选 择Customize 2) 勾选复选框去掉不需要显示的曲线

柱层析技术

柱层析技术 适用范围： 1. 样品量要适中（适用于g-公斤级），如果样品量只有几百克至一克，可以考虑使用制备TLC 纯化（俗称爬大板），既可以得到良好的分离效果，又可以节省大量的纯化时间。 2. 样品要有良好的溶解性，否则会导致化合物在硅胶上极难解析下来，从而导致硅胶柱堵塞。 3. 样品在TLC 板上产物与杂质点要有一定的分离度，而不是在一个点上，硅胶板的分离效果要高于柱层析，如果硅胶板都显示无法分开的话，尽量不要选择柱层析纯化，而可以考虑使用制备HPLC ，SFC 或其他分离方法。 操作过程： 干法上样为例 1. 装硅胶：在减压抽滤的状态下，将硅胶加入玻璃柱中， 2. 抽结实：减压抽气至10min ，将硅胶抽实 3. 上样：将拌好硅胶的样品，加入硅胶上层 4. 加石英砂：加入缓冲层 5. 石油醚淋洗：加入低极性溶剂淋洗，开始润柱时，一定要选取低极性的溶剂淋洗，可以充分稀释残留的大极性溶剂，以免色谱带在柱子上出现抢跑现象 6. 加缓冲球开始过柱 装柱： 1. 选择什么类型的柱子 过柱前知道样品的量，伴样硅胶是样品量的1-2倍，柱子中的硅胶是10-30倍这些硅胶在加入柱子后的径高比在1:5-1:10为比较合适的比例。如果比例太小1:1,1:3，硅胶高度不够，分离度比较差；如果比例太大，1:10,1:20，这样流速会非常慢 3. 注意事项及技巧 过柱前爬板拿标样，并且NMR 确认：过柱前，先拿到标样后，再开始过柱，因为在过柱过程中，你得到点往往比爬小板得到点的要多，如果每个点进行确认的话，时间损耗非常大 取硅胶时必须带口罩：硅胶吸入肺中，是无法代谢出身体的，会得矽肺病 必须时需要碱化硅胶： 硅羟基为弱酸性，所以它可以和胺类物质发生反应，加压柱：速度比较易于控制，但是由于需要在柱子上方加装一个磨口，限制柱子直径至多在10cm 左右，约束它的的最大上样量。适合小于100-200 g 产品的纯化。大尺寸的加压柱难以制作，用起来危险性大。在公司过柱时，请使用双链球加压减压柱：适用比较广，但是如果控制不好真空度的话，流速会非常快，同时溶剂很大一部分被抽走，适合任何量的过柱, 比加压柱快，需要减小流动相极性过柱(比加压柱小一倍), 不然会导致分离效果差。常压柱：适用于量大的物料，但流速较慢。适合大于50-100 g 的产品. 常压柱是分离效果最好的，但是时间也最长。2.选择多大柱子

离子交换层析柱的装填及处理

一、原理： 有些高分子物质含有一些可以分离的基因，例如-SO3H，-COOH等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应。如： R-SO3H＋M+ ————R-S3M＋H+ 或R-NH3OH＋CL－—————R-NH3CL＋OH－ 这类高分子物质通称离子交换剂，其中使用最普遍的是离子交换树脂。由于一定的离子交换剂对不同离子的亲和力不同，因此在洗提过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后得到分离。 二、目的与要求： 本实验是采用Zerolit225型阳离子交换树脂所装的柱，选以特定的PH缓冲洗脱液来分离含有两个性质不同的氨基酸溶液。通过实验要求掌握装柱、上样、洗脱、收集等离子交换柱层析技术的要点。 三、仪器与装置： 玻璃层析柱：长19cm，内径1.2cm，3# 砂芯。 HL-2型恒流泵。 HD-4型电脑核酸蛋白检测仪。 BS-100A自动部份收集器。 250ml烧杯。 1ml吸管。 水浴锅。 72型（或721型）分光光度计。 四、试剂与药品： 树脂：Zerolit225型阳离子交换树脂。 洗脱液：0.45N，PH5.3柠檬酸缓冲液，取285g柠檬酸（C6O7H8?H2O）；186g 97℅NaOH；105ml浓硫酸溶于水中稀释至10升。 样品液：0.005M ASP和LYs的0.02N HCL混合溶液。 显色剂：显色剂列出两种可任选一种。 显色剂（Ⅰ）茚三酮-TiCL3溶液。 10g茚三酮溶于500ml乙二醇甲醚，再加入0.85 ml TiCL3（15%） 显色剂（Ⅱ）：茚三酮-KCN溶液。 0.1M KCN:0.1628g KCN溶于水中稀释至250ml A、将1.25g茚三酮溶于25ml乙二醇甲醚，配成5%（W/V）浓度的溶液。 B、将2.5ml 0.01M KCN溶液与125ml乙醇甲醚混合。将A和B合并置棕色瓶中过夜即可使用。此溶剂用时，A、B两溶液在前一天合并，配好的溶液仅能在1-2天内使用，过时失效须重配。 五、方法与步骤： 1、树脂的处理： 关于市售新树脂的处理见7、，本实验采用处理好的树脂。 2、装柱：将层析柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约1cm高的柠檬酸缓冲液。将经处理已成钠型的树脂置于烧杯中，加进1倍体积的柠檬酸缓冲液，搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满。倒时不要太快，以免产生泡沫。待树脂在柱底逐渐沉积至约1cm高时，用吸管吸去柱内上层所出现的清液，慢慢打开柱底出口，继续加注树脂悬液直至柱体装到8cm高度为止。 在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败，另外树脂悬浮液的温度要相对恒定（特别是

常用色谱柱简介

常用色谱柱简介 气相色谱毛细柱 （键合，聚二甲基硅氧烷） HP-1，DB-1，P-1，CP-SIL5CB， Ultra-1,007-1,RTx-1,AT-1 类似固定相：SE-30，SP-2100，OV-1，OV-101,使用 温度：-60℃-320℃ 应用范围：烷烃，芳烃，多环芳烃，醇，酚，酮，酯，醛，胺，卤代烃，吡啶，糖衍生物，氨基酸衍 生物，维生素衍生物，镇痛药，农药，溶剂，胆固SPB-50型中等极性柱 醇，香料，咖啡，食品添加剂等。 (键合, 50%二苯基,50%二甲基聚硅氧烷) 对照品牌：HP-50，HP-17，DB-17，RTx-50，AT-50 SPB-5型弱极性柱 类似固定相：OV-17, SP-2250,使用温度：30℃-310℃（键合，5%苯基，95%甲基聚硅氧烷） 应用范围：烷烃，低沸点芳烃，多环芳烃，醇，甘 对照品牌：HP-5，DB-5，BP-5，CP-SIL 8CB， 油三酸酯，喹啉，卤素化合物，香料，农药，酯，Ultra-2, ,RTx-5,AT-5 镇痛药，除草剂等。 类似固定相：SE-54，SE-52，OV-73 使用温度： -60℃-320℃ PTE-5，PTE-5QTM型弱极性柱

应用范围：烷基苯，多环芳烃，醇，酚，酮，脂肪(MS专用柱,键合,5%苯基,95%甲基聚硅氧烷) 酸酯，苯二甲酸酯，硝基芳烃，芳胺，烷基胺，联 对照品牌：HP-5 MS，DB-5 MS, DB-5.625，XTI-5， 苯胺，卤代烃，多氯联苯，，糖类衍生物，维生素衍BPX625，半挥发污染物分析柱（US EPA方法525， 生物，有机酸，镇痛药，农药，抗组胺药，溶剂，625.5，625） 生物碱，防腐剂，香料等。 类似固定相：SE-54,SE-52 使用温度：-60℃-320℃ 应用范围：多氯联苯，胺，有机磷，有机氯农药，SUPELCOWAX 10型极性柱 含氯除草剂，酚，苯胺，香料等。 (键合,聚乙二醇二万) 对照品牌：HP-Wax，DB-Wax，BP-20，CP-Wax 52CB，SPB-1701型中等极性柱 HP-INNO Wax,AT-Wax (键合, 14%氰丙基,86%二甲基聚硅氧烷) 类似固定相：PEG-20M, CARBOWAX-20M,使用温 对照品牌：HP-1701，DB-1701，RTx-1701，AT-1701，度：35℃-280℃ BP-10，CPSil19CB 应用范围：低沸点芳烃，醇，酮，酸，酯，醛，醚， 类似固定相：OV-1701,SP-2250 使用温度：室温-280 乙二醇，丙二醇，甘油，吡啶，胺，亚硝胺，卤代 ℃ 烃，胆汁酸衍生物，冰片，薄荷，精油，香料，酒，

BPG 层析柱实用标准化装柱流程要求规范

操 作 标 准 目的：为了使BPG300层析柱装柱过程可重复，并能够得到较好的柱效，故建立此操作规。 围：配合?KTA process 系统进行有效的蛋白质纯化操作。 责任人：层析工序操作人员 标准操作程序： 1 基本术语概念 填料因子（Packing Factor, PF ）：指在在装柱过程中，用低流速（如60cm/h ）对填料进行沉降压缩得到的调料高度和最后装柱完成时填料高度（柱高）的比值， GEHC 生产的各种常见填料的PF 参见《GEHC AxiChrom 300-1000 columns User Manual 28-9562-89 Edition AA 》； 线性流速（linear flow rate ）：单位时间液体流经的直线距离，常用cm/h 表示； 体积流速（volume flow rate ）：单位时间液体流经的空间容积，常用ml/min 表示；

换算： 2 准备工作 2.1 检查层析柱的完整性，所带配件，是否水平（用水平仪矫正），是否清洁（如有污染应进行清洗）。 2.2 确定所用填料及其特性、浓度等 以DEAE Sepharose Fast Flow填料为例，其填料因子（PF）为1.15，新填料（slurry）浓度为75%（保存于20%乙醇中），耐压3bar。 2.3 确定放大后的工艺参数 以XX生化制药股份的放大工艺为例， 中试工艺参数： 柱高h=10cm；体积流速v1=3ml/min；柱径d=1.6cm. 即，线性流速v2=v1/s柱=3/(3.14×0.82) cm/min=1.5 cm/min； 样品与填料接触时间t=h/v2=10/1.5min=6.67min； 在工艺的线性放大中h、v2和t均不变，则可保证样品出峰的位置（洗脱时间）和形状不变。 使用BPG300层析柱进行放大的工艺参数： 装柱体积V 柱= S 柱 h=3.14×1.52×1L=7L； 装柱需要slurry体积V slurry =V 柱 ×PF/C slurry 以DEAE Sepharose Fast Flow为填料，则，V slurry =7×1.15/0.75L=10.73L； 装入柱中的slurry高度L slurry =V slurry /S 柱 =10.73/(3.14× 1.52)dm=1.52dm=15.2cm. 3管路安装 3.1 层析柱管道和配件安装 3.1.1卸下柱子顶部和底部的盲堵垫圈，旋松密封调节器，用纯水或20%乙醇充分浸润柱壁和柱头O型圈； 3.1.2 用扳手对称卸下支持杆连接到法兰的螺丝，并通过旋转高度调节手柄将