鸡胚原代细胞培养

鸡胚原代细胞培养

[实验材料]

9～10日龄鸡胚,Hank"s液50mL,0.5％水解乳蛋白液或MEM培养液20mL(内含犊牛血清1mL,双抗0.2mL,pH7.2),O.25％胰蛋白酶5mL、7％NaHC031mL,手术剪,镊子,灭菌的培养皿,50mL三角瓶,滴管若干,链霉素小空瓶若干(加入细胞悬液培养用),高压灭菌塞子若干,培养盘,蛋座,95％酒精,水浴锅。

[实验内容及操作程序]

1.配液制备细胞前先在Hnak"s液中加青、链霉素,使其含量为青霉素100IU/mL,链霉素100μg/mL,用7％NaHC03调整pH至7.2～7.4,将胰蛋白酶调整

pH7.6(玫瑰红色)。置37℃水浴锅中预热备用。

2、取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上,用碘酊消毒气室,以镊子击破卵壳并弃之,撕破卵膜揭之,继撕破绒尿膜、羊膜,取出胚胎于灭菌平皿中。剪去头部、翅爪及内脏,用Hank"s液(简称H液)洗去体表血液,移人灭菌三角瓶中,用灭菌剪刀剪碎鸡胚,使成为约1mm3大小的碎块,加5mL H液轻摇,静止1～2min,使其组织块下沉。吸去上层悬液,依同法再洗2次,至上悬液不混浊为止,吸干H液留组织。

3.消化自水浴锅内取出预热的胰酶,按组织块量约3～5倍加入三角瓶中,1个鸡胚约需5mL胰酶,三角瓶上加塞,以免CO2挥发及污染。37℃水浴约20min左右,每隔5min轻轻摇动1次,由于胰酶作用,使细胞与细胞之间的氨基与羧基游离,待液体变混而稍稠,此就是再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时,则需中止

消化,如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长,如果消化不够,则细胞不

易分散。

4.洗涤取出三角瓶后静置1min,让组织块下沉后,吸去胰酶液,用10mL Hank"s

液反复轻洗3次,以洗去胰酶,吸干上清液,留组织块。

5.吹打加2mL含血清的0.5％水解乳蛋白营养液或:MEM培养液,以粗口吸管反复吹吸数次,使细胞分散,此时可见营养液混浊即为细胞悬液。静置1min,使未冲散的组织块下沉后,小心地将细胞悬液吸出1mL于20mL营养液中,此液细胞数约50万～70万/mL。如需大量细胞,可继续加营养液冲打,一个鸡胚约可做

100mL细胞悬液。

6.细胞计数取上述细胞悬液0.5mL加入0.1％结晶紫一柠檬酸(0、1mol/L)溶液2mL,置室温或37℃温箱中5～10min,充分振动混合后,用毛细管吸取滴人血细胞计数板内,在显微镜下计数。计数方法按白细胞计数法,计算四角大格内完整细胞的总数。如3～5个聚集在一起,则按1个计算,然后将细胞总数按下法换算成每毫升中的细胞数。

细胞数/mL=4大格细胞总数/4×10 000×稀释倍数

例如:4大格的细胞总数为284个,而稀释倍数为5(0.5mL染色液),则每毫升细胞悬液的细胞数为284/4×10 000×5=3.5×104个。

7.稀释按照每毫升50万～70万个细胞密度的标准,将细胞悬液用营养液稀释之。(计数时,可见到大部分细胞完整分散,3～5个细胞成堆,且细胞碎片很少,说明消化适度;如分散细胞少,则消化不够;如细胞碎片多,则消化过度。)

活细胞计数法取2％台盼蓝溶液1滴,细胞悬液1滴,混合计数,活细胞不着色,死细胞呈蓝色。

8.分装培养分装于链霉素瓶中,每瓶约1mL,瓶口橡皮塞要塞紧。不合适者弃去,以免漏气造成污染或C02跑掉而营养液变碱。将细胞瓶横卧于培养盘中,于瓶上面划一直线,以表示直线的对侧面为细胞在瓶内的生长位置。瓶上注明组别、日期,置37℃温箱培养,4h后细胞即可贴附于瓶壁,24～36h生长成单层细胞,此时可吸去培养液,更换维持液,并接种病毒。

附:细胞培养所需的常用培养基与试剂

1.Hank’s液配制

原液甲

NaCl 8g

KCl 2g

MgSO4·7H20 2g

MgCl2·6H20 2g

2.8％CaCl2 100mL

双蒸水加至1 000mL

先将固体成分加于800mL双蒸水中,加温到50～60℃加速溶解,再加入CaCl2溶液,最后加双蒸水补足到1 000mL。加氯仿2mL,摇匀后于4℃贮存。

原液乙

Na2HPO4·2H20 1、2g