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实验二 总糖和还原糖的测定(DNS)

实验二 总糖和还原糖的测定(DNS)
实验二 总糖和还原糖的测定(DNS)

实验二总糖和还原糖的测定

──3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的要求:

掌握还原糖和总糖的测定原理,学习用比色法测定还原糖的方法。

二、实验原理:

在NaOH和丙三醇存在下,3,5-二硝基水杨酸(DNS)与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色,在540nm波长处有最大吸收,在一定的浓度范围内,还原糖的量与光吸收值呈线性关系,利用比色法可测定样品中的含糖量。

三、试剂和器材

1、试剂

3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂:称取5.0g DNS溶于200ml 2mol/L NaOH溶液中(不适宜用高温促溶),接着加入到酒石酸甲钠的热溶液中(192g就是酸甲钠溶于500ml水中),再加入5g结晶酚和5g亚硫酸钠,摇匀溶解后,冷却定容至1000ml,暗处保存备用。

葡萄糖标准溶液:准确称取在105℃的温度下烘干至恒重的葡萄糖0.5g,加少量蒸馏水溶解后,以蒸馏水定容至1000ml。

6mol/L HCl:取250ml浓HCl(35%~38%)用蒸馏水稀释到500ml。

碘-碘化钾溶液:称取5g碘,10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。

6N NaOH:称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。

0.1% 酚酞指示剂:0.1g酚酞溶于100ml无水乙醇中。

1%淀粉

2、材料

淀粉。

3、器材

WFJ UV-2000型分光光度计,水浴锅,电炉,10ml比色管。

四、操作方法

1、葡萄糖标准曲线制作

取6支10ml 比色管并编号,按下表顺序加入各种试剂。(表1)

混匀后置沸水浴上加热5min 进行显色,取出后用流动水迅速冷却,各加入蒸馏水4.0mL ,摇匀(用10mL 比色管,加蒸馏水补齐至5mL 刻度线),在540nm 波长下,用0号管调零,分别读取各管的吸光度值A 540。以葡萄糖含量(mg )为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。

2、淀粉水解及还原糖的提取

取1%淀粉25mL ,放在100mL 烧杯中,加入6mol/L HCl 10mL ,然后加入蒸馏水15mL ,混匀,于沸水浴中保温30min ,取出1~2滴置于白瓷板上,加1滴I 2-KI 溶液检查水解是否完全。如已水解完全,则不呈现蓝色。水解毕,冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂,以6N NaOH 溶液中和至溶液呈微红色,并定容到100mL ,从中取10mL 于100mL 容量瓶中,定容至刻度,混匀,即为稀释1000倍的总糖水解液,用于还原糖测定。

4、样品中含糖量的测定

取3支10ml 比色管,分别按下表加入试剂:(表2)

注:0号管同表1中0号管; 6号、7号为淀粉水解液平行实验。

加完试剂后,于沸水浴中加热5min 进行显色,取出后用流动水迅速冷却,各加入蒸馏水4.0mL ,摇匀(用10mL 比色管,加蒸馏水补齐至5mL 刻度线),在540nm 波长处测定光吸收值。测定后,取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖量。

5、结果处理

按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量:

%100

1000%100

1000C V

m C V

m ??????还原糖(以葡萄糖计)=

总糖(以葡萄糖计)=

式中:C──还原糖或总糖提取液的浓度,mg/ml ;

V──还原糖或总糖提取液的总体积,ml;

m──样品重量,g;

1000──mg换算成g的系数。

五、注意事项

标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行,一起显色和比色

思考题

1. 比色时为什么要设计空白管?

2. 比较费林试剂比色法与3,5-二硝基水杨酸比色法测定可溶性淀粉中还原糖和总糖的结果,这两种方法各有何优点?

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