凝胶电泳实验原理与步骤

一、实验目的

学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理和方法。

二、实验原理

琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。

三、实验材料

实验14提取的DNA样品，

四、器具及药品

电泳仪，电泳槽，紫外透射反射仪，恒温水浴锅，微波炉，微量进样器，三羟甲基氨基甲烷，盐酸，醋酸钠，EDTA，琼脂糖，溴酚蓝，溴化乙锭。

五、实验步骤

1、安装电泳槽

将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。

2、琼脂糖凝胶的制备

称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，（按0.3-1.5%的琼脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝胶，20-100kb的DNA用0.5%的凝胶，200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶）置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化（不要加热至沸腾），取出摇匀。

3、灌胶

将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。

4、待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。

5、加样

将DNA样品与加样缓冲液按4：1混匀后，用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加10-20μl，记录样品的点样次序和加样量。

6、电泳

安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至3-5V/cm，电泳1-3hr，当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。

7、染色和观察

取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外灯下观察，有橙红色荧光条带的位置，即为DNA条带，或在紫外灯下照相记录电泳图谱。溴化乙锭是致癌剂，操作时要小心，必须戴手套。

附：

⑴5×TBE（tris-硼酸及EDTA）缓冲液的配制(1000ml)：

Tris 54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA 20ml，将pH调到8.0，定容至1000ml，4℃冰箱保存，用时稀释10倍。

⑵加样缓冲液的配制：

0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。

⑶溴化乙锭的配制：

称取0.1g溴化乙锭，溶于10ml水，配成终浓度为10mg/ml的母液，4℃冰箱保存。染

色时，吸取12.5μl的母液，加入250ml的水中，使其终浓度为0.5μg/ml，混合均匀。

⑷100倍TE缓冲液的配制：

1mol/L Tris-HCl（pH8.0），100mmol/LEDTA

称取Tris121.1g，EDTA-Na237.23g，先用800ml双蒸水，加热搅拌溶解后，再用盐酸调pH 至8.0（大约加入盐酸20ml），然后定容至1000ml。

⑸100倍电泳缓冲液的配制：

4mol/LTris-HCl（pH8..0），2mol/L醋酸钠，200mmol/LEDTA

称取Tris242.2g，无水乙酸钠82.03g，EDTA-Na237.23g，先用400ml双蒸水加热搅拌溶解后，再用冰乙酸调pH至8.0（大约加入冰乙酸50ml），然后定容至500ml。用时稀释100倍。

毛细管电泳实验报告

毛细管电泳实验报告 高乃群S0 实验目的 1.了解毛细管电泳实验的原理 2.掌握毛细管电泳仪的操作方法,并设计样品组分的分析过程. 3.学会处理实验数据,分析实验结果. 实验原理C E所用的石英毛细管柱, 在pH>3情况下, 其内表面带负电, 和溶液接触时形成了一双电层。在高电压作用下, 双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象叫电渗, 粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)两种速度的矢量和, 正离子的运动方向和电渗流一致, 故最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反, 但因电渗流速度一般都大于电泳流速度, 故它将在中性粒子之后流出, 从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。 电渗是CE中推动流体前进的驱动力, 它使整个流体像一个塞子一样以均匀速度向前运动, 使整个流型呈近似扁平型的“塞式流”。它使溶质区带在毛细管内原则上不会扩张。 一般来说温度每提高1℃, 将使淌度增加2% (所谓淌度, 即指溶质在单位时间间隔内和单位电场上移动的距离)。降低缓冲液浓度可降低电流强度, 使温差变化减小。高离子强度缓冲液可阻止蛋白质吸附于管壁, 并可产生柱上浓度聚焦效应, 防止峰扩张, 改善峰形。减小管径在一定程度上缓解了由高电场引起的热量积聚, 但细管径使进样量减少, 造成进样、检测等技术上的困难。因此, 加快散热是减小自热引起的温差的重要途径。

实验设备：电泳仪。仪器及试剂： 缓冲溶液(buffer)：20 mmol/L Na 2B 4 O 7 缓冲溶液。1mol/L NaOH溶液，二次 去离子水。未知样饮料（雪碧和醒目） 1．实验步骤仪器的预热和毛细管的冲洗：打开仪器和配套的工作站。工作温度设置为30℃，不加电压，冲洗毛细管，顺序依次是：1 mol/L NaOH溶液5 min， 二次水5 min，10 mmol/L NaH 2PO 4 -Na 2 HPO 4 1:1缓冲溶液5 min，冲洗过程中出 口(outlet)对准废液的位置，并不要升高托架。 2．混合标样的配制：毛细管冲洗的同时，配制标样苯甲酸浓度依次为、、、、1 mg/ml。 3．做标准曲线：待毛细管冲洗完毕，取1 ml混合标样，置于塑料样品管，放在电泳仪进口(Inlet)托架上sample的位置，然后调整出口(outlet)对准缓冲溶液(buffer)，升高托架并固定，然后开始进样。进样压力30 mbar，进样时间5 s。进样后将进口(Inlet)托架的位置换回缓冲溶液(buffer)，切记换回buffer 的位置！选择方法，修改合适的文件说明，然后开始分析，电压25 kV，时间约10 min。 4．未知浓度混合样品的测定：方法与条件同上，测试未知浓度混合样品，分析时间约25min，据苯甲酸钠标准曲线测雪碧与醒目这两种饮料中的苯甲酸钠的

血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳实验报告

血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳实验报告 实验名称血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量 实验日期实验地点xx实验室 合作者xxx 指导老师xxx 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.1.学习醋酸纤维薄膜电泳的基本原理和操作方法； 1.2.了解电泳技术的一般原理； 1.3.掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量的方法。 二、实验原理 2.1.血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。 血清蛋白质等电点分子量占总蛋白的％ 清蛋白 4.64 69,000 57～72 α1－球蛋白 5.06 200,000 2～5 α2－球蛋白 5.06 300,000 4～9 β－球蛋白 5.12 90,000～150,000 6.5～12 γ－球蛋白 6.85～7.3 156,000～950,000 12～20 缓冲液pH=8.6，pI＜pH。

血清蛋白带负电荷，在电场中向正极移动。 预测血清蛋白电泳区带图 血清蛋白依次分为清蛋白，球蛋白的α1、α2、β、γ五个区带 2.3.①膜条经过氨基黑10B染色后显出清晰色带；②各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比；③可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中；④用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。 三、材料与方法： 3.1.实验材料： 3.1.1.实验试剂：①样品：健康人血清（新鲜、无溶血）；②巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度0.06mol/L）；③氨基黑10B染色液；④漂洗液；⑤洗脱液：0.4mol/NaOH溶液。 3.1.2.实验器材：①V-1100分光光度计（×1）；②恒温水浴箱（×1）；③试管（×6）、试管架（×1）；④1000μL加样枪（×1）、加样枪架（×1）；⑤醋酸纤维薄膜（2cm*8cm，厚度120μm）；⑥培养皿（×5）；⑦点样器或载玻片（×1）；⑧平头镊子（×2）；⑨剪刀（×1）；⑩电泳槽（×1）；?直流稳压电泳仪（×1） 3.2.实验步骤 1．准备与点样：①取2×8cm的膜条；②亚光面距一端1.5cm处取一点样线；③充分浸透在巴比妥缓冲液中；④取出膜条，用滤纸吸去多余的缓冲液；⑤点样器下端粘上薄层血清；⑥垂直点样。 点样示意图：

qPCR实验操作流程

Q-PCR实验流程 一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打 开15-20分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。 二、总RNA抽提 1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min； 组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称） 2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致） 3）4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层） 4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min； 5）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g 离心10min，收集RNA沉淀），去上清； 6）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不

QPCR原理及应用

QPCR原理及应用 由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR 所代替。由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。 本文就从real-time qPCR的发展史说起，包括real-time qPCR的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！ 一、Real-time qPCR发展史 Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点，real-time qPCR 由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。 在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman 技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。从而荧光定量PCR获得广泛应用。现在的定量PCR 仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM系列；Roche LightCycler@系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。 随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的real-time PCR

PCR反应及琼脂糖电泳实验报告

多聚酶链式反应（PCR）扩增DNA片段及琼脂糖凝胶电泳产物检测 一、实验目的： 1、了解PCR技术的基本操作 2、理解PCR的原理 3、讨论PCR的应用 二、实验原理： PCR是一种在体外模拟细胞内环境进行迅速扩增DNA片段的技术，这一技术需要模板、四种脱氧核苷酸等组分条件外，还需要不同温度环境以进行DNA的解旋和聚 1、PCR反应组分 细胞内DNA复制条件分析： 2、PCR反应条件

PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR 仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。 PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸。 (!)变性（模板DNA解旋） 模板DNA经加热至90℃以上。一定时间后，使模板DNA双链解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。 (2)复性（退火） 模板DNA经加热变性成单链后，温度降到50℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 (3)延伸 DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。 3、PCR产物的检测 (1)紫外分光光度计 DNA在260nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，可以通过与蒸馏水的对比进而计算扩增出DNA的含量。 (2)琼脂糖凝胶电泳 DNA在电厂作用下，可以由电源的负极向正极泳动，泳动的速度与DNA片段的长度成负相关，与电压强度成正比，因此可以分离不同长度的DNA。在有DNA marker（不同已知碱基

对大小的DNA片段的混合物）的条件下，由于不同碱基大小的DNA片段在琼脂糖凝胶上涌动的速度不同，因此电泳完毕后会出现在胶块的不同位置。通过将扩增出的DNA片段与已知的条带做比较，可以大概推测出该片段的碱基对的大小。如果要进一步检测其大小，可以换另外规格的DNA marker 继续电泳。核酸荧光染料可以与DNA嵌合，一起电泳，DNA图谱观察仪可以激发特定的蓝色光源，荧光染料在该光照射下可见到荧光，荧光的亮度与DNA大小成正比。 三、实验仪器及试剂 7种PCR组分微量可调移液器离心管 PCR仪水平电泳槽电泳仪电源紫外分光光度计 250ml锥形瓶(封口膜) 记号笔卫生纸 四、实验步骤 1、DNA体外扩增 (1) 将所有试剂管瞬时离心一次（4000r/min,1min），使管壁没有残留药品，在引物 I 和引物II的离心管内用移液器各加入40ul双蒸水（ddH2O），混匀后瞬时离心一次。所有的离心管都摆到双面板上。 (2)向装有Taq DNA 聚合酶的离心管按下表加入以下成分： 原有的Taq DNA 聚合酶有15ul，此时混合液体系共计500ul,此步骤由第一、二组同学合作完成。（在实验老师的监督指导下操作，确保此后其他同学的实验顺利进行） (3)共分25组，第一、二组的同学并入其他小组进行实验。每组取20ul的上述混合液于的离心管中，加入15ul的液体石蜡封闭体系，以防止在加热过程中蒸发。 (4) 对自己组的离心管上进行标记之后，放到PCR仪上进行DNA扩增。 2、琼脂糖凝胶电泳检测DNA （1）用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子。 （2）配制浓度为1%（1 g/100 mL）的琼脂糖凝胶2块。在锥形瓶中，称取1g的琼脂糖粉，加入100ml 1x电泳缓冲液，用封口膜封住瓶口后在微波炉内加热，使琼脂糖粉熔化，

凝胶电泳实验报告模板

凝胶电泳实验报告模板

降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数，因此根据分子大小的不同、构成或形状的差异，以及所带的净电荷的多少，便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基因呈离子状态从这种意义上讲，D N A 和RNA多核苷酸链可叫做多聚阴离子( Polyanions ) 。因此，当核酸分子被放置在电场中时，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖- 磷酸骨架结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因而它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型，分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA 分子迁移要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。 聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 3.1 凝胶电泳的分类 按照分离物质来分凝胶电泳可以分为核酸凝胶电泳和蛋白质凝胶电泳；按照分离介质来分可以分为琼脂糖凝胶电泳技术和PAGE凝胶电泳。本次实验我们采用按介质的分类方法来学习的。 3.1.1琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他

(待分)rtpcr原理和实验步骤

原理与实验步骤 一、知识背景： 、基因表达： 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因个丝心蛋白（每个存活，可以合成个丝心蛋白）共合成个丝心蛋白。因此单拷贝基因的表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 、技术( )：即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于聚合酶的酶促反应，其特异性由两我工合成的引物序列决定。反应分三步： .变性：通过加热使双螺旋的氢键断裂，形成单链。 .退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。 .延伸：在聚合酶和及＋存在下，退火引物沿’’方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。 、逆转录酶和 逆转录酶（）是存在于病毒体内的依赖的聚合酶，至少具有以下三种活性： 、依赖的聚合酶活性：以为模板合成第一条链。 、水解活性：水解杂合体中的。 、依赖的聚合酶活性：以第一条链为模板合成互补的双链. 二、的准备： .引物的设计及其原则： ) 引物的特异性决定反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的剪切方式以及可能存在的对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。 ) 引物设计原则的把握 引物设计原则包括 : 、引物长度:一般为～，引物太短会影响的特异性，引物太长的最适延伸温度会超过酶的最适温度，也影响反应的特异性。 、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现个以上的单一碱基。含量（值）：％～％，扩增的复性温度一般是较低值减去～度。 、’端要求：’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是时错配的引发效率最低，、居中间，因此引物的’端最好选用、、而尽可能避免连续出现两个以上的。 、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。 、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于个连续碱基互补，’端不应超过个。、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续个的互补碱基存在。 、’端无严格限制：’末端碱基可以游离，但最好是或，使产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。 根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如，等对于这些条件都可以自行设置。 、耗材：

凝胶电泳实验原理与步骤

一、实验目的 学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理和方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。 三、实验材料 实验14提取的DNA样品， 四、器具及药品 电泳仪，电泳槽，紫外透射反射仪，恒温水浴锅，微波炉，微量进样器，三羟甲基氨基甲烷，盐酸，醋酸钠，EDTA，琼脂糖，溴酚蓝，溴化乙锭。 五、实验步骤 1、安装电泳槽 将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。 2、琼脂糖凝胶的制备 称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，（按0.3-1.5%的琼脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝胶，20-100kb的DNA用0.5%的凝胶，200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶）置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化（不要加热至沸腾），取出摇匀。 3、灌胶 将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。 4、待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。 5、加样 将DNA样品与加样缓冲液按4：1混匀后，用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加10-20μl，记录样品的点样次序和加样量。 6、电泳 安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至3-5V/cm，电泳1-3hr，当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。 7、染色和观察 取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外灯下观察，有橙红色荧光条带的位置，即为DNA条带，或在紫外灯下照相记录电泳图谱。溴化乙锭是致癌剂，操作时要小心，必须戴手套。 附： ⑴5×TBE（tris-硼酸及EDTA）缓冲液的配制(1000ml)： Tris 54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA 20ml，将pH调到8.0，定容至1000ml，4℃冰箱保存，用时稀释10倍。 ⑵加样缓冲液的配制： 0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。 ⑶溴化乙锭的配制： 称取0.1g溴化乙锭，溶于10ml水，配成终浓度为10mg/ml的母液，4℃冰箱保存。染

SDS-PAGE电泳实验步骤

垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 一、实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是： M r =K(10-b·m) logM r =LogK—b·R m ， 式中M r ——蛋白质的分子量； logK——截距； b——斜率； R m ——相对迁移率。 实验证明，蛋白质分子量在15,000—200,000的范围内，电泳迁移率与分子量

血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳实验报告

血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳实验报告 一、实验目的 1.1.学习醋酸纤维薄膜电泳的基本原理和操作方法； 1.2.了解电泳技术的一般原理； 1.3.掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量的方法。 二、实验原理 2.1.血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 2.2.①膜条经过氨基黑10B染色后显出清晰色带；②各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比；③可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中；④用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。 三、材料与方法： 3.1.实验材料： 3.1.1.实验试剂：①样品：健康人血清（新鲜、无溶血）； ②巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度0.06mol/L）； ③氨基黑10B染色液；④漂洗液；⑤洗脱液：0.4mol/NaOH

溶液。 3.1.2.实验器材：①V-1100分光光度计（×1）；②恒温水浴箱（×1）；③试管（×6）、试管架（×1）；④1000μL 加样枪（×1）、加样枪架（×1）；⑤醋酸纤维薄膜（2cm*8cm，厚度120μm）；⑥培养皿（×5）；⑦点样器或载玻片（×1）； ⑧平头镊子（×2）；⑨剪刀（×1）；⑩电泳槽（×1）；?直流稳压电泳仪（×1）四、结果与讨论条 4.1.结果分析本次实验得到的图谱只能够清晰的看出清蛋白和γ－球蛋白的区带，其余无法区别。原因可能如下：①醋酸纤维薄膜质量不足。②薄膜过湿，样品扩散迅速，导致样品分离不成区带。③点样太少，区带显色不明显。④电泳时间不足。 ⑤薄膜在缓冲液中浸泡的时间不足。⑤取出电泳后的薄膜过程中曾不慎将薄膜掉到地上。⑥染色时，因为现场混乱，可能导致醋酸纤维薄膜不是一张一张放入染色液的，在染色固定前，薄膜与薄膜之间重叠，造成薄膜上还未固定的血清蛋白彼此粘连。 四、结果与讨论 4.2.课后思考题 1.电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？ 答：点样端置于电场的负极。因为人体血清的蛋白质会因电槽中溶质呈碱性而带负电，要成功分离出各类各类蛋白质，理应将点样端置于电场的负极。

(完整word版)DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤

一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA 核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。 影响核酸分子泳动率的因素主要是： 1、样品的物理性状 即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。 对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数——泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。 DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNA ＞IDNA＞ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。 2、支持物介质 核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质，琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，是于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）在N,N,N′-四甲基乙四胺（TEMED）和过硫酸铵

血红蛋白电泳实验报告

实验汇报 实验名称：血红蛋白电泳 项目名称：两种碱性血红蛋白样品处理方法的电泳结果 实验时间：2018年9月17日 实验室：龙泉驿区妇幼保健院检验科 实验人员：杨松 报告单位：成都温伦科技有限公司 一、实验目的： 1、掌握生理盐水处理血红蛋白样品的方法 2、掌握四氯化碳处理血红蛋白样品的方法 3、掌握电泳仪实验的操作 4、分析两种碱性血红蛋白样品处理方法电泳结果的不同 二、实验原理： 血红蛋白电泳就是利用在电场的作用下, 由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小, 形状等性质的差异, 使带电分子产生不同的迁移速度, 从而对样品进行分离, 鉴定或提纯的技术，在临床检验中, 主要用于分离各类蛋白分子。 三、实验方法： 琼脂糖电泳法 四、实验器械： 样品：10个EDTA抗凝管抽取的病人全血样品 试剂：0.9%生理盐水500ml，四氯化碳500ml，界面液250ml，美国Helena Spife3000血红蛋白电泳检测试剂盒 器材：移液枪，一次性移液枪头若干，EDTA抗凝管10个，玻璃试管10个设备：美国Helena Spife3000 全自动电泳仪 五、实验步骤： 1、取得医院检验科EDTA抗凝管抽取的病人全血样品10个，编号为1，2,3......10。 2、将1-10号十个个样品分别用移液枪取200ul到玻璃试管中，编号为 1-1,2-1,3-1,.....10-1。

3、将1-10号10个样品进行生理盐水前处理，处理方法如下： -用0.9%生理盐水混匀，3500 rpm离心10分钟. -吸走弃去清液。 -以上步骤连续进行三次。 -完全吸走弃去上清液。 -20ul制作后的样本+80ul溶血素，混匀。 -取溶血后的样本17ul加入样品孔。 4、将1-1到10-1号10个样品进行四氯化碳前处理，处理方法如下： -用0.9%生理盐水溶液5000μL与样品混合。 -3000rpm离心5分钟。 -弃去上清液，只留下红细胞。 -加入200ul 蒸馏水溶解红细胞。 -加入300ul 的四氯化碳，混合均匀，3000rpm离心5分钟。 -取上面萃取后的血红蛋白液17ul 加入样品孔。 5、记录下这20个样品的样品孔编号，将样品孔放入样品板，摆放进电泳槽中，放上加样刀锋，添加界面液，放上琼脂板，掀开琼脂板保护膜，吸取多余界面液，放上碳棒，关上电泳槽的盖子，启动设备开始电泳。 6、大约30分钟后，电泳完成，取出碳棒放好，铲掉琼脂板上的盐桥，取出琼脂板，放入染色槽中进行染色脱色干燥。 7、大约30分钟后，染色脱色干燥完成，取出琼脂板，放入扫描仪中进行扫描，用PT软件进行分析数据，记录数据。 六、实验数据： 七、实验结果： 采用前处理方法二（四氯化碳）处理的血红蛋白，相对于前处理方法一（生理盐水）处理的血红蛋白，电泳结果HbA2偏高，HbA1偏低，电泳条带更加聚集。

实验6、琼脂糖凝胶电泳

实验六、琼脂糖凝胶电泳 【实验目的】 熟练掌握琼脂糖凝胶的配置和DNA凝胶电泳的方法。 【实验原理】 琼脂糖是从海澡中提取的长链状多聚物，琼脂糖凝胶点为 40~45℃。当加热至90℃左右时，即可成清亮、透明的液体，浇在模具上冷却后固化形成凝胶，琼脂糖凝胶可区分相差100bp 的 DNA片段。为了满足特殊的要求，可选择低溶点琼脂糖(<70℃,低于双链DNA的变性温度)。 带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳(electrophoresis)。各种生物大分子在一定的pH值条件下，可解离成带电荷的离子，在电场中向相反的电极移动。分子生物学领域中，琼脂糖和聚丙烯酰胺作为支持介质的凝胶电泳应用最多，它们是分离、鉴定和纯化DNA及RNA片段的主要方法。该方法操作简便、快速，可以分辨其它方法(如梯密度离心法)所无法分离的片段。直接嵌入荧光染料后，在紫外灯下可直接检出DNA片段所在的位置，如有必要，从凝胶中回收DNA片段，用于各种克隆操作。 琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶均可制成各种不同大小、形状和孔径的凝胶块，在不同的装置上进行电泳。琼脂糖比聚丙烯酰胺凝胶的分辨率低，但其分离范围广，约200bp~50kb的DNA。琼脂糖凝胶电泳通常在水平装置上进行。聚丙烯酰胺分离小片段(5~500bp)的效果较好，甚至可以分辨相差1bp的DNA片段。长度大于10 000kb的DNA片段，可以通过电场方向呈周期性变化，在脉冲电场胶中进行电泳。 【试剂和器材】 试剂：灭菌重蒸水；TE缓冲液；琼脂糖；核酸染料；；DNAmarker；6×上样缓冲液（0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油） 器材：移液器；水平电泳槽；电泳仪，枪头，移液器，锥形瓶，微波炉，制胶槽，梳子，水平电泳仪，稳压器，凝胶成像系统 【实验步骤】 （1）称取1 g琼脂糖加入250mL锥形瓶中，量取100 ml 1× TAE电泳缓冲液加入锥形瓶。 （2）微波炉加热并多次摇晃锥形瓶使琼脂糖充分溶解。

Real-time qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手_生物吧

Real-time qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手 时间:2012-03-05 21:22来源:生物吧作者:刘浩点击: 13338 次 由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR所代替。由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的 由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR所代替。由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。 本文就从real-time qPCR的发展史说起，包括real-time qPCR的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！ 一、Real-time qPCR发展史 Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的PCR 的缺点，real-time qPCR由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。 在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了 Taqman技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。从而荧光定量PCR获得广泛应用。现在的定量PCR仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、 PRISM@StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM 系列；Roche LightCycler@系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。 随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的real-time PCR仪器生产比如西安天隆科技公司的TL系列仪器。 二、Real-time qPCR概述 1. Real-time qPCR原理 实时PCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。一般来讲，定量PCR仪包括：实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特是这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。 常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和LED；荧光检测元件常用两种方式：光电倍增管和冷光CCD摄像机，光单色元件有滤光片和光栅。在实时PCR扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线，荧光阈值和Ct值。 2. Real-time qPCR的数学原理 首先来看一个real-time qPCR中的重要参数Ct值（Ct value），阈值（threshold），和基线（baseline）。一般来讲，第3-15个循环的荧光值就是基线，是由于测量的偶然误差引起的。阈值一般是基线的标准偏差的10倍。在实际操作中也可以手动调节，位于指数期就可以。Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR

电泳实验报告

电泳实验报告 This manuscript was revised on November 28, 2020

实验十二 电泳 一、目的要求 1）掌握电泳法测ζ电势的原理和技术； 2）从实验现象中加深对胶体的电学性质的理解，即在外电场作用下，胶粒和介质分别向带相反电荷的电极移动，就产生了电泳和电渗的电动现象（因电而动）。 二、基本原理 1．电泳 由于胶粒带电，而溶胶是电中性的，则介质带与胶粒相反的电荷。在外电场作用下，胶粒和介质分别向带相反电荷的电极移动，就产生了电泳和电渗的电动现象。影响电泳的因素有：带电粒子的大小、形状；粒子表面电荷的数目；介质中电解质的种类、离子强度，pH 值和粘度；电泳的温度和外加电压等。从电泳现象可以获得胶粒或大分子的结构、大小和形状等有关信息。 2．三种电势 0?：热力学电势（或平衡电势），固体表面相对溶液的电势，0?=f （固体表面电荷密度，电势决定离子浓度）。 ：斯特恩电势。 离子是有一定大小的，而且离子与质点表面除了静电作用外，还有范德华吸引力。所以在靠近表面1-2个分子厚的区域内，反离子由于受到强烈的吸引，会牢固的结合在表面，形成一个紧密的吸附层，称为固定吸附层或斯特恩层；在斯特恩层中，除反离子外，还有一些溶剂分子同时被吸附。反离子的电性中心所形成的假想面，称为斯特恩面。在斯特恩面内，电势呈直线下降，由表面的0?直线下降到斯特恩面δ?。δ?称为斯特恩电势。 ：电动电势。 当固、液两相发生相对移动时，紧密层中吸附在固体表面的反离子和溶剂分子与质点作为一个整体一起运动，其滑动面在斯特恩面稍靠外一些。滑动面与溶液本体之间的电势差，称为 ζ电势。ζ电势与δ?电势在数值上相差甚小，但却具有不同的含义。应当指出，只有在固、液两相发生相对移动时，才能呈现出ζ电势。 ζ电势的大小，反映了胶粒带电的程度。ζ电势越高，表明胶粒带电越多，其滑动面与溶液本体之间的电势差越大，扩散层也越厚。当溶液中电解质浓度增加时，介质中反离子的浓度加大，将压缩扩散层使其变薄，把更多的反离子挤进滑动面以内，使ζ电

琼脂糖凝胶电泳实验

琼脂糖凝胶电泳实验技巧 核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，基其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。琼脂糖主要多海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分了，使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速、通过调整其使用浓度，使得分辨率达到大多实验的要求。因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。 一、操作过程中要注意以下一些问题。 1、凝胶制作 凝胶浓度 凝胶的浓度据实验需要而变，一般在%%之间，没有用完的凝胶可以再次融化，但随着融化次数的增加，水分丢失也越多，凝胶浓度则会越来越高，导致实验结果不稳定。补水办法：一是在容器上标记煮胶前的刻度，煮胶后补充水分到原刻度；二是在煮胶前称重，煮胶后补充水至原重量。粗略一点的办法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值，以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。如果条带要回收最好不要用回收胶。 梳板的选用 一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板。梳齿宽厚，形成的点样孔容积较大，用于DNA片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成的点样孔容积就较小，用于PCR产物、酶切产物鉴定等。回收的话还可以将几个齿用透明胶带粘起来，形成一个窄而长的大孔以加大点样量提高回收率。梳板的选择主要是看上样量的多少而定。一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。另外，每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要 1mm，否则，拔梳板时易损坏凝胶孔底层，导致点样后样品渗漏。当然，点样孔的破坏还与拔梳板的时间和方法有关，一般凝胶需冷却30min以上方可拔出梳板，应急的情况下可以将成型的凝胶块入4度冰箱中冷却15min左右，拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中，然后垂直向上慢慢用力，因为有液体的润滑作用，梳板易拔出且不易损坏点样孔。 2、点样

凝胶电泳实验报告模板

重庆大学研究生专业实验教学 实验报告书 实验课程名称：凝胶电泳实验 实验指导教师： 学院： 专业及类别：生物学 学号： 姓名： 实验日期： 成绩： 重庆大学研究生院制

一、实验目的 1.理解凝胶电泳的分类及琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验的基本原理。 2.熟练琼脂糖凝胶电泳实验的基本操作。 3.通过实验了解凝胶电泳实验的注意事项并在以后的实验中尽量避免。 4.利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、浓度和分子量以及分离大小不同的DNA 片段。 5.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳测定DNA和蛋白分子量大小的方法。 二、实验材料、用具及试剂 1.材料：菌落PCR产物（待检测DNA片段）； 2.用具：①琼脂糖凝胶电泳：电泳仪，水平板型电泳槽，电子天平，微量移液器 （10μl），枪头，三角瓶，点样板，梳子，微波炉， 凝胶成像仪； ②聚丙烯酰胺凝胶电泳：垂直板电泳槽，稳压稳流电泳仪，梳子； 3.试剂：琼脂糖，1×TAE缓冲液，载样缓冲液（Loading buffer），goldviwe染料， DL5,000 DNA Marker (Takara)。 三、实验原理 核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA 片段，具有以下优点：便于分离、便于检测和便于回收。其工作原理相对而言比较简单、主要用到了物理学的电荷理论。 当一种分子被放置在电场当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极，这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率。它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。也就是说，电场强度越大、电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度也就越快，反之则较慢。由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺胶等，从而

半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤

半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤 以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml 的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板