昆虫杆状病毒细胞表达系统 课件

杆状病毒表达蛋白

杆状病毒表达蛋白 1 donor vector的构建 1.1 外源基因的连接 1.2 转化 1.2.1 取10μL连接产物放入100μL感受态细胞中。 1.2.2 冰浴30min。 1.2.3 42℃，90s。 1.2.4 马上放入冰浴中，2min。 1.2.5 加入800μL LB培养基，37℃，150rpm摇1hr。（LB 37℃预热） 1.2.6 取200μL涂Amp+LB平板。 1.2.7 37℃，恒温培养箱，倒置培养12-16hr。 1.3 鉴定 1.3.1 挑取10个单菌落于Amp+LB培养基中，37℃，225rpm，摇过夜。 1.3.2 小量提取质粒，操作步骤见附录2。 1.3.3 用SalI及XbaI双酶切鉴定连接结果。 1.3.4 取1ml菌液测序。 1.4 菌种的保存 1.4.1挑取单菌落于1-2ml Amp+LB培养基中。 1.4.2 37℃，225rpm摇至平稳期。 1.4.3 0.85ml细菌培养物+0.15ml灭菌甘油，混匀。 1.4.4 -80℃保存。 2 转座 2.1 转座反应 2.1.1 将DH10Bac放入冰中备用。 2.1.2 轻轻混匀，取100μL DH10Bac细胞于遇冷的15ml圆底灭菌管中。 2.1.3 加入下列质粒DNA并轻混匀。 pFastBac TM construct 1ng(5μL) pFastBac TM control 1ng PUC19 control 50pg 2.1.4于冰中放置30min。 2.1.5 42℃，热激45s，不要摇动。 2.1.6 马上放入冰浴中，2min。 2.1.7 加入900μL室温LB培养基。 2.1.8 37℃，225rpm摇4hr。 2.1.9准备一系列10倍稀释的细菌培养物（10-1、10-2、10-3），每板加入100μL的稀释菌液。（平板为：50μg/ml kana、7μg/ml的genta、10μg/ml tet、100μg/ml Bluo-gal、40μg/ml IPTG）。 2.1.10 37℃，倒置培养48hr，挑取白斑进行分析。

昆虫杆状病毒诱导宿主行为变化及其分子机制

Science of Sericulture 蚕业科学 收稿日期：2013－06－14接受日期：2013－06－30资助项目：国家自然科学基金项目（No．31272506）。第一作者信息：王国宝（1987－），男，博士研究生。 E-mail ：gbwang0216@163．com 通信作者信息：吴小锋，教授，博士生导师。 E-mail ：wuxiaofeng@zju．edu．cn * Corresponding author．E-mail ：wuxiaofeng@zju．edu．cn 2013，39（5）：1005－1010 ISSN 0257－4799；CN 32－1115/S E-mail ：CYKE@chinajournal．net．cn 昆虫杆状病毒诱导宿主行为变化及其分子机制 王国宝吴小锋 （浙江大学动物科学学院，杭州310058） 摘要最近的研究发现杆状病毒感染能够诱导宿主昆虫产生行为变化，典型的表现为寄主运动能力的增强。从生物学的 角度分析，这是杆状病毒有利于自身传播的操控策略。本文综述了3种典型杆状病毒诱导宿主昆虫行为发生变化的现象以及其可能的分子机制。其中，舞毒蛾核型多角体病毒（LdMNPV ）的egt 基因能够引起吉普赛舞毒蛾（Lymantria dispar ）出现异常活跃的攀爬行为；而家蚕（Bombyx mori ）与甜菜夜蛾（Spodoptera exigua ）幼虫分别被家蚕核型多角体病毒（BmNPV ）和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV ）感染后，出现爬行异常活跃的行为则是由于病毒中ptp 基因的存在。不同种类的杆状病毒对宿主昆虫行为的操控策略不同，对杆状病毒操控宿主行为的分子机制的探索是一个新的研究领域，其研究成果不仅有助于揭示杆状病毒与寄主的互作关系，而且将为农林病虫害的生物防治提供新的参考策略。关键词 杆状病毒；egt 基因；ptp 基因；昆虫宿主；行为 中图分类号 S884．5+1 文献标识码 A 文章编号0257－4799（2013）05－1005－06 Host Behavior Alteration and Its Underlying Molecular Mechanism upon Infection of Insect Baculovirus WANG Guo-Bao WU Xiao-Feng * （College of Animal Sciences ，Zhejiang University ，Hangzhou 310058，China ）Abstract Recent studies discovered that baculovirus infection could induce behavior alteration on their host insects．A typ- ical consequence of it is the enhanced locomotor activity．In view of biology ，it is a manipulatory strategy of baculovirus that favors its own transmission．This paper describes behavior alterations in host insect caused by three types of baculov-irus and possible molecular mechanisms underlying the alterations．Among them ，the egt gene of LdMNPV is essential for the hyperactive climbing behavior of Lymantria dispar ，while the ptp gene of BmNPV and AcMNPV is the cause of abnor-mal wandering behavior of Bombyx mori and Spodoptera exigua lavrae．Different types of baculovirus have various mecha-nisms in manipulating host insect behavior．Studies on the underlying molecular mechanisms of such behavior manipula-tions constitute a new and fascinating research field．It will not only uncover the interactive relationship between baculovirus and their host insects but also provide new strategy for biological control of agricultural and forestry pests /diseases．Key words Baculovirus ；egt gene ；ptp gene ；Insect host ；Behavior 杆状病毒是一个庞大的病毒家族，其基因组大 小在80 180kb 之间，为共价闭合环状双链DNA ，包含100多个基因。有趣的是，其中超过10%的基因是从原始宿主中通过水平转移获得的，这些基因 被利用后更加有利于病毒的复制和传播［1］ 。已发现的几百种昆虫杆状病毒分为杆状病毒属（NPV ）和颗粒体病毒属（GV ）2个属。杆状病毒在感染循环过程中会产生遗传物质完全一致但表型具有差

杆状病毒表达系统简介

体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。 1、杆状病毒的生物学特性 杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用： ①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。 ②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。 昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。 近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该病毒是杆状病毒科 Baculoviridae 的原型，是一种大的、带外壳的双链DNA病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体的杆状病毒，主要是来自家蚕的NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好的应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同的特征。 AcNPV的基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白：多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因现在都已被定位和克隆这两个基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。 杆状病毒基因组的结构和功能研究 杆状病毒基因组为双链环状 DNA分子。DNA以超螺旋方式被压缩包装在杆状核衣壳(rod.shaped nueleocapsid)内，核衣壳包被脂质蛋白囊膜(envelope)后形成病毒粒子。核衣壳包括衣壳(capsid)蛋白和髓核(COle)。其中衣壳蛋白是杆状病毒粒子的主要结构蛋白；髓核由病毒DNA分子和与其密切相关的碱性蛋白构成。碱性蛋白同DNA紧密结合以维持其复杂有序的超螺旋结构。 目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)b]、家蚕核多角

杆状病毒介绍

杆状病毒 关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型多角体病毒，颗粒体病毒，质型多角体病毒 杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA 分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA 插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。核型多角体病毒有两种形式： 一种为包含体病毒(occluded virus，OV)， 另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。 它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该病毒是杆状病毒科 Baculoviridae的原型，是一种大的、带外壳的双链DNA病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体的杆状病毒，主要是来自家蚕的NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好的应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同的特征。 AcNPV的基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白：多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因现在都已被定位和克隆这两个基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。

定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法

定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法 摘要 本发明提供一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法，该方法利用重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞后会干扰宿主细胞的生长和复制，通过酸性磷酸酶法检测细胞的数量实现定量测定重组昆虫杆状病毒滴度。该方法灵敏度高，准确性好，所需试剂廉价易得；操作简便，技术容易掌握；耗时较短，效率更高。 说明 定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法 技术领域 [0001] 本发明涉及病毒滴度测定，具体地，涉及一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。背景技术 [0002]自从80年代初发现杆状病毒科核型多角体病毒的多角体蛋白基因(polh)的强启动子特性后，Smith and Summer [Smith GE, MD Summers and MJ Fraser.Production ofhuman beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expressionvector.Mol Cell Biol.1983; 3 (12): 2156-2165]首次建立了杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression Vector System, BEVS)。杆状病毒表达系统已成为当今基因工程领域四大表达系统之一，与大肠杆菌、酵母哺乳动物细胞表达系统相比，BEVS在以下四个方面具有特殊的研究价值:(I)作为超高效的真核基因表达系统，生产有用的目的蛋白； [2]作为基因工程病毒杀虫剂，提高害虫防治效率；(3)研究杆状病毒基因组的结构和功能；(4)研究真核基因的表达调控机制。杆状病毒表达载体系统已成为研究各种原核蛋白和真核蛋白的非常有效和广泛使用的工具[李卫国，王厚伟，牟志美，石连辉.昆虫重组杆状病毒获得技术研究展望.山东农业大学学报(自然科学版).2003，34(1): 134-138]。 [0003] 检测病毒滴度的方法有终点稀释法和空斑法。终点稀释法是常用检测病毒滴度的方法，具有简便、快速的特点。它是将病毒进行梯度系列稀释后感染细胞，通过检测50%组织细胞感染量(TCID5tl)来判定病毒滴度。空斑技术最早是由Dulbecco建立[DulbeccoR.-Production of plaques in monolayer tissues by using single particles ofanimal virus.Proc Nat Acad Scil952; 38 (8): 747-752], Hink 和Vial 后来把这项技术应用于杆状病毒的研究工作。空斑法是将适量病毒感染细胞后，病毒在感染的细胞内复制、增殖并释放出游离病毒粒子，这些游离病毒粒子由于受到琼脂糖固定培养基的限制，只能感染邻近的细胞。经过几个感染周期以后，这些被感染的细胞均死亡而不被中性红染色，周围的活细胞则被染成红色，于是在最初被病毒感染的细胞周围形成一个无色透明区域，即空斑。通过计数空斑的数量即可判定病毒滴度。

鸡IgM μ 链在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达

鸡IgM μ 链在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达 及其反应原性的测定 赵莉1，2，3，步志高2*，鲍恩东1* （1.南京农业大学动物医学院南京 210095；2.中国农科院哈尔滨兽医研究所国家重点实验室生物技术六室，哈尔滨 150001； 3.瑞普（天津）动物药业有限公司天津 300300） 摘要：本研究构建了表达鸡IgM μ链蛋白的重组杆状病毒rBac-c IgMμ。采用抗c IgM μ 链蛋白的多克隆抗体间接免疫荧光检测重组杆状病毒表达的c IgMμ 蛋白，显示出良好的特异免疫反应原性。以感染rBac-c IgMμ 的昆虫细胞裂解液上清包被96孔ELISA板，抗鸡IgM μ 链蛋白多克隆抗血清为一抗间接ELISA 检测，同样具有良好的敏感性和特异性。结果表明，重组杆状病毒能良好表达鸡IgM μ 链蛋白，且其表达产物具有良好的反应原性。 关键词：鸡IgM μ 链； 重组杆状病毒；反应原性 IgM是机体初次体液免疫应答中最早出现的免疫球蛋白，其在血清中的含量会在首次接触抗原的几天内达到高峰（杜念兴，1997），然后通过免疫球蛋白类转换作用转变为IgG而使其含量逐渐下降（Nossal et al, 1964；Coleclough et al, 1980; DePinho et al, 1984；Wabl et al, 1978；Yancopoulos et al, 1986；Burrows et al, 1983）。由于记忆B细胞并不大量分泌IgM，所以IgM的升高预示近期机体内有抗原出现，因此，IgM在动物疾病的早期诊断方面发挥着重要作用（杨汉春, 2003）。由于目前各类传染病危害严重，迫切需要一种有效的早期诊断试剂进行快速诊断以控制病情，淘汰感染畜禽，减少损失。本试验利用杆状病毒—昆虫细胞系统表达了鸡IgM μ 链蛋白，由于杆状病毒表达系统在外源基因的表达方面具有糖基化、磷酸化和蛋白切割加工修饰过程，表达产物的理化性质和生物学特性与天然蛋白相似（刘高强等，2004；王清华等，2006；董双林等，2006；李雪菲等，2005），因此用该蛋白包板建立的间接ELISA便于筛选出可以与天然IgM表位特异性反应的单抗，从而可为进一步建立快速灵敏的抗鸡IgM μ 链诊断试剂盒奠定基础。

杆状病毒表达系统及其应用进展

综述与专论 生物技术通报 BI OTEC HNOLOG Y BULLETI N 2010年第10期 杆状病毒表达系统及其应用进展 韦永龙 李轶女 张志芳 沈桂芳 (中国农业科学院生物技术研究所,北京100081) 摘 要: 杆状病毒是节肢动物门的专性寄生病毒,20世纪80年代被开发为表达载体以来,由于其真核表达环境等优点,受到了广泛的重视和研究,短短不到30年的时间里,杆状病毒表达体系的重组载体构建技术,筛选技术得到了很大程度的改进和简化,成为与大肠杆菌、酵母、哺乳动物相并列的四大表达体系之一。在表面展示,类病毒颗粒表达,哺乳动物基因转移,RNA 干扰等方面取得了重要的成果。就杆状病毒表达系统的发展及其应用作一个综述。 关键词: 杆状病毒 BEVS 表达 Advances i n Research and Application of Bacul ovirus Expression Syste m W ei Y onglong L i Y i nv Zhang Zhifang Shen G uifa ng (B i o tec hnology Research Instit ute ,CAAS,B eijin g 100081) Abstrac:t Bacu l ov iruses are ob li g ate l e t ha l pathogens o f arthropodas .They have been h i gh l y va l ued and w ide l y stud ied si nce be i ng explo ited as a expression vector i n 1980s ,for t he ir exce llen t advantag e i nclud i ng eukaryotic express i on env iroment .In l ess t han 30years ,g reat advances have ach i eved i nvolv i ng reco m b i nant baculovirus constructi on and sc reeni ng .T hus ,t he bacul ov irus expressi on vec tor syste m (BEV S)has beco m e one o f the f our m ost popular expression syste m co m prisi ng bacte ri um ,yeasts ,m a mma li an ce lls and bacu loviruses .T he BEV S has been used i n surface d isplay ,v irus li ke particles producti on ,m a mm a lian ce lls gene de livery ,RNA i nterfe r ence ,etc .The deve l op m ent and applica tion o f the BEV S i s reviewed i n this arti c l e . K ey words : Bacu l ov irus BEVS Express i on 收稿日期:2010 04 26 基金项目:国家自然科学基金项目(30770279),国家!863?计划项目(2006AA10A119)作者简介:韦永龙,硕士,研究方向:分子病毒学;E ma i :l w ei yonglong @126 com 通讯作者:沈桂芳,教授,E m ai:l gf sh2008@caas net c n 杆状病毒是一种DNA 双链病毒,基因组约 80-160kb 之间。杆状病毒是节肢动物门的专性寄生病毒,目前已报道有600种以上的昆虫被杆状病毒所感染,包括鳞翅目、膜翅目、双翅目等7个目[1] 。根据包涵体的形态和病毒诱导的细胞病理学特征,杆状病毒分为核多角体病毒属(nucleopolyhedr ovirus ,NP V ) 和颗粒体病毒属(g r anulov ir us ,GV )[2] 。杆状病毒表达系统(baculov ir us e xpression vector syste m,BE VS )是一个利用杆状病毒作为载体,在昆虫培养细胞或虫体中表达外源蛋白的真核表达系统。具有安全性高,真核修饰环境,容量大,表达量高等特点,自Sm it h GE 等于1983年利用A c NPV 成功表达外源蛋白以来,经过不到30年的发展,杆状病毒表达系统已经成为当今基因工 程四大表达系统(杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物 细胞表达系统)之一。 杆状病毒基因组较大,不易通过常规酶切连接载入外源基因,所以通常是将外源基因连接到转移载体上,此类转移载体含有病毒的两个同源臂,一个或多个杆状病毒启动子,将外源目的基因插入到启动子下游之后,与杆状病毒重组,获得重组病毒,将重组病毒纯化,感染昆虫细胞或虫体,外源基因随着病毒的复制的而获得表达。 1 重组杆状病毒的构建和纯化 最早的重组病毒构建使用的是野生病毒,当病毒与转移载体发生重组之后,病毒的多角体蛋白基因受到破坏,不能形成多角体,感染这种重组毒株的

哺乳动物细胞表达系统

哺乳动物细胞表达系统 按照宿主细胞的类型，可将基因表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统。与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。从最开始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的30余年间，哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因工程药物的生产平台，在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。本文主要从表达系统及其两个组成部分——表达载体和宿主细胞等方面，简要介绍哺乳动物细胞表达系统和相关的研究进展。 研究现状 ①部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生产或中试生产阶段。 ②已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子Ⅷ、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素Ⅲ，集落刺激因子等。有些产品已投入临床应用或试用。 ③虽然经过多年努力，哺乳动物细胞表达系统的表达水平有大幅度增高，但从整个水平上看仍偏低，一般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即1-30μg/l08细胞/24小时。有人认为其限速步骤可嚣是在工程细胞中(对于重组蛋白来讲，常是异源的)，重组蛋白的分泌效率较低。 1 表达载体 1．1 表达栽体的类型 哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。 根据进入宿主细胞的方式，可将表达载体分为病毒载体与质粒载体。病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(sFv)载体等。另外，杆状病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达在近几年颇受重视，这是因为它与其它病毒载体相比有特有优势，如可通过昆虫细胞大量制备病毒颗粒；可感染多种哺乳动物细胞，但在细胞内无复制能力，生物安全度高；可插入高达38 kb的外源基因等。 质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体分为整合型和附加体型载体两类。整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在，如SV40病毒载体、反转录病毒载体和游离型如痘苗病毒、腺病毒载体。利用Sindbis virus(SV)、Scmliki Forest virus(sFV) 和痘苗病毒载体感染哺乳动物细胞表达的蛋白在结构与功能上与天然哺乳动物来源的蛋白更相似。Liljestrom等利用SFV病毒载体感染哺乳动物细胞获得的外源蛋白占细胞总蛋白的；而附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在。整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性。相比之下，附加体型载体不存在这方面的问题，但载体DNA在复制中容易发生突变或重排。 附加体型载体在胞内的复制需要两种病毒成分：病毒DNA的复制起始点(ori)及复制相关蛋白。根据病毒成分的来源不同，附加体型表达载体主要分为4大类，表2对这几类附加体载体进行了简要的概括。 载体的选择取决于外源基因的导人方式和其调控元件是否有利于转录和翻译。真核

杆状病毒对昆虫有什么危害

杆状病毒对昆虫有什么危害 杆状病毒感染会让昆虫患病，目前发现的有： 1.颗粒病体 根据39蜂疗网调查目前仅见于鳞翅目昆虫。其自然侵染过程与细胞病变均类似于核型多角体病，但病虫症状与核型多角体病不同，病虫皮色变灰或乳黄，虫尸以腹部前端1～2对腹足握持植物枝条，虫尸以“∧”型倒挂。幼虫被感染后至少至4日龄才发病，死于化蛹前，病虫生存期常大于21天。 2.核型多角体病 现已发现280余种核型多角体病，约占昆虫病毒病总数的40％，大多侵染鳞翅目昆虫。 核型多角体病的自然感染过程为：昆虫吞食了被病毒污染的食物，病毒即进入中肠，在昆虫中肠碱性消化液的作用下，多角体被溶解，释放出病毒粒子，游离病毒粒子的囊膜与中肠上皮细胞绒毛的膜融合，核衣壳侵入细胞中，脱壳后，病毒的DNA经细胞核膜的核孔侵入细胞核内，开始其增殖过程。 随病毒的增殖，细胞表现的病理变化为：细胞核内染色质凝集成块，核仁增大，数目增多，RNA合成旺盛，合成出的RNA不断转移到细胞质中；凝集的染色质块集中于细胞核中部形成网状结构的病毒发生基质，在病毒发生基质中病毒的DNA大量合成。随后，在病毒发生基质表面核衣壳开始装配，并不断移到细胞核周围，大部分包入新形成的囊膜内，成为成熟的病毒粒子。最后在病毒发生基质周围形成一个环状带，在带上开始多角体的结晶，病毒粒子随机地包入多角体中，多角体约到一定大小后停止生长，在其表面形成了一层难溶的多角体膜。从多角体开始形成时起，病毒发生基质开始缩小，待多角体充满细胞核后，病毒发生基质消失，核膨大，破裂，细胞随之崩解。 小部分未被包入多角体的病毒粒子，可随细胞崩解进入昆虫血体腔。血体胶中病毒粒子的靶细胞为：气管皮膜细胞，脂肪细胞，肌肉细胞，真皮细胞，血细胞及神经、生殖腺、丝腺等几乎所有组织的细胞。 最后新形成的大量多用体充满了昆虫整个血体腔。 蛀虫幼虫被感染后，4～5天体液是乳白色，厌食，不喜运动，多数移到植物枝条顶部后死亡，虫体软化，脚失去握持力，仅以1～2对臀足附着在植物枝条上，最后松弛倒挂死之。体内组织完全溶解，变成黑褐色，表皮完整但脆弱易破裂。从感染到处亡约1～2周。

杆状病毒

杆状病毒多角体病多角体病毒，颗粒体病毒，质型关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型毒病毒粒子呈杆DNA病毒，感染节肢动物得杆状病毒就是一类在自然界中专一性以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大DNA DNA分子，状，基因组为双链环状之间。目前杆状病毒作为高效、安全得无公害生物虫剂广泛应180 Kb小在90～多种杆状病毒，600 杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽 然已发现用于害虫防治。DNA杆状病毒得基因组为单一闭合环状双链但进行分子生物学研究得不到20种。复制后组DNA，其基因组可在昆虫细胞核复制与转录。分子，大小为80～160 kbDNA装在杆状病毒得核衣内，后者具有较大得柔韧性，可容纳较大片段得外源用作外源基因表达载体得杆其中，DNA得理想载体。插入，因此就是表达大片段。该NPV)(nuclear polyhedrosis virus，状病毒，目前仅限于核型多角体病毒呈多角得包含体病毒，1~5 m病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约体形状。核型多角体病毒有两种形式：，，OV)一种为包含体病毒(occluded virus BV)。，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus它们在病毒感染中扮演得角色不同，包含体病毒就是昆虫间水平感染得病毒形得食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋式，昆虫往往就是食入污染OV得多角体蛋白，它对病毒得水平感染起以下作用：①保护白晶体，即为29 000②保证 病毒颗粒在适当病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素得破坏而失活。，可使病毒、5)得位置释放，引起感染。昆虫中肠上皮局部得强碱性环境(pH=10病毒 就是个体内细胞间得感染形式，由细胞芽颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV BV，进入血淋巴系统中感染其它部位得细胞或直接在临近细胞内感染。生出有关杆状病毒基因结构、功能与表达调节得研究进展迅速，其中研究近几十年，最深入得就是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病xumù毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该 病毒就是杆状病毒科 Baculoviridae得原型，就是一种大得、带外壳得双链DNA 病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体得杆状病毒，主要就是来自家蚕得NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好得应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同得特征。 AcNPV得基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期 基因表达与极晚期基因表达。前两个阶段得基因表达早于DNA复制，而后两个阶段得基因表达则伴随着一系列得病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达得蛋白，它们就是多角体蛋白与P10蛋白：多角体蛋白就是形成包含体得主要成分，感染后期在细胞中得积累可高达30％~50％，就是病毒复 制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定与感染能力另一类高效表达得极晚期蛋白为P10蛋白，也就是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因与P10基因现在都已被定位与克隆这两个基因得启动子具有较强得启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想得外源基因插入位点。 1、杆状病毒基因组得结构与功能研究 以超螺旋方式被压缩包装DNA分子。DNA 杆状病毒基因组为双链环状 在杆状核衣壳(rod、shaped nueleocapsid)内，核衣壳包被脂质蛋白囊膜

杆状病毒——昆虫细胞表达系统

实验材料： 1. 重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。 2. 昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自Roche。 实验步骤： 一、昆虫细胞转染： 1． Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。 2．准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物： a. 溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。 b. 转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。 c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。 3．重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。 4．取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。 5．移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。 二、病毒贮液的制备： 1. 病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。 2. 上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。 3. 病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量： 感染所需病毒贮液量(ml)= [MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)] 注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。 4. 扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下： a. 转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。 b. 每孔加入适量的P1贮液，27℃湿盒孵育48h。 c. 根均细胞病变情况（约48h后）收集各孔中的病毒上清液，500g离心5min取上清，即为P2病毒贮液。4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。 d. 制备了高效价的P2液后，按上述方法扩增P3贮液，用于高效表达。 三、病毒贮液初步鉴定 1. SDS-PAGE蛋白电泳：取P2或P3病毒贮液浓缩后上样（或直接上样）进行SDS-PAGE 蛋白电泳，初步根据分子量对表达蛋白进行鉴定。CAT-his融合蛋白分子量约为28KDa，nsp6-his融合蛋白分子量约为34KDa。 2. western blot：以小鼠抗his单克隆抗体鉴定在相应条带出是否有his标记。 3. 以CAT-ELISA检测试剂盒检测Bacmid/CAT对照的蛋白表达情况。方法详见CAT-ELISA 试剂和说明书。 结果 1. CAT-ELISA检测试剂盒成功检测出对照CAT质粒在细胞中的表达，同时可测于上清和细

杆状病毒表达系统00000001

昆虫杆状病毒系统高效表达重组蛋白 ●杆状病毒表达系统介绍 ●杆状病毒蛋白表达系统的优势 ●杆状病毒表达载体系统（BEVS） ●杆状病毒表达宿主细胞 ●表达优化条件 ●翻译后修饰对蛋白表达的影响 ●高通量表达 ●总结

杆状病毒介绍 1.杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状 DNA病毒。 2.杆状病毒在其生命周期中有两种不同的形态： 一种为出芽型病毒（budded virus, BV），另 一种为包含体病毒（Occlusion‐derived virus, OV）。 3. BV由糖蛋白GP64包裹的单一囊膜蛋白和膜蛋白构成。 4. OV由蛋白结晶基体包裹的多囊膜病毒粒子。 5. 研究最多的杆状病毒株为苜蓿银蚊夜蛾(autogra— phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro‐sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。 6. AcMNPV只侵染鳞翅类幼虫。

杆状病毒生命周期 ●早期（0‐6h PI） ?核衣壳迁移到细胞核 ?病毒DNA释放 ?开始早期基因表达 ●晚期（6‐24h PI） ?更多DNA复制 ?新产生的核衣壳离开细胞核，随后在离开细胞质 ?的过程中得到囊膜蛋白 ?产生新的出芽病毒 ●极晚期 Courtesy: Dr. Linda Lua, The University of Queensland, Australia ?出芽病毒减少 ?核衣壳在细胞核内得到囊膜蛋白形成MNPVs ?MNPVs以多晶体形式出芽，主要是多角体蛋白，形 成包含体病毒。 多角体启动子是杆状病毒表达载体系统的主要元件。

昆虫细胞表达系统

昆虫细胞表达系统 昆虫细胞表达系统是四大表达系统（昆虫细胞、细菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统）之一。昆虫细胞表达系统原理是通过转座作用将转移载体中的表达组件定点转座到能在大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体（Bacmid）上，通过抗性和蓝白斑筛选到重组穿梭质粒，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒。将病毒上清浸染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白。 杆状病毒是一类闭合环状双链病毒，病毒粒子呈杆状，以昆虫为主要宿主。杆状病毒还是一种出芽型分泌性病毒粒子，在感染细胞后能迅速在培养细胞中水平传播而保持细胞在相当长的时间内不裂解，从而最大限度地保持了外源蛋白的稳定，昆虫细胞表达系统又被称为昆虫杆状病毒系统。昆虫细胞表达系统本身是一个蛋白裂解性系统，在杆状病毒感染昆虫细胞的过程中，杆状病毒可以编码一些蛋白酶如木瓜蛋白酶等导致蛋白的降解。因此，收集细胞后，在裂解细胞之前要加入蛋白酶抑制剂防止蛋白的降解。 昆虫细胞表达系统属于真核细胞表达系统，但又不同于酵母及哺乳动物细胞表达系统，酵母表达的蛋白易纯化但也易降解，而哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白具有生物活性但成本高。细菌表达系统属于原核表达系统，操作简单、周期短收益大、表达产物稳定，但是表达基因的相对分子量有限，且不能对表达产物进行翻译后加工修饰。而昆虫细胞表达系统具有很多优点： (1)具有糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用等一系列蛋白质翻译加工修饰系统； (2)正确的蛋白折叠、二硫键形成，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，有利于表达产物形成天然的高级结构； (3)具有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等；

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统 试剂盒内容物： Introduction： Overview： Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座子的表达框的质粒在Ecoli中扩增。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。 *一个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产生重组杆粒。 *一个控制表达的质粒，包括Gus和/或CAT基因，以便在感染细胞后产生重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。 Bac-to-Bac表达系统的优点： 使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点： *与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的4-6周相比，鉴别纯化重组病毒少于两周 *减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率 *可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白 选择pFastBac菌体（Vector）： 大量的pFastBac菌体都适于进行Bac-to-Bac表达系统。选择对于你的需要最合适的菌体。

指南提供了一个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导： 1、克隆目的基因到pFastBac TM供体质粒的选择 2、转化pFastBac TM 结构到最高效的DH10Bac TM产生重组质粒 3、转染重组质粒DNA到昆虫细胞产生重组杆状病毒 4、扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使用病毒株感染昆虫细胞表达目的重组蛋白 重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组杆状病毒，在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系统。虽然他可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白，但是使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表达背景的使用者。我们高度推荐使用者具有病毒和组织培养的技术和知识。 Bac-to-Bac表达系统 表达系统的成分： 表达系统简单高效的产生重组杆状不能给党。基于Luckow1993年的方法，此系统利用了位点特意的专座子Tn7区简化和提高重组质粒DNA *系统的第一个成分是用来克隆目的基因的pFastBac TM菌株。基于pFastBac TM菌株的选择，表达基因被AcMNPV的PH或p10启动子控制，在昆虫细胞内高水平表达表达框被Tn7 的左右臂包围，并且包含一个庆大霉素抗性点和SV40多腺苷酸化信号，形成一个微型的Tn7 *第二个主要结构是Ecoli的DH10Bac TM品系，用来作为pFastBac TM菌株的宿主。DH10Bac TM细胞包含带有微型-attTn7靶位点的病毒质粒和辅助质粒（详细见下文）。一旦pFastBac TM表达质粒转入DH10Bac细胞，转化就会发生在pFastBac TM菌株的微型Tn7单位和微型-attTn7的靶位点之间产生重组质粒。这个转化反应发生在辅助质粒提供的转化蛋白处。 如果你已经完成了转化反应，你需要分离这个高分子量的重组质粒DNA并将质粒DNA转染如昆虫细胞趋产生重组杆状病毒，用来进行初步表达实验。在杆状病毒株扩增和滴定后，高效价的病毒株可以用来感染细胞，进行大规模的重组蛋白的表达。 杆状病毒菌株： 病毒菌株（杆粒），bMON14272(136KB)，在DH10Bac Ecoli中包括： *一个低拷贝的微型F复制子 *卡那霉素的抗性标记 *一个来自于pUC载体的编码LacZa肽的DNA片段，用来接触病毒转座子，Tn7（微型attTn7）已经被插入。插入的微型attTn7不会中断LacZa肽的阅读框。 杆粒在具有卡那抗性的大的质粒Ecoli DH10Bac中扩增，在显色物质如Bluo-gal 或X-gal和诱导剂IPTG 存在时，能补充染色体LacZ的缺失形成蓝斑（LacZ+） 辅助质粒：DH10Bac Ecoli也包含辅助质粒，pMON7124(13.2kb)，他编码转移酶和四环素抗性基因。这个辅助质粒提供Tn7 转化功能。 图示Bac-toBac系统：下图刻画了重组病毒的产生和目的基因的表达