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取小鼠脑组织

取小鼠脑组织
取小鼠脑组织

丁香园上面总结的方法,排版有点乱。

其实过程与大鼠近似,我的经验是:

1. 材料准备;大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等;

2. 步骤:处死小鼠,取头颅;

剪开皮肤,漏出颅骨;

用大尖镊子夹住两侧眼眶,用眼科剪稍剪除颅骨中线;

再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹,从下向上逐步去除颅骨;

当全脑露出时,再用眼科镊去除脑膜和血管;

然后用竹签从嗅球处向下取出全脑,即可。

3. 注意事项:用力轻柔,否则容易弄破脑部;

用剪刀剪颅骨时,一定要贴壁向上剪,否则容易剪破脑部;

去除脑膜时,不能硬拉,否则容易弄破大脑;

取出全脑时应把头顶朝下,用竹签轻轻取出,离桌面也不要太远、高;

若留病理,建议一定要取完整无损的大脑。

做免疫组化的话,稍微麻烦一点儿,因为脑组织含水量多,要固定的好,就需要先灌注。

先麻醉小鼠

剪开胸腔,找到心脏,从心尖入针,剪开右心耳

先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了

再改用固定液(一般是4%多聚甲醛)灌注至小鼠四肢僵硬

小鼠只需要用注射器就行了,我做的25~35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。具体步骤:常规麻醉小鼠,将其固定,用剪刀剪开胸部皮肤,暴露出皮下组织,剪开时注意钝性分离,以免误伤。然后用镊子提起剑突,用剪刀剪开胸腔,剪断两侧肋骨,暴露整个胸腔,小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜,暴露心脏,用眼科剪剪开右心耳,然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室,注射,注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流,针孔最好是同一个,多聚灌流时小鼠四肢会抽搐,待抽搐结束,小鼠僵硬即可。取下小鼠,用剪刀在颈部离断头颅,用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀,将两边皮肤向下翻用手捏住,暴露整个颅骨,用眼科剪从脊髓端插入椎孔,沿着颅正中线剪开颅骨,注意剪刀向上翘一些,以免误伤脑组织,剪开后用弯眼科镊分离颅骨,小心分离,直至暴露整个大脑,然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经,就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。

具体操作如下:

实验操作步骤:

1) 小鼠称重,以每克小鼠0.0025ml 4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。也可以用10%的水合氯醛,3-5ul/g腹腔注射麻醉。

2) 将麻醉的小鼠仰放在操作台上,去毛。

3) 解剖小鼠,暴露心脏。

4) 找到心尖部,左手用镊子提起心尖部,右手或左手将灌流针刺破心尖部进

针约 0.5cm(最好是用小点的针头,用止血钳固定针尖,剪开右心耳。

5) 将灌流器的导管部开口放到生理盐水中里,打开灌流器灌流,直到从右心耳流出的液体为无色,同时小鼠肝脏色淡,肠管肿胀为止,停止灌流。没有灌流器的用注射器或者吊瓶都可以。

6) 将灌流器的导管小心的移至4%多聚甲醛或2.5%戊二醛中,注意不要产生气泡,开始灌流。此时如果看到小鼠四肢突然紧张,尾部卷曲,说明达到固定效果。

7) 灌流大约5分钟,灌流液用量约150毫升左右结束。(小鼠的用量没这么多)

8)取材。取实验所需的标本。

9)将取出的材料放到事先准备的多聚甲醛(戊二醛)中固定2——4小时后移至30%蔗糖中4度冰箱保存过夜。

我们实验室鼠脑冰冻切片采用4%的多聚甲醛固定,小鼠直接灌注saline20ml,4%多聚甲醛20ml经左心室固定然后取材在4度4%多聚甲醛后固定4-6h,浸20%-30%糖沉底,就可以切片,切片首先需要冰冻切片机,我们的leica1900的,不知道lz那里有没有这个机子,还有一种原始的自己刷冻台的那种,比较麻烦,切片厚度大概选择20-40um差不多

开胸时要把肋骨提起,大U字剪开左右肋弓后掀起,血管钳固定一下(以免挡遮视野);平头针插入后稍许打开输液器开关并迅速剪开充盈的右心耳(可见血涌出),用血管钳将心室和平头针一起钳夹固定再推(但滴速也不能太快以免血管被冲破,使灌流液流进肺里)。另:开胸时动作尽量要快;针头可以不插入主动脉,留置于左室也行。

试剂名称:4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠

所需药品及剂量:A液:多聚甲醛40g

蒸馏水400ml

B液:Na2HPO4·2H2O 6.88g

蒸馏水300ml

C液:NaOH 3.86g

蒸馏水200m

操作过程:A液最好在500ml的三角烧瓶中配制,至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意,在溶解多聚甲醛时,要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后,将B液倒入C液中,混合后再加入A液,以1n NaOH或1N HCl 将pH 调至7.2~7.4,最后,补充蒸馏水至1000ml充分混合

应用范围:光镜和电镜免疫细胞化学研究,用于免疫电镜时,最好加入少量新鲜配制的戊二醛

保存期限及温度:4℃冰箱保存备用,长期保存

我在很多方面是个新手,经常在园子里逛,学到了很多东西,但同时也看到了关于同一个问题有很多不同的回答,我想结合自己的实验,希望各位老师能就我提出的问题说说自己的经验看法,给我启示,因为很多自己未做过,怕自己哪里操作不恰当而影响实验结果,非常感谢各位老师的不啻赐教!

首先,我做的是大鼠(体重约230-250g),模型是大脑中动脉栓塞,在不同的时间点取脑标本,准备做荧光实时定量PCR、Western blot和冰冻切片,我提的问题主要是在于脑标本的取和存方面。

问题如下:

荧光实时定量PCR方面:

1、标本需要灌注么,有战友说不需要,你是怎么做的,有灌注的话什么溶液灌注,温度?

2、标本取下后液氮速冻,然后转-80度冰箱,这样保存一般可以多久?

3、抽提后的中RNA放-80度冰箱会很容易降解么,还是说要放液氮?

Western blot方面:

4、标本用什么溶液灌注,温度?

5、同一个标本可以同时用于RT-PCR和Western blot检测么?(如果灌注手段一样的话)

冰冻切片方面:

6、灌注冲血用什么溶液,温度?

7、4%多聚甲醛灌注固定一般灌注多常时间?多少毫升?

8、4%多聚甲醛后固定时间是多久为宜?

9、蔗糖梯度脱水,蔗糖是用什么配置的,PBS还是PB,浓度是多大的?蔗糖梯度是15%到20%再30%么?在每种浓度里沉底后就换另一种还是?

10、我试做过一次,做法为:常规多聚甲醛灌注固定后,再多聚甲醛后固定过夜,然后30%的蔗糖脱水,这些都是用0.1M的PBS配的,结果发现蔗糖脱水3天了都还没沉底(中间换过一次蔗糖溶液)。有战友提议可以切几块后脱水效果会更好,如果你有跟我做一样的模型标本,你是怎么处理的,如何切?

11、还有什么需要注意的地方或tips。

6、灌注冲血用什么溶液,温度?

用的是含有肝素钠的生理盐水。每瓶500ml的生理盐水加入80mg的肝素钠,肝素钠要避光保存,而且必须使用前临时加入到生理盐水中。肝素钠生理盐水需要用4度预冷。我们用注射器推,大概推100ml,10min。就可以将血液冲干净。速度要自己掌握。

每支肝素钠每亳升含12500U,相当于100mg,用20ml生理盐水稀释,分装成40支,消毒备用(4℃贮存)。临用时,注射器吸取肝素钠溶液一支,而后将肝素液来回抽动,使针筒局部湿润,多余肝素液全部排出弃之,注射器内死腔残留的肝素液即可抗凝。

纯的肝素10 mg能抗凝100 ml血液(按1mg等于100个国际单位,10个国际单位能抗凝1ml血液计)。如果肝素的纯度不高,或过期,所用的剂量应增大2~3倍。用于试管内抗凝时,一般可配成1%肝素生理盐水溶液,取0.1ml加入试管内,加热80℃烘干,每管能使5~10 ml血液不凝固。作全身抗凝时,一般剂量

为:大鼠2.5~3 mg·(200~300g体重)-1,兔或猫10 mg·kg-1,狗5~10 mg·kg-1。如果肝素的纯度不高,或过期,所用的剂量应增大2~3倍。

7、4%多聚甲醛灌注固定一般灌注多常时间?多少毫升?

一般多聚甲醛灌注20min,100ml。标准是动物的尾巴会甩动,全身四肢收缩(这是因为蛋白变性所致),一般看起来像动物活过来了一样。随后就可以将动物的头断掉,来取脑了。

8、4%多聚甲醛后固定时间是多久为宜?

这个不一定。对于石蜡切片,可以固定很久。但是对于冰冻切片,估计是隔夜或者24h。但是先固定一晚上后再取出来,将不需要的大脑组织切掉,比如脑干、小脑等等。擦干,放在蔗糖溶液里。

9、蔗糖梯度脱水,蔗糖是用什么配置的,PBS还是PB,浓度是多大的?蔗糖梯度是15%到20%再30%么?在每种浓度里沉底后就换另一种还是?

蔗糖用0.1M的PB配置。我一般配20%和30%两个浓度。我个人感觉每个浓度需要沉糖48h。至少我发现24h是不够的。沉糖必须完全沉底。

10、我试做过一次,做法为:常规多聚甲醛灌注固定后,再多聚甲醛后固定过夜,然后30%的蔗糖脱水,这些都是用0.1M的PBS配的,结果发现蔗糖脱水3天了都还没沉底(中间换过一次蔗糖溶液)。有战友提议可以切几块后脱水效果会更好,如果你有跟我做一样的模型标本,你是怎么处理的,如何切?

我不知道你是看哪个部位的表达。如果是海马的话,我建议从前囟-1.40mm到前囟-6.30mm左右。

确实提的问题很多,看样子还是有所思考,值得赞扬,我也只能说出我个人的经验,讲几个大概的原则,具体细节还要你自己在实验中体会。

RT-PCE与WB都是分子生物学方面的实验,可以共用一个标本,一般不需要灌注,文献上都如此,需要新鲜的脑组织,液氮速冻,-80度保存,半年应该没问题,既然是MCA栓塞,那就要取MCA供血区域,嗅极后3-9mm,如果要分半暗带,园子里有类似的帖子,可查找。至于不灌注,存留的血液可能会影响结果,我一般断头后用生理盐水把血液冲洗干净,然后再敲开露骨取脑,这样,效果会好些。至于你的脑组织灌注固定,蔗糖脱水3天还没沉底,可能与脑组织太大及梯度脱水有关,我一般在脱水前用双面刀片沿冠状面将多余的脑组织休掉,20%蔗糖1天,30%蔗糖2天,总共3天就足够了,希望对你有帮助。

你在断头后用生理盐水把血液冲洗干净,然后再敲开露骨取脑,我想没通过灌注应该没办法冲掉脑内血管的血吧?

我现在取RT-PCR和WB的标本的做法是:用临床上用的静脉留置针(相对会比较粗些,而且质软不会刺破血管)插到升主动脉快速灌注冰PBS 50ml左右(一般1分钟内灌完),然后快速取脑放入液氮速冻,尽量缩短时间,不知这种做法是否尚可?(个人觉得灌注后的脑标本相对未灌注的会好取些,视野感觉也更好,不会血淋淋的)

至于冰冻切片标本的灌注固定已经是按照你和甲醛版主的方法去做了,期待会有好的结果。

我也说两句冰冻切片,灌注用生理盐水还是PBS这个问题不是主要问题,主要作

用在于你能否冲干净血管内的血液,而且一般观点认为灌注液最好在10分钟之

内冲完(原因可能在于缺血后脑细胞在10分钟后会大量死亡),而且灌注液最

好不要用冰冻的(原因有时候冰冻的液体也会使老鼠抽搐,造成你的判断失误)

冲洗液的速度越快越好,量要适当控制,过量的话细胞会肿大,一般我们以肝脏

变白为标准,如果还不放心的话,再稍微延长点时间,但是最好不要超过10分

钟。灌注时,有一点小技巧,就是把心脏稍微往大鼠的右边向上扭一点,以进针

没有阻滞感为佳。

后固定我认为时间不宜太长,因为过多的甲醛会增加片子的背景颜色。一般以6

到12小时为佳。还有一种方法就是当你的老鼠灌注的不好时,可以后固定以及

脱水两个步骤一起进行。这是别人介绍的,个人没有试过。脱水我们一般是30%

的蔗糖水(pbs配置)等它沉底了就可以切了。脱水不好的话会使片子出现冰晶。

该切片了,其实切片时冰冻的过程是最容易出现冰晶的,我解决的办法比较简单

就是速冻,让标本快速的变白。但是问题也不要太低了,太低的话容易碎片,一

般在-20左右,脑组织的话最好不要低于-35度。

另外大家可有去找找莱卡CM1850的冰冻切片机说明书,里面有详细的介绍切片

过程。其它类型的切片机我想原理也应当差不多。弄明白了一台其它的也就相应

的熟悉了。

冰冻切片方面:

灌注冲血可以用生理盐水、0.1M的PB 0.01M的PBS都可以(注意调pH值)。我们实验室灌注的时候用常温的,我们认为冷的会引起血管收缩。快速冲到肝脏变白或者右心耳流出的液体变白为止。

多聚甲醛灌注固定速度先快后慢。灌得好就会看到老鼠抽搐、四肢变硬。如果只取脑,可以夹住腹主动脉,这样灌注固定的快,而且省液体。

我们后固定和沉糖都在4度进行。4%多聚甲醛和蔗糖溶液也是4度保存。

关于多聚甲醛灌注以后,确实对于石蜡切片可以固定很久,但是如果做组化的话,

一般都是24小时,时间长的话,比如超过1周,可能抗原就会丢失,不容易出

结果。

对于大脑:灌注取脑后是继续放到4度多聚甲醛进行24小时后固定,24h之后

进行蔗糖梯度脱水,那么下一步的保存,假如2天后已经沉底。因为没有做过大

脑,所以我的问题是:

第一:蔗糖溶液是否需要和多聚甲醛溶液一样一般是20倍体积于组织?

第二:这个时候的脑组织是否是和石蜡块里的脑组织一样,保存时间可以很长,

会不会很快出现抗原丢失的问题。

第三:保存的条件是什么,石蜡块可以室温,最好4度,甚至-20度。但是其外

面包有石蜡。而大脑还是裸体的,我见到多用OCT包埋后。那么是否必须包埋,

不包埋的话该如何处理;包埋之后是放到-20度,还是-80度,还是???

第四:这样作出来的冰冻切片在做免疫荧光的时候,是否需要抗原修复吗???

我觉得是需要的,因为是多聚甲醛固定的吗,抗原都被封闭了。但是没有做过,所以急切想听听大家的看法。

第五:可否不进行灌注和固定,直接动物麻醉,断头处死,然后直接-80度冰箱,用的时候取出,OCT包埋,切完片子后丙酮固定5-10min啊,我做心肌组织的时候就是这样做的,结果非常好。而且少了多聚甲醛固定这一步,就不用考虑抗原修复的问题了。

但是看文献上好像做脑的组化都进行了灌注固定,不知其中有何奥秘??

取小鼠脑组织

丁香园上面总结的方法,排版有点乱。 其实过程与大鼠近似,我的经验是: 1. 材料准备;大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等; 2. 步骤:处死小鼠,取头颅; 剪开皮肤,漏出颅骨; 用大尖镊子夹住两侧眼眶,用眼科剪稍剪除颅骨中线; 再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹,从下向上逐步去除颅骨; 当全脑露出时,再用眼科镊去除脑膜和血管; 然后用竹签从嗅球处向下取出全脑,即可。 3. 注意事项:用力轻柔,否则容易弄破脑部; 用剪刀剪颅骨时,一定要贴壁向上剪,否则容易剪破脑部; 去除脑膜时,不能硬拉,否则容易弄破大脑; 取出全脑时应把头顶朝下,用竹签轻轻取出,离桌面也不要太远、高; 若留病理,建议一定要取完整无损的大脑。 做免疫组化的话,稍微麻烦一点儿,因为脑组织含水量多,要固定的好,就需要先灌注。先麻醉小鼠 剪开胸腔,找到心脏,从心尖入针,剪开右心耳 先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了 再改用固定液(一般是4%多聚甲醛)灌注至小鼠四肢僵硬 小鼠只需要用注射器就行了,我做的25~35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。具体步骤:常规麻醉小鼠,将其固定,用剪刀剪开胸部皮肤,暴露出皮下组织,剪开时注意钝性分离,以免误伤。然后用镊子提起剑突,用剪刀剪开胸腔,剪断两侧肋骨,暴露整个胸腔,小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜,暴露心脏,用眼科剪剪开右心耳,然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室,注射,注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流,针孔最好是同一个,多聚灌流时小鼠四肢会抽搐,待抽搐结束,小鼠僵硬即可。取下小鼠,用剪刀在颈部离断头颅,用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀,将两边皮肤向下翻用手捏住,暴露整个颅骨,用眼科剪从脊髓端插入椎孔,沿着颅正中线剪开颅骨,注意剪刀向上翘一些,以免误伤脑组织,剪开后用弯眼科镊分离颅骨,小心分离,直至暴露整个大脑,然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经,就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。 具体操作如下: 实验操作步骤: 1) 小鼠称重,以每克小鼠0.0025ml 4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。也可以用10%的水合氯醛,3-5ul/g腹腔注射麻醉。 2) 将麻醉的小鼠仰放在操作台上,去毛。 3) 解剖小鼠,暴露心脏。 4) 找到心尖部,左手用镊子提起心尖部,右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约0.5cm(最好是用小点的针头,用止血钳固定针尖,剪开右心耳。 5) 将灌流器的导管部开口放到生理盐水中里,打开灌流器灌流,直到从右心耳流出的液体为无色,同时小鼠肝脏色淡,肠管肿胀为止,停止灌流。没有灌流器的用注射器或者吊瓶都可以。

小鼠解剖图完整版

图Ⅸ-1 整体骨骼侧面观The skeleton. Lateral view 图Ⅸ-2 整体骨骼背面观The skeleton. Dorsal view 1 背肋dorsal rib 2 胸椎thoracic vertebra 3 颈椎cerical vertebra 4 顶间骨interparietal bone 5 顶骨parietal bone 6 额骨frontal bone 7 鼻骨nasal bone 8 锁骨clavicle 9 肩胛骨scapula 10 肱骨hemerus 11 髌骨patella 12 腰椎lumbar vertebra 13 荐椎sacral vertebra 14 尾椎caudal vertebra 15 坐骨ischium 16 髂骨ilium 17 股骨femur 18 腓骨fibula 19 胫骨tibia 20 跖骨metatarsal bone 21 趾骨digital bone 22 胸肋sternal rib 23 头骨skull 24 指骨digital bone 25 桡骨radius

图Ⅸ-3 背柱背面The vertebral column. Dorsal aspect 1 枢椎axis 2 胸椎thoracic vertebra 3 第II 胸椎I Ith thoraac vertebra 4 第1 腰椎I st lumbar vertebra 5 第 6 腰椎6th lumbar vertebra 6 耻骨pubis 7 闭孔obturator foramen 8 寰椎atlas 9 第7 颈椎seventh cervical vertebra 10 胸肋sternal rib 1l 背肋dorsal rib 12 第4 腰椎4th lumbar 13 髂骨ilium 14 荐椎sacral vertebra 15 坐骨ischimn 16 尾椎caudal vertebra

组织病理学技术

组织病理学技术 组织病理学技术 一. 实验综述 组织病理学切片技术是融解剖学、组织胚胎学及技术、病理学及技术和临床于一体的综合性课程。是一门新兴的学科。在当今不断发展、变革的社会中,在学科相互融合,知识相互渗透,技术不断发展、概念不断更新的时代,在时代要求综合素质人才辈出的今天,组织病理学切片技术的兴起尤为必要和重要。主要任务是:使学生获得和掌握学会观察人体重要器官的解剖学特征、组织学结构、病理学变化并联系相关功能,从而在形态上观察、机能上分析、综合上判断和科学上研究疾病。同时联系病变器官的代谢和机能的改变,探讨疾病的病因、发病机制以及病理变化与临床表现的内在联系和相互的关系。为由基础走向临床打下坚实的基础。 二. 实验目的 1. 掌握病理组织切片的基本制作过程步骤 2. 掌握病变器官的代谢和机能的改变 3. 明白病理组织切片制作过程中的注意事项 4. 了解病理切片的制作程序及仪器的操作和注意事项 二.实验材料 1. 实验材料:手术盘、镊子、手术刀、石蜡、小鼠病理组织、纱布、烧杯、脱水机、塑料包埋盒、水浴锅、切片机、染色机、载玻片、盖玻片、铅笔、标签 2. 实验试剂:福尔马林、酒精(50% 55% 70% 75% 80% 85% 95% 无水浓度)、二甲苯、苏木素、盐酸酒精、伊红染液、树胶 四.实验步骤 (一)取材 从尸体解剖材料或临床手术切除的待检材料上选取供作切片标本的病理组织切块,称为取材。 1. 取材要全面具有代表性,能显示病变的发展过程。为此要选取病变显著的区域和可疑 灶,在统一组织块中最好包括病灶及其周围的健康组织,并应包含该器官的主要结构部分。较大而重要的病变可从病灶中心到外周的不同部位取材,以反映病变各阶段的形态学变化。

大鼠和小鼠解剖图谱(照片版)

图Ⅷ-1整体骨骼侧面观The skeleton. Lateral View 图Ⅷ-2整体骨骼左前面观The skeleton. Left anterior view 1肋骨rib 2胸椎thoracic vertebra 3颈椎cervical vertebra 4颅骨cranium 5肩胛骨scapula 6肱骨hiimeius 7桡骨radius 8尺骨ulna 9掌骨metacarpal bone 10指骨digital bone 11腰椎lumbar vertebra 12髂骨ilium 13尾骨coccyx 14股骨femur 15髌骨patella 16腓骨fubula 17胫骨tibia 18跖骨metatarsal bone 19趾骨digital bone

图Ⅷ-4头骨侧面The skull. Lateral aspect

图Ⅷ-6下颌骨侧面The mandible. Lateral aspect

1枕骨occipital bone 2顶间骨interparietal bone 3矢状缝sagittal suture 4颧骨malar bone 5上颌骨maxillary bone 6前颌骨premaxillary bone 7枕外嵴external occipital creat 8顶骨parietal bone 9额骨frontal bone 10鼻骨nasal bone 11鼻间缝internasal suture 12前筛孔preethmoid pore 13蝶腭孔sphenopalatine foramen 14门齿 incisor tooth 15下颌骨mandible 16视神经孔optic foramen 17枕骨occipital bone 18茎突styloid process 19外耳道external acoustic meatus 20颞骨temporal bone 21 腭裂patoschisis 22臼齿molar tooth 23腭骨palatine bone 24翼孔pterygoid apertures 25破裂孔foramen lacerum 26枕大孔foramen magnum 27腭后孔posterior palatine foramen 28鼻后孔posterior nasal apertures 29卵圆孔foramen ovale 30鼓骨tympanic bone 31舌下神经孔hypoglossal foramen 32下颌联合mandibular symphysis 33颏孔mental foramen 34冠状突coronoid process 35下颌支ramus of mandible 36角状突process of horn 37下颌孔mandibular foramen 38翼肌窝pterygoid fossa 39髁突condylar process

组织病理学技术

组织病理学技术 一.实验综述 组织病理学切片技术是融解剖学、组织胚胎学及技术、病理学及技术和临床于一体的综合性课程。是一门新兴的学科。在当今不断发展、变革的社会中,在学科相互融合,知识相互渗透,技术不断发展、概念不断更新的时代,在时代要求综合素质人才辈出的今天,组织病理学切片技术的兴起尤为必要和重要。主要任务是:使学生获得和掌握学会观察人体重要器官的解剖学特征、组织学结构、病理学变化并联系相关功能,从而在形态上观察、机能上分析、综合上判断和科学上研究疾病。同时联系病变器官的代谢和机能的改变,探讨疾病的病因、发病机制以及病理变化与临床表现的内在联系和相互的关系。为由基础走向临床打下坚实的基础。 二.实验目的 1.掌握病理组织切片的基本制作过程步骤 2.掌握病变器官的代谢和机能的改变 3.明白病理组织切片制作过程中的注意事项 4.了解病理切片的制作程序及仪器的操作和注意事项 二.实验材料 1.实验材料:手术盘、镊子、手术刀、石蜡、小鼠病理组织、纱布、烧杯、脱水机、塑料包埋盒、水浴锅、切片机、染色机、载玻片、盖玻片、铅笔、标签 2.实验试剂:福尔马林、酒精(50%、55%、70%、75%、80%、85%、95%、无水浓度)、二甲苯、苏木素、盐酸酒精、伊红染液、树胶 四.实验步骤 (一)取材 从尸体解剖材料或临床手术切除的待检材料上选取供作切片标本的病理组织切块,称为取材。 1.取材要全面具有代表性,能显示病变的发展过程。为此要选取病变显著的区 域和可疑灶,在统一组织块中最好包括病灶及其周围的健康组织,并应包含该器官的主要结构部分。较大而重要的病变可从病灶中心到外周的不同部位取材,以反映病变各阶段的形态学变化。 2.取材时要尽量保持组织的自然状态与完整性,避免认为变化。为此,切取组 织块的剪刀要锋利,切取时勿使组织受挤压、拉扯胡揉搓。 3.组织块的大小要适当,通常其长、宽、厚以1.5×1×0.4cm为宜,必要时可 增大到2×1.5×0.5cm,以便于固定液迅速浸透。尸体剖检时采取病理组织块可切得稍大些,待固定几小时后在家以修整,切到适当的大小。 4.对于特殊病灶要做适当标记。 5.注意避免类似的组织块混淆。 6.制片的组织块,越新鲜越好。 7.接受送检标本时,须依据送检单详细检查送检物。 (二)固定和固定液 将组织浸在固定液内,使细胞组织内的物质成为不溶性,让固有形态和结构得以保存叫作固定。固定是为了保持组织、细胞与生活时的形态相似。 1. 本次试验的固定液为:10%福尔马林液(实验室常用固定液) 福尔马林 100ml 自来水 900ml

小鼠解剖图谱

图Ⅸ-1整体骨骼侧面观The https://www.wendangku.net/doc/236143366.html,teral view 图Ⅸ-2整体骨骼背面观The skeleton.Dorsal view 1背肋dorsal rib 2胸椎thoracic vertebra 3颈椎cerical vertebra 4顶间骨interparietal bone 5顶骨parietal bone 6额骨frontal bone 7鼻骨nasal bone 8锁骨clavicle9肩胛骨scapula10肱骨hemerus11髌骨patella12腰椎lumbar vertebra 13荐椎sacral vertebra14尾椎caudal vertebra15坐骨ischium16髂骨ilium17股骨femur18腓骨fibula19胫骨tibia20跖骨metatarsal bone21趾骨digital bone22胸肋sternal rib23头骨skull24指骨digital bone25桡骨radius

图Ⅸ-3背柱背面The vertebral column.Dorsal aspect 1枢椎axis2胸椎thoracic vertebra3第II胸椎I Ith thoraac vertebra4第1腰椎I st lumbar vertebra5第6腰椎6th lumbar vertebra6耻骨pubis7闭孔obturator foramen8寰椎atlas9第7颈椎seventh cervical vertebra10胸肋sternal rib1l背肋dorsal rib12第4腰椎4th lumbar13髂骨ilium14荐椎sacral vertebra15坐骨ischimn16尾椎caudal vertebra

小鼠灌注取脑

成年小鼠心脏灌流及取脑组织步骤 实验步骤: 1、小鼠麻醉后立即将其用针头固定在泡沫板上(用针头插住四肢)。用镊子扯起胸部皮肤,另一只手用剪刀剪开胸腔的皮肤和肋骨,暴露出心脏和肝脏。 2、将注射针头插入小鼠左心室,同时将小鼠肝脏减掉,以使血液流出。灌注生理盐水,时间维持在1min(10~20ml)灌注液左右,血液排除后四肢、肝脏和舌头会变白。 3、待小鼠四肢、肝脏和舌头变白之后,用4%PFA#流固定,当PFA 流至大脑处可能会使小鼠尾巴略有反射现象(有时可能没有),此时可将灌流速度下调,以使固定更加充分。整个PFA灌流时间约为5min。 (固定原理:多聚甲醛可以使蛋白质交联)4、将导管始端从PFA中拿出,待管中液体流尽后,将心脏上的针头拔下,如果固定的较好,可发现小鼠眼球呈现白色。将托盘中的血液倒至废液桶内,并准备下一步的取脑操作。 取脑及脱水:

1、剪开头部皮肤,露出白色头盖骨。将延髓上包被的软骨剪开,除去多余的结缔组织。需要注意的时,眼睛要由剪刀剪下,不能够直接扯下来,因为眼睛后部连着视神经,如果扯的话有可能会损坏视交叉上核等其他脑部组织。 2、将头盖骨小心剥开,露出白色的脑部,在剥嗅球部位时要格外小心,必要的话可以先将嗅球前部的碎骨留着待进一步固定之后再去除。 3、将头盖骨剥开后,将脑下部连接的神经逐条剪短(可看到视神经交叉),待全部剪断后将脑整个剥离出来。 4、将剥离出来的脑浸泡在4%PF/中,过夜固定。 5、将PFA液换为30%蔗糖进行脱水(防止冷冻切片时形成冰晶和孔洞),初始脱水时脑会浮在蔗糖上面,待完全脱水后脑会沉底。此时可将脑取出进行冷冻切片。

大鼠解剖方面的资料

1. 外观大鼠外观与小鼠相似,但个体较大。一般成年大鼠体长不小于18-20cm。尾上覆有短毛和环状角质鳞片,数量多于200片。上下颌各有两个切齿和六个臼齿,共16颗牙齿。齿式为(1003/1003)×2。 2. 大鼠骨骼约105-108块,大鼠的生长发育期长,长骨长期有骨骺存在,不骨化。切齿终生不断生长,大鼠需不断啃咬磨牙以维持其长度恒定,故垫料中应有部分小木块供其啃咬。 3. 大鼠唾液腺包括腮腺、颌下腺和舌下腺。分别位于下颌骨后缘至锁骨的腹外侧、下颌骨后缘和胸腔入口的腹侧、颌下腺口侧。颈区肩胛部间沉积的脂肪组织呈腺体状,称为冬眠腺,在产热中起着重要作用。 4. 胃由前后两部分组成,前胃为无腺区,后胃为有腺区,前后两部分由一个界限嵴分开,食管通过界限嵴的一个褶进入胃小弯,此褶是大鼠不能呕吐的原因。 5. 肠道分为十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠。其中小肠最长,约114cm(102-126),盲肠较长,约6-8cm。 6. 肝脏呈紫红色,占体重的比例大,约为体重的1/25,由四叶组成(右侧叶、中叶、左叶和尾叶)。肝脏的再生能力强,经部分肝切除术后仍可再生。成年大鼠切除肝2/3,在一周内肝脏生长最快,三周内肝脏重量可恢复到接近正常。大鼠无胆囊,各肝叶的胆管会合成胆总管,开口于十二指肠。胰脏位于胃和十二指肠的弯曲处,呈淡粉色,形状不规则,似脂肪。 7. 心脏重量约占体重的1/30-1/20,由左心房、左心室、右心房、

右心室组成。左心室发出主动脉弓,由此分出无名动脉、左颈总动脉、左锁骨下动脉。无名动脉又分出右颈总动脉和右锁骨下动脉。主动脉弓到心脏背侧沿脊柱下行,形成背主动脉,背主动脉再分支到髂部和四肢。 8. 肺脏为海绵状,淡粉色,位于胸腔中部,分为左、右两部分。左肺为一个大叶,右肺分为4叶(前叶、中叶、副叶、后叶)。 9. 肾脏呈暗红色、蚕豆状,位于腹腔背侧脊柱两侧。每侧肾都和一条白色细长的输尿管相连,输尿管下接膀胱。 10. 大鼠的神经系统与人类相似,亦包括中枢神经系统和周围神经系统两部分。中枢神经包括脑和脊髓,周围神经包括脑神经、脊神经、植物神经。脑分为大脑、间脑、中脑、小脑和延脑,大鼠的大脑很发达,中脑较小。由脑发出的神经叫脑神经,共12对。脊神经和植物神经和其它动物相似。 实验用大鼠解剖生理学 一、概述 每年约使用3千5百万只鼠应用于研究和测试。使用实验大鼠进行的研究包括老化,肿瘤neoplasia,药效与毒性,含特定菌之动物gnotobiology,龋齿的研究,脂质新陈代谢,维他命之作用,行为,酒精中毒和肝脏硬化,关节炎,苯酮尿症(phenylketonuria),黄疸,果糖不耐症,高血压、胚胎学,畸胎畸形学,肾性尿崩症及传染性疾病等皆可使用大鼠进行研究。 二、解剖构造

组织病理学技术

组织病理学技术

组织病理学技术 一.实验综述 组织病理学切片技术是融解剖学、组织胚胎学及技术、病理学及技术和临床于一体的综合性课程。是一门新兴的学科。在当今不断发展、变革的社会中,在学科相互融合,知识相互渗透,技术不断发展、概念不断更新的时代,在时代要求综合素质人才辈出的今天,组织病理学切片技术的兴起尤为必要和重要。主要任务是:使学生获得和掌握学会观察人体重要器官的解剖学特征、组织学结构、病理学变化并联系相关功能,从而在形态上观察、机能上分析、综合上判断和科学上研究疾病。同时联系病变器官的代谢和机能的改变,探讨疾病的病因、发病机制以及病理变化与临床表现的内在联系和相互的关系。为由基础走向临床打下坚实的基础。 二.实验目的 1.掌握病理组织切片的基本制作过程步骤 2.掌握病变器官的代谢和机能的改变 3.明白病理组织切片制作过程中的注意事项 4.了解病理切片的制作程序及仪器的操作和注意事项 二.实验材料 1.实验材料:手术盘、镊子、手术刀、石蜡、小鼠病理组织、纱布、烧杯、脱水机、塑料包埋盒、水浴锅、切片机、染色机、载玻片、盖玻片、铅笔、标签 2.实验试剂:福尔马林、酒精(50%、55%、70%、75%、80%、85%、95%、无水浓度)、二甲苯、苏木素、盐酸酒精、伊红染液、树胶 四.实验步骤 (一)取材 从尸体解剖材料或临床手术切除的待检材料上选取供作切片标本的病理组织切块,称为取材。 1.取材要全面具有代表性,能显示病变的发展过程。为此要选取病变显著的区 域和可疑灶,在统一组织块中最好包括病灶及其周围的健康组织,并应包含该器官的主要结构部分。较大而重要的病变可从病灶中心到外周的不同部位取材,以反映病变各阶段的形态学变化。 2.取材时要尽量保持组织的自然状态与完整性,避免认为变化。为此,切取组 织块的剪刀要锋利,切取时勿使组织受挤压、拉扯胡揉搓。 3.组织块的大小要适当,通常其长、宽、厚以1.5×1×0.4cm为宜,必要时可 增大到2×1.5×0.5cm,以便于固定液迅速浸透。尸体剖检时采取病理组织块可切得稍大些,待固定几小时后在家以修整,切到适当的大小。 4.对于特殊病灶要做适当标记。 5.注意避免类似的组织块混淆。 6.制片的组织块,越新鲜越好。 7.接受送检标本时,须依据送检单详细检查送检物。 (二)固定和固定液 将组织浸在固定液内,使细胞组织内的物质成为不溶性,让固有形态和结构得以保存叫作固定。固定是为了保持组织、细胞与生活时的形态相似。 1. 本次试验的固定液为:10%福尔马林液(实验室常用固定液) 福尔马林 100ml 自来水 900ml

大鼠肝脏组织病理切片的制作和HE染色

大鼠肝脏组织病理切片的制作和HE染色 步骤如下: (一)固定与修块 取组织块放入Bouin氏液中,组织块的直径应小于7mm。6小时左右后用双面 刀片将组织块修剪成3-5mm3大小。 (二)脱水与透明 1. 75%乙醇50分钟 2. 85%乙醇50分钟 3. 95%乙醇(I) 30分钟 4. 95%乙醇(II) 30分钟 5. 100%乙醇(I) 30分钟 6. 100%乙醇(II) 30分钟 7 1/2二甲苯(乙醇与二甲苯等体积)20分钟 &二甲苯(I)20分钟 9 .二甲苯(II)10分钟(可依据透明效果而定) 若脱水不好,二甲苯溶液颜色会变混浊。在每一步骤之后,要充分滤干组织块,一般用筒纸吸干组织块上的液体,以免影响其他液体的浓度,但也要防止组织块干燥。全过程约需要5h。(三)浸蜡、包埋与修蜡块 1.浸蜡:将60C恒温箱打开,使石蜡充分溶解,待脱水与透明结束后,将组织块转入石蜡里,放置于60 C恒温箱120分钟。 2 .包埋:将60 C的石蜡倒入纸盒内,然后用小镊子将各组织块按一定的顺序排列好,使切面朝下。不同组别的同一组织包埋于一个蜡块中,以保证切片和染色条件相同。为防止倒入纸盒内的石蜡底部立刻凝固,可将纸盒置于一玻璃板 上(或大培养皿内),然后将玻璃板置于80-90 C左右热水上,包埋时蜡盒底部要放平,做蜡块的蜡要反复冻融较好。 3 .修蜡块:待纸盒内蜡凝固后,用刀片将其修成梯形,组织块与蜡块边缘之间的距离不得小于2mm。 (四)切片 在载玻片上擦少量甘油蛋白。可滴半滴甘油蛋白于载玻片上,用手指充分抹 匀,呈半干状为佳。切片厚约4-8卩m,将切片在55C左右水浴中展开,展开程度 以带黄颜色的组织完全摊平为准。用涂有甘油蛋白的载玻片从水浴中捞取切片,放入37C烘箱中过夜。每个组织块捞片2张。过夜后,将载玻片置于玻片架上, 进行下面的实验。 (五)脱蜡、染色与脱水 倾斜玻片架,将玻片架和载玻片下缘的试剂用筒纸吸干,减轻对其他试剂浓 度的影响。全过程约需要60分钟。 1.脱蜡 (1)二甲苯(I)15分钟 (2)二甲苯(II)15分钟 (3)100%乙醇2分钟 (4)95%乙醇(I)1分钟 (5)95%乙醇(II)1分钟 (6)蒸馏水浸洗1分钟 2 .染色

小鼠急性脑缺氧实验

本文通过小鼠急性脑缺氧实验、大鼠大脑中动脉栓线法局灶性脑缺血(MCAO)损伤模型、对脑血流量影响实验、抑制血小板聚集及血栓形成实验、小鼠不完全脑缺血模型、沙土鼠全脑缺血再灌注损伤等实验和模型,分别从扩张脑血管、抑制血小板聚集及血栓形成、抗水肿、抗缺血再灌注损伤、抗自由基和兴奋性氨基酸损伤等角度,系统的研究了三七中人参三醇皂苷(PTS)对缺血性脑中风的防治作用及其机制。方法1.小鼠急性脑缺氧实验小鼠i.p.给药,每天一次,共3次,末次给药后30min 将小鼠逐只断头,立即按秒表记录小鼠断头后至张口喘气停止时间作为耐缺氧指标。 2.大鼠大脑中动脉栓线法局灶性脑缺血(MCAO)损伤模型雄性SD大鼠,i.p.预防给药两次,每天一次,造模前O.5h i.v.给药1次,造模后4h和10h i.p.给药两次。模型建立:分离、结扎右侧颈总动脉,参照Berdson法用4-0尼龙线阻断大脑中动脉。造模成功能够存活24h的大鼠确定为最后实验对象,并进行行为学评分后,快速取右脑,并切成三片,将脑前部用于脑含水量测定,中部用于脑梗死面积测定,后部用于病理组织学检查。 3.对脑血流量影响实验犬静脉滴注给药,分别在给药前和给药后5、10、15、30、60、120以及180min测定平均动脉血压(MAP)、心率(HR)、脑血流量(CBF)和脑血管阻力(CVR)等指标。4.抑制血小板聚集及血栓形成实验抑制血小板聚集:大鼠i.p.给药,共3次,每天1次。于末次给药30min后,分别自颈总动脉放血,在血样中加入5μl已稀释的ADP(终浓度为50μmol/L)反应5min后测定最大聚集度。抑制血栓形成:大鼠经4%戊巴比妥钠i.p.麻醉,舌下静脉给药后20min,分离右侧颈总动脉和左侧颈外静脉。把插入丝线的聚乙烯管的两端分别插入右侧颈总动脉和左侧颈外静脉,打开动脉夹开放血液15min后,中断血流,迅速取出聚乙烯管中的血栓,在分析天平上称重,求出血栓抑制率。5.双侧颈总动脉结扎的不完全脑缺血模型给小鼠i.p.给药,共3次,每天1次;于末次给药后30min,麻醉后分离双侧颈总动脉,各组经尾静脉注射1%伊文思蓝溶液,并分别在注射10min后结扎双侧颈总动脉。在结扎3h后断头取出脑组织,称重后测脑组织内伊文思蓝含量并计算脑指数。6.沙土鼠全脑缺血再灌注损伤模型采用结扎沙土鼠双侧颈总动脉15min再灌注24h制备全脑缺血再灌注损伤模型,动物随机分成假手术组、模型组、PTS 30mg/kg组、PTS 60mg

取小鼠脑组织

丁香园上面总结得方法,排版有点乱、 其实过程与大鼠近似,我得经验就是:?1。材料准备;大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等;?2。步骤:处死小鼠,取头颅; 剪开皮肤,漏出颅骨;?用大尖镊子夹住两侧眼眶,用眼科剪稍剪除颅骨中线;?再 用眼科镊夹住颅骨从内向外夹,从下向上逐步去除颅骨; 当全脑露出时,再用眼科镊去除脑膜与血管;?然后用竹签从嗅球处向下取出全脑,即可。 3。注意事项:用力轻柔,否则容易弄破脑部;?用剪刀剪颅骨时,一定要贴壁向上剪,否则容易剪破脑部;?去除脑膜时,不能硬拉,否则容易弄破大脑;?取出全脑时应把头顶朝下,用竹签轻轻取出,离桌面也不要太远、高;?若留病理,建议一定要取完整无损得大脑。 做免疫组化得话,稍微麻烦一点儿,因为脑组织含水量多,要固定得好,就需要先灌注。?先麻醉小鼠?剪开胸腔,找到心脏,从心尖入针,剪开右心耳 先用生理盐水灌注直到从心耳流出来得水清亮了?再改用固定液(一般就是4%多聚甲醛)灌注至小鼠四肢僵硬 小鼠只需要用注射器就行了,我做得25~35g得小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。具体步骤:常规麻醉小鼠,将其固定,用剪刀剪开胸部皮肤,暴露出皮下组织,剪开时注意钝性分离,以免误伤。然后用镊子提起剑突,用剪刀剪开胸腔,剪断两侧肋骨,暴露整个胸腔,小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜,暴露心脏,用眼科剪剪开右心耳,然后提起心尖将准备好得生理盐水注射器插入左心室,注射,注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺与肝得颜色都变成灰白色即可、然后用多聚甲醛灌流,针孔最好就是同一个,多聚灌流时小鼠四肢会抽搐,待抽搐结束,小鼠僵硬即可。取下小鼠,用剪刀在颈部离断头颅,用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀,将两边皮肤向下翻用手捏住,暴露整个颅骨,用眼科剪从脊髓端插入椎孔,沿着颅正中线剪开颅骨,注意剪刀向上翘一些,以免误伤脑组织,剪开后用弯眼科镊分离颅骨,小心分离,直至暴露整个大脑,然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经,就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。 具体操作如下:?实验操作步骤:?1) 小鼠称重,以每克小鼠0、0025ml 4%戊巴比妥钠剂量得实施腹腔麻醉、也可以用10%得水合氯醛,3-5ul/g腹腔注射麻醉。?2) 将麻醉得小鼠仰放在操作台上,去毛、 3) 解剖小鼠,暴露心脏。 4) 找到心尖部,左手用镊子提起心尖部,右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约 0.5cm(最好就是用小点得针头,用止血钳固定针尖,剪开右心耳、? 5) 将灌流器得导管部开口放到生理盐水中里,打开灌流器灌流,直到从右心耳流出得液体为无色,同时小鼠肝脏色淡,肠管肿胀为止,停止灌流。没有灌流器得用注射器或者吊瓶都可以。?6) 将灌流器得导管小心得移至4%多聚甲醛或2、5%戊二醛中,注意不要产生气泡,开始灌流。此时如果瞧到小鼠四肢突然紧张,尾部卷曲,说明达到固定效果。 7) 灌流大约5分钟,灌流液用量约150毫升左右结束、(小鼠得用量没这么多)?8) 取材、取实验所需得标本、 9) 将取出得材料放到事先准备得多聚甲醛(戊二醛)中固定2—-4小时后移至30%蔗糖中4度冰箱保存过夜。

小鼠解剖图

图Ⅸ-1整体骨骼侧面观The skeleton. Lateral view 图Ⅸ-2整体骨骼背面观The skeleton. Dorsal view 1背肋dorsal rib 2胸椎thoracic vertebra 3颈椎cerical vertebra 4顶间骨interparietal bone 5顶骨parietal bone 6额骨frontal bone 7鼻骨nasal bone 8锁骨clavicle 9肩胛骨scapula 10肱骨hemerus 11髌骨patella 12腰椎lumbar vertebra 13荐椎sacral vertebra 14尾椎caudal vertebra 15坐骨ischium 16髂骨ilium 17股骨femur 18腓骨fibula 19胫骨tibia 20跖骨metatarsal bone 21趾骨digital bone 22胸肋sternal rib 23头骨skull 24指骨digital bone 25桡骨radius

图Ⅸ-3背柱背面The vertebral column. Dorsal aspect

图Ⅸ-4胸廓背面The thorax.Dorsal aspect

图Ⅸ -5前肢骨内侧面The bone of 图Ⅸ-6后肢骨外侧面The bone of anterior Iimb.Medial aspect posterior https://www.wendangku.net/doc/236143366.html,teral aspect 1枢椎axis 2胸椎thoracic vertebra 3第II 胸椎I Ith thoraac vertebra 4第1腰椎I st lumbar vertebra 5第6腰椎6th lumbar vertebra 6耻骨pubis 7闭孔obturator foramen 8寰椎atlas 9第7颈椎seventh cervical vertebra 10胸肋sternal rib 1l 背肋dorsal rib 12第4腰椎4th lumbar 13髂骨ilium 14荐椎sacral vertebra 15坐骨ischimn 16尾椎caudal vertebra 17指骨digital bone 18掌骨metacarp at bone 19腕骨carpal bone 20桡骨radius 21尺骨ulna 22三角突起deltoid process 23鼻骨nasal bone 24额骨frontal bone 25顶骨parietal bone 26顶间骨interparietal bone 27肱骨hemerus 28肩胛骨scapula 29肱骨头head of humerus 30肘突elbow process 31肩胛冈spine of scapula 32肩带pectoral girdle 33大转子greater trochanter 34 股骨 femur 35胫侧髁tibiale condyle 36髌骨 patella 37胫骨tibia 38跖骨metatarsal bone 39股骨头head of femur 40腓骨fibula 41跟骨calcaneus 42跗骨 tarsal bone 43趾骨digital bone

小鼠pcr基因扩增及鼠灌注取脑操作

小鼠PCR基因鉴定 一、取材:小鼠出生后3-4周,给小鼠打耳标,并依照雌雄分笼饲养, 需要鉴定的小鼠剪尾部、脚趾或耳部边缘,放置好在印管中,并做好相应的标志,放置标本与标志混乱。 处理: (1)将A液一定量加入带有样本的印管中,在98℃孔板中煮1小时 (2)取出印管后,再加入B液75 μl 二、扩增 1.反应体系 Mix 5μl H20 3μl Primer1 0.5ml Primer2 0.5ml 2.加样 先计算出所需总量,加入印管中,混合均匀,离心,摆放好单个PCR管,将上述混合液放入PCR仪,每管9 μl盖紧。 3.扩增 打开PCR仪并设置好程序,将PCR管放入PCR仪,扩增,40多分钟可以完成。 4.保存 扩增后,取出PCR管,放入冰中保存。 三、琼脂糖凝胶电泳

1.制胶:电子天平称取计算后的琼脂糖,小心倒入干净的锥形瓶内(锥 形瓶内保持干净)。加入TAE缓冲液,盖上锡箔纸,加热。取制胶模具、梳子,安装固定,保证不会漏胶。戴上手套,取出锥形瓶,掀开锡箔纸,冷却3-4分钟,加入染色剂,贴着远梳子端的制胶模板壁缓慢倒入琼脂糖溶液,若有气泡。室温放置凝固。 2.上样:胶凝固后,双手缓慢垂直地拔出梳子,避免破坏梳孔。将胶 板放上电泳槽,注意正负极变化,加入1×TAE缓冲液,从胶表面开始缓慢倒入,自然流向两边,然后依次对孔加入对应的DNA样品,剩余样品放入冰箱储存。 3.电泳:合上电泳槽,正负极对好,检查底部是否有气泡升起。有气 泡则电泳开始。 4.成像:观察是否出现条带,若出现条带,则停止电泳,打开凝胶成 像系统,对结果进行比对、记录并拍照。关闭系统,登记实验记录,取出胶并清洗仪器器材。

成年小鼠心脏灌流

成年小鼠心脏灌流 实验材料:需要观察脑切片的小鼠 试剂/试剂盒:乙醚;生理盐水(37℃水浴);4%PFA;30%蔗糖 仪器:蠕动泵;剪刀;镊子;针头;导管 实验步骤: 1、准备实验器材:两个锥形瓶(1个装生理盐水,一个装4%多聚甲醛,记得要用封口膜封口) 2、用生理盐水冲洗导管,并排除管内气体。(灌流时选用雄性动物比选用雌性动物要好,原因是雌性动物受其激素周期影响,雄性的结果更为可靠) 3、在密闭容器内加适量乙醚,麻醉小鼠。(需要注意的是,小鼠清醒一点比死掉要好,防止血液凝固给灌流带来阻力) 4、待小鼠麻醉后立即将其用针头固定在泡沫板上(用针头插住四肢)。 5、一只手用镊子扯起胸部皮肤,另一只手用剪刀剪开胸腔的皮肤和肋骨,暴露出心脏和肝脏。 6、将注射针头插入小鼠左心室(如针头不稳可用镊子将其固定在泡沫板上),同时将小鼠肝脏减掉,以使血液流出。灌流速度5.8rpm。(灌注生理盐水的时间维持在10min左右,血液排除后四肢、肝脏和舌头会变白) 7、对小鼠进行剪尾取样,以备测定其基因型。同时,将小鼠信息卡片上记录灌流信息,并将灌流小鼠的信息记录在自己的实验记录本上,以方便后续的重新基因型鉴定操作。 8、待小鼠四肢、肝脏和舌头变白之后,将导管始端从生理盐水中拿出,将其放入冰浴的4%PFA溶液(4℃)中,用4%PFA灌流固定时,当PFA流至大脑处可能会使小鼠尾巴略有反射现象(有时可能没有),此时可将灌流速度由5.8rpm调至4.8rpm,以使固定更加充分。整个PFA灌流时间约为20min。(固定原理:多聚甲醛可以使蛋白质交联) 9、将导管始端从PFA中拿出,待管中液体流尽后,将心脏上的针头拔下,如果固定的较好,可发现小鼠眼球呈现白色。将托盘中的血液倒至废液桶内,并准备下一步的取脑操作。 10、拿出一条纸巾,将小鼠尸体放在上面,沿颈部剪下头颅。 11、剪开头部皮肤,露出白色头盖骨。将延髓上包被的软骨剪开,除去多余的结缔组织。需要注意的时,眼睛要由剪刀剪下,不能够直接扯下来,因为眼睛后部连着视神经,如果扯的话有可能会损坏视交叉上核等其他脑部组织。 12、将头盖骨小心剥开,露出白色的脑部,在剥嗅球部位时要格外小心,必要的话可以先将嗅球前部的碎骨留着待进一步固定之后再去除。 13、将头盖骨剥开后,将脑下部连接的神经逐条剪短(可看到视神经交叉),待全部剪断后将脑整个剥离出来。 14,将剥离出来的脑浸泡在4%PFA中,过夜固定。 15、将PFA液换为30%蔗糖进行脱水(防止冷冻切片时形成冰晶和孔洞),初始脱水时脑会浮在蔗糖上面,待完全脱水后脑会沉底。此时可将脑取出进行冷冻切片。

取小鼠脑组织0001

丁香园上面总结的方法,排版有点乱。其实过程与大鼠近似,我的经验是: 1. 材料准备;大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等; 2. 步骤:处死小鼠,取头颅; 剪开皮肤,漏出颅骨;用大尖镊子夹住两侧眼眶,用眼科剪稍剪除颅骨中线;再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹,从下向上逐步去除颅骨;当全脑露出时,再用眼科镊去除脑膜和血管;然后用竹签从嗅球处向下取出全脑,即可。 3. 注意事项:用力轻柔,否则容易弄破脑部;用剪刀剪颅骨时,一定要贴壁向上剪,否则容易剪破脑部;去除脑膜时,不能硬拉,否则容易弄破大脑;取出全脑时应把头顶朝下,用竹签轻轻取出,离桌面也不要太远、高;若留病理,建议一定要取完整无损的大脑。 做免疫组化的话,稍微麻烦一点儿,因为脑组织含水量多,要固定的好,就需要先灌注。 先麻醉小鼠剪开胸腔,找到心脏,从心尖入针,剪开右心耳先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了再改用固定液(一般是4%多聚甲醛)灌注至小鼠四肢僵硬 小鼠只需要用注射器就行了,我做的25?35g的小鼠一般用50mLNS+30m多聚甲醛。具体步骤:常规麻醉小鼠,将其固定,用剪刀剪开胸部皮肤,暴露出皮下组织,剪开时注意钝性分离,以免误伤。然后用镊子提起剑突,用剪刀剪开胸腔,剪断两侧肋骨,暴露整个胸腔,小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜,暴露心脏,用眼科剪剪开右心耳,然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室,注射,注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流,针孔最好是同一个,多聚灌流时小鼠四肢会抽搐,待抽搐结束,小鼠僵硬即可。取下小鼠,用剪刀在颈部离断头颅,用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀,将两边皮肤向下翻用手捏住,暴露整个颅骨,用眼科剪从脊髓端插入椎孔,沿着颅正中线剪开颅骨,注意剪刀向上翘一些,以免误伤脑组织,剪开后用弯眼科镊分离颅骨,小心分离,直至暴露整个大脑,然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经,就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h 后包埋切片即可。 具体操作如下: 实验操作步骤: 1) 小鼠称重,以每克小鼠0.0025ml 4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。也可以用10%的水合氯醛,3-5ul/g 腹腔注射麻醉。 2) 将麻醉的小鼠仰放在操作台上,去毛。 3) 解剖小鼠,暴露心脏。 4) 找到心尖部,左手用镊子提起心尖部,右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约0.5cm (最好是用小点的针头,用止血钳固定针尖,剪开右心耳。 5)将灌流器的导管部开口放到生理盐水中里,打开灌流器灌流,直到从右心耳流出的液体为无色,同时小鼠肝脏色淡,肠管肿胀为止,停止灌流。没有灌流器的用注射器或者吊瓶都可以。 6)将灌流器的导管小心的移至4%多聚甲醛或2.5%戊二醛中,注意不要产生气泡,开始灌流。此时如果看到小鼠四肢突然紧张,尾部卷曲,说明达到固定效果。 7)灌流大约5 分钟,灌流液用量约150毫升左右结束。(小鼠的用量没这么多) 8)取材。取实验所需的标本。 9)将取出的材料放到事先准备的多聚甲醛(戊二醛)中固定2——4 小时后移至30%蔗糖中4 度冰箱保存过夜。

最新组织病理切片以及HE染色

组织病理切片以及HE染色 (一)实验原理:苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE染色)能较好地显示组织结构和细胞形态,可用于观察、描述正常和病变组织的形态学,而且HE切片可较长时间保存,被称为常规染色方法。 (二)实验步骤: 一、制作切片 1、取材、固定:取小鼠肾脏组织适当大小,并且放入盛有固定液的小瓶中保存。 2、组织的脱水、透明、浸蜡与包埋 组织固定后还需经过脱水、透明、浸蜡等过程才能制成蜡块,进行石蜡切片。脱水是指用某些溶媒置换组织内水分的过程。组织脱水后,必须经过一种既能与酒精相混合又能溶解石蜡的溶剂,通过这种溶剂的媒介作用,使石蜡浸入组织块。在此过程中,因组织块中的水分被溶剂所取代,组织块变得透亮,因此称之为透明。组织染色后也要进行透明。最常用的透明剂为二甲苯,处理时间为30min左右。 组织经透明后在溶化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。用其他浸透剂(如火棉胶、碳蜡和明胶等)渗入组织内部的过程称为浸透或透入。为使石蜡充分渗入组织块中,常需经过3小时的浸渍,期间需更换3次石蜡。一般用于浸蜡的石蜡熔

点为52-56℃。 组织块经过浸蜡或浸透,用包埋剂(石蜡、火棉胶、碳蜡和树脂等)包起的过程称包埋,包埋后便制成含组织的块。这种包埋块可使组织达到一定的硬度和韧度,有利于切成薄片。石蜡包埋是病理日常工作中最常用的包埋方法。用于包埋的石蜡熔点一般为60℃左右。但在有些情况下,如某些酶染色时,则需采用低温石蜡包埋,以保存组织内酶的活性。 3、切片、制片 石蜡切片常用的切片机有轮转式切片机和平推式切片机,以前者为多用。切片厚度一般为3-5μm。切片时先将组织片平摊于一块玻璃上,迅速滴加30%的酒精水溶液使组织片完全展开,再移入40℃恒温热水器中。也可直接将组织切片移入40℃的恒温热水器中,待组织片完全展开后将其贴附于载玻片上,经56-60℃烤片30-60min后即可进行染色。 二、HE染色 1. 二甲苯脱蜡2×10 min; 2. 无水乙醇洗去二甲苯2×5min; 3. 95%、80%乙醇各l0 min,自来水洗l min(不要让急水直接冲至载玻片上的组织),蒸馏水洗1min; 4. 苏木素染色4 min,自来水洗2 min; 5. 1%盐酸酒精分化20 s(镜下控制),自来水洗2 min; 6. 1%稀氨水返蓝30s(镜下控制),自来水洗2分钟,蒸馏

大鼠和小鼠解剖图谱

大鼠和小鼠解剖图谱

图Ⅷ-1整体骨骼侧面观The skeleton. Lateral View 图Ⅷ-2整体骨骼左前面观The skeleton. Left anterior view 1肋骨rib 2胸椎thoracic vertebra 3颈椎cervical vertebra 4颅骨cranium 5肩胛骨scapula 6肱骨hiimeius 7桡骨radius 8尺骨ulna 9掌骨metacarpal bone 10指骨digital bone 11腰椎lumbar vertebra 12髂骨ilium 13尾骨coccyx 14股骨femur 15髌骨patella 16腓骨fubula 17胫骨tibia 18跖骨metatarsal bone 19趾骨digital bone

图Ⅷ-4头骨侧面The skull. Lateral aspect

图Ⅷ-6下颌骨侧面The mandible. Lateral aspect

1枕骨occipital bone 2顶间骨interparietal bone 3矢状缝sagittal suture 4颧骨malar bone 5上颌骨maxillary bone 6前颌骨premaxillary bone 7枕外嵴external occipital creat 8顶骨parietal bone 9额骨frontal bone 10鼻骨nasal bone 11鼻间缝internasal suture 12前筛孔preethmoid pore 13蝶腭孔sphenopalatine foramen 14门齿 incisor tooth 15下颌骨mandible 16视神经孔optic foramen 17枕骨occipital bone 18茎突styloid process 19外耳道external acoustic meatus 20颞骨temporal bone 21 腭裂patoschisis 22臼齿molar tooth 23腭骨palatine bone 24翼孔pterygoid apertures 25破裂孔foramen lacerum 26枕大孔foramen magnum 27腭后孔posterior palatine foramen 28鼻后孔posterior nasal apertures 29卵圆孔foramen ovale 30鼓骨tympanic bone 31舌下神经孔hypoglossal foramen 32下颌联合mandibular symphysis 33颏孔mental foramen 34冠状突coronoid process 35下颌支ramus of mandible 36角状突process of horn 37下颌孔mandibular foramen 38翼肌窝pterygoid fossa 39髁突condylar process

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