小麦抗叶锈病基因Lr19 的SSR 标记

中国农业科学 2005,38(6):1156-1159 Scientia Agricultura Sinica

收稿日期：2005-01-10

资金项目：国家自然科学基金项目（30170602） 作者简介：李 星（1980-），女，河北滦南人，硕士研究生，主要从事分子植物病理学研究。Tel ：0312-*******；E-mail ：LXKZH@https://www.wendangku.net/doc/2d5444263.html, 。刘大

群为通讯作者，Tel ：0312-*******；E-mail ：ldq@https://www.wendangku.net/doc/2d5444263.html,

小麦抗叶锈病基因Lr19 的SSR 标记

李 星，杨文香, 李亚宁，刘大群, 闫红飞, 孟庆芳, 张 汀

（河北农业大学植物保护学院植物病理系/河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心，保定 071001）

摘要：选取小麦感叶锈病亲本Thatcher、6个以Thatcher 为遗传背景的小麦抗叶锈近等基因系及TcLr19与Thatcher 杂交F 2代为材料，开展了小麦抗叶锈基因Lr19的微卫星分子标记研究；从13对微卫星引物中筛选出了1对在亲本及TcLr19×Thatcher F 2抗感群体间揭示多态性的引物Xgwm44，并获得了1个与小麦抗叶锈基因Lr19紧密连锁的SSR 标记Xgwm44139bp ，此标记位点与Lr19基因之间的遗传距离为0.9cM。该研究可为分子标记辅助育种及构建遗传图谱、物理图谱和基因克隆奠定了基础。

关键词：小麦叶锈病；Lr19；微卫星分子标记

A SSR Marker for Leaf Rust Resistance Gene Lr19 in Wheat

LI Xing, YANG Wen-xiang, LI Ya-ning ，LIU Da-qun, YAN Hong-fei, MENG Qing-fang, ZHANG Ting

(Department of Plant Pathology ，College of Plant Protection ，Agricultural University of Hebei ， Biological Control Center of Plant Diseases and Plant Pests of Hebei Province ，Baoding 071001)

Abstract : Microsatellite was carried out in Thatcher, six near-isogenic lines and F 2 progeny of TcLr19 × Thatcher to develop molecular markers for leaf rust resistance gene Lr19. Thirteen primer pairs were screened, of which one primer pair Xgwm44 displayed polymorphsim in the population of TcLr19, Thatcher, and their F 2 generation. One marker closely linked to Lr19 resistance trait was obtained, and was named as Xgwm44139bp with the genetic distance 0.9 cM. The research shows that Lr19 has more potential in marker-assisted breeding programs in wheat and has leid a foundation for mapping genetic map, physical map and the eventual cloning.

Key words : Wheat leaf rust; Lr19; Microsatellite

利用抗叶锈品种是减轻叶锈病害的最经济、安全、有效的方法。目前，人们已就小麦抗叶锈基因遗传和抗病性进行了多方面的研究。国际上已发现近90个抗叶锈基因，其中正式定名的有56个，已有51个已被定位在特定染色体上[1]，有28个抗叶锈基因借助于RFLP 、RAPD 、ISSR 和AFLP 技术获得了紧密连锁或完全连锁的分子标记。Lr19是一个有效的抗叶锈病基因，自1966年首次将该基因从长穗偃麦草转到普通小麦中之后，直到1994年才首次报道在墨西哥有对Lr19有毒性的菌株，但至今在南非、中国等地只有少数几个菌株对之表现毒力，Lr19是一个应用潜力很大的抗病基因。

微卫星DNA ，又称简单序列重复(simple sequence repeat ，SSR)或短串联重复(short tandem repeat ，STR)，在小麦基因组中广泛分布[2]。微卫星标记具有多态性高、稳定性好、共显性等特点[3],非常适于在普通小麦这类遗传基础相对狭窄的物种中应用。目前，微卫星标记已成功用于小麦重要性状如抗条锈病、抗白粉病等基因的标记定位研究[4～9]，但尚未有对Lr19开展SSR 标记的报道。笔者采用SSR 标记技术开展小麦抗叶锈基因Lr19的分子标记研究，旨在找到与Lr19抗叶锈基因紧密连锁的分子标记，为实现该抗病基因分离，与其他抗病基因聚合培育抗病品种，进行种质资源基因型鉴定以及抗病基因合理利用奠定基础。

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1 材料与方法

1.1试验材料

供试的6个小麦抗叶锈近等基因系TcLr13、TcLr19、TcLr21、TcLr37、TcLr38、TcLr44和小麦感病亲本Thatcher及其杂交所获得的F2（TcLr19×Thatcher）分离世代的种子均来自河北农业大学小麦叶锈病研究室；对供试小麦叶锈菌株02-5-17，Thatcher表现高侵染型，TcLr19表现为免疫。

1.2抗性鉴定

供试材料的抗叶锈性鉴定按Seyfarth的方法[10]进行。种植TcLr19与Thatcher杂交F2代小麦幼苗，以感病亲本Thatcher为对照，幼苗生长1叶1心时，采用撒粉法接种对Lr19抗病基因无毒力的小麦叶锈菌菌株02–5–17，黑暗条件下保湿24 h，移入温度为（24±5）℃的温室内培养，接种14 d后按Roelfs[11]的标准记载单株小麦叶片的侵染型，用χ2测验法计算所得实际结果是否符合3∶1抗感分离规律。

1.3小麦DNA的提取

参照Gill[12]等人提供的CTAB法稍作修改后提取小麦叶片基因组DNA，然后用0.8%琼脂糖凝胶和紫外分光光度计检测样品的浓度和纯度。

1.4 微卫星扩增及电泳分析

根据Ro der等[13]报道的位于小麦7D染色体上的13对微卫星引物序列，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物。PCR反应体积为25 μl，含有5 μ·μl-1 10×buffer 2.5 μl；0.2 mmo l·L-1 dNTP；0.3 mmol·L-1引物；40 ng模板DNA；1.75U DNA聚合酶。PCR反应在T-gradient Thermal Cycler PCR扩增仪（Bio-metra）上进行。扩增程序为94℃变性3 min，接着94℃变性1min，50～60℃(因引物不同而异)复性1 min，72℃延伸2 min，共35个循环，最后72℃延伸10 min。

1.5电泳及银染

扩增结果在5%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，65W 恒定功率电泳至第一条loading buffer溴酚蓝带到达胶板的另一边缘，银染显色检测DNA的多态性。

1.6特异性DNA片段的回收、测序

扩增产物在PAGE胶上电泳，经过银染、显色后，用手术刀片切下特异性片段移至干净的2 ml离心管中，用Omega试剂盒进行回收，回收液的再扩增产物由上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA克隆序列测定。2 结果及分析

2.1抗性鉴定结果及遗传分析

以感病亲本Thatcher和抗病亲本TcLr19为对照，对其F1代接种无毒力菌株02-5-17，发现F1代全部表现抗病（侵染型IT为0－；）；当对F2代群体进行接种试验时，在120株F2代单株中，84株表现抗病（IT 为0－；），36株表现感病（IT为4），经适合性测验F2群体的抗感比符合3∶1分离模式，表明TcLr19对叶锈菌株02-5-17的抗性由1对显性基因控制。

2.2抗病基因分子标记

2.2.1微卫星扩增结果以抗感亲本为材料摸索分布于小麦7D染色体上的13对微卫星引物的最佳退火温度，然后在抗感亲本间进行扩增筛选，其中引物Xgwm37和Xgwm44在抗感亲本间扩增出多态性条带。

采用初筛出的2对引物（表），在F2代群体中选取的10株抗病材料和10株感病材料单株进行小群体扩增，其中引物Xgwm37在F2代抗感群体之间没有扩增出差异条带，引物Xgwm44在这两个群体间扩增出差异条带，且与抗病亲本扩增结果一致，此差异条带的长度为139 bp，初步表明这个SSR标记与小麦抗叶锈基因Lr19存在连锁关系(图1)。

表 从13对引物中初筛出的2对揭示TcLr19 多态性引物 Table Two pairs of primers selected from 13 pairs of primers showing polymorphism to TcLr19

引物编号

Primer

引物碱基序列 Sequence（5′ - 3′）

Xgwm37 ACTTCATTGTTGATCTTGCATG

CGACGAATTCCCAGCTAAAC

Xgwm44 ACTGGCATCCACTGAGCTG

GTTGAGCTTTTCAGTTCGGC

2.2.2遗传连锁性分析用引物Xgwm44对120株F2代进行SSR扩增及电泳分析，在84株抗病材料中均扩增出含有139 bp的特异性带，而在36株感病材料中，有1株含有该条带。数据用MAPMAKER

3.0b 软件进行连锁分析，结果Xgwm44扩增出的139 bp 的片段与Lr19的遗传距离为0.9cM，表明该标记位点与目的基因紧密连锁。

2.2.3品种验证用引物Xgwm44对感病亲本Thatcher和抗病亲本TcLr19及以Thatcher为背景的近等基因系：TcLr13、TcLr21、TcLr37、TcLr38、TcLr44进行了PCR扩增。可以看出，在抗病亲本TcLr19中

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M 为PBR322/Msp I marker ，S 代表F 2代感病材料条带，R 代表F 2代抗病材料条带，T 代表感病亲本Thatcher 条带，TL19为抗病亲本TcLr19条带，下同。箭头表示在F 2（TcLr19×Thatcher ）代抗病材料中含有的139bp 特异条带

“M” means PBR322/Msp I marker, “S” means the bands from the materials susceptible to wheat leaf rust in F 2 population. “R” means the bands from the materials resistant to wheat leaf rust in F 2 population, “T” means the bands from Thatcher, “TL19” means the bands from TcLr19, The same as below. Arrowhead indicated the 139bp specific band present in population resistant to the pathogen

图1 引物Xgwm44在F 2（TcLr19×Thatcher ）代中扩增出的特异性条带 Fig.1 The specific band of TcLr19×Thatcher F 2 population amplified with Xgwm44

1. 代表TcLr13条带，

2. TcLr21条带，

3. TcLr37条带，

4. TcLr38条带，

5. TcLr44条带，箭头表示在抗病材料中含有的139 bp 特异条带

1. Means the bands from TcLr13，

2. Means the bands from TcLr21，

3. Means the bands from TcLr37，

4. Means the bands from TcLr38，

5. Means the bands from TcLr44. Arrowhead indicated the 139bp specific band present in resistant lines

图 2 微卫星引物Xgwm44对不同小麦材料的扩增结果

Fig.2 The PCR amplification results of different wheat materials with primer Xgwm44

扩增出139 bp 的抗性标记带，而在其他不含有Lr19的个测试材料中均未扩增出抗病标记带（图2），因此Xgwm44139bp 可作为Lr19基因的特异性分子标记。2.2.4 特异性DNA 片段的回收测序 该特异性DNA 片段经回收后再扩增所得条带大小与该特异带大小一致（图3），并由上海生工生物工程技术服务有限公司测序得出了特异带的序列（图4），此序列长度为139 bp ，经BLAST 同源性序列比较发现该片段与GeneBank 中的记录不具同源性，为一新的片段。

3 结论与讨论

小麦叶锈病严重影响小麦生产，培育抗病品种是减轻病害的有效方法，所以找到与抗叶锈基因连锁的分子标记并将其应用于抗病育种是本研究的最终目的。微卫星标记普遍存在于真核生物基因组中，已被证明它是一种非常有效的分子标记，由于SSR 标记在

小麦基因组中多态性极高, 并具有染色体组特异性，相对RFLP 、RAPD 等分子标记而言,有操作简便,稳定性高,花费低等优点[2,13], 目前它已成为研究小麦最有

“M ” 为DL2 000 marker ，“TL19”代表回收的特异性条带

“M” means DL2 000 marker, “TL19” means specific band reclaimed

图3 特异性片段回收的结果

Fig.3 The pattern of the specific band reclaimed

139bp

R TL19 T S S 1 2 3 4 5 M

139bp

R R R R R R TL19 T S S S S S S S M

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图中斜体字母为引物序列 Italic letters indicate the primer sequence

图4 特异带序列

Fig.4 The sequence of the specific band

效的分子标记技术之一[14]。

本研究以小麦叶锈抗病亲本TcLr19和感病亲本Thatcher为材料，从13对SSR引物中筛选出2对能揭示出抗感亲本间多态性的引物，多态性引物出现率达16%，用此两对引物对它们的F2代抗感群体进行扩增并最终获得了一个与小麦抗叶锈基因Lr19紧密连锁的分子标记Xgwm44139bp，遗传距离为0.9cM。经品种验证，Xgwm44139bp作为Lr19基因的特异性分子标记可用于抗病育种的辅助选择。研究获得的139 bp的特异性片段经BLAST分析未能找到同源性的序列，表明这是一个目前尚未记载的不含ORF的片段。按该序列设计引物，利用Race 方法扩增全序列，可进一步克隆Lr19，为小麦抗叶锈病基因工程奠定基础。

References

[1]Yang W X，Liu D Q．Advances in localization and molecular markers

of wheat leaf rust resistance genes，Scientia Agricultura Sinica，

2004，3 (10)：770 - 779．

[2]Roder M S，Plaschke J，Konig S U，Borner A，Sorrells M E，Tanksley

S D，Ganal M W． Abundance， variability and chromosomal location of microsatellites in wheat．Molecular and General Genetics，1995，246：327 - 333．

[3]Wang Z，Weber J L，Zhong G，Tanksley S D．Survey of plant short

tandem DNA repeats．Theoretical and Applied Genetics，1994，88：1-6．

[4]Peng J H，Fahima T，Roder M S，Li Y C，Dahan A，Grama A，

Ronin Y I，Korol A B，Nevo E．Microsatellite tagging of the stripe-rust resistance gene YrH52 derived from wild emmer wheat，

Trticum dicoccoides，and suggestive negative crossover interference

on chromosome 1 B．Theoretical and Applied Genetics，1999，98：862-872．

[5]Liu Z Y，Sun Q X，Ni Z F，Nevo E，Yang T．Molecular

characterization of a novel powdery mildew resistance gene Pm30 in

wheat originating from wild emmer．Euphytica，2002，123：21-29．[6]Chagué V， Fahima T，Dahan A，Sun G L，Korol A B，Ronin Y I，

Grama A，Roder M S，Nevo E．Isolation of microsatellite and RAPD

markers flanking the Yr15 gene of wheat using NILs and bulked

segregant analysis．Genome，1999，42：1 050-1 056．

[7] 马渐新，周荣华，董玉琛，王晓鸣，贾继增．用微卫星标记定位

一个未知的小麦抗条锈病基因．科学通报，1999，44 (14)：1 513 -

1 517．

Ma J X，Zhou R H，Dong Y C，Wang X M，Jia J Z．Mapping of a

new stripe rust resistance gene in wheat using SSR markers．Chinese

Science Bulletin，1999，44 (14)：1 513-1 517．(in Chinese)

[8] Jarve K，Peusha H O，Tsymbalova J，Tamm S，Devos K M，Enno

T M．Chromosomal location of a Triticum timopheevii-derived

powdery mildew resistance gene transferred to common

wheat．Genome，2000，43(2)：377-381．

[9] Huang X Q，Hsam S L K，Zeller F J，Wenzel G，Mohler

V．Molecular mapping of the wheat powdery mildew resistance gene

Pm24 and marker validation for molecular breeding．Theoretical and

Applied Genetics，2000，101：407-414．

[10] Seyfarth R，Feuillet C，Schachermayr G，Winzeler M，Keller

B．Development of a molecular marker for the adult plant leaf rust

resistance gene Lr35 in wheat．Theoretical and Applied Genetics，

1999，99：554-560．

[11] Roelfs A P. Race specificity and methods of study．In：Bushnell W R，

Roelfs A P．The Cereal Rust．V ol 1．Origins， Specificity，Structure

and Physiology．Orlando：Academic Press，1984，2：131-164．[12] Gill K S，Lubbers E L，Gill B S，Raupp W J，Cox T S．A genetic

linkage map of Triticum tauschii(DD) and its relationship to the D

genome of bread wheat(AABBDD)．Genome，1991，34：362-374．[13] Roder M S, Korzun V, Wendehake K, Plaschke J, Tixier M H, Leroy P,

Ganal M W. A microsatellite map of wheat. Genetics, 1998, 149:

2 007-2 023.

[14] Plaschke J，Borner A，Wendehake K，Ganal M W，Roder M S．The

use of wheat aneuploids for the chromosomal assignment of

microsatellite loci．Euphytica，1996，89：33-40．

(责任编辑王红艳)

GTTGAGCTTTTCAGTTCGGC ACACTGAGCAATTAACTTCCAAATCCTGGAACAAGTAGAAGTATCGCATAGCTGT GGAGAGAAAGAGAGAGAGAACACCAACCTGCAGTCGATGTCGGAG CAGCTCAGTGGATGCCAGT