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纸层析法分离氨基酸

纸层析法分离氨基酸
纸层析法分离氨基酸

纸层析法分离氨基酸

目的和要求

掌握分配层析的原理,学习氨基酸纸层析法的操作技术(包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量)。学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的方法。

原理

层析法亦称色层分离法、色谱分析法或色谱法。1903年俄国化学家茨维特(M. Tswett)发现用挥发油冲洗菊粉柱时,各种颜色的色素在吸附柱上从上到下排列成色谱,故称“色层分离法”。1931年有人用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体,显示了这一分离技术的高度分辩力,从此引起了人们的广泛注意。自1944年应用滤纸作为固定支持物的“纸层析”诞生以来,层析技术的发展越来越快,五十年代开始,相继出现了气相色谱和高压液相层析,其它如薄层层析、亲合层析、凝胶层析等也迅猛发展。层析分离技术操作简便,样品用量可大可小,既可用于实验室分离分析,又适用于工业生产中产品的分析制备。现已成为生物化学、分子生物学、生物工程等学科广泛应用而又必不可少的分析工具之一。

根据所用的支持物及其理化性质不同可将层析法分成三类:1. 用固体吸附剂做支持物的称吸附层析;2. 用吸附了某种溶剂的固体物质(如滤纸)做支持物的称为分配层析;3. 用其表面所含离子能与溶液中的离子进行交换的固体物质做支持物的称为离子交换层析。

纸层析所依据的原理是分配层析,故属于分配层析的范畴。

㈠分配层析

分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而使之得到分离的方法。将分配层析法中的一种溶剂设法固定在一个柱内,再用另外一种溶剂来冲洗这个固定柱,同样可达到将不同物质分离的目的。我们把固定在柱内的液体称为固定相,把用作冲洗的液体叫做流动相。为了使固定相固定在柱内,需要有一种固体物质把它吸牢,这种固体物质本身对分离无作用,对溶质也几乎没有吸附能力,称为支持物。进行分离时由于被分离物质的各组分在两相中的分布不同,因此当流动相移动时,不同组分移动的速度也不相同。易溶于流动相中的组分移动快,在固定相中溶解度大的组分移动就慢,结果得以分离。

显然,分配层析法中不同溶质的分离取决于其在两相(固定相和流动相)间分配系数的不同,分配系数(α)的定义是:α =溶质在固定相的浓度(C S)/溶质在流动相的浓度(C L)

滤纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。滤纸的成份是纤维素,其–OH基为亲水性基团,可吸附一层水或其它溶剂作为固定相(S)。通常把有机溶剂作为流动相(L)。当将溶质样品(被分离物)点在滤纸的一端后,该物质溶解在吸附于支持物上的水分子或其它溶剂分子的固定相中,有机溶剂作为流动相自上而

下移动,称为下行层析;反之,使有机溶剂自下而上移动,称为上行层析。流动相流经支持物时即可与固定相对溶质进行连续的抽提,物质在两相间不断分配的结果即得到分离。滤纸层析原理还可进一步解释如下:把滤纸看成一个层析柱,后者由多个连续的微板层构成,与溶剂饱和水一道组成固定相;某有机溶剂用作流动相。当第一层流动相中加入分配系数不同的单位量A、B两物质后,各溶质即可根据一定的分配系数在两相中进行分配,而随着流动相继续向下层移动,各层固定相与新流下的流动相之间会不断进行新一轮的分配。如此继续抽提下去,A、B两物质就可以完全分开。显然,各物质分配系数相差越大,则越易分开。

物质分离后在图谱上的位置可用比移值Rf来表示,Rf值的定义是:从溶质层析的起点(原点)到层析斑点中心的垂直距离与从原点到溶剂流动的前沿的垂直距离的比值:

Rf = 原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

两相体积比在同一实验情况下是不变的,所以Rf值的主要决定因素是分配系数(α)。由于每一物质在一定条件下α值是固定的,因此Rf值为其特征常数,可做为定性鉴定的参考数值。

㈡影响Rf值的主要因素

1. 物质结构对于Rf值的影响:“物以类聚”,极性物质易溶于极性溶剂(水)中,非极性物质易溶于非极性溶剂(有机溶剂)中。所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸。所以前者在水(固定相)中分配较多,因此Rf值低于后者。

2. 溶质与溶剂间的相互作用对Rf值的影响:这种影响是由溶质与溶剂间的相互作用与分配系数的关系所决定的。溶质与溶剂之间若能形成氢键,对分配系数的影响就很大。例如酚、三甲基吡啶、氨等和水混合后都能很好地与溶质形成氢键。某些溶剂(例如酚,正丁醇等)是质子的供体,而水既是质子的供体又是质子的受体。当溶质结构中增加能接受质子的基团(例如-NH2)时,因酚与水都能给-NH2提供质子,所以酚和水两相对接受质子的基团的引力,基本上是一致的,因此当溶质结构中增加氨基时,该物质与酚和水的作用对其在酚和水两相间的分配影响不大,对Rf值影响较小。又例如当有机溶剂是质子的受体(如三甲基吡啶等),而溶质也是质子的受体(如-NH2基),这时有机溶剂对-NH2没有引力,而水却有引力,于是水的引力就大于有机溶剂,因此溶质就被水拉向水相,对Rf值的影响就大。

3. pH对Rf值的影响:这种影响主要是由pH与分配系数的关系所决定的。弱酸与弱碱的解离度受pH影响很大,解离度越大,极性越强,极性强的物质在两相溶剂中分配时,偏向于极性强的一相,这样,改变pH就会同时改变分配系数,从而使Rf也会相应变化。在氨基酸的层析法中,改变溶剂的pH,使酸性和碱性氨基酸的Rf值变动较大,而中性氨基酸的Rf值变动较小。在正丁醇中加甲酸,可使酸性氨基酸的极性降低,从而使Rf值变大,而使碱性氨基酸的Rf变小。反之,如在正丁醇中加氨,可使天冬氨酸和谷氨酸的Rf值变小,而使赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的Rf值变大。

4. 滤纸对Rf值的影响:滤纸本身的pH及含水量对Rf值的影响很大,所以

不同的滤纸得到不同的Rf值及不同的斑点形状。纸上含水量的多少随溶剂与纸对水的亲和力的大小而异,质地不均一的滤纸常使溶剂扩展不一致,随着纤维的纹理流动紊乱,另一方面纸的含水量不均一,也不能得到理想的分离效果。

5. 温度对Rf值的影响:Rf值的重现性与恒温情况的好坏有密切关系。温度对Rf值的影响主要是因为溶质在固体相与流动相之间的分配随温度的变化而不同。随各溶剂组分的粘度和表面张力的不同其蒸发能力也不同,因此有些溶剂系统对温度的敏感程度强些,有些则差些。敏感程度强的对温度的要求就严格,敏感程度差的对温度的要求就不太严格。温度改变使溶剂系统中的溶解度改变,所以Rf值也改变。一般层析展层是在恒温室中进行的,室温可在20℃至40℃,温度改变不超过±0.5℃。

无色物质的层析图谱可用光谱法(如核苷酸类物质用紫外光照射)或显色法鉴定。氨基酸纸上层析图谱常用的显色剂有茚三酮、吲哚醌。本实验采用茚三酮为显色剂。茚三酮显色反应受温度、pH,时间影响较大。如果要使结果重复,必须严格控制上述条件。样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不显出颜色。样品中含大量盐时显色点上会出现白斑,空气中其它的杂质如氨,硫化氢或酚等皆会影响显色结果。铜离子可以与氨基酸-茚三酮显色物形成络合物,颜色较稳定,用硫酸铜乙醇溶液洗脱层析后的显色斑点,可以通过比色法定量测定氨基酸含量。由于纸上层析设备条件较简单,操作比较简便,并可以分离微量样品,因此纸层析方法已成为生化分析和研究的主要方法之一,广泛应用于氨基酸、肽、核苷酸,糖、维生素以及脂肪酸等的分离鉴定。

操作步骤

标准氨基酸纸上层析(单向上行层析)

滤纸:选用国产新华1号滤纸(若有较多的样品需在纸上分离,可采用新华3号滤纸),戴上橡皮手套,将滤纸裁剪成28cm×28cm,在距纸边2cm处,用铅笔轻轻划一条线,于线上每隔适当距离画一小圆圈作为点样处,圈直径不超过0.5cm。

点样:点样要合适,样品点的太浓,斑点易扩散或拉长,以致分离不清,氨基酸的点样量以每种氨基酸含5~20μg为宜,将准备好的滤纸平铺在实验台上,用点样管(也可用血色素管代替)吸取氨基酸样品10μg(1μg/μL),与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心,这时样品就自动流出。点样的扩散直径控制在0.5cm之内,点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴,为使样品加速干燥,可使用吹风机吹干。记下点样位置(标样及混合样)。

将点好样品的滤纸两侧比齐,用线缝好,揉成筒状。注意缝线处纸的两边不要接触。避免由于毛细现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐,影响Rf值。

展层及显色:配制酸性溶剂系统(20 ml/份):正丁醇:80%甲酸:水=15:3:2(体积比),加入茚三酮显色液并混匀。

将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内(注意滤纸不要碰皿壁),盖好钟罩进行展层(60~90 min),当溶剂展层至距离滤纸上沿约1cm时,取出滤纸,立即用铅

笔标出溶剂前沿位置,置烘箱烘干至显色。

标准氨基酸Rf值的计算:用尺测量显色斑点的中心与原点(点样中心)之间的距离和原点到溶剂前沿的距离,求出此值,即得某特定氨基酸的Rf值。

依据各标准氨基酸的层析位置推断混合样品中含有哪些成份。

注意事项:

(1)使用茚三酮显色法时应在整个层析操作中避免手直接接触层析纸,因为手上常常有少量含氮物质,显色时亦呈现紫色斑点而污染层析结果,因此操作时应戴橡皮手套或指套。同时也要防止空气中的氨。

(2)为了鉴定未知样品中某几种氨基酸的存在,仅用一种溶剂系统展层通常是不够的。一船应采用2~3种溶剂系统展层,显色后再分别与这些溶剂系统的标准氨基酸图谱比较以相互印证,才能作出比较确切的结论。

试剂和器材

试剂

1. 若干种氨基酸标准液(1mg/mL)

2. 氨基酸混合液(每种氨基酸500mg/mL)

3. 0.5%茚三酮丙酮溶液(显色)

4. 正丁醇(需重蒸,沸程:116~120℃)。

5. 80%甲酸

器材

新华滤纸培养皿(直径115mm) 电热鼓风干燥箱吹风机

点样管针、线、尺橡皮手套钟罩

思考题

1. 为什么在展层时有时用一种溶剂系统,而有时用两种溶剂系统?

2. 酸性溶剂系统(或碱性溶剂系统)对氨基酸极性基团的解离有何影响?

3. 滤纸上点上1μl l0.02mol/L 的甘氨酸(分子量=75)溶液,请问实际上点了多少

微克的氨基酸?

4. 该实验中有哪些因素可能会影响到氨基酸的层析效果?

附1:分配层析原理

αA = 1 αB = 1/3

1st次分配2nd次分配3rd次分配

显然,分配系数愈小(流动相溶解度愈大)则移动愈快,反之亦然

附2:层析图谱

R f = X/Y Y

X1 X2

氨基酸的纸层析法

氨基酸的纸层析法 一、实验目的 了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。 二、实验原理 以滤纸为支持物的层析法,称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时,水为静止相,他与滤纸纤维亲和力强;有机溶剂为流动相,它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的,称为上行法;有上向下移动的,称为下行法。 将样品在滤纸上确定的原点处展层,由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配,且他们的分离系数各不相同,所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同,于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来,形成距原点不等的层析点。在一定条件下(室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变),不同的氨基酸有固定的移动速率(Rf值) Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。 用混合氨基酸做样品时,如果只用一种溶剂展层,由于某些氨基酸的移动速率相同或相近,就不能将它们分开,为此,当用一种溶剂展层后,可将滤纸旋转90度,以第一次所的层析点为原点,在用另一溶剂展层,从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有甘氨酸、苯丙氨酸组成。 三、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器 四、实验试剂 1、混合氨基酸 2、展层剂:正丁醇:12%氨水:95%乙醇:蒸馏水=13:3:3:1(v:v) 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液:0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮,贮于棕色瓶中 五、实验步骤 1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张,在一端打孔,系一根细线,在另一端2~3cm处用铅笔画一横线,中间画两个圆点(原点)。 2、取毛细管一支(回收),吸取氨基酸混合液,在上面两个点处点样,样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干,点2~3次为佳。 3、点样后将滤纸放入层析缸中展层,注意点样线要高于层析液面,滤纸不要贴在层析缸璧上,当展层至另一端1~2cm处时,停止展层(大约2~3小时)。 4、取出滤纸,用铅笔记下溶剂前沿,然后用热风吹干(或烘箱60℃)烘干。 5、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液,注意使溶液不倒流,不间断。 6、用吹风机吹干,观察层析点,确定其几何中心。 7、量取数值,计算各自的Rf值,与表中标准氨基酸Rf值比较,确定样品氨基

氨基酸纸上层析实验报告

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原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。用混合氨基酸做样品时,如果只用一种溶剂展层,由于某些氨基酸的移动速率相同或相近,就不能将它们分开,为此,当用一种溶剂展层后,可将滤纸旋转90度,以第一次所的层析点为原点,在用另一溶剂展层,从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。 三、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器 四、实验试剂 1、混合氨基酸(精氨酸,酪氨酸,苯丙氨酸) 2、展层剂:正丁醇:12%氨水:95%乙醇:蒸馏水=13:3:3:1(v:v) 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液:0.5g茚三酮溶于100ml 无水丙酮,贮于棕色瓶中

纸层析法分离氨基酸实验报告

纸层析法分离氨基酸 一、前言 纸层析法 纸层析法又称纸色谱法,是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。它是一种以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分,流动相为不与水相溶的有机溶剂;也可使纸吸留其他物质作为固定相,如缓冲液,甲酰胺等。将试样点在纸条的一端,然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后,各组分移动距离不同,最后形成互相分离的斑点。将纸取出,待溶剂挥发后,用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离(Rf值)与已知样比较,进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下,以溶剂溶出组分,用适宜方法定量(如光度法、比色法等)。 纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术,可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定;也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法,其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相,展层用的有机溶溶剂是流动相。

在环境分析测试中,有时用纸层析法分离试样组分,它用于一些精度不高的分析,如3,4-苯并芘。但不如GC、HPLC应用普遍。 做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎,浸出绿色液体,将液体与层析液(石油醚)混合,将滤纸一段进入混合液体,四种色素在层析液中的溶解度不同,在滤纸上留下4条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。 纸层析法一般用于叶绿体中色素的分离,叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b,它们在层析液中的溶解度不同,溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快,反之则慢;含量较多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下4条色素带,所以利用纸层析法能清楚地将叶绿体中的色素分离。 氨基酸 氨基酸是构成蛋白质的基本单位,广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术产业的发展逐渐成为2l世纪全球的主要产业之一,氨基酸的需求量越来越大,品种变更越来越快,工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为100万吨,而需求总量是800万吨。我国自20世纪60年代起,氨基酸的应用在食品工业占61,,在饮料工业占30,,医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。 氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用: (1)在食品行业的应用 (2)在医药工业的应用

DNS-氨基酸的制备和鉴定-

DNS-氨基酸的制备和鉴定 实验目的 1.了解并掌握DNS-氨基酸的制备和鉴定的原理 2.掌握制备Dansyl氨基酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法 实验原理 荧光试剂5-二甲氨基-1-萘磺酰氯(dansyl-Cl,简称DNS-Cl)在碱性条件下与氨基酸(肽或蛋白质)的氨基结合成带有荧光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白质),DNS-氨基酸再经酸水解可释放出DNS-氨基酸,其反应式如下: 图1:DNS-氨基酸生成反应机理图2:单项层析结果示意图DNS-Cl能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物,其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS-氨基酸衍生物。这些衍生物相当稳定,可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析,灵敏度可达10-10~10-9mol水平,比茚三酮法高10倍以上,比过去常用的FDNB 法高100倍。将Edman法和DNS法结合起来(称为Edman-DNS法)应用于蛋白质结构的序列分析上作,可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。 DNS-Cl在pH过高时,水解产生副产物DNS-OH,即: 图3:DNS-Cl在pH过高水解产生DNS-OH

在DNS-Cl过量时,会产生DNS-NH 2 ,即: 图4:DNS-Cl过量产生DNS-NH 2 DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄绿色荧光,而DNS-OH和DNS-NH 2 产生蓝色荧光,可彼此区分开。 DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定,在薄膜上检测灵敏度为0.01ug(相当于10—10mol)。由于它具有灵敏度高,分辨力强,快速,操作方便等优点,已被广泛应用于各种化合物的分析。 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异(如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等),使各组分在两相(一相为固定的,称为固定相;另一相流过固定相,称为流动相)中的分布程度不同,即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力影响不同,从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。 聚酰胺是—类化学纤维原料,由己二酸与己二胺聚合而成的称锦纶66 。因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团,故统称聚酰胺。它对很多极性物质有吸附作用,这是由于聚酰胺的一C=O及>NH基能与被分离物质之间形成氢键。如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类<如核苷酸、氨基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键;硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键。被分离物质形成氢键能力的强弱,确定吸附能力的差异。在层析过程中,层层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。因此选择适当的展层溶剂,使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异,经过吸附与解吸的展层过程,可以一一分离。 实验器材 1.聚酰胺薄膜(7×7cm) 2.电吹风一个 3.紫外灯一台 4.点样管(4支) 5.吸管 6.量筒

实验四-氨基酸的纸层析法

姓名:郭沈杰年级专业:2012级生物科学同组者:蔡萍萍 学号:12050011012 实验四氨基酸的纸层析法 一、实验目的 了解并掌握氨基酸纸层析法的原理和方法。 二、实验原理 以滤纸为支持物的层析法,称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时,水为固定相,它与滤纸纤维亲和力强;有机溶剂为流动相,它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的,称为上行法;有上向下移动的,称为下行法。 将样品在滤纸上确定的原点处展层,由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配,且他们的分离系数各不相同,所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同,于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来,形成距原点不等的层析点。 在一定条件下(室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变),不同的氨基酸有固定的移动速率(R f值) R f=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 混合氨基酸做样品时,如果只用一种溶剂展层,由于某些氨基酸的移动速率相同或相近,就不能将它们分开,为此,当用一种溶剂展层后,可将滤纸旋转90度,以第一次所的层析点为原点,在用另一溶剂展层,从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 氨基酸无色,利用茚三酮反应,可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。

本实验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、苯丙氨酸。 三、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器 8、铅笔 9、直尺 四、实验试剂 1、精氨酸、苯丙氨酸、混合氨基酸(精氨酸、苯丙氨酸) 2、展层剂:正丁醇:12%氨水:95%乙醇:蒸馏水=13:3:3:1(v:v) 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液:0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮,贮于棕色瓶中 五、实验步骤 1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张,在一端打孔,系一根细线,在另一端2~3cm处用铅笔画一横线,在上面相同间隔画3圆点(原圈直径约5mm)。 2、取毛细管3支,分别吸取精氨酸、苯丙氨酸、氨基酸混合液少许,在原圈处点样,样点

实验七 氨基酸的分离鉴定

实验七氨基酸的分离鉴定——纸层析法 一、目的 通过氨基酸的分离,学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、?原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法,它是利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。 惰性支持物是新华一号滤纸,其上含有很多的羟基,与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。水相因此称为静止相(固定相),有机溶剂称为流动相。 展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成,它们互相混合时便分成两相:一相是以水饱和了的有机相,另一相是以有机溶剂饱和了的水相。 分配系数(α)=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。 当用滤纸进行分配层析时,流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提,使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。 不同的氨基酸在一定的条件下,有其一定的Rf值,故可根据Rf值定性鉴定氨基酸,但通常用已知的标准氨基酸层析作对照,本实验就是如此。 ●纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 ●层析溶剂由有机溶剂和水组成

物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移值)来表示的: Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统;层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、材料与方法 (1)、材料:层析缸;毛细管;喷雾器;培养皿;层析滤纸;正丁醇;冰醋酸;分液漏斗;烧杯;培养皿;赖氨酸;脯氨酸;氨酸;苯丙氨酸;亮氨酸;茚三酮 (2)操作步骤 1.配置层析液置于密闭的层析缸中。 2.准备滤纸:取层析滤纸一张。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔划一直线,在直线上每间隔2cm做一记号,标出5个原点。 3.点样:用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上,用量10~20μl,每点在纸上扩散的直径,最大不超过3mm,边点样边用电吹风吹干,越小越好。干后再点一次。 4.扩展??用线将滤纸缝成筒状,纸的两边不能接触。将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中,并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下,扩展剂的液面需低于点样线1cm)。待溶剂上升15―20cm时即取出滤纸,铅笔描出溶剂前沿界线,自然干燥或用吹风机热风吹干。

纸层析法分离氨基酸

纸层析法分离氨基酸 目的和要求 掌握分配层析的原理,学习氨基酸纸层析法的操作技术(包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量)。学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的方法。 原理 层析法亦称色层分离法、色谱分析法或色谱法。1903年俄国化学家茨维特(M. Tswett)发现用挥发油冲洗菊粉柱时,各种颜色的色素在吸附柱上从上到下排列成色谱,故称“色层分离法”。1931年有人用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体,显示了这一分离技术的高度分辩力,从此引起了人们的广泛注意。自1944年应用滤纸作为固定支持物的“纸层析”诞生以来,层析技术的发展越来越快,五十年代开始,相继出现了气相色谱和高压液相层析,其它如薄层层析、亲合层析、凝胶层析等也迅猛发展。层析分离技术操作简便,样品用量可大可小,既可用于实验室分离分析,又适用于工业生产中产品的分析制备。现已成为生物化学、分子生物学、生物工程等学科广泛应用而又必不可少的分析工具之一。 根据所用的支持物及其理化性质不同可将层析法分成三类:1. 用固体吸附剂做支持物的称吸附层析;2. 用吸附了某种溶剂的固体物质(如滤纸)做支持物的称为分配层析;3. 用其表面所含离子能与溶液中的离子进行交换的固体物质做支持物的称为离子交换层析。 纸层析所依据的原理是分配层析,故属于分配层析的范畴。 ㈠分配层析 分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而使之得到分离的方法。将分配层析法中的一种溶剂设法固定在一个柱内,再用另外一种溶剂来冲洗这个固定柱,同样可达到将不同物质分离的目的。我们把固定在柱内的液体称为固定相,把用作冲洗的液体叫做流动相。为了使固定相固定在柱内,需要有一种固体物质把它吸牢,这种固体物质本身对分离无作用,对溶质也几乎没有吸附能力,称为支持物。进行分离时由于被分离物质的各组分在两相中的分布不同,因此当流动相移动时,不同组分移动的速度也不相同。易溶于流动相中的组分移动快,在固定相中溶解度大的组分移动就慢,结果得以分离。 显然,分配层析法中不同溶质的分离取决于其在两相(固定相和流动相)间分配系数的不同,分配系数(α)的定义是:α =溶质在固定相的浓度(C S)/溶质在流动相的浓度(C L) 滤纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。滤纸的成份是纤维素,其–OH基为亲水性基团,可吸附一层水或其它溶剂作为固定相(S)。通常把有机溶剂作为流动相(L)。当将溶质样品(被分离物)点在滤纸的一端后,该物质溶解在吸附于支持物上的水分子或其它溶剂分子的固定相中,有机溶剂作为流动相自上而

氨基酸纸层析

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氨基酸纸层析法(验证性) 相关知识 1. 层析法(色谱法):是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别,使各组分以不同程度分布在两个相中,其中一个相为固定的(称为固定相),另一个相则流此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动,从而达分离。 2.几种常用的层析法 ①吸附层析 ②离子交换层析 ③薄层层析 ④凝胶层析(凝胶过滤) ⑤亲和层析 ⑥分配层析(适于在水,有机溶剂中都可溶的混合物) 当把一种物质在两种不混溶的溶剂中振荡时,它将在这两相中不均匀的分配。达到平衡时,这种物质在两种溶剂中的浓度之比是一个常数,即分配系数。 如果某一混全物的各组分在这两相中的分配系数有足够的差异,它们就可以被分离。 3.氨基酸的极性大小及各氨基酸结构 一、实验目的 1.通过氨基酸的分离,学习纸层析法的基本原理及操作方法 2.掌握氨基酸纸上层析法的操作技术(点样、平衡、展层、显色、鉴定) 二、实验原理 纸层析法是分配层析的一种,以滤纸作为惰性支持物。层析溶剂(扩展剂)由有机溶剂和水组成。 在纸上水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。由于纤维素上的羟基具有亲水性,和水以氢键相连,使这部分水不易扩散,所以能与跟水混合的溶剂仍然形成类似不相混合的两相。当有机相沿纸流动经过层析点时,层析点上溶质就在水相和有机相之间进行分配,有一部分溶质离开原点随有机相移动而进入无溶质的区域,这时又重新进行分配,一部分溶质从有机相进入水相。当有机相不断流动时,溶质就沿着有机相流动的方向移动,不断进行分配。溶质中各组分的分配系数不同,移动速率也不同,因而可以彼此分开。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf 值(比移)来表示的。 在一定的条件下某种物质的R f 值是常数。R f 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、P H 层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。氨基酸、糖、核甘酸、甾体激素、维生素、抗生素等很多物质都能用纸上层析法分离。上层层析、下层层析、单向层析、双向层析。 三、仪器、材料和试剂 仪器:每组学生准备尺子、小剪子或小刀 1.层析缸、培养皿、量筒、小烧杯、长颈漏斗、毛细管、吹风机、电热鼓风干燥箱、层析滤纸、手套 、透明胶带。 实验材料和试剂 1.标准氨基酸溶液 分别配制0.5%的Lys 、Ala 、Ile 、Met 溶液 2.待分离测定的混合氨基酸溶液 3.显色剂 0.1%水合茚三酮丙酮溶液。 4.扩展剂(展层剂):本实验使用酸溶剂系统 α= 物质在溶剂II 中的浓度 物质在溶剂I 中的浓度 R f = 原点到溶剂前沿的距离 原点到层析点中心的距离

实验六 氨基酸的纸层析法

氨基酸的纸层析法 一.目的 了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。 二、原理 以滤纸为支持物的层析法,称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时,水为静止相,他与滤纸纤维亲和力强;有机溶剂为流动相,它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的,称为上行法;有上向下移动的,称为下行法。 将样品在滤纸上确定的原点处展层,由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配,且他们的分离系数各不相同,所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同,于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来,形成距原点不等的层析点。 在一定条件下(室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变),不同的氨基酸有固定的移动速率(Rf值)Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。用混合氨基酸做样品时,如果只用一种溶剂展层,由于某些氨基酸的移动速率相同或相近,就不能将它们分开,为此,当用一种溶剂展层后,可将滤纸旋转90度,以第一次所的层析点为原点,在用另一溶剂展层,从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。

三、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器 四、实验试剂 1、混合氨基酸(精氨酸,酪氨酸,苯丙氨酸) 2、展层剂:正丁醇:12%氨水:95%乙醇:蒸馏水=13:3:3:1(v:v) 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液:0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮,贮于棕色瓶中 五、实验步骤 1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张,在一端打孔,系一根细线,在另一端2~3cm处用铅笔画一横线,中间画一圆点(原点)。 2、取毛细管一支(回收),吸取氨基酸混合液,在原点处点样,样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干,点2~3次为佳。 3、点样后将滤纸放入层析缸中展层,注意点样线要高于层析液面,滤纸不要贴在层析缸璧上,当展层至另一端1~2cm处时,停止展层(大约2~3小时)。

氨基酸的纸层析

氨基酸的纸层析 一、实验目的 1、了解纸层析法的使用原理。 2、掌握用纸层析法分离蛋白质的操作步骤。 二、实验原理 1、纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析方法,滤纸上的纤维具有羟基,是亲水基团, 滤纸吸附水作为固定相,其上流经的有机溶剂即展层剂作为流动相。当展层剂流经固定相时,固定相上的样品由于亲水、疏水能力不同,在两相之间不断分配,疏水能力强的多溶于流动相,随流动相移动距离较远,亲水能力强的移动距离则较近。 2、所有的氨基酸的α碳上均连接一个氢原子和两个亲水基团羧基(—COOH)与氨基(—NH2), 唯一的不同则在于R基团。因此R基团在氨基酸的亲水疏水能力对比中起到了决定性的作用。本实验采用脯氨酸、甘氨酸,苯丙氨酸,组氨酸,其亲水疏水能力迥异,能在滤纸上明显分开。 分配系数K=溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度 3、Rf值表示原点中心至显色斑点中心的距离与原点中心至流动相前沿的距离比。在一定条件 下,Rf值为定值,其影响的因素有物质本身的性质,溶剂的性质,PH值,温度,滤纸的性质等等,本实验不予探究。在测量原点中心至显色斑点中心的距离时,由于斑点的形状不规范(近似圆形),所以,一般取斑点的重心,测量出重心与起点的距离即可。

4、显色原理:茚三酮在弱碱性溶液中与α—氨基酸共热,引起氨基酸氧化脱氧,脱羧反应,最 后茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮发生作用生成紫色物质。 三、试剂 1.酸性层析液:正丁醇:88% 甲酸:水=15:3:2

2.显色储备液:0.4mol/L茚三酮—异丙醇:甲酸:水=20:1:5 3.标准氨基酸溶液(6mg/ml,苯丙氨酸Phe、甘氨酸Gly、脯氨酸Pro、组氨酸His) 4.未知样品液:上述四种氨基酸中的一种或几种混合液(每组任选一样品) 四、实验仪器 样品管毛细吸管 层析缸100ml量筒 50ml烧杯胶头滴管 移液管滤纸:15cm*15cm *1 铅笔直尺 保鲜膜细玻璃棒 电吹风薄膜手套 五、操作步骤 (一)展层剂和平衡溶剂的配制 1.在100ml烧杯中按照体积比正丁醇:88%甲酸:蒸馏水=15:3:2的比例配制展层 剂,建议为45ml:9ml:6ml。 2.取1ml显色贮备液混于展层剂中 3.将混合好的液体放于层析缸中,混匀密闭,静置(展层缸洗净后应除去多余的水, 否则会影响展层溶剂的比例而影响展层。 (二)点样(点样操作应戴上手套,防止样品和滤纸受污染) 1.实验台上铺好保鲜膜,保鲜膜下面可以蘸少量水,使得保鲜膜能与实验台面紧密贴 合,此后所有操作都在保鲜膜上进行,不再赘述。

氨基酸的分离鉴定(纸层析法)

氨基酸的分离(纸层析法) 一、实验原理 1、层析法又称色谱法,是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异(如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等),使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中,并使各组分以不同速度移动,从而得到有效的分离。 操作方式:纸层析、薄层层析、柱层析等 分离机理:分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等 2、纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法,展层溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性,在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机溶剂(流动相)沿纸流动经过层析点时,层析法上溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质中各组分的分配系数不同,移动速率也不同,因而可以彼此分开。 物质被分离后在滤纸上的移动速率用值表示: 只要条件(如温度、展层溶剂的组成)不变,值是常数,故可根据值作定 性依据。 氨基酸无色,利用茚三酮反应,可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。 二、实验器材 标准氨基酸溶液、滤纸、层析缸、保鲜膜、剪刀、毛细管、电吹风。 三、实验试剂 1、酸相溶剂:V[正丁醇(A.R)]:V[88%甲酸]:V[水]=15:3:2 2、显色贮备液:V(0.4mol/L茚三酮-异丙醇):V(甲酸):V(水)=20:1:5 四、实验操作 1、点样 量取30mL层析溶剂、1mL显色贮备液于层析缸中,混匀密闭,静置。 戴好手套,在桌上铺好一层保鲜膜。取一张干净滤纸,将其剪彩为18cm*14cm。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一条直线,在此直线上等距离分出几个点作为点样原点。 用毛细管将标准氨基酸和未知样品分别点在点样点上,每次点样后用电吹风冷风吹干再点下一次,点样点直径不超过5mm。 2、层析与显色

氨基酸的分离与鉴定

实验一氨基酸的分离与鉴定——滤纸层析法 目的要求 (1)通过实验,了解氨基酸滤纸层析法的原理。 (2)掌握氨基酸滤纸层析的操作方法。 原理 滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析(它也并存着吸附和离子交换作用)。滤纸纤维上羟基具有亲水性,因此吸附一层水作为固定相,而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动称为下行层析,自下而上流动称为上行层析。流动相流经支持物时,与固定相之间连续抽提,使物质在两相间不断分配而得到分离。 溶质在滤纸上的移动速率用R f值表示: 溶质结构、溶剂系统物质组成与比例、pH值、选用滤纸质地和温度等因素都会影响R f 值。此外,样品中的盐分、其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。 无色物质的纸层析图谱可用光谱法(紫外光照射)或显色法鉴定。氨基酸纸层析图谱常用的显色剂为茚三酮或吲哚醌,本实验采用茚三酮为显色剂。 本实验用单向上行层析法作标准氨基酸的标准曲线,用双向上行纸层析法作几种已知氨基酸的层析图谱。然后将其中的谷氨酸和天冬氨酸加以定量测定。 试剂和器材 一、试剂 (1)8×10-3mol/L谷氨酸和8×10-3mol/L天冬氨酸混合液。 (2)谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸和丙氨酸混合液(已知氨基酸混合液)。将以上氨基酸分别配制成8×10-3mol/L的浓度,然后混合之。 (3)茚三酮重结晶方法:茚三酮有时由于包装不好或放置不当常带微红色,需重结晶方可使用。5g茚三酮溶于15mL热水,加入0.25g活性炭轻轻搅动,若溶液太浓不易操作,可酌量加5—10mL热水,加热30min后趁热过滤(用热滤漏斗,以免茚三酮遇冷结晶而损失),滤液置冰箱内过夜,次日晨即见黄白色结晶出现,过滤,再以1mL冷水洗涤结晶,置于干燥器中干燥,最后装入棕色瓶内保存。 (4)0.1%硫酸铜(CuSO4·5H2O):75%乙醇=2 :38 硫酸铜难溶于乙醇,将硫酸铜直接用75%乙醇溶解不能得到澄清溶液,如将硫酸铜溶液和乙醇混合后,放置过久则会有沉淀析出,因此,必须在临用前按比例混合。 正丁醇(需重蒸),95%乙醇,88%甲酸,12%氨水(因氨易挥发,稀释前需测出毕重)。 0.5%茚三酮丙酮溶液。 二、器材 新华中速薄层析滤纸,层析缸(高约430mm,直径约290mm,具有磨口盖子),鼓风恒温箱,国产72型分光光度计,水浴锅,喷雾器,电吹风机,点样架,点样管,加溶剂的漏斗,针、线和尺子,橡皮(或线)手套,结晶皿。

实验七-氨基酸的分离鉴定

实验七-氨基酸的分离鉴定

实验七氨基酸的分离鉴定——纸层析法 一、目的 通过氨基酸的分离,学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法,它是利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。 惰性支持物是新华一号滤纸,其上含有很多的羟基,与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。水相因此称为静止相(固定相),有机溶剂称为流动相。 展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成,它们互相混合时便分成两相:一相是以水饱和了的有机相,另一相是以有机溶剂饱和了的水相。 分配系数(α)=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。 当用滤纸进行分配层析时,流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提,使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。 不同的氨基酸在一定的条件下,有其一定的Rf值,故可根据Rf值定性鉴定氨基酸,但通常用已知的标准氨基酸层析作对照,本实验就是如此。 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。

●层析溶剂由有机溶剂和水组成 ●物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移值) 来表示的: Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统;层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、材料与方法 (1)、材料:层析缸;毛细管;喷雾器;培养皿;层析滤纸;正丁醇;冰醋酸;分液漏斗;烧杯;培养皿;赖氨酸;脯氨酸;氨酸;苯丙氨酸;亮氨酸;茚三酮 (2)操作步骤 1. 配置层析液置于密闭的层析缸中。 2.准备滤纸:取层析滤纸一张。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔划一直线,在直线上每间隔2cm做一记号,标出5个原点。 3.点样:用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上,用量10~20μl,每点在纸上扩散的直径,最大不超过3 mm,边点样边用电吹风吹干,越小越好。干后再点一次。 4.扩展用线将滤纸缝成筒状,纸的两边不能接触。将盛有约20 mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中,并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下,扩展剂的液面需低于点样

实验六蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离

实验六蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离 一、目的 1.学习水解蛋白质的方法。 2.掌握纸层析的基本技术。 3.学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的方法。 二、原理 1.蛋白质的水解 蛋白质可以用酸、碱或酶如胃蛋白酶,胰蛋白酶,糜蛋白酶水解成最终产物氨基酸。实验室中常使用酸解法水解蛋白质。当在6 mo叭。盐酸溶液中将蛋白质在110t加热大约20 h,肽键断裂,此时蛋白质完全分解为氨基酸。 酸法水解蛋白质的优点是在水解过程中不发生外消旋作用,所得到的氨基酸均为L一氨基酸。大多数氨基酸在煮沸酸中是稳定的,但色氨酸则完全被破坏。丝氨酸和苏氨酸在酸解过程中或多或少地也有破坏。色氨酸的水解产物已知是一种棕黑色的物质——腐黑质,因此,用酸法水解蛋白质得到的水解液为棕黑色的。 2.纸层析法分离氨基酸 纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法。它利用不同物质在同一推动剂中具有不同的分配系数,经层析而达到分离的目的。在一定条件下,一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数,若以K表示分配系数 层析溶剂(又称推动剂),是选用有机溶剂和水组成的。滤纸纤维素与水有较强的亲和力(纤维素分子的葡萄糖基上的-OH基与水通过氢键相作用)能吸附很多水分,一般达滤纸重的22%左右(其中约有6%的水与纤维素结合成复合物),由于这部分水扩散作用降低形成固定相;而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱,可在滤纸的毛细管中自由流动,形成流动相。层析时,点有样品的滤纸一端浸入推动剂中,有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处,使其上的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。随着有机溶剂不断向前移动,溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的重新分配,同时溶质离开原点不断向前移动,溶质中各组分的分配系数不同,前进中出现了移动速率差异,通过一定时间的层析,不同组分便实现了分离。物质的移动速率以R f值表示: 各种化合物在恒定条件下,层析后都有其一定的R f值,借此可以达到定性、鉴别的目的。 溶质的结构与极性、溶剂系统的物质组成与比例、pH值、滤纸的质地以及层析的温度、时间等都会影响R f值。 三、仪器试剂和材料 1.仪器 (1)干燥箱 (2)水浴锅 (3)安培瓶 (4)层析缸 (5)吹风机 (6)喷雾器 2.试剂

氨基酸的分离鉴定--纸层析法

. 实验一:氨基酸的分离鉴定--纸层析法 一、目的: 通过氨基酸的分离,学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、原理: 层析法也叫色谱法,是一种物理分离方法,它是利用混合物中各组分的物理、化学性质的差异,使各组分以不同的程度分布在两个相中,其中一个相为固定相,另一个相则流过此固定相(称流动相)并使各组分以不同的速度移动从而达到分离。 层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一,运用这种方法可以分离性质极为相似而用一般化学方法难以分离的各种化合物。如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。 层析法有许多种类,根据分离所依据的理化性质不同,可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析等。 纸层析是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术,可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定;也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗生素等物质的一中分离分析工具。纸层析属于分配层析法。分配层析法是一种连续抽提法,利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数的不同而得到分离。纸层析以滤纸作为惰性支持物,滤纸纤维素上的羟基具有亲水性,能吸附一层水,把吸附在滤纸上的水作为固定相,展层用的有机溶剂为流动相。水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相:由于纤维素上的羟基具有亲水性,和水以氢键相连,使这部分水不易扩散,所以能与跟水混合的溶剂仍然形成类似不相混合的两相。当有机相沿纸流动经过层析点时,层析点上的溶质就在水相和有机相之间进行分配,有一部分溶质离开原点随有机相而进入无溶质的区域,这时,又重新分配,一部分溶质从有机相进入水相。当有机相不断流动时,溶质就沿着有机相流动的方向移动,不断分配。溶质中各组分的分配系数不同,移动速率也不同,因而可以彼此分开。 纸上层析法的一般操作是将混合物点到纸上,干后让溶剂从有样品的一端经毛细作用流到纸的另一端。 在密闭的容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向反复抽提,由于混合氨基酸在两相中的分配系数(当把一种物质在两种不相溶的溶剂中振荡时,它将在这两相中不均匀分配。达到平衡时,这种物质在两种溶剂中的浓度之比为一个常数,即所谓的分配常数,用a表示)不同,使不同的氨基酸分布在滤纸的不同位置上而得到分离。 一种物质在两种溶剂中的浓度之比是一个常数,也就是分配系数(?)。 分配系数不同: 物质在溶剂I中的浓度 ???= ——————————— 1 / 4 . 中的浓度物质在溶剂IIRf值基本上是常数。某一种物质在特定的溶剂系统、纸、展层方式、温度、pH等条件下的Rf 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、纸层析纸的质量(新华一号)和层析温度等因素有关。物质被分离后在纸层析图谱上的位置Rf:值(比移)来表示原点到层析点中心的距离 Rf = —————————————

氨基酸的鉴定

氨基酸的鉴定——纸层析法 171850044钱诗晨 一、实验目的 掌握纸层析法的基本原理。 通过对氨基酸的分离,掌握纸层析的操作方法并不学会分析未知样品中的氨基酸组分 二、实验原理 1、层析法又称色谱法(Chromatography),是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异(如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等),使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中,并使各组分以不同速度移动,从而得到有效的分离。操作方式:纸层析、薄层层析、柱层析等。 分离机理:分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等。 2、纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法,展层溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性,在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机溶剂(流动相)沿纸流动经过层析点时,层析点上溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质中各组分的分配系数不同,移动速率也不同,因而可以彼此分开。 物质被分离后在纸层析图谱上的移动速率用Rf值来表示: 在一定条件下,物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。 本实验利用纸层析法分离氨基酸,利用茚三酮反应将氨基酸层析点显色来鉴定氨基酸的种类。 三、实验试剂 1.酸性展层剂——正丁醇:88%甲酸:水=15:3:2 2.显色储备液:0.4mol/L茚三酮-异丙醇:甲酸:水=20:1:5 3.标准氨基酸溶液(6mg/ml,苯丙氨酸Phe、甘氨酸Gly、脯氨酸Pro、组氨酸His) 4.未知样品液:上述4种氨基酸中的一种或几种混合液(每组任选一个样品) 四、实验器材

氨基酸纸层析法

生物医药工程系《生物化学实验》预习报告 姓名刘英学号12104114 专业生物科学班级1班日期2013-9-28 实验名称 氨基酸纸层析法 实验目的1.了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。 2.学习纸层析法的操作技术,分析未知样品氨基酸的成分。 实验原理用滤纸为支持物进行层析的方法,称为纸层析法,它是分配层析法的一种。纸层析所用的展层溶剂大多是由水饱和的有机溶剂组成。滤纸纤维的—OH 基的亲水性基团,可吸附有机溶剂中的水作为固定相,有机溶剂作为流动相,它沿滤纸自下向上移动,称为上行层析;反之,使有机溶剂自上而下移动,称为下行层析。将样品点在滤纸上进行展层,样品中的各种氨基酸即在二相中不断进行分配,由于它们各自的分配系数不同,故在流动相中移动速率不等,从而使不同的氨基酸得到分离和提纯。纸层析法主要是依据混合组分对二相分配系数的差异进行分离,但亦存在着某种程度的吸附作用和离子交换现象。氨基酸经层析在滤纸上形成距原点不等的层析点,氨基酸在滤纸上的移动速率用R f 表示。 R f = 原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 只要实验条件(如温度、展层溶剂的组分、pH、滤纸的质量等)不变,R f 值是常数,因此可做定性分析参考。如果溶质中氨基酸组分较多或其中某些组分的Rf 值相同或近似,用单向层析不宜将它们分开,为此可进行双向层析,在第一溶剂展开后将滤纸转动90度,以第一次展层所得的层析点为原点,再用另一种溶剂展层,即可达到分离目的。由于氨基酸无色,可利用茚三酮反应使氨基酸层析点显色,从而定性和定量。 仪器及材料(型号、规格、数量 等)层析滤纸、烧杯、剪刀、层析缸、培养皿、猴头喷雾器、微量加样器或毛细管、吹风机一个、直 尺、铅笔、分光光度计 实验试剂(配制方法、数量多少、 用途)1.混合氨基酸溶液(水解后的氨基酸干粉) 甘氨酸溶液:50mg 甘氨酸溶于5mL 水中。 蛋氨酸溶液:25mg 蛋氨酸溶于5mL 水中。 亮氨酸溶液:25mg 亮氨酸溶于5mL 水中。 氨基酸混合液:甘氨酸50mg,亮氨酸25mg,蛋氨酸25mg 共溶于5mL 水中。 2.展层溶剂 碱相溶剂:正丁醇∶12%氨水∶95%乙醇= 13∶13∶13(V/V) 酸相溶剂:正丁醇∶80%甲酸∶水= 15∶3∶2(V/V),摇匀后放置半天以上,取上清液备用。

氨基酸纸层析分离鉴定

1.本实验中滤纸的作用是什么? 答:惰性支持物 2.实验中作为固定相和流动相的物质分别是什么? 答:吸附一层水作为固定相,有机溶剂为流动相。 3.R f值的含义、影响因素? 答: R表示溶质在滤纸上的移动速度。在一定的条件下某物质的Rf f 值是常数,可作为定性分析的依据。 Rf 值大小与样品物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量及温度、样品溶液中的杂质等因素有关。 4.R f值为多少范围内可以确定为同一物质? 答:样品与标样差值<0.05为同一物质。 5.层析滤纸和普通滤纸有什么区别? 答:层析滤纸,组成该滤纸的纤维素是亲水物质,能形成水相和展层溶剂的两相系统,被分离物质在两相中的分配保持平衡关系。纸层析用于分析简单的混合物时可做单向层析。对于复杂的混合物,可做双向层析。普通滤纸,由棉质纤维组成,按不同的用途而使用不同的方法制作。由于其材质是纤维制成品,因此它的表面有无数小孔可供液体粒子通过,而体积较大的固体粒子则不能通过。这种性质容许混合在一起的液态及固态物质分离。 6.为什么要平衡?平衡剂和扩展剂是同一物质吗? 答:平衡剂起到使纸层析上吸附的溶剂达到饱和, 是物质在展开剂和纸层析上吸附的溶剂中

7.用手直接接触滤纸会引起什么不良后果,为什么? 答:人手上含有汗渍(内涵氨基酸和干扰物)会干扰试验。 8.缝制的纸筒如果两边缘相靠会造成什么后果? 答:如果缝制的纸筒两边缘相靠的话会造成展开剂上升速度不均匀,影响氨基酸的分离,使得实验所得Rf值不准确。 9.为避免实验结果出现“拖尾”现象,实验操作中应注意哪些环节? 答:①层析滤纸要质地均匀,平整无折痕,厚薄适当,溶剂能匀速展开; ②点样时尽量将它们点在同一个点上,等一个干了再点下一个; ③要保证层析滤纸不被污染,特别是从点样线到溶剂前沿的部 分; ④各氨基酸样品点样时量要均匀,量要适中。 10.标记滤纸不能使用油性笔,为什么? 答:油性笔的油墨属于有机物,也会发生层析反应,以至于影响氨基酸的层析效果。

实验七氨基酸的分离鉴定精修订

实验七氨基酸的分离鉴 定 标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]

实验七氨基酸的分离鉴定——纸层析法一、目的 通过氨基酸的分离,学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法,它是利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。 惰性支持物是新华一号滤纸,其上含有很多的羟基,与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。水相因此称为静止相(固定相),有机溶剂称为流动相。 展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成,它们互相混合时便分成两相:一相是以水饱和了的有机相,另一相是以有机溶剂饱和了的水相。 分配系数(α)=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。 当用滤纸进行分配层析时,流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提,使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。 不同的氨基酸在一定的条件下,有其一定的Rf值,故可根据Rf值定性鉴定氨基酸,但通常用已知的标准氨基酸层析作对照,本实验就是如此。 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 层析溶剂由有机溶剂和水组成 物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移 值)来表示的:

Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统;层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、材料与方法 (1)、材料:层析缸;毛细管;喷雾器;培养皿;层析滤纸;正丁醇;冰醋酸;分液漏斗;烧杯;培养皿;赖氨酸;脯氨酸;氨酸;苯丙氨酸;亮氨酸;茚三酮 (2)操作步骤 1.配置层析液置于密闭的层析缸中。 2.准备滤纸:取层析滤纸一张。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔划一直线,在直线上每间隔2cm做一记号,标出5个原点。 3.点样:用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上,用量10~20μl,每点在纸上扩散的直径,最大不超过3mm,边点样边用电吹风吹干,越小越好。干后再点一次。 4.扩展?用线将滤纸缝成筒状,纸的两边不能接触。将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中,并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下,扩展剂的液面需低于点样线1cm)。待溶剂上升15―20cm时即取出滤纸,铅笔描出溶剂前沿界线,自然干燥或用吹风机热风吹干。 5.显色?用喷雾器均匀喷上0。1%茚三酮正丁醇溶液,然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。

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