016-2010版中国药典培训回答(第4部分：菌种传代与特定菌检测1)

1.以第五代菌做阳性对照，实验过程中的接种按药典应该也算传代，那是否算是第六代菌呢？

答：依然算第五代(接种的菌株算第5代，培养后算第6代)

2.其实验结果是算哪一代菌的？

答：见上题

3.现在有无对照菌种可以购买？联络电话？

答：省药检所业务科销售药典规定的标准菌株，为第二代甘油冻存管，电话：020-********

4.菌种发放单应包括什么信息？

答：根据自己工作的需要，大致包括：菌种名称，编号，来源，接收日期，接收人等。

5.如何检查黑曲霉孢子悬浮液孢子含量为50~100个

／ml。铜绿假单胞菌单菌如果用甘油冷冻管，也是低温，是否也会影响它的活性？应如何保存？

答：可用玫瑰红钠琼脂培养基或改良马丁琼脂来确定黑曲霉孢子悬浮液。铜绿假单胞菌应使用最终甘油浓度为20%的甘油冻存管保存，保存在-30℃或更低温度，则可保持其活性。若是斜面或营养肉汤，建议室温保存。

6.工作菌株，25℃下可连续使用一周，这里的工作菌株是指原液还是制备好的菌悬液。为何工作菌株不低温存放，而是25℃？

答：首先要说明，所有的操作应按药典要求来操作，这里的工作菌株指原液，工作菌株建议在2-8℃保存，但要注意的是，铜绿假单胞菌的工作菌液不能低温保存，低温会损伤其活性。由于笔误，写成了25℃，请更正为2-8℃。

7.简单方便的厌氧培养方案？

答：硫乙醇酸盐培养基；固体培养基的话可考虑使用一次性厌氧袋。

8.甘油冻存管一定要－30℃吗？0℃以下不可以吗？答：详见《中国药品检验标准操作规范》2010版341页。我们的甘油冻存管保存在-30℃。

9.第一代菌种可不可以作为工作菌株使用？

答：我们不这样使用，因为担心菌株没有充分复壮，生化特性可能不典型。

10.制备菌悬液时，要使其在10~100cfu中，应多注意的地方是什么？

答：制定标准化操作规程，减少不同实验者带来的误差，接种量、培养温度和时间应每次一致。

11.铜绿假单胞菌不宜放冰箱内保管，但其营养肉汤液能否放在冰箱保管？

答：详见《中国药品检验标准操作规范》2010版341页。能否放冰箱可自行验证。

12.黑曲霉的存放期如何验证？

答：通过孢子悬液计数和菌落特征，进行验证。

13.标准储备菌株必须进行纯度和特性确认？还是在

必要情况下才做？

答：详见《中国药品检验标准操作规范》2010版341页，我们在制备标准贮备菌液前进行纯度和特性确认，最好在使用前再进行纯度和特性确认。

14.铜绿假单胞菌贮存温度应为多少度？

答：一般在10℃以上，甘油冻存管至少在-30℃以下。

15.制备工作菌种进行菌种保藏中的保存期是否要进

行验证？

答：可参考2010年版《中国药典》标准操作规程（SOP），应进行验证。

16.验证用菌株可否使用ATCC？

答：如果按中国药典检验的，用CMCC

17.菌种鉴定该如何做？

答：请参考讲义内容。

18.药典菌悬液制备是要菌种的新鲜培养物接种至培养基中，培养18-24h再进行稀释，制备菌悬液，可否直接使用未过期工作菌种进行稀释来制备菌悬液？答：按药典要求不行，如要使用，请自己验证。。19.斜面低温保藏法：每一次的菌种传代都需要做菌种纯度鉴定吗？

答：建议制备斜面保存管前进行菌种纯度鉴定，以后的每次传代视具体情况而定。

20.如何比较快速有效判断菌液的浓度？除了可以用“比浊仪”参考，还有什么方法？

答：比浊仪只做辅助参考，还需通过平板计数来最后确认菌液的浓度。

21.曾于中检所中购买过黑曲霉的0代包子悬液，说明书上表示应于-20℃中保存，可保存一年，对于此保存唯独及效期，药企可否同法保存自制的黑曲霉孢子悬液？是否要验证？如何验证？

答：黑曲霉孢子悬液制备请参照2010版药典的相关内容。关于验证在前面的问题中已经回复。

22.菌种纯度确认，怎么确认，需确认哪些项目？答：请参照2010版药典的相关内容。

23.细菌菌种接入营养肉汤中保存一周，这需要验证吗？、

答：建议做验证。

24.菌种斜面最多能保存菌几代？经冰箱保存的斜面菌种是否需复苏二次才能进行菌悬液配制？

答：药典规定，菌种传代不应超过5代。冰箱保存的斜面菌种复苏后即可使用。

25.革兰氏染色的时间一般多长时间，染色时间长了对结果有无影响？

答：详见讲义内容，应严格控制染色时间，否则对结果影响很大。

26.哥伦比亚血琼脂平皿生长的菌落，对氧化酶试验是否有影响？菌悬液的制备过程中，接种菌种新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，这个新鲜培养物怎么理解，冰箱保存斜面菌种是新鲜培养物吗？答：没使用过哥伦比亚血琼脂及相关实验。新鲜培养物指刚培养好的菌株，冰箱保存斜面菌种不算新鲜培养物。

27.菌种鉴定时，一定要根据药典的所有试验做完，才能确认是某种菌株吗？可否省略一些试验？

答：请按药典规定来进行菌种鉴定，具体情况可能还要增加适宜的鉴定试验。

28.工作菌株可在25℃连续使用一周，是指同一代同一管的菌株吗？还是说同一代不同管的菌株？

答：笔误更正，同上一题。

29.若没有比浊仪，用什么方法来确认50~100cfu/ml？特别是孢子？

答：孢子计数建议通过平板计数的方法来确定浓度。

30.工作菌种是否可以使用后再次冷藏使用（斜面保藏法）？

答：请自行掌握。

31.大肠埃希菌镜检时，有时固定好的菌在染色过程中脱落，请问是什么原因引起这种情况？

答：首先，洗干净拨片，挑菌注意不要太多，待菌固定好后再进行染色。

32.生孢梭菌，菌落培养计数时一定要在厌氧条件下进行吗？

答：是

33.菌悬液怎样在24h内确定其菌落数？请讲解细菌和真菌的方法.

答：平板计数方法。

34.生孢梭菌培养时，怎样做才能使其在厌氧中培养？答：详见2010版药典

35.菌种的纯度鉴定包括哪些内容？如果是跟省药检所买的3代菌是否就不用做纯度或确认试验？

答：省所现在销售的是第二代的甘油冷冻管，严格来说，请做纯度确认。

36.为什么有时候细菌管会长真菌，而真菌管也会长细菌。

答：原因可能是多方面的，某些细菌适宜在真菌培养基上生长，而某些真菌也能在细菌培养基上生长。比如2010版药典无菌检查法，两种培养基的使用范围已删去，已不是绝对的细菌培养基或真菌培养基。

37.在做方法验证时，黑曲霉菌浓度大于20cfu/皿时，培养5天后菌落蔓延扩散，无法各个区分，如何在药典要求的50~100cfu和实际操作结果中找到平衡？因为菌浓对回收率及操作RSD%影响很多.

答：培养48-72h后，菌落刚形成时，及时点计并做记号，然后每天观察有无新的菌落长出并计数。

38.标准菌黑曲霉在传代前需要先接到改良马丁培养基复苏后，再传代，如果需要，接到改良马丁培养基后培养时间怎么定？

答：2010版药典规定，黑曲霉传代，培养时间为5~7天

39.有时候在玫瑰红钠琼脂或营养琼脂平板上生长有酵母菌，在酵母菌生长的位置底部产生了一个气泡状的圆形，把底部的琼脂都贡起来了，又或者表面没有

任何菌落，而琼脂被贡起来，请问这种圆形气泡是菌吗？在计数时是否也把它算入酵母菌？

答：建议挑取气泡内含物接种至改良马丁琼脂培养基中，若能生长，且为酵母菌的菌落形态，应该可以将其算入酵母菌。

40.大肠生化实验中的靛基质试验（I）项结果为“ ”或者“-”均不影响最终结果的判断，请问该项的意义何在？是否可以取消？

答：反应为，为典型大肠埃希氏菌，-为非典型大肠

埃希菌。关系到最终判断，都是必须的实验，不可取消。