犬骨骼肌成肌细胞体外分离、纯化及培养方法改良探索

犬骨骼肌成肌细胞体外分离、纯化及培

养方法改良探索

（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）

作者：苏冠华,刘启云, 卢永昕, 米少华, 孙雨霏, 刘晓明,帅欣欣

【摘要】目的: 探讨犬骨骼肌成肌细胞（SkMs）体外分离、纯化及培养方法的改良并研究其生物学特性。方法: 采用机械分离结合Ⅱ型胶原酶、中性蛋白酶双酶一步消化法分离犬骨骼肌成肌细胞, 经差速贴壁法纯化后, 在骨骼肌细胞生长培养基（SKGM）中进行原代和传代培养, 免疫细胞化学染色鉴定。结果: 改良后的培养方法适于获取犬骨骼肌成肌细胞, SKGM培养基适于犬骨骼肌成肌细胞的体外培养。SkMs在细胞密集或低血清分化培养基作用下可融合成肌管。结蛋白（desmin）单克隆抗体（mAb）细胞化学染色鉴定SkMs呈阳性, 纯度在90%以上。结论: 通过改良后的双酶一步消化法获得的SkMs 在合适的培养条件下能够增殖、分化并保持其生物学特性, 为其在基因治疗和组织工程中的应用奠定了基础。

【关键词】犬; 骨骼肌成肌细胞; 细胞培养; 生物学特性1961年, Mauro等首次在蛙骨骼肌中发现了具有自我更新和分化

形成肌纤维能力的肌卫星细胞（muscle satellite cells）。从骨骼肌中分离获得的肌卫星细胞在体外分离培养时被统称为骨骼肌成肌细胞(skeletal myoblasts, SkMs)。来源于骨骼肌的成肌细胞具有取材方便、免疫源性低、植入后容易与宿主的肌纤维融合、体外培养条件下较易被携带外源基因的病毒转染、转染外源基因的成肌细胞可释放重组蛋白到局部或体循环中等优点［1］。因此, 成肌细胞被广泛应用于基因治疗和组织工程方面的实验研究。本研究以获取基因治疗载体SkMs为目的, 探讨建立简便、经济的成肌细胞分离、纯化及培养方法。

1 材料和方法

1.1 材料

实验犬由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。中性蛋白酶购自美国Roche公司, Ⅱ型胶原酶、结蛋白（desmin）单克隆抗体（mAb）购自美国Sigma公司; SKBM培养基和SKGM Bullet Kit购自美国Lonza公司; 亲和素生物素过氧化物复合物法（avidin biotin complex, ABC）免疫组化试剂盒购自美国Vector 公司, DAB 显色试剂盒购自武汉博士德公司; 胰蛋白酶、 DMEM、M199培养基购自美国Hyclone公司; 胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）, 小牛血清购自美国Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 SkMs的原代培养

完全生长培养基70SKGM各成分按以下比例SKGM∶DMEM∶FBS＝

70∶25∶5配制。无菌全麻下自5～8 kg左右杂种犬股四头肌取3～5 g肌肉, 将其移入盛有PBS的90 mm培养皿中剔除筋膜、脂肪、肌腱和血管组织后剪为碎糜状, 将组织块移入盛有约30 mL的4 g/L中性蛋白酶和1 g/L Ⅱ型胶原酶混合消化酶溶液的100 mL玻璃瓶中, 37℃恒温摇床60 r/min, 1 h。然后吸取9 mL上清液经孔径75 μm 的不锈钢网筛（200目）过滤到10 mL玻璃离心管中, 再加入1 mL FBS 中和, 1 000 r/min, 离心5 min, 弃上清。加70SKGM培养基重悬细胞沉淀, 种入明胶预包被的培养瓶。再加入双酶溶液重复消化上述剩余的组织块, 反复3～4次。计数、台盼蓝染色确认细胞成活率。2 d 后换液, 以后每2～3 d换液1次, 在倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况。

1.2.2 SkMs的传代培养及纯化

倒置显微镜下观察细胞生长情况, 当细胞生长到培养瓶面积的70%～80%时, 以2.5 g/L胰蛋白酶+ 0.2 g/L EDTA混合溶液消化, 中止消化后离心, 重悬细胞后将细胞悬液接种另一培养瓶, 静置于培养箱内约8～10 min后取出, 轻轻晃动培养瓶, 动员未贴壁的细胞, 吸出培养液接种另一培养瓶, 反复差速3次。最后按1∶2或1∶3比例进行传代, 每2～3 d换液1次。4 g/L台盼蓝染色确认细胞成活率。

1.2.3 SkMs细胞生长曲线测定

取处于对数生长期的细胞, 用上述EDTA/胰酶溶液消化后制

成单细胞悬液, 细胞计数后以5×103细胞/孔接种于24孔板, 共接种8组, 每组3孔, 每天取一组细胞进行计数, 计算平均值, 连续8 d, 绘成细胞生长曲线。未计数孔细胞每2～3 d换液1次。

1.2.4 SkMs的诱导分化

取培养至第2～3代的细胞, 消化后以1×105细胞/孔接种于放有盖玻片的6孔培养板中, 加入生长培养基进行培养, 待细胞分裂、增殖至70%～80%汇合后, 加入分化培养基（含200 mL/L FBS的M199培养基）继续培养, 倒置显微镜下观察细胞生长及分化情况。

1.2.5 SkMs的免疫细胞化学染色

将细胞接种于有盖玻片的6孔板, 待长至培养面积的80%取盖玻片。40 g/L多聚甲醛固定后, 以ABC法行免疫化学染色, 以鼠抗desmin mAb为一抗, DAB显色。

1.2.6 差速贴壁组与非差速贴壁组纯化所得细胞desmin阳性数比较

取等量的第2代细胞悬液种于25 cm2培养瓶, 差速贴壁纯化组与非差速贴壁组各2瓶, 制作细胞爬片行desmin免疫化学染色。每组取4片, 每片随机取5 个视野进行采样, 以Olympus BX50 显微摄像系统进行阳性细胞计数, 所得数据以χ2检验进行统计学处理。

2 结果

2.1 SkMs体外培养的生物学特点

经酶消化分离出的成肌细胞为圆形小亮点, 悬浮于培养液中。有

活力的细胞能够在48 h内完全贴壁, 变扁并向四周伸展而成为一梭形或纺锤形细胞, 有折光性（图1A）。约3～4 d后进入对数生长期（图1B）, 6～7 d后因接触抑制生长速度减慢。细胞增多后逐渐按一定方向呈有序排列。

2.2 骨骼肌成肌细胞体外培养的鉴定

2.2.1 多核肌管形成

在体外培养的成肌细胞当细胞密集或改变培养基中的血清浓度时, 可清楚地观察到长轴方向胞质融合后形成多核肌管（图2）。

2.2.2 desmin细胞免疫化学染色

差速纯化后培养的成肌细胞经desmin进行免疫化学染色（DAB 显色）, 成肌细胞胞质呈阳性反应, 细胞核外周及胞质呈棕黄色, 表明培养的细胞为成肌细胞（图3）。多核肌管呈强阳性。

2.3 成肌细胞生长活性测定和生长曲线的绘制

原代细胞进行台盼兰染色, 结果发现97%以上的细胞均不着色, 表明本实验方法培养的细胞存活率高。细胞连续计数所绘制的成肌细胞生长曲线显示: 细胞在培养的3～5 d增殖达高峰, 5～7 d后基本达生长平台期。

2.4 成肌细胞的差速纯化

将差速贴壁组与非差速贴壁组纯化所得细胞进行desmin免疫化学染色, 发现两组阳性细胞数有显著差异, 经计算得χ2值为5.47, P0.05为具有统计学意义。

3 讨论

SkMs是位于骨骼肌纤维膜与基底膜之间的组织干细胞。当骨骼肌受损伤时, 可被启动形成新的骨骼肌纤维［2］。一般来讲, 肌肉来源的动物越老, 分离肌肉细胞所需要的时间越长, 而且单个核前体细胞的产量也越低。国内大多数研究取成年犬的骨骼肌组织坚韧, 同时由于成肌细胞量少, 提取困难。本实验综合国内外研究经验, 采用了约5～8 kg的未成年犬进行原代培养, 产量较高。目前提取犬成肌细胞大多采用机械分解法结合三步消化法［3］（I 型胶原酶, 透明质酸酶, 链霉蛋白酶）或二步消化法［4］（I 型或IV 型胶原酶+胰蛋白酶）获得单细胞悬液, 步骤繁琐, 成本均较高。蛋白水解酶如胰蛋白酶, 链霉蛋白酶等往往还存在可能损伤细胞、在孵育的过程中不稳定、可能成为支原体污染的来源等缺点。而中性蛋白酶则能够克服以上缺点。故本研究创新性地采用中性蛋白酶/Ⅱ型胶原酶混合酶溶液一步消化法, 大大简化了流程并以较少的代价获得足量的原代成肌细胞。研究认为, 原代细胞中混有大量的成纤维细胞, 既往为提高纯度往往采用不连续密度梯度离心法［5］、免疫磁珠分离法［6］、不完全消化法等方法, 但均以操作复杂、产量低或价格昂贵为代价。差速贴壁操作方法简单有效, 具有很大的适用性。原理是利用成纤维细胞的贴壁能力强于成肌细胞, 10 min左右即可贴壁, 而成肌细胞多数仍处于悬浮状态, 此时移出培养液, 即为纯化的成肌细胞。本实验中采用3次预贴壁, 每次10 min进行差速纯化获得的成肌细胞经鉴定阳性率均在90%以上, 符合组织工程基因治疗的纯度要求。

据已有文献报道, 不同种属动物SkMs的最佳培养条件不同。目前犬SkMs常用的生长培养基有M199, MEM, DMEM, F12以及RPMI1640等。SkMs体外增殖、分化除受血清浓度改变的影响之外, 还要受到多种因子的调节, 如胰岛素、肝细胞生长因子（HGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、表皮生长因子（EDF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）等。研究证实［7］, 在不含任何生长因子的DMEM、M199等生长培养基进行培养时, 原代细胞中混杂的成纤维细胞迅速生长, 并随着传代次数的增多呈几何级数增长逐渐占据优势。包含特定生长因子的生长培养基更适合于SkMs的增殖培养。SKGM 培养基中含有胰岛素, EGF, 地塞米松等成分则可明显地促进成肌细胞的增殖、生长。因此, 本课题组在国内首次采用了SKGM培养基进行原代培养, 结果发现成肌细胞逐渐呈现选择性生长优势并成为原代培养物中的主导细胞类型, 并且随着时间延长, 肌源性细胞逐渐增多, SkMs的纯度和增殖活力明显优于M199、DMEM等其他传统的生长培养基。

成肌细胞在长轴方向融合, 形成细胞核在中央, 肌丝在周边的多核肌管是鉴定的重要依据。本研究在体外培养的成肌细胞当细胞密集或改变培养基中的血清浓度时, 可清楚地观察到长轴方向胞质融合后形成多核肌管, 初步证明成肌细胞体外培养成功。同时, 肌管可以有一些粗短的分支, 这一点与心肌组织的发育相类似, 也提示骨骼肌来源的成肌细胞可以作为心肌组织的前体细胞用于心肌组织工程研究。结蛋白（desmin）是肌细胞内细胞骨架中间丝的构成成

分之一, 它是最早表达的肌源性标志蛋白［8］。用免疫细胞化学染色方法检测细胞有无desmin表达是目前所知的鉴定SkMs的最佳方法。本实验研究采用desmin染色显示, SkMs呈阳性, 而多核肌管呈强阳性。

成肌细胞是哺乳动物体内惟一能大量分裂、增殖及迁移的前体细胞, 具有与宿主肌纤维融合的能力, 可作为一种有效载体广泛用于目的基因的转移。目前已经通过基因工程获得能表达人类Ⅸ因子（hFⅨ）、人生长激素（hGH）、红细胞生成素（EPO）、克隆形成刺激因子（CSF1）及IGF等基因产物的成肌细胞株。利用组织工程技术将基因修饰的SkMs塑形为生物人工肌肉, 目前已发展成为一种新型基因治疗载体。本课题组已成功将其应用于小鼠后肢缺血模型, 大鼠心梗后心力衰竭模型的基因治疗［9］。因此, 简单、经济、快捷的成肌细胞获取和培养将为基因治疗和组织工程的进一步研究奠定坚实基础。

【参考文献】

［1］Yao SN, Kurachi K. Implanted myoblasts not only fuse with myofibers but also survive as muscle precursor cells ［J］. J Cell Sci, 1993, 105(Pt 4): 957-963.

［2］Hughes SM, Blau HM. Migration of myobasts across basal lamina during skeletal muscle development［J］. Nature,

1990, 345(6273) : 350 -353.

［3］Fouts K, Fernandes B, Mal N, et al. Electrophysiological consequence of skeletal myoblast transplantation in normal and infarcted canine myocardium［J］. Heart Rhythm, 2006, 3(4): 452-461.

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［5］Chiu RJS, Zibaitis A, Kao RL. Cellular cardiomyoplasty: myocardial regeneration with satellite cell transplantation［J］. Ann Thorac Surg, 1995, 60: 12-18.

［6］Périé S, Mamchaoui K, Mouly V, et al. Premature proliferative arrest of cricopharyngeal myoblasts in oculo pharyngeal muscular dystrophy: Therapeutic perspectives of autologous myoblast transplantation［J］. Neuromuscul Disord, 2006, 16(11): 770-781.

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［9］Lu Y, Shansky J, Del Tatto M, et al. Recombinant vascular endothelial growth factor secreted from tissue engineered bioartificial muscles promotes localized angiogenesis［J］. Circulation, 2001, 104(5): 594-599.

细胞和细胞器及间质的分离

第一篇组成人体的细胞 第三章亚细胞结构的分离与鉴定 细胞山各种亚细胞结构组成。其重要的研究手段之一是分离纯化亚细胞组分，观察它们的结构或进行生化分析。离心技术是实现这一日标的基本手段。一般认为，转速为10?25Kr/mm的离心机称为高速离心机；转速超过25Kr/min,离心力大于89Kg者称为超速离心机。U前超速离心机的最高转速可达lOOKr/min, 离心力超过500Kg。 第一节亚细胞结构分离的技术 分离亚细胞组分的第一步是制备组织匀浆或细胞匀浆。匀浆 (Homogenization)是在低温条件下，将组织或细胞放在匀浆器中加入等渗匀浆 介质(即0?25moLZL蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液)研磨，使细胞被机械地研碎成为各种 亚细胞组分和包含物的混合物。 分离亚细胞组分的第一步是分级分离。它通过山低速到高速离心技术，使非均一混合体中的颗粒按其大小轻《分批沉降到离心管的不同部位，再分部收集, 即可得到各种亚细胞组分。山于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时是均匀分布于整个离心管中，故每级分离得到的第一次沉淀必然不是纯的最巫的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。分离亚细胞组分主要离心技术是差速离心和密度梯度离心。 差速离心(differential centrifugation)是在密度均一的介质中山低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体、最后为核糖体。山于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，一般重复2?3次效果会好一些。通过差速离心可将细胞器初步分离，但常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 密度梯度离心(density gradient centrifugation)是用一定的介质在离心管内 形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过? 力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离乂可分为速度沉降和等密度沉降两种。密度梯度离心常用的介质为氯化锂，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：能产生密度梯度，且密度高时，粘度不商；pH中性或易调为中性；浓度大时渗透圧不大；对细胞无毒。①速度沉降(velocity sedimentation)主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于彼分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒(细胞或细器)在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离：②等密度沉降(isopycnic sedimentation)适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。 等密度沉降通常在较高密度的介质中进行。介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度。再者，这种方法所需要的力场通常比速度沉降法大10、100倍，故往往需要高速或超速离心，离心时间也较长。大的离心力、长的离心时间都对细胞不利。因此，这种方法适于分

实验一 植物细胞的质壁分离及死活鉴定

实验一植物细胞的质壁分离及死活鉴定 细胞是植物结构与功能的基本单位,而原生质则是细胞中有生命的部位。死、活细胞原生质的理化性质有显著差别，如果细胞原生质的膜系统有半透性，可与外界溶液构成渗透系统；活细胞可以主动积累某些溶质等等，而死细胞的原生质则丧失了这些特性。在植物生理研究中，经常需要鉴定细胞的死活。本实验练习两种鉴定方法：质壁分离法及活体染色法，同时还可以通过对质壁分离及活体染色结果的观察，了解原生物的某些特性，如黏滞性、荷电性等，以加深对有关理论的理解。 一、植物细胞的活体染色与死活鉴定 ［原理］活体染色是利用某种对植物无害的染料稀溶液对活细胞进行染色技术。中性红是常用的染料之一，它是一种弱碱性pH6.4～8.0之间（由红变黄），在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应，因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现桃红色。在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色。死细胞由于原生质变性凝固，胞液不能维持在液泡内，因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象，相反，中性红的阳离子却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。 ［仪器与用具］显微镜1台；小培养皿一套；载玻片2片；盖玻片2片；单面刀片1片；尖头镊子1把；酒精灯1具；火柴1盒；擦镜纸、吸水纸适量。 ［试剂］ 0.03%中性红溶液；1mol/dm３硝酸钾溶液。 ［方法］ 1.选用洋葱鳞茎（或大葱假茎基部幼嫩部位）及小麦片作实验材料。 2．切下一片较幼嫩的洋葱鳞片，用单面刀片在鳞片内侧纵横割划成0.5cm2的小块，用尖头镊子将内表皮小块轻轻撕下，即可投入中性红溶液染色（注意应将表皮内側向下）。若用小麦片为材料，可将叶片背面朝上平放在载玻片放入盛有少量清水的培养皿内，用左手将叶片按平，右手用刀从一个方向轻轻刮去下表皮和叶肉部分，只留下透明的上表皮细胞。当刮到的只剩下少量叶肉细胞时要小心，用力太重容易损伤表皮细胞，甚至只剩下一层细胞壁，太轻又会留下过多的叶肉细胞，影响观察。除了小麦外，其他禾本科植物均可用此法制备表皮细胞纸片。将刮好的纸片切成约0.5cm2的小块。

人类小鼠原代肺成纤维细胞分离方法

Primary human/mouse lung fibroblast isolation 人类/小鼠原代肺成纤维细胞分离方法 参考文献(H: 1.Katharina Heinzelmann et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2018; 2. Claudia A Staab-Weijnitz et al. Am J Respir Crit Care Med. 2015. FK506-Binding Protein 10, a Potential Novel Drug Target for Idiopathic Pulmonary Fibrosis; M: Isolation and characterization of mouse fibroblasts, Benjamin L. Edelman and Elizabeth F. Redente) Materials: 材料： 1. Digestion solution: a).Liberase TM (5401119001, Merck) solution, 2.5mg/ml (HBSS); b).DNAse (D4263-5VL, Sigma), 2000U/ml(PBS) 消化液：a) Liberase TM 溶液（5401119001, Merck）：溶于HBSS（终浓度2.5mg/ml） b) DNAse溶液（D4263-5VL, Sigma）：溶于PBS（终浓度2000U/ml） 2. Nylon filters 40/70 μm 3. Complete medium (Mouse: DMEM/F12 + 20% FBS + 1% Penicillin/Streptomycin + 0.1% Amphotericin B + 1% Glu; Human: DMEM/F12 + 20% FBS + 1% Penicillin/Streptomycin + 0.1% Amphotericin B) 4. Knife (disposable) 5. Syringe 6. PBS Digestion solution: Steps: (Mouse from 1-13, Human from 7-13) 步骤： 1. Weight the mouse, calculate the amount of anesthesia, Xylazin : Kelamin : NaCl = 1:4:5, 100ul/10g weight; 称重小鼠后麻醉 2. Inject and wait 10min till the mouse sleep 腹腔注射后等待10分钟

免疫细胞的分离和保存技术

免疫细胞的分离和保存技术 用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。 一、白细胞的分离 （一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。 本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min 后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。 （二）聚合物加速沉淀法 本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。本法的细胞获得率比自然沉降法高。 二、外周血单个核细胞的分离 外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为 1.075～1.090，血小板为 1.030～1.035。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的

细胞的质壁分离

观察植物细胞的质壁分离 一、实验目的： 1．学会观察植物细胞质壁分离与复原的方法。 2．了解植物细胞发生渗透作用的原理。 二．实验原理： 1．质壁分离的原理：当细胞液的浓度小于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而失水，细胞液中的水分就透过原生质层进入到溶液中，使细胞壁和原生质层都出现一定程度的收缩。由于原生质层比细胞壁的收缩性大，当细胞不断失水时，原生质层就会与细胞壁分离。 2．质壁分离复原的原理：当细胞液的浓度大于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而吸水，外界溶液中的水分就通过原生质层进入到细胞液中，整个原生质层就会慢慢地恢复成原来的状态，紧贴细胞壁，使植物细胞逐渐发生质壁分离复原。 三、实验材料： 紫色洋葱鳞片叶的外表皮。（因为液泡呈紫色，易于观察。） 0.3g/ml的蔗糖溶液。（用蔗糖溶液做质壁分离剂对细胞无毒害作用。） 三、实验步骤： 步骤注意问题分析 1．制作洋葱表皮的临时装片。在载玻片上滴一滴水，撕取洋葱鳞片叶外表皮放在水滴中展平（也可挑取几条水绵放入水滴中）。盖上盖玻片。盖盖玻片应让盖玻片的一侧先触及载玻片，然后轻轻放平。防止装片产生气泡。 2. 观察洋葱（或水绵）细胞可看到：液泡大，呈紫色，原生质层紧贴着细胞壁。（或水绵细胞中有带状叶绿体，原生质层呈绿色，紧贴着细胞壁。液泡含花青素，所以液泡呈紫色。先观察正常细胞与后面的“质壁分离”起对照作用。 3. 观察质壁分离现象。从盖玻片的一侧滴入0．3g/ml的蔗糖溶液，在另一侧用吸水纸吸引，重复几次。镜检。 观察到：液泡由大变小，颜色由浅变深，原生质层与细胞壁分离。原生质层与细胞壁之间充满蔗糖溶液。重复几次( 蔗糖溶液浓度大于细胞液浓度，细胞通过渗透作用失水，细胞壁伸缩性小原生质层的伸缩性大，液泡和原生质层不断收缩，所以发生质壁分离。) 为了使细胞完全浸入蔗糖溶液中。糖液浓度不能过高否则，细胞严重失水死亡，看不到质壁分离的复原。 4. 观察细胞质壁分离的复原现象。从盖玻片的一侧滴入清水，在另一侧用吸水纸吸引，重复几次。镜检。 观察到：液泡由小变大，颜色由深变浅，原生质层恢复原状。(细胞液的浓度高于外界溶液，细胞通过渗透作用吸水，所以发生质壁分离复原现象。) 发生质壁分离的装片，不能久置，要马上滴加清水，使其复原。重复几次。( 因为细胞失水过久，也会死亡。为了使细胞完全浸入清水中。) 四、实验讨论答案： 1．如果将上述表皮细胞浸润在与细胞液浓度相同的蔗糖溶液中，这些表皮细胞会出现什么现象？ 答：表皮细胞维持原状，因为细胞液的浓度与外界溶液浓度相等。 2．当红细胞细胞膜两侧的溶液具有浓度差时，红细胞会不会发生质壁分离？为什么？ 答：不会。因为红细胞不具细胞壁。

肺成纤维细胞分离

【摘要】目的：建立一套可靠的鼠肺细胞分离、纯化和培养技术,用于体外研究间质性肺病的发病机制及治疗方法。方法：采用胰酶消化出生后2 d SD大鼠肺组织块及SD大鼠肺泡灌洗液, 经差时贴壁法, 分离、纯化红皮鼠肺成纤维细胞(lung fibroblast, LF)和SD大鼠肺泡巨噬细胞（pulmonary alveolar macrophage,AM）, 并进行原代培养。用波形蛋白(Vimentin)、CD14细胞免疫荧光染色、蛋白质印迹和电镜对所分离的细胞进行鉴定。结果：所得细胞产量大、纯度高。细胞免疫荧光染色LF细胞波形蛋白染色阳性而CD14染色阴性；AM细胞则相反。扫描电镜观察可见肺成纤维细胞有微绒毛，细胞间连接成网状，蛋白质印迹结果显示波形蛋白表达。结论：该方法是一种可靠的红皮鼠肺成纤维细胞及大鼠肺巨噬细胞的分离纯化培养技术, 可用于间质性肺病（interstitial lung disease, ILD）的发病机制及治疗方法的体外研究。 【关键词】大鼠; 肺成纤维细胞; 巨噬细胞; 原代细胞培养 ［基金项目］江苏省高校自然科学研究计划项目（03KJD320076）;镇江市社会发展科技计划项目（SH2004043） Isolation and purification and primary culture of lung cells from rats Y AN Yu-lan, LIU Yang, BU Xue-feng, ZHANG Zhi-jian, ZHENG Jin-xu (Department of Respiratory Medicine, the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212002; School of Medicine，Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013,China) ［Abstract］Objective: To develope a reliable method for isolation, purification and primary culture of lung fibroblast(LF) and pulmonary alveolar macrophage(AM) from rat for studies on pathogenesis and treatment of interstitial lung disease in vitro. Methods：The lung tissue of 2 days old immature rats was digested with trypsin.LFs and AMs were isolated and purified, then cultured. The nature of the cultures was identified by CD14 staining, vimentin staining, electron micrography and Western blot. Results：Excellent yields of highly purified, culturable AMs and LFs could be obtained from adult rats and 2 day babyish rat lungs,respectively. The expression of CD14 in AMs was positive and that of vimentin negative by immunofluorescence chemistry. Those, however, in LFs were just opposite. Ramified stracture between purified LFs were observed by ultrastructural examination under electron micrography.Vimentin in purified LFs was revealed by Western blot. Conclusion：This technique might be a reliable method for isolation and purification and primary culture of pulmonary alveolar macrophages and lung fibroblasts from rat lung and could be used for the study of interstitial lung disease ［Key words］lung fibroblasts; immature rat; pulmonary alveolar macrophage; primary cell culture 原代培养又称初代培养, 是自供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。原代培养的细胞来源于刚刚离体的组织和细胞, 其生物学特性未发生很大变化, 仍具有二倍体遗传特征, 最接近和反映体内生长特性, 对研究细胞的生长、分化、代谢及其生理、病理变化的机制具

细胞培养的基本方法-细胞分离技术

细胞培养的基本方法-细胞分离技术 细胞分离技术 一、从原代组织中分离细胞将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机 械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。 从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短, 以保持最大的活性。下列步骤可以解聚整个组织，获得较高产量的有活性细胞。 1. 胰蛋白酶（Trypsin） ?在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mn小片，通过悬 浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗2到3次。 ?将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。加入0.25 %溶解在无钙镁的平衡盐 溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml胰蛋白酶）。 ?在4C孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。 ?移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37C孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。 ?在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要 加入大豆胰蛋白酶抑制剂。 ?通过无菌不锈钢丝网（100?200mm过滤，分散所有剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。 2. 胶原酶（Collagenase） ?用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm」、片，用Hanks'平衡液（HBSS清洗组织碎片 几次。 ?加入胶原酶（50?200单位/ml，溶解在HBSS中）。 ?在37C孵育4到18小时。加入3mM CaCI2增加解离效率。 ?通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。 如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。 ?通过离心在HBSS中清洗悬液几次。 ?再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。 3. Dis pase ?用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mn小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片 几次。 ?加入Dispase （0.6?2.4单位/ml溶解在无钙镁的平衡盐溶液） ?在37C孵育20分钟到几个小时。 ?通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的

观察植物细胞的质壁分离和复原

实验九观察成熟植物细胞的质壁分离和复原 实验原理： 当外界溶液浓度大于细胞液浓度时，根据扩散作用原理，水分会由细胞液中渗出到外界溶液中，通过渗透作用失水； 由于细胞壁和原生质层的伸缩性不同，细胞壁伸缩性较小，而原生质层性较大，从而使二者分开； 反之，外界溶液浓度大于细胞液浓度，则细胞通过渗透作用吸水，分离后的质和壁又复原。 目的要求： 1．初步学会观察植物细胞质壁分离和复原的方法； 2．理解植物细胞发生质壁分离和复原的原理。 重点和难点： 1．初步掌握植物细胞质壁分离和复原的实验方法； 2．临时装片的制作； 3．高倍显微镜的使用。 实验器材： 紫色洋葱的鳞片叶、刀子、镊子、滴管、载玻片、盖玻片、吸水纸、显微镜； 质量浓度为0.3g/mL的蔗糖溶液、清水； 方法步骤： 一．临时装片制作： 1．选材： （1）选用紫色特别深的洋葱外表皮； 说明： A．在实验之前，最好将洋葱放在水中浸泡一下，可以使洋葱吸 水多一些，而且代谢也比较旺盛，实验效果明显。 B．将洋葱的外层剥去两层，因为处于最外的可能已经死亡； （2）取表皮： 在洋葱的外表皮上，用刀片划一些“井”字，用镊子轻轻撕取一小块； 关键： 最好撕取的是一层细胞，如果撕的太厚，则会使细胞重叠，严重影响 实验效果； 2．制片： 在载玻片中央滴上一滴清水，然后将取下的洋葱表皮放在水中，平展开来； 加上盖玻片。 二○○一年十月二十五日星期四第 1 页共4 页

二○○一年十月二十五日星期四 第 2 页 共 4 页 注意： A ． 洋葱表皮不能卷曲起来； B ． 不能带有气泡； C ． 加盖玻片时，要从一侧大约呈45°角放下，在载玻片和盖玻片之间 充满了清水，以便挤出空气。 二．观察： (一) 低倍镜观察： (二) 高倍镜观察： 在高倍镜下主要要注意以下几个结构： （1 ） 紫色的大液泡，几乎充满了整个细胞； （2） 注意观察原生质层和细胞壁紧紧地贴在一起。 （3） 找到细胞核，它是判断液泡膜还是细胞膜的关键。 (三) 质壁分离实验： 1．处理： 从载物台上取下装片，在盖玻片的一侧，滴入0.3g%mL 的蔗糖溶液，另一侧用吸水纸重复吸引几次。 实验成功关键之处： (1) 最好多重复几次，因为在洋葱表皮周围充满的是清水，如 果不多重复几次，洋葱表皮周围的蔗糖溶液浓度太低，质壁分离效果不明显。 (2) 所用的溶液特别要注意以下几点： A ． 不能是对植物细胞有伤害作用的物质，如强酸强 碱，因为它们会使细胞致死，而死亡的细胞内的膜便失去了选择透过性，而成了全透性； B ． 外界溶液中的物质必须是不可以被植物细胞吸收的物

原代细胞培养之--细胞分离技术

原代细胞培养之－－细胞分离技术 原代细胞的分离和制作 人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下： 一、悬浮细胞的分离方法 组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。 二、实体组织材料的分离方法 对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。 （一）机械分散法 所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。 （二）消化分离法 组织消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。 1、酶消化分离法 酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下： （1）胰蛋白酶分散技术

实验二 细胞器的分离与提纯

实验二细胞器的分离与观察 一、教学目的与要求 1. 学习利用差速离心法分离动物细胞的细胞器。 2. 掌握细胞核与线粒体的染色方法和现象。 二、实验原理 线粒体（Mitochondria，MT）是真核细胞特有的，进行能量转换的重要细胞器，有“细胞动力工厂”之称。细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在线粒体中进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成A TP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。 制备线粒体采用组织匀浆悬液介质中进行差速离心的方法。在给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次分离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而细胞质中的染料被还原成无色。 三、实验用品 器材：冰箱、纱布、瓷研钵、高速冷冻离心机。 材料：新鲜的猪肝脏。 试剂：见PAGE 64 四、实验步骤 1. 制备猪肝细胞匀浆。实验前购买新鲜猪肝脏备用。 割取一小块肝组织，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织1g，剪碎，用预冷到0-4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0-4℃条件下，按每克肝加4ml 冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加，匀浆用双层纱布过滤备用。注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。 2. 差速离心。先将5ml 0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心地加入5ml 肝匀浆使其覆盖于上层，用高速冷冻离心机进行差速离心。 3. 滤液经700×g离心10min，分离核和杂质沉淀。 4. 取上清液10 000×g离心10min，沉淀为线粒体。 5. 沉淀经再次洗涤、离心后，即可得到纯度较高的线粒体。 5. 分离物鉴定。

(生物科技行业类)灏洋生物向您介绍几种细胞的分离方法

灏洋生物向您介绍几种细胞的分离方法： 白细的胞分离：（加速红细胞沉降法） 加速红细胞沉降法利用高分子量的聚合物促使红细胞凝聚成串钱状，从而加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。常用的高分子聚合物有明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及甲基纤维素等。 （1）试剂及配制 3%明胶（灏洋生物产）（粘度为25泊以上）：选取优质明胶，用生理盐水配成3%溶液，置沸水浴加热溶解，分装，高压蒸汽灭 菌8磅15-20min. 6%右旋糖酐（灏洋生物产）（分子量200-400KD）：用生理盐水配制。 操作方法分为2种。 第一种：①取抗凝静脉血加入等量3%明胶盐水溶液中，混匀或用3份血液与1份3%明胶溶液混匀；②将试管直立静置室温或37℃温箱中30-60min,利用明胶与红细胞的粘合作用，促使红细胞快速下沉，而白细胞留在明胶溶液中；③用毛细吸管吸取富含白细胞的上层液，移入另一试管中；④按自然沉降法④-⑤操作。 第二种：①取1份右旋糖酐溶液加等量抗凝血，混匀；②按操作方法1的②-④操作。 外周血单个核细胞分离试剂：（聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法） 外周血中单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同，红细胞和多核细胞比重较大，为1.092左右，而淋巴细胞和单核细胞比重为1.075左右。利用比重1.077左右的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 1．试剂及配制 ⑴聚蔗糖泛影葡胺分层液（LTS1077）：（灏洋生物有成品供应），比重为1.077±0.001 ⑵台盼蓝染液：称取4g台盼蓝，于研钵中用少量双蒸水研磨，加双蒸水至100ml ,1500r/min离心15min,吸出上层液，即为4%水溶液。用前，1.8%氯化钠溶液1倍，即为2%台盼蓝染液。 2.操作方法 ⑴取静脉血放入抗凝管，摇允，用Ph7.2-7.6 Hank 液稀释血液1-2倍。 ⑵取LTS1077聚蔗糖-泛影葡胺分层液（灏洋生物产）3-4ml,放入15X150mm试管中。 ⑶用毛吸管吸取稀释血液，在离分层液上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于分层液上，稀释血液与分层液体积比例约为2：1。 ⑷用水平离心机以2000r/min离心30min,离心后管内容物分为三层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分层液，底层为红细胞和多核白细胞。在上、中层液体界面处可见到乳白色浑浊的单个核细胞层。 ⑸用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿试管壁周缘吸取界面层单个核细胞，移入另一试管中。 ⑹加5倍以上体积不含Ca2+、Mg2+Hank液，混匀，1500r/min离心10min,吸弃上清，重复洗涤2次。 ⑺末次离心后，吸尽上清。按每毫升血液标本加0.2ml含20%小牛血清Hank液重新混悬细胞。取1滴细胞悬液置血球计数板内计数。然后细胞浓度调节至2X106/ml ⑻细胞活力检测：取1滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液混匀，加盖片，显微镜高倍镜检。活细胞不着色，折光强；死细胞被染成蓝色，体积略膨大。活细胞数应在95%以上。 3．注意事项 ⑴用稀释后的全血可是单个核细胞得率高，将稀释的血液叠加于分层液上时，一定要细心，动作要轻，避免冲散分层液面或与分层液混合而影响分离结果。 ⑵配制单个核细胞悬液所用的培养液要求等渗，具缓冲作用，并对细胞无毒性。 ⑶吸取单个核细胞时，应避免吸出过多上清液或分层液而导致血小板污染。 ⑷配制好的单个核细胞可放室温或0-4℃，后一条件较好，可减低细胞代谢活动。注意不要迅速改变其所出的温度，以免造成“温度”休克。 通用型细胞分离液（LTS1130）的比重的配方（灏洋生物产） 取比重LTS1077的人淋巴细胞分离液（灏洋生物产）3ml ,放入15X150mm试管中。 用PBS将肝素抗凝血稀释1-2倍后，将稀释全血加到LTS1077分离液上，稀释的血液：分离液约为2：1。 用水平离心机以1500r/min离心10min,离心后，单个核细胞位于血浆和分离液的界面层，红细胞和粒细胞沉淀在

植物细胞器的分离

植物细胞器的分离 一、叶绿体的分离： 1.实验原理： 采用差速离心法，利用不同颗粒的大小形状不同导致沉降速率不同，把叶绿体的颗粒沉降出来。 2.实验材料及试剂： 成熟的猪笼草、山梨醇、Tris、EDTA与β-巯基乙醇均为Amresco产品、细胞器分离缓冲液:300 mmol/L山梨醇, 50mmol/L Tris-HCl(pH为8.0), 5 mmol/L EDTA(pH 8.0), 0.1%β-巯基乙醇(临用前加入)。 3.实验器材： SG350C多功能食品料理机(上海天航电器有限公司) , GL21M高速冷冻离心机及配套的2号角转头(湘仪集团) 山梨醇：配制体积：100 mL，浓度：3 mol/L；分子量：182.17g/mol 需要称取质量g:=100 mL*3 mol/L*182.17g/mol=0.1L*3 mol/L*182.17g/mol=54.651g EDTA: 配置体积：100ml , 浓度：0.5mol/lL ,分子量：292.248g/mol m= 0.5mol/L *100mL *292.248g/mol =14.6124 g LEDTA : 配置体积:100ml 浓度：25mol/L ,分子量：292.248g/mol m=2.5mol/L*100mL * 292.248g/mol=73.062g 4.制备方法 4.1 叶绿体粗提物的制备 （1）. 取25 g叶片置于100 mL充分预冷的细胞器分离缓冲液中,用食品料理机匀浆2 min(5000r/min), （2）. 然后将匀浆液用4层纱布过滤于500ml烧杯, （3）. 滤液于4℃、700g在1000r/min离心10 min,

植物细胞质壁分离与复原详细实验步骤

植物细胞质壁分离与复原详细实验步骤 （一）制作临时装片并观察 1、制片 ①、用拇指和食指夹住载玻片，然后取三层纱布沿一个方向擦拭载破片，直到对光看到载玻片光亮无污物为止。 ②、在载玻片上滴一滴水。（注意胶头滴管的正确使用方法：①握持方法是用中指和无名指夹住玻璃管部分以保持稳定，用拇指和食指挤压胶头以控制试剂的吸入或滴加量。 ②不能倒置，也不能平放于桌面上。③胶头滴管加液时，不能伸入容器） ③、 A 、洋葱：选用紫色特别深的洋葱外表皮，用刀片划“井”字，用镊子轻轻撕取中间的小正方形。（注意在洋葱未经过处理时一定要取外表皮）由于每种材料主要只在取材上有区别，其它步骤基本类似。下面老师演示一种洋葱鳞片叶外表皮装片。 ④、将撕取的洋葱鳞片叶外表皮借助解剖针放在水滴中展平，主要是为了细胞尽量无重叠。 ⑤、用镊子夹住盖玻片盖在载玻片上（同学们注意：盖盖玻片应让盖玻片的一侧以大约 45 ?先触及载玻片，然后轻轻放平，防止装片产生气泡）如果四周水过多可以用滤纸吸一下。 2、观察洋葱细胞 显微镜使用顺序：取镜—安放—对光（无载破片）打开光源—低倍镜对准通光孔—聚光器调到最高—调节反光镜—把宏光光圈打开（如果还不够亮可以稍微动一下粗准焦螺旋）—放装片—先用低倍镜调粗准焦螺旋至物像清晰，并调至中央，后扭转物镜转换器用高倍镜观察 可以看到洋葱鳞片叶表皮细胞中紫色的中央液泡，还可以看到原生质层紧贴着细胞壁。 （二）、观察质壁分离及复原 1、观察质壁分离现象 ①取下载玻片（如果不取下，在载物台上滴加蔗糖会一不小心滴漏在显微镜上，会损坏显微镜） ②从显微镜上取下装片，放在实验桌上。从盖玻片的一侧滴入0.3g /mL的蔗糖 溶液，在盖玻片的另一侧用吸水纸吸引，重复几次，为什么要重复呢？让盖玻片下面的洋葱鳞片叶完全侵润在蔗糖溶液中。 ③高倍镜观察表皮细胞发生的变化。中央液泡变小，原生质层脱离细胞壁 2、观察细胞质壁分离的复原现象 ①取下载玻片（如果不取下，在载物台上滴加清水会一不小心滴漏在显微镜上, 会损坏显微镜） ②从显微镜上取下装片，放在实验桌上。从盖玻片的一侧滴入清水，在盖玻片另一侧用吸水纸吸引，这样重复几次。洋葱鳞片叶表皮浸润在清水中。 ③用高倍显微镜观察，可以看到中央液泡逐渐胀大，原生质层又逐渐贴向细胞壁。实验

小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养

小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养 一、实验材料 1.主要仪器设备 (1)倒置显微镜（Olympus，Japan） (2)CO2培养箱（BB16HF，上海力申科学仪器有限公司） (3)100ml的玻璃培养瓶（江苏海门市大路塑料实验仪器厂） (4)6孔培养板（COSTAR，每孔直径为3.5cm） (5)Eppendroff管 (6)1ml,2ml,5ml的玻璃滴管各30支；10ml尖底离心管和直径为8cm的平皿 (7)离心机 (8)5ml冻存管 (9)两套小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊） 2.主要试剂配制 (1)MEF(mouse embryo fibroblast，小鼠胚胎成纤维细胞)培养液 ——低糖DMEM母液 1)用一个1000ml的大烧杯加入1000ml无菌无内毒素的超纯水（购自福州新北生化工业有限公 司）； 2)将一小袋低糖DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水中，同时轻轻搅拌，并 冲洗包装袋的内面以洗下所有的粉未。 3)每升培养基中添加3.7gNaHCO3。 4)搅拌直至完全溶解。 5)用1NHCl或1NNaOH调培养基的pH至比最终的工作液的PH低0.2-0.3，调好PH后，将容 器密封（在该实验中用1NHCl调PH至7.3）。 6)立即用0.22um的滤器过滤除菌，装入高压过的盐水瓶中, 4℃保存(1个月内用完)。 ——MEF培养液 取100ml上述配好的低糖DMEM液体，加入10000IU青霉素钠（6.25mg）和10mg链霉素，溶解后再次调节PH至7.3，经0.22um的滤器过滤至高压过的血清瓶中，再添加10ml分装好的 新生牛血清（Newborn Calf Serum, GIBCO/BRL,需56℃，30min灭活过），4℃保存至使用。 (2)PBS 在500ml超纯水中依次溶入 NaCl 4.0g KCl 0.1g Na2HPO4.12HO2 1.445g KH2PO40.1g 于121℃高压灭菌30min或经0.22um的滤器过滤除菌再分装入100ml洁净灭菌的盐水瓶中，再放入4℃冰箱中保存备用。 (3)0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液 在100ml超纯水中分别溶解 胰蛋白酶干粉(Trypsin, Sigma,T4799) 0.25g EDTA 0.02g

常用的微生物分离纯化方法

(一)常用的微生物分离纯化方法 菌种分离纯化的方法有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法、选择培养分离法等。其中前三种方法最为常用,不需要特殊的仪器设备,分离纯化效果好,现分别简述如下 1.稀释混合倒平板法 平板是指经熔化的固体培养基倒入无菌培养皿中,冷却凝固而成的盛有固体培养基的平皿。该法是先将待分离的含菌样品,用无菌生理盐水作一系列的稀释(常用十倍稀释法,稀释倍数要适当),然后分别取不同稀释液少许(0.5-1.0ml)于无菌培养皿中,倾入已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基,迅速旋摇,充分混匀。待琼脂凝固后,即成为可能含菌的琼脂平板。 于恒温箱中倒置培养一定时间后,在琼脂平板表面或培养基中即可出现分散的单个菌落。每个菌落可能是由一个细胞繁殖形成的。

挑取单一个菌落,一般再重复该法1-2次,结合显微镜检测个体形态特征,便可得到真正的纯培养物。若样品稀释时能充分混匀,取样量和稀释倍数准确,则该法还可用于活菌数测定。 图4混合倒平板操作法示意图图5涂布平板操作法示意图 2.稀释涂布平板法 采用上述稀释混合倒平板法有两个缺点，一是会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间,缺乏溶氧而生长受影响,形成的菌落微小难于挑取；一是在倾入熔化琼脂培养基时，若温度控制过高,易烫死某些热敏感菌，过低则会引起琼脂太快凝固,不能充分混匀。

在微生物学研究中,更常用的纯种分离方法是稀释涂布平板法。该法是将已熔化并冷却至约50℃(减少冷凝水)的琼脂培养基,先倒入无菌培养皿中,制成无菌平板。待充分冷却凝固后,将一定量(约0.1ml)的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面,再用三角形无菌玻璃涂棒涂布,使菌液均匀分散在整个平板表面,倒置温箱培养后挑取单个菌落。 另一种简单快速有效的涂布平板法,可省去含菌样品悬液的稀释,直接吸取经振荡分散的样品悬浮液l滴加入1号琼脂平板上,用一支三角形无菌玻璃涂棒均匀涂布,用此涂棒再连续涂布2号、3号、4号平板(连续涂布起逐渐稀释作用，涂布平板数视样品浓度而定),翻转此涂棒再涂布5号、6号平板,经适温倒置培养后挑取单个菌落。该法可称之为玻璃涂棒连续涂布分离法。 3.平板划线分离法 先倒制无菌琼脂培养基平板,待充分冷却凝固后,用接种环以无菌沾取少量待分离的含菌样品,在无菌琼脂平板表面进行有规则的划线。划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其它形式的划线。通过这样在平板上进行划线稀释,微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少,并逐步分散开来。经培养后,可在平板表面形成分散的单

关于植物质壁分离与复原的实验报告单

观察植物细胞的质壁分离和复原 一、实验目的 1．学会观察植物细胞质壁分离与复原的方法； 2．了解植物细胞发生渗透作用的原理。 二．实验原理 成熟的植物细胞在一定浓度的溶液中，构成一个渗透系统。当水分通过原生质层出入细胞后，由于原生质层与细胞壁的伸缩性大小不同，将导致原生质层与细胞壁分离或复原。 三、实验材料、用具 实验材料：（原因？） g/ml的蔗糖溶液（可否适用0.5g/ml的蔗糖溶液？原因？） 显微镜，镊子、载玻片及盖玻片、滴管、水等 四、探究程序 1：制作临时装片与观察 制作临时装片：用刀片在洋葱鳞片叶的外表面划一个小方块，用镊子撕取这一小块洋葱表皮，将它平展地放在载玻片中央的清水滴中，并盖上盖玻片； 观察：先用低倍镜找到洋葱表皮细胞，并移到视野中央，然后移走低倍镜，换上高倍镜。这时可看到洋葱表皮细胞中紫色的大液泡，还可以看到______ __________________________________；2：细胞的质壁分离 滴蔗糖溶液：从载物台上取下装片，从盖玻片的一侧滴入0.3g／mL的蔗糖溶液，在盖玻片的另一侧用吸水纸吸引。这样重复几次，洋葱表皮细胞就浸润在蔗糖溶液中 观察：将装片放在载物台的中央，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察。可以看到细胞中的液泡逐渐变小，_________________________________，最后完全分离 3：质壁分离的复原 滴清水：从载物台上取下装片，从盖玻片的一侧滴入清水，在盖玻片的另一侧用吸水纸吸引这样重复几次，洋葱表皮细胞又浸润在清水中 观察：将装片放在载物台的中央，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，可以看到中央液泡逐渐胀大，原生质层又逐渐贴着细胞壁 五、实验结果及结论的分析 1．实验现象： 在细胞液的浓度__________外界溶液的浓度时，洋葱鳞片叶表皮细胞就失水，液泡体积，细胞液浓度，颜色；发生质壁分离； 在细胞液的浓度__________外界溶液的浓度时，细胞就吸水，液泡体积，细胞液浓 度，颜色已出现了质壁分离的细胞，发生质壁分离复原。 2．实验结论 细胞能否从外界吸收水分取决于细胞液的浓度和外界溶液浓度的高低。当细胞液的浓度高于外界溶液的浓度时，细胞就吸水，否则就失水 习题 1．对图示的生物学实验的叙述正确的是（） A．图甲是用低倍显微镜观察某视野中的图像，如要看清洋葱根尖处于分裂期的细胞，应将装片适当向左移动 B．图乙是某同学在2m×2m样方范围内进行的双子叶草本植物苦荬菜种群密度的调查，圆圈表示个体，则这块地苦荬菜的种群密度为3.25株/m2 C．图丙是在高倍显微镜下观察到的黑藻叶细胞的细胞质处于不断流动的状态，实际上图中所标注的叶绿体位于右下角，细胞质按逆时针方向流动 D．图丁表示用高倍显微镜观察正在发生质壁分离的紫色洋葱表皮细胞，可见其液泡的颜色逐渐变浅 2．很多生物学实验都需要制作临时装片，在显微镜下观察，下列实验步骤不正确的是（） A．脂肪的鉴定：切取花生子叶薄片→染色→洗去浮色→制片→观察 B．观察细胞中叶绿体：取黑藻幼嫩小叶→染色→制片→观察 C．察观察细胞有丝分裂：解离洋葱根尖→漂洗→染色→制片→观察 D．观察细胞质壁分离：制作洋葱鳞片叶表皮装片→观察→滴入0．3g/mL蔗糖溶液→观察 3．（多选）用一个紫色洋葱的鳞片叶可做下列哪些实验的材料? （） A．观察植物细胞减数分裂B．观察植物细胞的质壁分离和复原 C．观察细胞中DNA和RNA的分布D．叶绿体中四种色素的提取和分离 ①