微生物实验报告

微生物学大实验

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1.培养基的配置及消毒灭菌

1.1通用培养基的配制（液体、固体、半固体三种）

1.1.1实验目的

（1）了解配制微生物培养基的原理和培养基的种类。

（2）掌握配制微生物通用培养基的一般方法和操作步骤。

1.1.2实验原理

培养异养细菌最常用的培养基是牛肉膏蛋白胨培养基，它是一种天然培养基。牛肉膏是牛肉浸液的浓缩物，含有丰富的营养物质，它不仅能为微生物提供碳源、氮源，还含有多种维生素。蛋白胨是酪蛋白、大豆蛋白或鱼粉等经蛋白酶水解后的中间产物，含有?、胨和氨基酸等丰富的含氮素营养物，因此完全能满足大多数异养细菌对营养的需要。

1.1.3材料和器皿

（1）试剂：牛肉膏、蛋白胨，NaCl，1mol/LNaOH,1mol/L HCl。

（2）器皿：台秤，玻璃烧杯，搪瓷烧杯，三角瓶，量筒，漏斗，试管，玻璃棒等。

（3）其他：pH试纸，牛角匙，牛皮纸，棉花，纱绳，灭菌锅等。

1.1.4方法和步骤

1.配制牛肉膏蛋白胨培养基

（1）配方及配量：牛肉膏1.5g，蛋白胨5g，NaCl2.5g，琼脂（固体6g 半固体

0.4g 液体不加）蒸馏水500ml

（2）称取药品：按照营养基配方与配量分别称取各药品，取少于总量的水于烧杯

中，将培养基成分（琼脂除外）逐一加入水中待溶。

（3）加热溶解：将烧杯放在石棉网上，用文火加热，并不断用玻璃棒搅拌，使各

药品快速溶解，然后补水至500ml。

（4）调节pH：用1mol/l NaOH 调pH至7.2—7.4.避免调过碱，应缓慢加入，边

加入边搅拌，并用pH试纸测酸碱度值。

（5）分装：将配制好的培养基分装到相应的玻璃器皿中，并在固体和半固体培养

基中加入琼脂，贴好标签，待灭菌。

1.2加压蒸汽灭菌法

1.2.1实验目的

懂得加压蒸汽灭菌原理及其安全使用的注意事项。

1.2.2实验原理

以加热密封锅体内的水和水蒸气的压力来提高锅体内蒸汽温度而达到对物品灭菌的目的。

1.2.3方法和步骤

（1）加水：取出装料桶，往锅内加水至与搁架圈同样高度为止。

（2）装料：将待灭菌的物品放入装料桶内并放回锅。

（3）加盖

（4）排气：在水煮沸后，以蒸汽驱赶锅内的空气沿排气软管从排气阀中溢出，待空气排尽后，才可关闭气阀继续加热。

（5）升压、保压、降压

（6）取料

1.2.4注意事项

（1）注意检查锅体和锅盖上的部件是否完好，并严格按照操作程序进行，避免发生各类意外事故。

（2）灭菌时切勿擅自离开岗位，要注意压力表指针动态；要按培养基中的营养成分的耐热程度来设置合理的灭菌温度与时间，以免营养成分过多被破坏。

（3）务必待锅压下降到零后再打开排气阀和锅盖，否则因锅内压力突然下降，使瓶装培养基或其他液体因压力瞬时下降而发生复沸腾，从而造成瓶内液体沾湿棉塞或溢出等事故。

（4）在放入灭菌料桶前，切记应往锅体内加入适量的水，若锅体内无水或水量不够等均会造成在灭菌时引发重大事故。

2. 大肠杆菌的接种方法（穿刺接种法和液体接种法）

2.1穿刺接种法

2.1.1实验材料目的

掌握穿刺接种法并观察细菌在半固体培养基中的运动力。

2.1.2实验原理

穿刺接种法就是用接种针挑取少量菌苔，直接刺入半固体直力柱培养基中央的一种接种法。

2.1.3方法和步骤

1、接种前准备

（1）标明菌名（2）旋松棉塞（3）点燃酒精灯

2、穿刺接种法（直握法）

（1）挑取菌种：在超净台中，酒精灯旁，左手持菌种管，右手拿接种针，经火焰灭菌后，用持针的右手拔出试管塞，试管口过火灭菌后再将接种针伸入菌种管中，现在斜面上端冷却后挑取少量菌苔，移出接种针，管口再过火，塞上塞子，将菌种管放回试管架上。

（2）刺穿接种：左手拿直立柱试管，在火焰旁用右手的小指和掌边拔出塞子。随之将试管口朝下，同时将接种针从直立柱培养基中央自下而上直刺到离管底

1-1.5cm处（切勿穿透培养基），然后沿原穿刺线拔出接种针。管口过火，塞上塞子，插在试管架上。

（3）灭接种针上的残菌：将带有菌的接种针在火焰上烧红，经灭菌后才可以放在桌面上。随手再将塞子塞紧，以防脱落。

3、培养

将已接种的直立柱试管置37℃恒温箱中，培养24h后取出，通过透射光目测细菌在穿刺线上的生长情况，并记录结果。

4、接种后处理

（1）清洗：将废弃的菌种管塞子拔去，置水浴中煮沸20min，然后刷洗干净，倒置于试管架上，沥干。

（2）整理：清理桌面。

2.1.4实验结果

结果总体上来说算不错，穿刺线形状如玻璃棒，有扩散现象；边缘不整齐，这说明了大肠杆菌有鞭毛，可运动。

2.1.5注意事项

（1）半固体培养基琼脂的用量依据琼脂牌号不同而定的。其硬度的判断，以培养

基冷却凝固后，用手轻敲即碎为准。为使培养基透明而不浑浊，配置的培养基必须过滤。

（2）接种前应该将接种针拉直，穿刺时手要平稳，不可左右摆动。

（3）穿刺接种时，接种针不可穿透培养基。

2.2液体接种法

2.2.1实验目的

掌握利用各种接种工具进行液体接种的步骤及方法。

观察细菌在液体培养时的群体特征。

2.2.2实验原理

在无菌操作条件下，用无菌的接种环、滴管、移液管或移液枪等接种工具将斜面菌种或菌种悬液移接到液体培养基中的一种方法。在定量接种时可用移液管进行。

2.2.3方法与步骤

接种环接种

1、接种前准备

（1）标明菌名（2）旋松棉塞（3）点燃酒精灯

2、接种操作要点

左手持试管，右手拿接种环，在火焰上灭菌后，将接种环伸入菌种管中，现在斜面上端冷却后挑取少量菌苔转移到试管的新鲜培养液中，让接种环在液面和管壁的交界处反复摩擦及振荡，以洗下环上的菌体，使其均匀分散入培养液中，然后移出接种环，塞上塞子，并立即烧去环上的菌体。

3、混匀培养液：用拇指和中指捏住试管的上部，食指摁住塞子，将试管底部在左手手掌心上轻拍振荡，使成团的细菌细胞与培养液充分混匀。

4、适温培养:将试管插于试管架上，置于37℃恒温箱中，培养24h后取出，观察细菌在液体培养基中的生长特征，并记录结果。

2.2.4实验结果

没摇动前，液面微浑浊，有一层菌膜覆盖，

且管底有大量菌体沉淀，摇动后观察到液体有絮状

浑浊。

3. 大肠杆菌菌种分离的三种方法（平板划线法、平板涂布法和倾注法）3.1平板划线法

3.1.1实验目的

了解平板划线法分离菌种的基本原理，并熟练掌握其操作方法。

3.1.2实验原理

平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。通常认为这种单菌落就是某微生物的纯种。实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可以形成一个单菌落，故在科学研究中，特别在遗传学实验或菌种鉴定工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。

具体的划线形式有多种，现在主要说一种，将一个平板分成A、B、C、D4个面积不同的小区进行划线，A区面积最小，作为待分离菌的菌源区，B和C为经过初步划线稀释的过渡区，D区则是关键的单菌落收获区，它的面积最大，出现单菌落的概率也最高。由此可见，这4个区的面积安排应该做到D>C>B>A。

3.1.3方法与步骤

1、倒平板

将冷却至50℃左右的培养基按无菌操作的方法倒入平板中，平置，待凝。

2、做分区标记

在皿底用笔划出4个不同面积的区域，使D>C>B>A，且各区的夹角应为120°左右，以便使D区与A区所划出来的线条平行、美观。

3、划线操作

（1）挑取菌样：选用平整圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量含菌试样。（2）先划A区：将平板倒置于煤气灯旁，用左手取出平板的皿底，使平板表面大致垂直于桌面，并让平板面向火焰。右手持含菌的接种环，先在A区轻巧地划上3-4条连续的平行线当作初步稀释的菌源。烧去接种环上的残余菌样。

（3）划其余区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转至划线位置，把接种环通过A区而移至B区，随即在B区轻巧地划上6—7条致密的平行线，接着再以同样的操作在C区和D区划上更多的平行线，并使D区的线条与A区平行（但不能与A或B区线条接触），最后，将左手所持皿底放回皿盖中。烧去接种环上的残菌。

5、恒温培养

将划线后的平板至28℃倒置培养2-3d。

6、挑单菌落

良好的结果应该在C区出现部分单菌落。而在D区出现较多独立分布的单菌落。然后从典型的单菌落中挑取少量菌体至试管斜面，经培养后即为初步分离的纯种。

7、清洗培养皿

将废弃的带菌平板作煮沸杀菌后进行清洗、晾干。

3.1.4实验结果

有A、B、C、D四个区，且D区有单菌落出现，实验结果很好。

3.1.5注意事项

（1）为了取得良好的划线效果，可事先用原纸垫在空的培养皿内划上4个区，并用接种环练习划线动作，待通过模拟实验后熟练操作与掌握划线要领，再进行正式平板划线。

（2）用于划线的接种环，环柄宜长些（约10cm），环口应十分圆滑，划线时环口与平板间的夹角宜小些，动作要轻巧，以防划破平板。

（3）用于平板划线的培养基，琼脂含量宜高些（2%左右），否则会因平板太软而被划破。

(4)平板不能倒得太薄，最好在使用前一天倒好。为防止平板表面产生冷凝水，倒平板前的培养基温度不能太高。

3.2涂布平板法和浇注平板法

3.2.1目的

了解用浇注平板法和涂布平板法分离微生物纯种的原理，并掌握有关的具体操作方法。

3.2.2原理

浇注平板法和涂布平板法是两种最常用的菌种分离纯化方法，它们不仅可用于分离纯化，还可用于计数等。浇注平板法是将待分离的试样用生理盐水等稀释液作梯度系列稀释后，取其中一合适稀释度的少量菌悬液加至无菌培养皿中，立即倒入融化的固体培养基，经充分混匀后，置适温下培养。最后可从其表面和内层出现的许多单菌落中，选取典型代表，将其转移到斜面上培养后保存，此即为初步分离的纯种。

涂布平板法是指取少量梯度稀释菌落，置于已凝固的无菌平板培养基表面，然后用无菌的涂布玻棒把菌液均匀地涂布在整个平板表面，经培养后，在平板培养基表面会形成多个独立分布的单菌落，然后挑取典型的代表移接至斜面上培养后保存。分离某一新菌种时，为保证所获纯种的可靠性，一般可用上述方法反复分离多次来实现。

在上述两种方法中，浇注平板法较适合兼性厌氧的细菌和酵母菌的分离，而涂布平板法则更适于好氧性和有气生菌丝的放线菌和细菌的分离。

3.2.3方法和步骤

1、浇注平板法

（1）培养皿编号：取6支无菌培养皿，分别编上10-4、10-5和10-63种稀释度（各2皿）。

（2）稀释菌样：取6支无菌试管，依次编号10-1-10-6，在各管中分别加入生理盐水4.5ml，然后逐级稀释。

（3）吸取菌液：从10-4、10-5和10-6各管中，分别吸出0.2ml菌液加至相应编号的无菌培养皿中。

（4）浇培养基：向各培养皿中分别倒入充分融化并冷却至45℃左右的琼脂培养基，并立即将培养基充分混匀，并立即放平，待凝。

（5）恒温培养：将含菌平板倒置在各组的培养皿筒内，在37℃恒温箱中培养24h 左右。

（6）挑单菌落：用灭菌后的接种环分别挑取大肠杆菌至试管斜面，经培养后保存。

2、涂布平板法

（1）浇制平板：先将融化并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿中，每皿约15ml，共6皿。待待均匀铺开后，放平，待凝。分别编上10-4、10-5和10-6，各2皿。

（2）菌样稀释：取6支无菌试管，依次编号10-1-10-6，在各管中分别加入生理盐水4.5ml，然后逐级稀释。

（3）滴加菌液：吸取菌液：从10-4、10-5和10-6各管中，分别吸出0.2ml菌液加至相应编号的平板表面上。

（4）涂布平板：左手执培养皿，并将皿盖开启一缝，右手拿涂布玻璃把平板上的

一滴菌液轻轻涂开、均匀涂满整个平板，并防止平板培养基破损。

（5）平板培养：将平板倒置放在各组的培养皿筒内，置37℃恒温箱中培养24h左右。

（6）挑单菌落：用灭菌后的接种环分别挑取大肠杆菌至试管斜面，经培养后保存。

3.2.4实验结果

浇注平板法

因操作的时候培养基没有摇匀，导致菌落分布不均匀，在其表面及内部都有菌落分布。

涂布平板法

表面有大量菌体生长，但因涂抹的时候不均匀，导致菌体分布不均匀。且太密集，长不开。

3.2.5注意事项

（1）在浇注平板中，注入培养基不能太热，否则会烫死微生物；在混匀时，动作要轻巧，应多次上下、左右、顺或逆时针方向旋动。

（2）做涂布用的平板，琼脂含量可适当高些，倒平板时培养基不宜易在平板表面形成冷凝，否则易在平板表面形成冷凝水，导致菌落扩展或蔓延。若将凝固平板先倒置、搁在皿盖上并留一开口，事先放在37℃恒温箱中一段时间，则可保证平板表面无冷凝水形成。

（3）挑取单菌落时，应注意选取分散、孤立并具有典型特征的菌落，以尽快获得纯种。

4.水中细菌总数的测定和菌种的保藏

4.1水中细菌总数的测定

4.1.1实验目的

（1）学习并掌握水样采集和水样中细菌总数的测定方法

（2）了解水质状况与细菌数量在饮水中的重要性

4.1.2实验原理

水中细菌总数可作为判定被检水样被有机物污染程度的标志。细菌数量越多，则水中有机物质含量越大。在水质卫生学检验中，细菌总数是指1ml水样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中经37℃、24h培养后所生长出的细菌菌落数。

4.1.3实验方法与步骤

1.水样的采集和保存

（1）自来水：先将水龙头用火焰烧灼3min灭菌，然后再放水5~10min，最后用无菌容器接取水样，并速送回实验室检测。

（2）池水、河水或湖水：将无菌的带玻璃塞瓶瓶口向下浸入距水面10~15cm的深层水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，当取完水样后，即将瓶塞塞好（注意：采样瓶内水面与瓶塞底部间留些空隙，以便在测定时可充分摇匀水样），再从水中取出。

2.水中细菌总数的测定

（1）自来水：用无菌移液管吸取1ml水样，加入无菌培养皿中（每个水样重复3个培养皿），然后在每个上述培养皿内个加入约15ml已融化并冷却至45~50℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，并轻轻旋转摇动，使水样与培养基充分混匀、冷凝后即成检测平板。然后将其倒置于37℃恒温箱内培养24h。

（2）池水、河水或湖水

①水样稀释：取3~4支无菌试管，依次编号为10-1、10-2、10-3（或10-4），然后在上述每支试管中加入9ml无菌水。接着取1ml水样加入到10-1试管中，摇匀（注意：这根已接触过原液水样的移液管的尖端不能再接触10-1试管中液面），另取1ml无菌

移液管从10-1试管中吸1ml水样至10-2试管中（注意点同上），如此稀释至10-3或10-4管（稀释倍数视水样污染程度而定，取在平板上能长出30~300个菌落的稀释倍数为宜）。

②加稀释水样：最后3个稀释度的试管中各取1ml稀释水样加入无菌培养皿中，每一稀释度重复2个培养皿。

③加入融化培养基：在上述每个培养皿内加入约15ml已至融化并冷却至45~50℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，随即快速而轻巧地摇匀。

④待凝培养：待平板完全凝固后，倒置于37℃培养箱中培养24h。

3.记菌落数

将培养24h的平板取出，用肉眼观察，记平板上的细菌菌落数。

4.1.4实验结果

污水涂抹的部分其表面有菌落，但涂抹不好，有的涂到边缘上，菌落大约40个；而自来水涂抹的部分其表面无菌落。

4.1.5注意事项

水样采集后，应速送回实验室测定，若来不及测定应放在4℃冰箱存放，若无低温保藏条件，应在报告中注明水样采集与测定的间隔时间。一般较清洁的水可在12h 内测定，污水须在6h内结束测定。

4.2菌种的保藏

4.2.1实验目的

（1）了解甘油法保存微生物菌种的原理

（2）掌握简易甘油保藏菌种的方法

4.2.2实验原理

在长期微生物菌种的保种实践中发现，虽然在相当宽的低温保藏范围内，温度越低越能保持菌种的活性[液氮（-196℃）比干冰（-70℃）好，干冰优于-20℃，-20℃比0℃或4℃好]，但由于菌种在冷冻和冻融操作中会造成对细胞的损伤，而利用40%左右的甘油或适当浓度的二甲基亚砜等作为保护剂对细胞加以保护，可减少冻、融过程中对细胞原生质及细胞膜的损伤。因为在适当浓度的甘油中，将会有少量甘油分子渗人细胞，使菌种细胞在冰冻过程中缓解了其由于强烈脱水及胞内形成冰晶体而引起的破坏作用。再将甘油保存菌种放在-20℃左右的冰箱（能维持生命和保持极微的细胞代谢率）或超低温冰箱（-70℃以下）中保藏。

4.2.3实验方法及步骤

1.无菌甘油制备

将80%甘油置于三角瓶内，塞上绵塞，外加牛皮纸包扎，加压蒸气灭菌（121℃，20min）后备用。

2.保藏培养物的制备

（1）菌种活化：将待保藏菌种在斜面上传代活化1~2代。

（2）菌种纯化：将活化后的斜面菌种在相应的平板培养基上做划线分离、培养并挑选最典型的单菌落移接斜面后进行适温培养，再作菌种性能检测。

（3）性能检测：对已纯化的菌种作各种典型特征的检测或质粒等鉴定。

（4）菌种培养物的制备：接种上述待保存菌种（作斜面、平板划线或液体接种），适温下培养。

3.保藏菌悬液的制备

（1）液化法

①菌液制备：将菌种培养液离心（4000r/min）,倾去上清液，并用相应的新鲜培养液制备成一定浓度的菌悬液（108~109/ml）。然后用无菌移液管吸取1.5ml，置于一支带有螺口密封圈盖的无菌试管（或无菌的Eppendorf加0.5ml）中。

②滴加甘油：再加入1.5ml灭菌80%甘油，使甘油浓度为40%左右为宜，旋紧管盖或塞紧Eppendorf管（加0.5ml甘油）的盖子。

③振荡混匀：振荡密封的菌种小试管或Eppendorf管，使培养液与甘油充分混匀。（2）菌苔法

①菌悬液制备：培养适龄斜面或平板菌苔作甘油菌种保存用。用生理盐水洗下菌苔细胞制成一定浓度（108~109/ml）菌悬液。

②滴加甘油：加等量甘油混匀，制备成含40%左右甘油的菌悬液。

（3）低温保存

上述两种甘油菌悬液即可在-20℃左右的低温下保藏（此温下40%的甘油菌悬液即不会冻结）。

4.快速冷冻

也可将上述甘油菌悬液管置于乙醇-干冰或液氮中速冻，然后作超低温保藏。此法可延长保存期限。

5.超低温保藏

速冻甘油菌种管置于-70℃以下保藏，保存期的检测中切莫反复冻融，一般细菌或酵母菌种的保存期为3~5年。

6.菌种保藏期限的检测试验

（1）取菌样：在保藏期间可用无菌接种环蘸取甘油菌悬液（或刮取超低温保藏的甘油菌的冻结物），迅速盖好菌种管返回冰箱，切忌将菌种管放置在室温下冰融，从而加速其内细胞的死亡。

（2）接种斜面：将蘸有甘油菌悬液（冻结物）接种到对应的斜面培养基上，适温培养后判断各菌种的保藏情况。

（3）再保藏制备：用接种环挑取斜面上已长好的细菌培养物，置于装有2ml相应培养液的试管中，再加入等量灭菌80%甘油，振荡混匀后再分装菌种管。

（4）分装菌种管：将上述甘油菌悬液分装于灭菌的具螺口密封圈盖的试管或无菌Eppendorf管中，按上法直接低温保存或速冻后作超低温长期保藏。

4.2.5注意事项

1．甘油法保藏菌种时应特别注意菌体与甘油的充分混匀。

2.菌体与甘油混匀后的冰冻必须迅速，每次取样时严防出现反复冻融现象，以防止菌种死亡。