裸小鼠脑胶质瘤原位移植瘤模型的建立及磁共振成像研究
裸小鼠脑胶质瘤原位移植瘤模型的建立及磁共振成像研究
王舒楠，张伟国，陈金华，马长锁，赵丽
(第三军医大学大坪医院野战外科研究所放射科，重庆400042) 摘要：目的建立裸鼠脑胶质瘤原位移植瘤模型并进行MR扫描，摸索扫描的最佳参数，探讨1.5T磁共振在检测裸鼠颅内成瘤的可行性，为下一步实验奠定基础。方法SHG-44细胞传代培养后，用微量注射器吸取肿瘤细胞悬液直接穿刺接种，在肿瘤细胞接种后第15天行1.5T MR扫描，裸鼠麻醉后置于小动物线圈采集图像并利用影像工作站测量体积。而后取脑组织做病理切片，计算体积后行HE及CD34染色，与MRI图像进行对比分析。结果除去围手术期死亡2只裸鼠外，剩余的13只裸鼠在MR增强序列图像上均能见到肿瘤，成瘤率达100%，且位置同组织切片相一致。在MR图像上测得的肿瘤体积为（29.41±10.95）mm3，组织切片测得的肿瘤体积为(26.57±9.70) mm3，二者无显著性差异（P＞0.05）但具有明显的相关性（r=0.985，P ？）。肿瘤微血管丰富，且主要集中在肿瘤的边缘。结论采用微量注射器直接建立裸鼠胶质瘤原位移植瘤模型简单便捷，成瘤率高。
1.5T磁共振能活体检测裸鼠脑胶质瘤成瘤情况，并能进行一定的功能成像，是动态监测裸鼠胶质瘤发生发展的有效途径。
关键词：裸鼠；胶质瘤；磁共振成像；原位移植
Estabilshment of human glioma orthotopic model in nude mice and monitored by 1.5T magnetic resonance imaging
Wang Shu-nan, Zhang Wei-guo, Chen Jin-hua, Ma Chang-suo, Zhao Li（Department of Radiology, Daping Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400042, China）
Abstract：Objective To establish the model of human glioma orthotopic implantation in nude mice，and investigate 1.5T magnetic resonance in the detection of transplanted tumor. Methods The glioma cell line SHG-44 was cultured in vivo. The glioma cells were injected into nude mice brain using micro-syringe to form glioma. Fifteen days later, nude mice were scaned by 1.5T MR with animal-coil to detect the tumor. Tumor volume was measured in AW4.3 imaging workstation. Then take brain tissue biopsy done with HE staining and CD34 staining. Tumor volnme was measure under microsope to evaluated the relativity with the dates in MR imagings. Results Two nude mice were dead in perioperative, the other thirteen mice survive
基金项目：重庆市科技攻关课题(CSTC, 2007AC5014)
基金项目英文名称：（基金编号）
作者简介：王舒楠，男，福建省漳平市人，硕士研究生，医师，主要从事神经放射学方面的研究。电话：159********，023-******** E-mail：wangshunan2001@https://www.wendangku.net/doc/275231712.html,
and be detected tumor in bran by MR scanning with contrast injected. The location in MRI is consistent with that in tissue section. Tumor volume is 29.41±10.95mm3measured by MRI and is 26.57±9.70mm3 measured under microsope. There is no significant difference（P＞0.05）but significant correlation（r =0.985）. Conclusion It is easy and convenient using micro-syringe directly to establish the human glioma orthotopic implantation model in nude mice. 1.5T MR can detect the tumor in mouse brain in vivo, and to carry out certain functional imaging. 1.5T MR is an effective way to dynamic monitor the occurrence and development of glioma in nude mice.
Key word：Nude mice；Glioma；Orthotopic implantation；Magnetic resonance imaging
胶质瘤是脑内最常见、浸润性最强的一种原发性脑肿瘤，临床治疗效果差，病死率很高。提高其早期诊断准确率及寻找新的治疗方案是目前研究的热点问题[1]。针对胶质瘤研究首要的一点是建立准确可靠的胶质瘤模型。脑原位移植瘤模型形成的胶质瘤生物学性质与人类更接近，是一种理想的研究脑胶质瘤的生物学行为和治疗方法的实验工具，但不如皮下移植瘤易于观察。目前国外多采用超高场磁共振（4.7T以上）进行小动物研究，而该设备在国内配备较少。本研究通过瘤细胞接种法建立脑胶质瘤原位模型，利用临床1.5T磁共振进行动态观察，摸索扫描的最佳参数，评价1.5T磁共振在检测裸鼠胶质瘤的可行性，为下一步以裸鼠胶质瘤模型为基础的实验研究奠定一定的基础。
1材料与方法
1.1材料
DMEM高糖培养基（Gibco公司），优级胎牛血清（Hyclone公司），胰酶（Amresco公司），1.5T 磁共振及线圈（美国GE公司），钆喷酸葡胺（广州康臣药业），CD34大鼠抗小鼠单克隆抗体（美国ABCam公司），DAB显色试剂盒（北京中杉）。
1.2 细胞培养
SGH-44细胞由西南医院病理科惠赠，复苏后接种于10%胎牛血清DMEM高糖完全培养液(含双抗，3%谷氨酰胺及适量HEPES)中，单层培养法传代培养生长至所需的细胞数，在细胞于对数生长期大约80%时，以0.25%胰酶消化，收集消化液离心后去除上清液，PBS液吹打冲洗2次后制成细胞悬液，调节细胞浓度为1×106/6 μl，置于37 ℃水浴中待接种。苔盼蓝排斥实验检测细胞活力>95%。接种的细胞量：1×106 个/只。
1.3 模型制作
健康裸鼠(15只、雄性、4～5周龄，体质量12～14g)购于大坪医院野战外科研究所实验动物中心，SPF级环境饲养。采用瘤细胞悬液接种法对所有裸鼠建立胶质瘤原位移植瘤模型：在超净工作台上，
以1%戊巴比妥于裸鼠腹腔内注射(0.01 ml/g)麻醉后，用棉球蘸取少量乙醚置于裸鼠鼻前。常规消毒铺巾后确定进针位置(前卤前1 mm，右侧2.5 mm处), 用50μl微量注射器吸取6μl瘤细胞悬液垂直、缓慢插入裸小鼠脑实质中，轻柔注射完毕后留针5 min，缓慢退针，消毒后放入SPF环境中继续饲养。每天观察裸鼠的生长状态并记录。所有模型裸鼠于胶质瘤细胞接种后第15天进行MR扫描。
1.4 裸鼠胶质瘤模型MR扫描
扫描前于腹腔内注射1%戊巴比妥麻醉裸鼠后，放入自制泡沫模具中以固定位置，置于GE小动物线圈内，在空隙中塞入棉花用于保温。定位后送入1.5T磁体中开始扫描。扫描序列及参数如下：T1WI 序列：（TR：300；TE：10；FOV：8×8；矩阵：192×160；NEX：6.00）；T2WI序列（TR：2760；TE：85.7；FOV：8×8；矩阵：256×192；NEX：2.00）；DTI序列：（TR：8000；TE：112.5/FE；FOV：24×24；矩阵：192×160；NEX：6.00）；增强序列：裸鼠腹腔注射增强剂后，在T1WI序列上行增强扫描。扫描冠状面、矢状面、横断面，完毕后将图像传送至AW4.3工作站进行图像分析与处理。肿瘤的大小采用在增强序列上测量肿瘤最大长径（L），宽径（W）和高径（H），计算肿瘤体积采用以下公式：V=L×W×H/2。
1.5 病理学检测
过量麻醉处死裸鼠后以生理盐水和4%多聚甲醛先后经左心室灌注，至肝脏变白，断颈取脑，置于4%多聚甲醛中固定24 h以上。对以上取材的组织进行石蜡包埋，以3 μm厚度由前向后连续切片，直至切至肿瘤最大层面，分别测量肿瘤长径和短径，根据公式a2×b/2计算肿瘤体积。做HE染色观察肿瘤组织特征。用CD34染色观察肿瘤微血管，根据Weidner等[2]的方法计算肿瘤微血管密度密度（MVD）。
1.6 统计学处理
计量资料用x±s表示。采用SPSS 13.0版本进行统计学处理。先行方差齐性检验，组间比较采用配对t检验，方差不齐时采用t'检验或秩和检验。评价MRI和组织切片所测得肿瘤体积大小采用Pearson简单相关分析，并计算相关系数。
2结果
2.1 裸鼠一般情况
共有15只裸鼠参与模型建立，其中2只裸鼠在接种过程中由于进针太深，预计损伤裸鼠生命中枢部分而导致死亡，其余13只裸鼠顺利建立模型。胶质瘤细胞接种后一周内，裸鼠状态正常，体质量略有增加，体质量在15～17g左右。接种一周后，部分裸鼠出现神经受压症状，表现为皮肤变干，行走不稳、下肢僵直、体质量减轻，随着时间的增加神经症状越为明显，极度萎靡，偏瘫进一步加重，到后期裸鼠体质量在10～11g左右，裸鼠生存期为20～29 d。
2.2 裸鼠磁共振扫描
在T1加权像上，肿瘤与正常组织分辨不清。在T2加权像上，裸鼠大脑右侧脑室扩张，可见片状、条带状高信号水肿带，仅能分别出肿瘤的轮廓，呈等高信号。腹腔注射造影剂后，增强扫描肿瘤显示清楚，于右侧大脑内可见边界清楚地圆形或类圆形高信号影，同周围组织信号差异明显，肿瘤内坏死、囊变少见。DTI重建后见右侧大脑部分白质纤维素中断、缺失，其范围同肿瘤范围基本一致（图1）。13只裸鼠经MRI扫描后均能显示出肿瘤存在，成瘤率达100%。
A B
C D
A：正常裸鼠T2加权像；B：荷瘤裸鼠T2加权像，见颅内脑室扩张，水肿明显↑：；C：荷瘤裸鼠增强像，可见境界清楚地肿瘤，信号同周围组织差异明显（红箭）；D：荷瘤裸鼠脑部DTI 重建，见肿瘤区白质纤维束中断、缺失（红箭）。
图1 裸鼠1.5T磁共振扫描图像
2.3 组织病理学观察
病理大体标本可见右侧脑组织内色泽苍白的肿瘤，正常脑组织受压移位，HE 染色后，镜下见病理学所见瘤细胞排列失去极向，结构紊乱，瘤细胞不规则形，大小不一致，核深染、异形、分裂相多见。瘤细胞向周围浸润明显，形成瘤巢、菊形团或假菊形团样结构。CD34免疫组化染色表明，脑肿瘤组织内微血管分布及形态呈异质性，瘤内微血管数目明显增多，富含各种各样形态的血管，其高密度区多见于肿瘤边缘部分，而在肿瘤的坏死、囊变区域血管密度较小。肿瘤区边缘微血管密度显著高于肿瘤内部、瘤周组织和对侧正常脑组织（图2）。病理结果和肿瘤微血管染色证实所形成的肿瘤符合胶质瘤母细胞瘤的特性。
A ：HE 染色；
B ：CD34染色；
C ：肿瘤MV
D 计数
，见肿瘤细胞排列不规则，核深染，形成瘤巢（×50），肿瘤微血管呈棕黄色，主要集中在肿瘤边缘，肿瘤边缘微血管密度明显高于肿瘤内部及正常脑组织。
图2 胶质瘤组织HE 染色及CD34染色
对侧脑组织
B A
2.4 磁共振成像与组织病理学对比分析
根据切片上所见肿瘤的位置同磁共振图像上基本一致。磁共振图像上所测得肿瘤的平均体积为（29.41±10.95）mm3，组织切片计算的平均体积为（26.57±9.70）mm3，两种方法测得的大小基本吻合，无显著差异（P＞0.05），但两者之间具有显著的相关性（r=0.985，P＜0.01）（图3）。
图3：两种方法测得肿瘤体积大小相关性分析
3、讨论
为寻找胶质瘤靶向治疗新方案，首要工作是建立理想可靠、可重复性的胶质瘤模型。Vottorion 等[3]认为，理想的胶质瘤动物模型应具备以下特点：肿瘤细胞具备胶质瘤细胞和恶性细胞生物学特性；肿瘤形成的时间较短，成瘤率较高，动物生存期稳定；肿瘤模型应具备与人脑胶质瘤相似的生长特征。裸小鼠的出现为人胶质瘤异种移植提供了良好的载体，因为裸鼠先天免疫缺陷，其形成的胶质瘤生物学性质与人类更接近。早期的研究多建立皮下移植瘤的模型，该模型建立方法简单，能直接观察肿瘤体积变化及各种干预后的效果，但移植瘤接种在皮下，无法模拟颅内肿瘤生存发展的环境，其形成的肿瘤同临床有一定差别[4]。脑胶质瘤原位移植瘤动物模型所处的宏观和微观环境同临床差别较小，是一种理想的研究脑胶质瘤的生物学行为和治疗方法的实验工具，建立原位移植瘤模型无疑具有更好的应用价值。
我们采用人恶性胶质瘤细胞SHG-44建立胶质瘤原位移植瘤模型。SHG-44细胞来源于人胶质母细胞瘤，是恶性程度最高的肿瘤。在实验动物的选择上，我们采用雄性裸鼠作为肿瘤的宿主，因为Hatch等[5]]研究发现，雌、孕激素在一定程度上对脑胶质瘤的发生有负面影响。我们用微量注射器吸取肿瘤细胞直接穿刺注射。在步耀星等[6]的实验中，他们利用立体定向仪确定穿刺点位前卤前0.5mm，
右侧2mm，本实验参考步耀星的实验数据，但发现有数只裸鼠该处头皮有明显血管，因此我们做出了适当的调整，主要为了避开脑部血管，防止头皮或颅内出血。穿刺时应注意深度，可在穿刺前用橡胶在针头上进行定位，深度约为3.5mm左右。在接种肿瘤细胞的过程中，可在裸鼠呼吸道前放置乙醚浸泡的棉球以维持麻醉，避免进针后裸鼠疼痛应激而引起针道损伤。注射胶质瘤细胞的速度应缓慢，以利于裸鼠脑组织适应局部压力增高，避免由于颅内高压而导致裸鼠死亡。注射后应留针5min以上，可以防止肿瘤细胞沿针道外溢而引起转移。在本研究中，除了在围手术期死亡2只裸鼠外，其余裸鼠均成功建立模型并能存活较长的时间，死亡的原因主要是徒手操作时力度不容易控制，而麻醉过浅时裸鼠因疼痛应激后躁动，导致进针过深损伤生命中枢而导致裸鼠死亡。
既往常用来判断脑胶质瘤原位移植瘤动物模型成瘤的方法是观察动物的精神状态、饮食、体质量、有无颅内压增高症状及偏瘫等肿瘤压迫症状，但只有肿瘤较大时才可以发现以上变化。研究者一直在寻找无创性活体观察动物颅内肿瘤的方法。磁共振成像具有空间分辨率高、清晰的解剖成像及强大的功能成像分析，其“一站式”扫描可涵盖形态、结构、功能等内容，是活体检测动物模型颅内成瘤的最佳途径。目前国外采用超高场（4.7T以上）磁共振进行小动物实验，获得了较为清晰地解剖图像，但在1.5T磁共振方面报道较少[7,8]。我们在接种胶质瘤细胞后第15天开始行1.5T MR扫描，在T1、T2加权像上肿瘤显示不清，或仅能辨别肿瘤的大致轮廓，这是裸鼠的体素和磁共振场强等限制造成的。但腹腔注射造影剂后，在增强序列上能清晰地显肿瘤的大小、形态及于周围组织结构的关系。DTI重建后能显示裸鼠脑内白质纤维素分布情况。我们也尝试通过调整参数，对裸鼠进行磁共振血管成像（MRA），灌注成像（PWI）及波谱成像，但图像质量不尽人意，这主要还是因为磁共振场强的限制造成的。虽然提高层厚、层间距能提高图像的信噪比，但裸鼠个体较小，过大的层厚和间距容易丢失细节。我们还尝试通过提高激励次数（NEX）来提高信噪比，但扫描的时间也相应延长，一个序列需要数小时以上，这显然是不可取的。尽管如此，在本实验中采用1.5T磁共振和小动物线圈仍获得了较为清晰地图像，且同病理切片的结果具有很好的相关性，证明采用1.5T磁共振成像作为活体内动态观察裸鼠颅内肿瘤变化是可行的。
参考文献：
请按照如下正规格式核实补充：
1. Tuettenberg J, Friedel C, Vajkoczy P. Angiogenesis in malignant glioma—A target for antitumor therapy? Critical Reviews in Oncology/Hematology, 2006, 59:181–193.
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4. 蔡山、杨智勇, 脑胶质瘤原位移植瘤动物模型的研究进展. 实用临床医学, 2007, 8(2):134-137.
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（编辑/栾嘉）