光学成像的里程碑

光学显微成像的里程碑

翻译：罗望熙

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里程碑一：显微镜的起源

如果我们定义显微镜为一个能够让人们看到肉眼看不到的细微物体或构造的设备，那么显微镜出现在十六世纪末期。虽然水晶或者玻璃材质的棱镜型放大镜在更早以前就已经有人使用，大约到公元1000年才有人描述记录凸透镜和凹透镜的功能。而眼镜则是在大约1300年前后发明的并且马上风靡整个欧洲。

在William Borel的信件中提到，荷兰驻法兰西大使宣称荷兰眼镜制造者Hans Jansen和他的儿子Zacharias在1595年发明了第一台组合型显微镜。他们发明的显微镜是将两组棱镜组合在一个镜筒中，其放大倍率能够通过改变棱镜之间的距离来调节。但是，Jansen并没有发表任何通过他们的显微镜得出的观测结果；取而代之的，与显微镜起源相关联的两个名字是Robert Hooke 和 Antonie van Leeuwenhoek.

Hooke的著作, 1665年出版的《Micrographia》影响非常广泛，这是第一部由科学家执笔的关于显微镜的书籍。在《Micrographia》出版时，Robert Hooke (1638–1703)是伦敦皇家学会的成员，担任着伦敦皇家学会实验室的主管。在这本书的序言里，他描绘了他的精确组合的显微镜作为插图。这台显微镜装备了载物台，一个光源和三个光学棱镜。他精准的《Micrographia》在很多领域推进了科学理论的发展，对生物学和其他方面的样品进行了表征，还配上了Hooke亲自素描勾勒的精美图像。在这些画像当中有虱子，跳蚤，苍蝇的复眼，种子和植物的截面。他还观察了软木塞上的多孔结构，并把这些孔状结构命名为现在妇孺皆知的“细胞”。尽管它们其实并不是现在生物学意义上所说的细胞，但是现在细胞的称呼却来自Hooke。

这本书有着巨大的影响力并且第一次论证了显微镜可以用于科学研究。Van Leeuwenhoek (1632–1723)是一个之前没有受过科学训练的荷兰布料商人，但是他对使用放大镜来观看布料中的细小纤维丝非常着迷。他学会了打磨棱镜的方法并进一步发展了这门工艺。Van Leeuwenhoek制作了超过500个简单的显微镜，每一个都包含有一个单独的小凸透镜，这些小透镜能分辨小到一微米的细节。他在解剖支撑样品方面特别熟练，尽管他的显微镜用起来很费劲，但是他却成为了第一个细致描述精子细胞和水滴中细菌和原生动物的人。

从1673年起，他用写信的方式与皇家学会交流了他的观测结果。最终他细致认真的观察得到了认可，他本人也在1680年被选为皇家学会的成员。

多棱镜组合的引入会带来球面化和色差的问题。Van Leeuwenhoek的简单设备其实比Hooke 等人的更适用于组合显微镜的。很多显微镜学家继续使用单棱镜显微镜，直到十九世纪早期消色差棱镜的广泛使用才有所改变。

里程碑二：染色和荧光染料

Robert Hooke也许是第一个描述染色物体光学显微结构的人，他观察的是染色的羊毛和头发。尽管其他人随后报导了染色液的使用，任何被观察到的差分染色都被认为是偶然的。Hartig 和 osborne独立观察了植物细胞内含物，被记录为显微学领域染色的发现者。然而他们都没有在这项技术的发展方面做出什么重要贡献。Hartig甚至偶然在1854年的文章中提到了使用一种从雌性介壳虫中提取的染料——洋红。

Joseph von Gerlach在1858年在用洋红溶液做实验的时候，把一部分脑组织留在洋红的稀溶液中过夜。发现第二天观察时能够比较容易地区分出细胞核区的小颗粒和细胞质以及细胞间质，他推断之前使用的染色溶液浓度太高，并且意识到这种染料会被细胞内特定物质吸收并且不易洗掉。而Von Gerlach也因认识到染色的重要性并详细描述了他的染色方法而得到学界认可。在18世纪晚期和19世纪早期人们发现了很多细胞学现象，合成了一些新的染料并发展了一些新的染色方法。Camillo Golgi于1873年首先将银用于细胞学染色，并因Santiago Ramón y Cajal详尽的神经解剖学观测中使用后而闻名。

碱性和酸性染料的概念在组织学上是截然不同的，这一点对于苏木素和曙红染色的发展非常重要(Paul Mayer, 1896)，之后这两者成为了关键的诊断染色试剂。一种酸性染料（曙红）和一种碱性染料（亚甲基蓝）也构成了Giemsa染色方法的基石(Gustav Giemsa,1904),这种染色方法在诊断疟疾和其他寄生虫的时候至今仍在使用。Robert Feulgen在1924年的发现表明染色体材质能被基于DNA的酸水解化学反应染色，这成为了细胞化学的基石。

Graham等人报道了过氧化物酶的细胞化学染色，随后又在1970年Sternberger等人将其发展到与免疫组织化学相近。在此染色通过改变不同细胞结构的光吸收属性提供了一定的区分度，而荧光则能在经过特定的设备后提供更高的对比度。尽管在荧光刚发现时，这样的设备显然不存在。关于荧光的早期描述可以上溯到16世纪，Nicolás Monardes报道从Lignum nephriticum 提取的木材具有荧光属性（Athanasius Kircher也在将近一个世纪后也得到了相似的观察结果）。John Herschel在1845年对于奎宁硫酸盐的荧光属性进行的描述被认为是现代荧光观察的里程碑。在George Stokes1852年出版的100页专论中阐述了到了这种荧光是什么，并收集了大量的荧光物质素材，其中包括奎宁硫酸乃至波尔图酒。虽然David Brewster在1838年首先使用“内部散射”来描述荧光现象，但却是Stokes创造的“荧光”这一名词来描述光激发导致的光发射。随着合成染料工业的发展，不久后Adolf von Bayer在1871年人工合成了第一个荧光染料。Paul Ehrlich在1882年使用荧光素来确定房水的分泌通道——这标志着荧光染料第一次在动物生理学领域使用。在1914年，在第一台荧光显微镜发明不久之后，Stanislav von Provazek在微观层面使用荧光染料增强细胞和组织的自荧光——这标志着荧光染料第一次在细胞生物学中的使用。

里程碑三成像的极限

如果没有光学显微镜，我们对于“小生物学”的认识将大幅度削减。观察细胞迁移的能力，确定细胞器在细胞中的数目和分布，预言假定蛋白之间的相互作用（根据近似推算）推动了现代生物学的研究。然而，这些观测有一个由光本身属性决定的物理学极限，这个极限限制了我们在细胞世界中的视野。在光学显微镜中，当光通过小孔会发生衍射，从而影响空间分辨率，空间分辨率就是我们能清楚区分两个物体的最小距离。当这个小孔是一个棱镜时，光通过一个照亮的圆形小孔形成的衍射图会是一个“艾利圆盘”,这是George Airy在1835年描述的。之后，Emile Verdet注意到了定量衍射极限的数学基础，Ernst Abbe在他1873年划时代的文章里完整描述并公式化了这一过程。Abbe指出，使用一台常规显微镜所能达到的分辨两个点的最小距离不会小于成像所用光线波长的一半。尽管没有数学等式在文章中出现，Abbe提出这一点并在后续文章中认为分辨率被衍射所限制，并用介质折射率和锥形聚焦的角度修正了半波长。根据结论性的等式，可以通过提高使用短波长的的光来提高空间分辨率（例如紫外光）。但是在生物样品中，这是不受欢迎的，因为紫外光更可能对样品造成损伤并且增加了在组织中的光散射。相反的，长波长的光通过损失对点的区分能力却提高了对组织的穿透能力。 Abbe关于成像和透镜象差的数学基础为与Carl Zeiss和Otto Schott合作正确设计显微棱镜提供了帮助。Abbe定量的眼光大大提高了显微镜光学器件的质量，对数据采集做出了巨大贡献并改善了显微镜使用者的用户体验。

当然，Abbe，Zeiss和Schott在棱镜设计上的成功也给最后很成功的显微镜制造厂商 Carl Zeiss带来了极大的影响。在这些物质遗产之外，另一个永久的遗产就是Abbe的工作在很长一段时间内成为成像领域的物理学边界。实际上， Abbe的研究对这一领域的影响是如此之大，以至于很少有人去尝试突破衍射极限，尽管对于提高分辨率的需求在增长，尽管有必要提高细胞内结构的可观测性。相反，其他技术发展了并提供了这些信息，例如在发展电子显微镜时用电子来取代光子。直到最近才有更多的科学家来重新审视Abbe的极限并通过多种不同的新策略成功的提高了光学显微镜的分辨率。(见里程碑21).

里程碑四荧光显微镜

由Ernst Abbe 关于短波长带来高分辨率的发现带来的灵感， August Kohler于1904年在德国Jena的Zeiss光学作坊组装了第一台紫外（UV）显微镜。用于UV照明的设备来自镉弧光灯并允许物体在两倍于可见光显微镜分辨率的状态下光学还原。Kohler也意识到有的物体在紫外光照明下发射出更高波长的光， 1911年物理学家oskar Heimstadt使用这种观察方式为基础成功制作了第一台荧光显微镜。

Heimstadt意识到有两个主要的挑战：一个是怎样聚焦足够的紫外光到样品上来让样品发光，另一个则是怎样在无噪音条件下去捕获那些发射出来的荧光。为了解决前一个问题，他使用Hans Moritz Lehmann制作的小玻璃管来去除从弧光灯获取的可见光只留下紫外光，为了解决后者，他采用了暗场照明来保证没有激发光进入物镜以获取高对比度的荧光信号。虽然Heimstadt成功的对细菌进行了成像，但是他并不相信荧光显微镜能有一个持久的影响。他在文章中用这样的话来做结论：“荧光显微镜能否在某种程度上能拓宽显微镜成像领域，只有未来才能知道。”

事实上，依靠成像样品的自发荧光，对照明途径的需求以及使用暗场电容器限制了显微镜的初期应用。这两个障碍都在接下来的二十年中被克服，澳大利亚学者 Haitinger 与其他科学家一起发展了运用外源荧光化合物标记样品的第二代荧光技术。 Haitinger 也创造了“fluorochrome”这个词汇。荧光染料对于荧光显微镜在活组织观测上的应用是很有必要的。这就带来了入射光（宽场落射式）荧光显微镜的发展。在这里，光源和作为观测物的样品位于同一侧，激发和发射光都透过观测物。这种配置能够让更多有效样品被激发并实现不透明样品成像。宽场落射式荧光显微镜的原型是1929年由德国药理学家Philipp Ellinger和解剖学家August Hirt设计的。当时被称为“活体显微镜”的结构中，激发光在正确波长到达物镜前要通过一系列滤镜并引发被观察组织发射荧光。一个黄色的阻挡滤光片位于物镜和目镜之间来阻止大量的反射激发光，以防止其干扰观察。Ellinger和 Hirt用荧光染料荧光素和锥黄素对啮齿动物的肝组织和肾组织进行成像。

另一个巨大的进步差不多40年后才到来，伴随着双色分光器或者双色镜的发明。不再是像传统滤镜一样吸收特定波长的光，双色滤镜反射一个窄带的波长，其它所有波长则能透过去。让样品用精确的波长来照明并保证没有激发光进入物镜。

荷兰科学家Johan Sebastiaan Ploem在1967年描述了用双色滤镜垂直入射照明的方法。与入射的激发光成固定的45度角，滤镜能反射95%的短波长激发光，但是透射长波长的光。反射的激发光束进入物镜，也相当于一个聚光器来保证样品的激发。波长较长的荧光发射出来被物镜收集，返回通过双色滤镜和一个阻挡滤镜再进入目镜。双色滤镜将宽场落射式荧光显微镜从一个专业人士才能使用的工具转变为现代生物学领域普遍使用的不可或缺的设备。

里程碑5 发现相差

在1930年，物理学家Frits Zernike的实验室获得了一个巨大的凹光栅，用于研究衍射光栅的光学原理。由于其尺寸太大，Zernike不得不在它表面以外6米处放一个小望远镜来观看光

栅制造的光模式。和平常一样，他得到了一个条纹图案信号图，看到一个直射光通常的光谱线和由于光栅不完整导致的左右两侧衍射光形成大的虚假弱线。但是，当Zernike把他的望远镜聚焦到光栅本身上时，惊奇的事情发生了——条纹图案消失了。这一事件发生的原因确定之后改变了显微镜学家们看细胞的方式,也让Zernik获得了1953年的诺贝尔物理学奖。通过一系列的实验，Zernike认识到衍射光实际上是处于不同位相的。当望远镜聚焦到光栅，通过干涉得到的图像呈现的图像之所以看不见是因为人眼无法像区分振幅或者亮度那样区分位相。但是Zernike认为位相也包含了物体的信息，并意识到这需要一个足够的分度曲面来利用位相信息。

Zernike于是回想起Lord Rayleigh在1900年的工作，他描述了一种用非常稀的氢氟酸在玻璃上浅蚀刻的工艺。用类似的方法，Zernike制造了“相位带”，直射光入射一个玻璃表面上的薄蚀刻层时，衍射光会通过玻璃。结果让直射光的方向偏移了90度，使它比标准相干光的背景要更暗一些。Zernike在他的望远镜上增加一个相位带后，光栅上的色条信号图又出现了。Zernike马上意识到将他的发现有着应用到全世界显微镜上的潜力。在细胞中找到的透明的物体过去被比喻为光栅,通过在显微镜的焦平面放置相位带，类似于他在望远镜上所作的，Zernike能看到其它的透明物质而不需要染色。Zernike在1935年发表描述了他的方法，他把这种方法叫“相位对比”。在他的发现后不久，Zernike激动的在最初对其潜力没有什么热情的显微镜制造商Carl Zeiss那里实证了这种方法。此后又大概过了十年，其他公司才开始制造能够实现相位对比功能的显微镜。今天大部分高端显微镜都有这种功能，让研究者能够在不使用特别染料或染色的情况下实时观测到细胞内的结构。

里程碑6 眼见为实：亚细胞结构活起来了

荧光显微镜技术的发展让活细胞成像成为现代细胞生物学家的常规手段。但是，要观察到细胞内的结构直到二十世纪50年代还不那么容易。尽管细胞和亚细胞结构成像早在十九世纪中期就实现了，但是图像源自固定的材料。因此，细胞内是否存在三维大分子结构成为辩论的源头。

细胞内存在细胞器的革命性观点是在二十世纪四五十年代通过对有丝分裂纺锤体成像后得出的。在那之前，大分子自组装成纤维的过程被认为是固定染色过程中导致的蛋白聚集使得出现了一个纤维状纺锤体的假象。纤维化组装过程的第一个证据是W.J. Schmidt在1937年对发育中的海胆卵活细胞成像时观察到纺锤体，并在1939年用偏振显微镜重新诠释了这一过程。这个设备利用透明材料的光学各项异性得到样品内部结构的细节信息，而这些信息在当时是无法通过其他任何光学显微镜得到的。Schmidt报道了纺锤体有着正双射折-一种光学各项异性的测量-被认为是一种由排成一行的蛋白单元导致的结构。但是，虽然足球型的纺锤体在Schmidt的图片中可以看到，但是他的显微镜并没能提供足够的分辨率来看清不连续的纤维。

最后的实物演示来证明在没处理的活细胞中纺锤体纤维存在是由Shinya Inoue在十多年以后的事了。Inoué通过战后投降的日本建立了他第一台偏振纤维镜并成功的重复了Schmidt 的观察结果。随后他在美国新泽西州的普林斯顿大学建立了一台改进的偏振显微镜能够对弱的双折射结构进行成像。在1953年，带来了海产环节动物Chaetopterus pergamentaceous 卵母细胞和Lilium longiflorum花粉母细胞分裂中期和末期纺锤体结构文章的发表。文章中他写道：“随着新设备带来的分辨率和敏感度的增加，使得我能够观察到活细胞中纺锤体的细节结构并且跟踪其在分裂过程中的变化。”进一步的观察让Inoué推测微管运动产生染色体运动的动力，推论出活精子细胞DNA和染色质折叠方式。Schmidt和Inoué的发现首先证明了细胞内结构的复杂性并展示了用活细胞成像来了解复杂生物学过程的巨大潜力。偏振显微镜无疑提供了荧光显微镜无法提供的在免标记方面的优势，因此一种非侵入式的成像方式投

入使用。例如，用来监视已受精的卵母细胞的发育能力。另外，在1995年“pol-scope”的发展克服了之前显微镜在偏振对比依赖于样品取向方面的限制。

里程碑7 荧光抗体处方

在1961年的一次研讨会上，Albert Coons 谦恭地提到：“荧光抗体的时代”到来了。在Coons 和他的研究伙伴们首先发表描述荧光抗体的使用将近70年后，免疫荧光染色成为了细胞生物学家的常用手段。

让抗体可视化的想法构思来自于对在Aschoff节结中用于表征风湿热的的A组溶血性链球菌成像。开始时，Coons和他的伙伴们重复了John Marrack的工作，成功地把四偶氮联苯胺修饰到抗体上得到有颜色的抗体，并且不干扰它的抗原结合属性。然而在稀溶液中，这些有色抗体发光太弱以至于无法检测。换成一种叫蒽异硫氰酸酯的荧光化合物时，他们得到了能够黏附到细菌上的明亮的荧光抗体。这意味着这种修饰没有影响到抗体的结合能力。但是，当他在组织结构中去测试其荧光时，他们发现蒽的荧光波长与人体或老鼠组织自发荧光的波长相近。Coons和他的合作者转而研究荧光素这种著名的荧光染料。最开始的时候需要合成一种能够与蛋白结合的荧光素，异氰酸荧光素。在与哈佛大学的同事合作的过程中，Coons获得了这种物质的一种天然制备方法并将其用于标记一种肺炎球菌菌株3血清抗体。这种标记是通过在PH= 9.0的碳酸钠盐溶液中混合血清抗体和溶解在二恶烷（C4H8O2）中的异氰酸荧光素实现的，这一实验流程直到今天也没有什么变化。

结合异氰酸荧光素后抗体依然是特异性针对肺炎球菌菌株3血清的，肺炎球菌菌株2血清在与之孵育的时候没有被染上荧光。为了测试荧光抗体是否能够检测到组织中的细菌，他们取出了感染肺炎球菌菌株3的老鼠的器官并用荧光抗体染色。当Coons和他的伙伴能看到明亮的荧光充斥了那些被感染的动物器官，而没有出现在未感染的区域时，这表明免疫荧光的时代到来了。后续又有很多改进，这些改进主要在这一领域所倚重的棱镜、显微镜和相机方面，另外也有通过引入不同的荧光染料来改进。分辨率从组织层面提高到了细胞层面，这些技术现在甚至用于更小的细胞中的亚细胞结构定位。这种方法从最开始描述到现在，七十年过去了，但是基本的思路依然没有改变。

里程碑8 干涉对照

在20世纪50年代，差分干涉对比（DIC）系统作为一种和可以与相差技术二选一的方法被设计出来（见里程碑5）。在DIC系统中，偏振光被分离成两束光，这两束光通过样品时走着由于光学密度不同导致的稍有不同的路径。当两束光合束时，他们的干涉呈现出由不同厚度或者不同折射率材质区域之间形成的界面，从而得到三维图像效果。DIC能够对没有染色的样品，活细胞，活生物体以及厚样品的“光学截面”成高分辨率的图像。另一个优势在于DIC 图像中没有相差显微镜中呈现的假“光晕”。在Smith于1955年发明的第一套DIC系统中，一个Wollaston 棱镜作为分束器被放在物镜焦平面附近，这个位置通常很难找准。法国物理学家Georges Nomarski阐述了DIC的理论基础，改进了Wollaston棱镜使之能够在位于远离焦平面的位置作用，这一做法使得这个系统能够投入实际应用。这一设计被商业化显微镜制造商Carl Zeiss发展，Allen, David and Nomarski在1969年阐述了它的理论和潜在应用。

DIC的全部潜力是在录像相机走上历史舞台后才被认识的。1981年，两篇文章证明了改变相机的增益和抵消能够增加图像的分辨率和对比度。

当然，录像相机也让研究者能够实时记录事件发生。Allen 和 Travis 举例证明了这一技术对海洋原生动物Allogromia进行微管动力学运动观测的可能性。Inoué通过录像增强展示了对偏振光和DIC生动的改进。录像增强的DIC（VE-DIC）被随后用于无数的细胞内高分辨率动力学行为研究当中。例如，这一技术被用于发现直径50-100纳米沿着神经元轴突中的微管快

速穿膜的囊泡，并在随后通过体内体外实验表明是微管分子马达拉动着这个囊泡状货物。

里程碑9 只见树木，不见森林

在20世纪60年代，研究者为了克服宽场落射式荧光显微镜衰弱的功能而努力奋斗。捷克斯洛伐克和美国对于处理掉这些不需要的信号都有了一些进展，结果就是共聚焦显微镜的降临。传统显微镜能够得到的分辨率会被离焦的信息削弱。共聚焦显微镜通过限定照明的范围和并让到达物镜的光和焦平面在一个单点上从而避免了这一问题。通过光栅扫描样品中感兴趣的区域并重建，可以移动样品，也可以移动激光或者小孔盘。在排除离焦光的影响后，图像的对比度增加了，更出色的细节也能显现出来。共聚焦显微镜的专利权首先是1961年在哈佛大学工作的Marvin Minsky获得的——此人关于人工智能方面的先驱性工作更加闻名。不久以后，捷克斯洛伐克，布拉格查尔斯大学的Mojmir Petran开始与耶鲁大学的David Egger和Robert Galambos合作。回国后，Petran继续搭建超小针孔扫描显微镜；之后他在1967年回到耶鲁大学，并和Egger报道了用反射光得到的脑部和活动中心细胞的未染色图像。1981年，Colin Sheppard 和 Tony Wilson 从理论上讨论分析了普通显微镜和Petran的共聚焦显微镜，并预言了一个怎样结合“通过对普通显微镜进行简单改造来实现共聚焦显微镜的分辨率和辨别深度改进”的理论。一些后续研究对共聚焦的设计做出了重要调整——激光的使用。这能够兼容更快的扫描速度和更高的分辨率。当然，最重要的是，提供了获得荧光图像所需要的照明。1987年发表的两篇文章使用到这种设备成为共聚焦显微镜在细胞生物学领域的第一次重要应用。第一项研究，英国剑桥大学医学研究委员会实验室工作的John White, William Bradshaw Amos 和Michael Fordham用他们的激光扫描共聚焦显微镜来对比不同细胞和组织的图像。从浆细胞内的网状组织到蠕虫胚胎中的有丝分裂纺锤体，对比宽场落射式显微镜和共聚焦显微镜所成的像。第二项研究来自Gerrit van Meer和他的合作者，他们工作于德国海德堡的欧洲分子生物学实验室-Kai Simon的实验室。他们使用的是

Wijnaendts-van Resandt等人研发的激光扫描共聚焦显微镜，配合荧光神经酰胺标记来追踪表皮细胞中新合成的鞘脂。通过这一例子，共聚焦显微镜在分析亚细胞过程方面的优势清楚显现出来。通过展示厚组织样品的清晰图像，共聚焦显微镜消除了组织切片的必要性，让组织能够在更加接近生理条件的环境下成像。随着绿色荧光蛋白的发现（见里程碑 18），共聚焦显微镜引领着活体成像的新纪元。

里程碑10 荧光相关光谱和荧光漂白后恢复：照亮细胞过程

直到20世纪60年代末，荧光成像还只是例行公事的使用在一些实验中。但是在1972年，Webb 实验室提出了荧光显微镜的新颖用法：测量反应动力学。联合使用溴化乙锭和DNA的自发荧光，在紫外光照射时发射出黄色光。通过测量结合在DNA上的溴化乙锭荧光的波动，Magde 等人计算了复合物形成和解离平衡的热动力学参数，通过精确的数学公式解释它们的互相依赖。从1972年到现在，这一被称为荧光相关光谱（FCS）的技术被应用来测量化学和生物学反应、解离和流动的动力学参数。解离和流动的速率是通过检测荧光分子进出聚焦的激光束的随机移动来测量的。现在检测技术改进了，让单个分子动力学定量成为可能 (Rigler and Widengren,1990)。FCS的广泛使用最初是广泛的标度测量需求和专门的设备强制带来的，但是现在主要是作为共聚焦显微镜的一个模块投入使用。

在开始使用FCS的二十五年后，荧光交叉相关光谱（FCCS）的发展让分子间作用力的测量成为可能。 1997年，Schwille等人用两个离散的荧光染料来标记寡核苷酸——红色和绿色——并测量了红绿复合体形成的动力学来推测平均的退火时间。自此以后这一技术被使用来测量蛋白-蛋白相互作用，包括动力学共定位，追踪和caspase（天冬氨酸特异性蛋白酶）介导的分裂。FCS能被用于测量膜蛋白的扩散，另外一种叫荧光漂白后恢复（FRAP）的技术则能

让研究者在微米尺度上阐明细胞膜内和膜间蛋白的运动。1974年，Bahr和他的合作者把标记异硫氰酸荧光素（FITC）的红细胞膜光漂白了一半，发现膜蛋白并不会从未漂白的区域移动到漂白的区域。FRAP的宽容性和它的广泛有效应用使得在两年后，Axelrod等人就测量了细胞内膜运输过程。

检查漂白样品的荧光恢复曲线让作者推断出恢复过程是由随后的扩散来完成？还是从细胞内间隔流动过来？或者是两者都存在。精确的迁移速率公式的发展也让不同样品中扩散和流动的对照成为可能。今天，FRAP被广泛用于研究细胞内不同区域中和区域间的运输以及定量活体中膜蛋白的结合和解离。

1976年，Koppel等人作了一个FCS和FRAP的逐项对比，发现这两个系统有着各自的优势和劣势。FCS能够提供单分子的信息，但是导致的样品光漂白限制了观测时间和实验视野而且实验设备对震动非常敏感。而与FCS不同的是，FRAP能够检测细胞膜中静止的元素并能用于跨越大量细胞，但是需求的光漂白步骤将对样品造成不可逆的损伤。虽然如此，这些补充性技术的发展和改进引导着荧光显微镜进入新纪元，支持着荧光染料的更多应用。

里程碑11 到FRET出场了

Forster共振能量转移或者叫荧光共振能量转移（FRET）背后的理论是由Theodor Forster 首先在20世纪40年代正式提出来的。他揭示了当受体供体足够接近时，电子激发能量能从供体荧光染料传递到一个受体发色团的过程，其传递效率与两者距离的六次方成反比。这个相对简单的等式对生物学尤其是显微镜产生了举足轻重的影响。

Forster的设想由Lubert Stryer和 Richard Haugland于1967年实验证实了，他们证明能量共振转移现象能作为测量两个发色基团距离的“光谱级标尺”。这些发现为使用FRET来观察体外提纯蛋白的构想动力学铺平了道路。

但是Forster的理论也带来了另一个应用：使用荧光显微镜对活细胞中蛋白分布和相互作用制作高分辨率地图。Fernandez和Berlin在1976年首先提出用FRET来检测细胞表面受体复合物的动力学分布的概念。这是这一领域跨出坚实的进步，因为它推进了比标准荧光标记空间分辨率高很多的确定受体分布的方法。然而，作者的工作并没有实现，Fernandez和Berlin 并没有给出任何显微镜图像。

FRET是为细胞内蛋白-蛋白相互作用的成像量身定做的，因为要想看到FRET信号，两个发色基团需要非常靠近。第一篇证实这一应用的文章是在20世纪90年代中期发表的，在荧光显微镜技术提高了，共聚焦荧光显微镜投入使用之后。1993年，Brian Bacskai，Roger Tsien 和他们的合作伙伴使用FRET和共聚焦荧光显微镜来追踪接触反应和调节cAMP依赖的蛋白激酶的亚基和自由的cAMP的命运，用Serotonin刺激海产蜗牛的感觉神经元后的反应。Thomas Jovin的小组不久后跟上了使用FRET显微技术的先驱，提高了FRET的敏感性和精确度用来定量测量细胞中的蛋白相互作用。1995年，Jovin和他的同伴们引入了供体漂白和荧光寿命成像显微镜（FLIM），他们用来研究在单个细胞上表皮生长因子受体的寡聚化过程。他们在1996年引入受体漂白，他们用来跟踪亚细胞定位和细胞中霍乱毒素的寡聚化状态。

在这些地标性的发展滞后，FRET作为一个显微技术，在挑战生物问题上应用的重要性被证实出来，例如脂筏的存在。

大量不同的基于FRET的生物传感器现在可以用于检测小分子和细胞中酶活性。技术还在继续发展，随着新的供体-受体对的拓展，新方法被引入，仪器也在提高。

里程碑12 钙离子，聚光灯下的信使

“没有什么比强调细胞内游离的钙离子作为第二信使在细胞内的重要性需要更长的时间”，读钱永健1980年的文章，首次报道细胞内使用的钙离子荧光染料的定向合成。

实际上，在钙离子的研究方面可以上溯到十九世纪，指出其重要性。首先出现的测量细胞内钙离子浓度的可靠方法是在20世纪60年代，但是直到20世纪80年代新的钙离子测量技术的迅速传播开拓了活细胞中钙离子浓度复合动力学时空分析的方法。

在他原创性的论文中，钱永健介绍了一种来自选择性钙离子螯合剂乙二醇四乙酸（EGTA）的新一代荧光聚羧酸染料。且不论他们破天荒的潜力，BAPTA原型和它衍生出来的Quin2有着相对有限的应用，只因为它们吸收光谱的限制，低选择性和低的荧光强度。但是，现在所用到的所有的聚羧酸染料都是源自这个最原始的设计。其可塑性使得原始报道后短短几年就有很多改进型的染料合成出来。

在1985年，钱永健和他的同伴们介绍了六个新的指示剂，其中Fura-2和Indo-1最为成功。与Quin2相比，这些新的染料表现出更强的荧光，在结合钙离子后有着更明显的光谱变化，与钙离子结合能力更弱，对其他离子选择性更强。不久之后，Fura-2标记的单个平滑肌细胞高分辨数字成像让钱永健，Fredric Fay和他们的合作者能够实现空前的细胞内钙离子浓度梯度的时空测量，揭示着细胞质，细胞核和这些收缩细胞的肌浆网中存在不同的钙离子浓度调节。聚羧酸钙离子指示剂的发展临界是乙酰甲氧基酯的合成，它是膜相容的，能够无干扰地通过，并能在酯基水解后有效地捕捉收缩细胞中的染料（钱永健，1981）。Fura-2染料家族的一个不足之处在于它们需要在紫外波长下激发，这限制了它的潜在应用。1989年，钱永健和他的同事进一步发展了可见光波段的指示剂Rhod-2，Fluo-2和Fluo-3。这几个都是迄今广泛使用的非比例钙离子指示剂，也部分得益于它们能够大体上满足包括神经细胞在内的多种细胞系的需要。

除了他们在这一系列更改教条的发现中扮演的至关重要角色，合成钙离子指示剂也让其他科技得到发展，例如高速相机和自动滤光轮，它们的使用伴随着荧光寿命成像和多光子显微镜让成像科技得到了更深层次的延伸扩展。今天，荧光钙离子染料依然是荧光成像结合电生理分析的核心。

里程碑13 全内反射荧光显微镜：在细胞的边缘成像

如果你想看到在生物表面或者细胞表面发生了什么，去除所观察层面之内所有物质带来的背景干扰是至关重要的。其实这就很接近全内反射荧光显微镜的应用。基于在19世纪末期全内反射激发时检测到散射光子的研究，Daniel Axelrod 建立了一台激光束成角度射入载玻片的显微镜，而样品放在载玻片的另一侧。入射角大于临界角，因此激光束完全反射回载玻片。同时，激光束的一小部分被称为隐失波成功穿透样品几百纳米并且将标记了发色团的生物介质激发出荧光来。

隐失波只能穿透样品200纳米，并且其强度是随深度指数衰减的，因此产生超强的Z轴敏感度。限制照明样品表面上很薄的部分，用玻璃载玻片消除来自样品更深层面的背景荧光并通过让发色团进出照明层面限制发色团光漂白从而延长成像时间，Axelrod证明了这一技术对玻璃片支撑的细胞焦面成像的潜力。

20世纪90年代中期，Yanagida和他的研究伙伴们用TIRF提供的薄照明层得出了合乎逻辑的结果，并实现了水溶液中发生的生物过程的单个分子实时检测。1995年，他们报道了单个分子马达分子导致的单个ATP翻转过程。这一设置比共聚焦显微镜早了好几年，而且退一万步说，它也更便宜更简单，因为在普通的倒置显微镜上就可以安装。

在2000年的时候，Almers和他的研究伙伴们使用了高Z轴分辨率的TIRF来对突触小泡的内化过程成像，观察到囊泡接近质膜并释放其内含物的过程。

同年，Axelrod和他的研究伙伴们近似成像了后高尔基载体和质膜的融合过程。这些研究研究基本都是物镜型TIRF的早期应用，通过使用高数值孔径的物镜，进一步简化了装置和样品处理。列数在细胞膜上发生的重要事件，包括胞吞，胞吐，受体激活和离子运输，掌握一

种能够读取这一层面的技术已经为这些TIRF现在能够完成的任务打好了基础。

里程碑14 让模糊的图像变得清晰

细胞内的分子分布和结构都是以他们的功能为中心的。通过实现细胞内部的高分辨率三维成像，显微学上的去卷积运算应用为我们对细胞生物学的理解做出了不可磨灭的贡献。

在20世纪80年代，很多细胞分子特异性的荧光染料走入大家视野，但是要在厚的样品中看到它们的分布并不容易。研究者希望从“光学部位”——穿透厚样品获取的连续焦平面图像进行三维重构。但是破译任何一个焦平面获取的信息都很难，相邻焦平面带来的焦外荧光很复杂。在1983年，Agard和Sedat引入了去卷积——一种消除离焦荧光或者说将其恢复到原始状态的方法，引起了细胞生物学家的注意。去卷积算法用到显微镜的光学属性知识来模拟成像中被扭曲的物体而显现出自然的图像。

在多次迭代计算中，物体的估量被代入等式同时计算结果和自然图像的对照的被用于提高估量的近似性。用这种方法，Agard和Sedat获得了第一张荧光标记的果蝇唾液腺细胞核中染色质结构和组织的高分辨率图像。

去卷积运算无处不在，但是，另一个重要的进展是在1989年Fay和他的同伴们在检测平滑肌细胞中力量来源的分子基础时完成的。

基本的去卷积运算能放大图像中的噪音，这对缩小真实物体可能的估量范围带来困难。为了解决这个问题，作者引入了物体估量的限制：有的估量会被抹去，如果物体不是“规则”（或者说平滑）的或者这部分的荧光比零还小，这在物理上是不可能的。得到的高分辨图像让定量分析平滑肌细胞中的α-肌动蛋白分布成为可能。

最初，去卷积仅限于那些拥有大型运算工具的研究者来进行这些精密计算。然而，随着个人电脑逐渐强大，细胞生物学家迅速意识到去卷积的优势，尤其是长时间的活细胞成像，在这方面减少光强度很重要，使得共聚焦显微技术（见里程碑9）受限。去卷积对细胞大分子和器官可视化的贡献居然，因此成为现在我们对很多细胞过程的理解的中心。

里程碑15 两个光子才能跳探戈

一个显微镜学家的梦想是能够看到发生在组织细胞深处的现象而又让活样品受到的光损伤最小。这个目标的实现受到焦外闪光的限制，使得传统落射式显微镜获得的图像变得模糊。在共聚焦激光扫描显微镜（见里程碑9）体系，离焦的背景被小孔消除，但是大的激发体积意味着散射光限制了背景干扰被消除的程度。在双光子显微镜中，激发集中在焦点体积，所以荧光检测对于组织光散射不那么敏感。双光子吸收是一个量子光学中的老概念，最开始是Maria Goppert Mayer1931年在她的博士论文中描述的。三十年后，Kaiser和Garrett在晶体中观察到了这一现象。双光子激发是由一个分子几乎同时吸收的两个光子引发的。激发光的波长需要是单光子激发时波长的两倍，因为光子能量与波长成反比。在双光子显微镜中，激光束被聚焦到样品上，提高染料被激发的概率，同时激光焦点在视野中扫描实现成像。这在1990年才从理论走到现实，直到锁定模式激光出现。它能够比普通激光器传输高一百万倍的光子密度并能实现飞秒量级典型间隔的超短脉冲。

Denk，Strickler和Webb是第一批使用这一方法来对活细胞染色体成像的。但是Denk等人不久后就将其适用于原位神经元成像，Svoboda等人在1997年用其测量完整老鼠大脑中锥形神经元受感官刺激导致的树枝状钙离子动力学，使得这一技术的全部潜力变得非常显然。

通过限制激发到焦点体积，双光子激光扫描荧光显微镜使得在空间上正确的安置光子成为可能。长激发波长的使用并减少散射光敏感度以及限制激发可以在比普通共聚焦显微镜深十倍的位置得到清晰的图像。而且，双光子激发极大减少了光漂白和光损伤，是一种对深埋在完整胚胎或者器官内的活细胞的理想成像方式。

里程碑16 垂直地看着光

尽管光学显微镜在大步向前，对很大的生物结构进行三维成像依然是疑难重重。组织学切片的图像不能传达足够的空间信息，而且切片不能适用于活样品。后来，非破坏性的光学截面（例如通过共聚焦显微镜）为大型样品提供有限的成像深度，而且Z轴分辨率自然远远低于水平分辨率。一个简单的方法也许能克服这些这些麻烦：用一个光的薄层垂直照射样品。用光薄层从侧面照亮样品的思路早在1903年就有人描述了，但是直到1993年才由Voie等人将同样的原理来发展正交平面荧光光学截面法（ORFOS）。在这个方法中，样品被由柱状宏观棱镜产生的薄层激光进行光学截面。光薄层被投影到一个透明的荧光标记的样品平面，垂直于检测轴。因为只有样品的一个平面被照亮，没有光能从焦平面外的区域发出来，因此图像中没有离焦成分。通过旋转他们的大鼠耳蜗样品，Voie等人收集了一系列不同角度的图片并重构了耳蜗的三维图像，非常细致地展现了其完好的内部结构。

虽然这一方法为针对大样品的细致观察提供了巨大的潜力，它还没有商业化发展，只是在少数几个研究组中使用，最显著的是，Fuch等人2002年发展了一个光薄片系统使用一个显微镜棱镜来观察处在自然状态下的水生细菌。在2004年，Stelzer和他的同伴们发展了一个应用更为广泛的光薄片显微镜，它能同时用于观察固定或者活的胚胎。学术上被称为选择平面照明显微镜（SPIM），这一技术能够延伸到活胚胎的内部提供高分辨率的三维图像。更进一步，单位时间的光毒性被减少了，因为薄片光只会照亮胚胎的一个截面。这对克服一个重要挑战有所帮助：长时间观察胚胎发育过程。事实上，在2008年，Stelzer和他的合作者报道了一种升级版的SPIM，能够对斑马鱼胚胎进行24小时观察，并追踪了每一个细胞核，进而获得了细胞分裂和细胞迁移形成的全部图像。Stelzer小组现在和显微镜制造商Carl Zeiss合作提高这一技术并使之成为商业化产品，光薄片显微镜无疑将加深我们对三维尺度上生理过程的进一步理解。

里程碑17 黑暗中的单分子

在黑暗背景上使用荧光显微镜观察明亮的荧光分子的潜力点亮了这一领域，提供了其他染料无法比肩的分子特异性和图像对比度。理论表明这些特性让单分子检测成像成为可能。这些特性的首次使用是在1976年，Tomas Hirshfeld使用荧光显微镜来检测单分子，限制多个荧光染料通过一个照亮的小薄层。但是技术上的限制阻碍了这一过程。虽然接下来的二十年实现了低温下或者途经一个高聚焦激光束(见里程碑10)的单个荧光染料分子的检测，这些方法不适合在周围环境中对已鉴定的分子反复成像。在1993年，这一情况发生了显著的改变，Eric Betzig和Robert Chichester首先报道了室温下单个荧光染料反复成像的新技术：近场扫描光学显微镜（NSOM）。NOSM能反复扫描样品上一个非常小的光学染料。这提供了分子尺度的空间分辨率和分子旋转的信息。单分子图像潜在的生物学应用吸引了显微镜学家和生物学家的想象力，因为它的侵入性和复杂性使得NSoM对于复杂生物样品的成像是不太适合的。

虽然很多人继续尝试改进NSoM，包括其在FRET中的使用。在1995年，Toshio Yanagida和他的同伴们通过最优化执行全内反射荧光显微镜（TIRF）来对单个标记有单个荧光染料的myosin分子成像，用另一个染料标记来检测ATP的翻转。与之前使用的静态分子不同，这一工作表明TIRF能够在漂白前对溶液中的大量分子进行数秒的成像，并证明了这一方法适合于生物学上的应用。

虽然TIRF对于大部分单分子成像应用有着优势，这并非第一个观察到单个染料分子运动的方法。这最开始是通过高敏感性的CCD显微镜由传统落射式荧光显微镜实现的（见里程碑4）。Hansgorg Schindle和他的合作者吸收了Jeff Gelles等人基于高斯峰拟合判断染料标记的膜上脂球位置的单粒子追踪的方法来追踪其随时间变换的位置移动，这一追踪的精度达到了

15纳米。到此打止，对他们而言单分子荧光显微镜应用有着一个近乎无法突破的瓶颈，而大然而在1998年，谢晓亮和他的同伴使用在胆固醇氧化酶活化位点的黄素腺嘌呤二核苷酸本身有的荧光明暗切换揭示了酶活性受到保存在蛋白质构象形式的分子记忆影响。这一行为是宏观实验未曾预期到的，这无疑表明单分子显微镜能够对目前看来表征得很清楚的体系开辟新的支流。其他课题组后来发展的类似酶翻转的化验引发了单个DNA分子的测序技术。方法在不断发展改进，例如很多关于核酶，分子马达和单个活细胞中的基因表达突破性的研究，因而科学家在推动着技术和想象的限制。

里程碑18 GFP：绿色革命

在1994年，Chalfie等人在《science》上发表了一篇报导，从Aequorea victoria 水母上提取的绿色荧光蛋白能够作为标记物来应用到蛋白质定位和活细菌以及蠕虫中的表达上，这一表达过程不需要任何来自于A. Victoria的辅助因子。这证明GFP作为一个研究活体蛋白的工具根本上改变了自然界和细胞生物学家的知识范围。GFP最初是Shimomura和他的同伴们1962年在纯化A.victoria水母的生物发光蛋白过程中偶然发现的，之后的净化，结晶和补充体外从发光蛋白到GFP的能量转移过程是由Morise和他的同伴们在1974年完成的，Morise洞察到了GFP的内在荧光属性，能够在接受来自aequorin的能量后发出绿色的光芒。在其他体系中，GFP是否需要aequorin或者其他可能的来自水母的因子来发出荧光，很多年来都是一个公开的疑问。在1992年，GFP发现的三十年后，Prasher等人克隆了GFP的基因，为其作为一个蛋白标签来进行实验铺平了道路。两年后，Chalfie等人展示了GFP在细菌和蠕虫细胞中表达后能够发出荧光。在蠕虫中，GFP是通过编码β-tubulin的基因作为前体表达的。它在蠕虫的特定神经元特定时间，位置和内源的β-tubulin基因表达一模一样，这证明了GFP能作为一个可信的标记物来监视基因表达类型。在那之后不久，钱永健的实验室将原来的GFP改造得更加明亮，光稳定性更强，能够使用与传统显微镜滤镜波长设置相匹配的光激发，使其实际使用更加方便（在1998年的review中有总结）。

GFP技术接下来的另一个突破是GFP能够变化为产生蓝色，青色和黄色荧光蛋白（也在钱永健的综述中有所描述），这使得成像实验能够实现多种蛋白同时标记在同一细胞或者细胞器中，在GFP发现后的将近半个世纪里，2008年诺贝尔化学奖颁发给了Osamu Shimomura，Martin Chalfie和钱永健，以答谢他们在“绿色荧光蛋白的发现和拓展”这一发现过程中的根源作用。

里程碑19：第二信使的检测

绿色荧光蛋白作为染料来实现蛋白可视化这一发现为更久经世故的显微镜技术提供了基础。GFP的变种改变了激发或者发射波长，发射出蓝色，青色，绿色和黄色的光，可以作为FRET 的供体和受体—能量在两个染料之间传递，传递的能量与它们的接近程度以及取向相关，使得受体染料能发出更长波长的荧光。在1997年，两个小组使用FRET来做生物传感器工程来测量活细胞中钙离子浓度的变化。钙离子结合钙调蛋白（CaM），改变其构象并使之结合到目标蛋白。Miyawaki等人构建了带蓝色GFP的CaM，肌球蛋白短链激酶（M13）的CaM结合肽和GFP。结合钙离子后，CaM缠绕着M13，减少了GFP蛋白之间的距离，使得FRET发生。在细菌中，Ca离子的存在使得紫色发射光从445nm改变到510nm。这一生物传感器能鉴定出从10-7到10-4M的钙离子浓度。Romoser等人也同时独立连接了蓝色和绿色发射的荧光蛋白通过M13来检测钙离子浓度。在没有钙离子的时候，激发的蓝色荧光蛋白由于FRET效应导致绿色受体发出505nm的绿色荧光。结合钙离子和CaM到M13增加了染料之间的距离，消除了FRET作用，使得供体发射448nm的荧光。细胞中的钙离子的荧光响应被共表达的CaM生物传感器增强了。这两个钙离子生物传感器是最初的遗传编码分子传感器。在2001年，Nakai

等人发展了使用一个GFP蛋白的高信噪比钙离子生物传感器。他们在M13和CaM之间放置不同的GFP，当钙离子和CaM结合时导致GFP发生构象变化，增加其荧光强度。从这一高亲和力的钙离子染料中释放出来的荧光会在管道钙离子浓度升高时增强。另一项改进是在2000年完成的，使用一个针对cAMP的生物传感器，Zaccolo等人指出FRET能够测量蛋白-蛋白相互作用。作者连接绿色荧光蛋白和蓝色荧光蛋白来催化和调节蛋白激酶A的亚基，分别在细胞中共表达这些结构。在380nm激发时产生了FRET现象，这表明这些亚基在活体中存在相互作用。cAMP的生理刺激导致FRET现象减少，这和cAMP对PKA亚基的解离作用相吻合。因此，这一生物传感器检测生理学的cAMP水平改变并且确认了FRET适合作为一个研究蛋白-蛋白相互作用的工具。今天，荧光生物传感器使得蛋白活性，蛋白相互作用和小分子信号能够被检测和进行瞬时的高分辨率空间定量。

里程碑20 不止是GFP：Ds Red和Pa-GFP

1962年，GFP从发光水母Aequorea victoria中分离出来，它1994年首次作为荧光染料应用（见里程碑18）之后，接下来的竞赛就是拓展其荧光颜色来获得新的适合研究动态细胞内过程的染料。蓝色，青色和黄色荧光蛋白很快就通过修饰GFP得到了，但是更多不同的能够在橙色和红色谱线发光的（由于其更长的激发波长能使多色成像实验比其他颜色光毒害更少）却难以获取。在1999年，终于取得了突破，Matz等人提议GFP类型蛋白的荧光属性也许不一定与生物发光关联，并在非生物发光的珊瑚-展现出明亮荧光的reef coral里面寻找。这导致了第一个红色荧光蛋白（被称为DsRed ，Discosoma sp. Red）的克隆，注射编码了DsRed或者绿色变体的mRNA到Xenopus laevis胚胎分裂球显示出被标记的区域，它会以一种依赖于微管的方式在溶酶体之间移动。去年之后,Ando等人克隆了一种来自Trachyphylla geoffroy珊瑚的明亮绿色荧光蛋白的基因并偶然留下了一部分的表达了的蛋白在实验台上：第二天这个样品就变红了。这一被称为Kaede（日本语，意思是枫叶）的荧光蛋白受到350-400nm的紫外光照射时会变成红色。通过使用聚焦的紫外光脉冲，作者在多个表达绿色Kaede的神经元中得到变成红色的单神经元，这表明了这一蛋白作为光学标记物的潜力。

且不论这些进展，多种发射波长在橙色到红色区域的荧光蛋白应用于多颜色活体成像时并不理想（例如亮度和光稳定性的问题）。然而，Shaner等人通过直接蛋白进化得到了属性更好的红色，橙色和黄色荧光蛋白。这些因颜色相近而以水果命名的蛋白（例如m草莓，m樱桃和m香蕉）都是单体，对氨基末端融合没有要求，有着更快的成熟速度并且比之前得到的红移的单节显性的荧光蛋白更亮。荧光蛋白在颜色上的多样性，光激活（PA-GFP）或者光转化（Kaede）给活细胞成像带来了革命性的变化。

里程碑21 点亮显微镜的极限

对20世纪的绝大部分时间来说，远场照明显微镜不能分辨两个相隔150-200纳米以下的物体（见里程碑3）。这是因为光通过不同介质时发生衍射，因此从单个点发出的光被检测时会表现出更大的体积。光照型显微镜因此存在衍射极限。但是很多细胞内过程发生在衍射极限之内，在10到100nm的尺度。为了能够看到这些过程因此，需要提高足够的分辨率。打破衍射的屏障很有必要。

在早期工作中达到最大理论分辨率之后，包括Fred Lanni 和Jans Taylor的驻波照明以及Stefan Hell 和Ernst Stelzer的双光子4π显微镜，Hell首先从理论和实验上阐述了受激耗尽显微镜（STED）能够打破衍射屏障。为了实现这一过程，激发焦点使用圆环状红移激光通过受激激发的方式耗尽染料的周围激发而被缩小到很小的尺寸。这个细小的焦点扫描样品来获得一个低衍射的图像。在最初STED的实验执行过程中，包括活酵母和细菌的成像，轴向和横向分辨率都达到了大约100nm。此后分辨率得到了更进一步的提升，使得这一技术能够展

现出突触小泡相关蛋白synaptotagmin在胞吐后团聚在神经元质膜上。当STED显微镜被证实后，Mats Gustafsson发展了一种相近的方法叫做结构化照明显微镜（SIM）。在SIM中，激发光被构筑在一个控制好的图案上，在图像处理后补偿了正常情况下不可获取的信息的获取途径。虽然还存在着衍射极限，SIM通过叠图提高了横向分辨率从而得到更加清晰的生物结构图像。这一技术通过使用三维机构的光源被延伸拓展到三维尺度；此外，它使得通过非线性处理打破了衍射屏障。

最后，通过开拓已知的能力来定位单分子到纳米精度，很多亚衍射极限分辨率的单个分子被发展起来。这些方法的先行者包括Eric Betzig和Harald Hess的光激发定位显微镜（PALM），庄小威的随机光学重建显微镜（STORM）以及Samuel Hess的荧光光激发定位显微镜（FPALM）—结合使用光激发和光控开关的荧光染料。这些方法有着高精确性的单分子定位来打破衍射屏障。虽然细节不尽相同，这三种方法都是基于一个原则：荧光染料的稀疏子集能够在某一时间发生改变，每个分子位于高精确度的位置上。这些荧光染料的光转换过程不断重复其他子集知道获得足够信息来获得一个亚衍射图像。

超分辨显微镜的愿望是能够在空前的尺度上观察细胞从而得到空前的视野。虽然这些方法应用到生物问题上才刚刚开始，完全认识到它们的潜力还有很多路要走。它们拓展到三维活细胞成像的能力在飞速发展，这将是这一过程至关重要的部分。

决胜预测题中考物理 专题03 光学之平面镜成像特点的应用含解析

专题03 光学之平面镜成像特点的应用 光现象中平面镜成像，在中考中多以选择题、填空题、实验题、作图题为主，是中考的重点。但作为压轴题就很少见。 1.平面镜中的“花”的大小取决于 A．花本身的大小 B．平面镜的大小 C．花到平面镜的距离 D．平面镜放置的高低 【答案】A 考点：平面镜成像的特点 abc是两支完全相同的和为玻璃板，2.下图是探究平面镜成像特点的实验装置，蜡烛。下列说法错误的 是 A.为了保证实验效果应选择较薄的玻璃板 B.实验时玻璃板a应与水平桌面垂直放置 C.沿水平桌面移动前蜡烛c应先点燃 D.该实验最好在较暗的环境中进行 【答案】C 【解析】 试题分析：A、因为厚玻璃板的两个面都可以当作反射面，会出现两个像，影响到实验效果，所以应选用薄玻璃板，故本选项正确，但不符合题意．B、实验时玻璃板如果不竖直，不论怎样移动后面的蜡烛都不 可能与前面蜡烛的像完全重合，就无法验证像的位置和大小，所以玻璃板a应与水平桌面垂直

放置．故本选项正确，但不符合题意．C、因为玻璃板是透明的，两面都能发生反射现象形成像，如果移动蜡烛c前先将其点燃，在玻璃板两面都会形成蜡烛的像，实验很难进行．故本选项错误，符合题意．D、因蜡烛是 1 故但不符合题意．点燃的，所以适合在较黑暗的环境下才可看清蜡烛的像，能保证实验效果．故本选项正确，选C．考点：平面镜成像的特点和原因 3.下列现象中，由于光的反射形成的是 ．豹子在水中D．BA．铅笔在水面处．人在阳光下C水中的筷子的倒影“折断”向上翘形成影子 D 【答案】【解析】是试题分析：A和C都是由于光的折射形成的；B是由于光的直线传播形成的；的，D是由于光的反射形成 平面镜成像。当物体射到平面镜上的光，经平面镜反射后的反射光线是发散的，这些光线的反向延长线相D 交而成的点，就是我们看到的像。故选考点：光现象） 4.下面方框中的四个福娃图像中，有一幅是福娃在竖直放置的平面镜中的像，它应当是 （ A 【答案】【解析】福娃在竖直放置的平面镜中的像，平面镜成的是正立等大的虚像，像和物关于镜面对称。所以，试题分析：A A。故选它应当是考点：平面镜成像的速度远离平面镜身高1.6m的人，站在平面镜前s1m处，则人在镜中的像高2m／ m，若此人以5.）“不变”、“变小”、。，镜中的像的大小后，像与平面镜的距离为运动1s m （选填“变大”【答案】1.6 3 不变 2

第三节 平面镜成像

分层训练·提能力 1.(2017·襄阳中考)关于平面镜成像,下列说法中错误的是(C) A.像与物总是大小相等 B.像与物到平面镜的距离相等 C.物体在镜中成的是实像 D.物体远离平面镜时,像的大小不变 【解析】由平面镜成像的特点可知像与物总是大小相等,故A选项说法正确;由平面镜成像的特点可知像与物到平面镜的距离相等,故B选项说法正确;由平面镜成像的特点可知物体在镜中成的是虚像,故C选项说法错误;由平面镜成像的特点可知,像与物体的大小相同,所以当物离平面镜的距离变小时,像的大小不变,故D选项说法正确。 2.如图所示是生活中常见的几面镜子,具有扩大视野功能的是 (C) 【解析】穿衣玻璃镜和古代梳妆铜镜都是平面镜,没有扩大视野的功能,故A和D 错误;圣火点燃装置是利用了凹面镜,它能够把太阳光线会聚在一点上,来提高它的温度,达到点燃圣火的目的,故B错误;拐弯处的反射镜是利用了凸面镜对光线起发散作用制成的,因此它能够起到扩大视野的作用,故C正确。 3.(2018·钦州期末)如图所示,进入人眼的光线是由(C)

A.人眼发出的 B.平面镜发出的 C.平面镜反射的 D.像S′发出的 【解析】图中表示的是蜡烛在平面镜中成像的原因,进入人眼的光线是由平面镜反射而来的,故选C。 4.(2018·济南质检)在“探究平面镜成像特点”的实验中,下列说法正确的是 (B) A.为了便于观察现象,该实验最好在较明亮的环境中进行 B.点燃蜡烛A,将光屏放到像的位置不能呈现出蜡烛的像 C.将完全相同的点燃的蜡烛B放到玻璃板后寻找像的位置 D.如果将蜡烛A向玻璃板靠近,像也向玻璃板靠近且变大 【解析】探究平面镜成像实验时,烛焰是成像物体,在明亮的环境中,烛焰和明亮环境的对比度降低,成像不太清晰。故应选择较暗的环境。故A错误。平面镜成虚像,把光屏放在玻璃板后像所在的位置,像不会成在光屏上。故B正确。将完全相同的点燃的蜡烛B放到玻璃板后不便于寻找像的位置。故C错误。根据平面镜成像特点可知,如果将蜡烛A向玻璃板靠近,像也向玻璃板靠近,但像的大小不变。故D错误。 5.(2017·潍坊中考)海若面向穿衣镜,站在镜前60 cm处,镜中的像与她相距

20-21年八年级物理上册同步课堂试题：4.2 平面镜成像(沪科版)[含答案]

精品资源教育学院 2021年同步课堂帮帮帮 姓名： 学号： 班级：学号：

第四章 多彩的光第二节 平面镜成像 目标梳理 学习目标 重点难点 1. 在实验探究中掌握平面镜成像的特点。 2. 掌握平面镜成像的应用。 3. 会用平面镜成像原理解释镜面反射及生活相关现象。 4. 理解等效替代法的含义。 1．重点：平面镜成像实验及其应用。2．难点：平面镜成像实验。 知识梳理 一、探究平面镜成像的特点 1．提出问题 平面镜成像时，像与物有何异同？平面镜成像的特点是什么？2．猜想与假设 （1）像与物大小相同，像与物到平面镜的距离相等，像和物关于平面镜对称。

（2）像比物大，像与物到平面镜的距离不相等。 3．设计实验与制订计划 （1）实验器材：两支相同的蜡烛、一块玻璃板、玻璃板支架、一张纸、一个光屏、一把刻度尺、量角器及火柴。 （2）实验装置： 4．进行实验与收集证据 （1）将纸平铺在水平面上，玻璃板垂直架在纸上，在玻璃板的一侧立一支点燃的蜡烛，透过玻璃板观察其另一侧蜡烛的像。 （2）将光屏放到像的位置，不透过玻璃板，直接观察光屏上有无像。 （3）将另一支完全相同的，但未点燃的蜡烛放到玻璃板后像的位置，与像重合。比较像与蜡烛的大小、正倒等关系。 （4）在玻璃板下所铺的白纸上描绘出蜡烛、玻璃板和蜡烛像的位置，画出连接蜡烛和像的直线，量出直线与玻璃板的夹角，用刻度尺量出蜡烛和像到玻璃板的距离，并记录。 （5）多次改变蜡烛的位置，重复步骤（4）。 像到玻璃板的距离 实验次数蜡烛到玻璃板的距离/cm 像与物的大小关系像与物的正倒关系 /cm 11010等大正立 21515等大正立 32020等大正立 5．分析与论证 分析和观察实验现象和数据可知： （1）物体通过平面镜所成的像是①。 （2）像与物体的大小②。 （3）像到平面镜的距离与物体到平面镜的距离③。 （4）像与物体关于平面镜④。

初二物理第三节平面镜成像练习题

第三节 平面镜成像（1） 、填空题： 1、 物体在平面镜中成的像是 ____________ 像，像和物的大小 _________________ ,它们的连线 跟镜面 ________________ ，它们到镜面的距离 ____________________________ 。 2、 水池中水深3m ，池旁有一高8m 的树，池旁的人看到树在池水中的像，则像长 为 ____________________ m ,如果月球到地球的距离为 380000km ，则月亮在水池中的像到水 面的距离是 ______________________ m 。 3、 用笔尖接触平面镜，笔尖的像距笔尖约 5mm ，镜子的厚度约为 ____________ mm 。 4、 影子和平面镜成像不同的，影子是光的 ______________________ 形成的，平面镜成像是由光 的 ______________________________ 形成的。 5、 一束平行光射到某镜面后，如果反射光仍是平行的，则该镜子是 _________________ ，如果反 射光变为发散光束，则该镜子是 ___________________ ，如果反射光变为会聚光束，则该镜子 6、在距离竖直放的平面镜前 1.5m 有一个1.65m 的人，这时像和人的之间距离是 _____________________________________________________________________________________ m ， 如果把镜子移到原来的位置时，那么镜子中的像与镜面之间的距离是 ___________ m ，像长 是 _________________ m.。 7、 汽车的头灯中用 __________________ 镜做反射面，灯丝应放在 ___________________ 上。 8、 汽车的观后镜是 __________________ 镜，太阳灶是 ____________________ 镜，太阳灶烧水 时，水壶应放在 ___________________________ 上。 9、 利用平面镜不但可以成像，还可以改变 ___________ ，在潜水艇里的 ____________ 镜就是利 用这一原理。 二、选择题： 10、你在竖直的平面镜前向平面镜走走时，则你的像（ ） A 、变大，像与你的距离变小 C 、不变，像与你的距离变大 12、对于口径相同的平面镜和凸镜来说， 当人离镜同样远时则下列说法正确的是（ A 、 从平面镜观察到范围要比凸镜范围大 B 、 从平面镜观察到范围要比凸镜范围小 C 、 观察到范围相同 D 、 无法判断观察到的范围大小 13?人站在平面镜前，当他向平面镜走近时，发生的现象是【 A .像变大，像到镜面的距离变小 B .像变大，像到镜面的距离变大 C .像不变，像到镜面的距离变小 D .像不变，像到镜面的距离不变 14、要使一只铅笔跟它在平面镜的像在一条直线上，这只铅笔跟平面镜的夹角应是 A 、1800 B 、600 C 、300 D 、900 三、作图题：（1）作像 （2 ）完成光路 B 、变大，像与你的距离变大 D 、不变，像与你的距离不变 ） (1) (2)宀? J

平面镜成像

平面镜成像教学目标 认知目标 1.理解平面镜成像特点 2.知道在光的反射现象中光路可逆 3.知道潜望镜、万花筒的光学原理 技能目标学会平面镜成像作图法 重点 平面镜成像特点 难点 “像”的概念，区别实像和虚像 教学过程 复习

1．光的直线传播 2．光的反射现象及反射定律 3．光路可逆 导入 学生观察课本P54照片 设问湖中的倒影是怎样产生的？为什么与湖面上的景物对称？ 展示表面平的镜子、玻璃板、表面抛光的金属板、平静的水面、大理石及透明塑料片等都能产生与物体对称的影子。 这类反射面是平面的镜子称为平面镜。 新课 一、平面镜所成的像有什么特点？ 实验1 内容活动卡P35实验1 记录将蜡烛和蜡烛的像的位置用刻度尺连起来， 量出蜡烛到镜面的距离和蜡烛的像到镜面的距离。 结论平面镜所成的像是虚像；像和物体到平面镜的距离相等；像和物体的大小相等；像和物体对镜面来说是对称的。

实验2 内容活动卡P35实验2 观察比较描画与原画的大小、左右和朝向关系 结论虚像、对称、大小相等 练习课本P56思考与练习1.2.5. 二、平面镜中的像是如何产生的？ 阅读课本P54-P55 发光点S发出的光束经平面镜反射，进入人眼。所有反射光线的反向延长线都交于镜面后的S’。因为光的直线传播，人眼感到反射光线是从镜面后的S’发出的，好像S’在发光，S’实际没有光线射出，它是发光点S在平面镜中所成的虚像。物体上的每一点都会在平面镜中形成一个相应的`虚像点，在平面镜中就形成了物体的像。像的大小与平面镜的大小无关。 演示平面镜成像作图法 利用物像对称性先决定像点位置，任取两根发散光线并画出反射光线。（用虚线表示反射光线的反向延长线） 提问如果入射光线沿着反射光线的方向射入，情况会怎样？ 练习活动卡P36思考和讨论1.2.

光学成像原理

光学成像原理 光学成像原理简介 一个成像系统主要包含以下几个要素： ·视场：能够在显示器上看到的物体上的部分 ·分辨率：能够最小分辨的物体上两点间的距离 ·景深：成像系统能够保持聚焦清晰的最近和最远的距离之差 ·工作距离：观察物体时，镜头最后一面透镜顶点到被观察物体的距离 ·畸变：由镜头所引起的光学误差，使得像面上各点的放大倍数不同，导致变形 ·视差：是由传统镜头引起的，在最佳聚焦点外物体上各点的变化，远心镜头可以解决此难题。 ·图像传感器尺寸：图像传感器（一般是CCD 或CMOS ）有效的工作区域，一般指的是水平尺寸。对所希望的视场来说，这个参数对决定预先放大倍数（PMAG ）是很重要的。多数图像传感器的长度与宽度之比是4:3 ，如下图所示。

·预放大倍数：是指视场与图像传感器尺寸的比值，这个过程是由镜头来完成的 ·系统放大倍数：是指显示器上的图像与实际物体大小的比值，也就是整个系统的放大倍数。它也可以写成预放大倍数与电子放大倍数的乘积，而电子放大倍数则是显示器尺寸与图像传感器尺寸的比值。 ·分辨率：分辨率的大小表征了对物体上细节的辨别能力，下图简单的说明了物体上的两个方块区域成像到CMOS/CCD相机上。可以看出，因为图像传感器上像素间的距离已经确定，如果想要区分物体上很近的两点，它们之间必须隔开一定的距离。 与分辨率相关的术语有以下几个： ·每毫米对线（lp/mm）：如上图所示，一对线是指一个红色的区域和一个空白的区 域。分辨率就是用每毫米上对线的数量来表示，因此分辨率常常被看作是空间频率。 这个频率的倒数是指最小可分辨的物体上两点间的距离，用毫米来表示。这个参数可 以用来表征镜头或者相机的分辨率。 ·像素数：数码相机的分辨率也可以用图像传感器的像素数来表示。如图所示，一对线 与两个像素相对应，换句话说，如果要使两个红色区域分开，就必须一个像素贡献于 红色区域，一个像素贡献于红色区域间的空白。

八年级物理全册第四章第2节《平面镜成像》同步练习(新版)沪科版及答案

《平面镜成像》同步练习 班级：姓名：考号： 一．选择题（共12小题，满分60分，每小题5分） 1．（5分）《荷塘月色》是朱自清先生名作，荷塘中月球的像到水面的距离与月球到水面距离相比（） A．相等 B．较小 C．较大D．无法比较 2．（5分）你在竖直的平面镜前，向平面镜走去时（） A．镜中像的位置是不变的 B．镜中像是越来越大的 C．镜中像是大小不变的虚像 D．镜中像与人是等大正立的实像 3．（5分）视力检测时要求被测的人与视力表的距离为5m．如图所示，视力表与平面镜的距离是3m．为满足测量要求，人与平面镜的距离应为（） A．1m B．1.5m C．2m D．2.5m 4．（5分）“猴子捞月”的寓言故事中，猴子看见月亮在井中（如图所示），就要去捞，结果什么也没捞到，关于水中月亮离水面的远近，以下说法中正确的是（） A．月亮就在水的表面上 B．井有多深月亮就有多深 C．和天上月亮到水面的距离相等 D．和猴子的眼睛到水面的距离相等 5．（5分）如图中能正确表示小丑在平面镜中成像的是（）

A． B． C． D． 6．（5分）如图所示，关于“探究平面镜成像特点”的实验，下列说法中正确的是（） A．实验用茶色玻璃板的目的是为了在玻璃板后成实像 B．选择大小相等的蜡烛A、B是为了比较像与物大小关系 C．将蜡烛A远离玻璃板，像会变小 D．把光屏放在玻璃板后像所在位置，像会成在光屏上 7．（5分）如图所示，平面镜竖直放置在水平面上，一支直立的铅笔从平面镜前40cm处，以5cm/s的水平速度垂直向平面镜匀速靠近，下列说法正确的是（） A．铅笔在平面镜中所成的像逐渐变大 B．经过2s，铅笔与它的像之间的距离变为20cm C．铅笔的像相对于平面镜的速度为10cm/s D．若平面镜顺时针转至图中虚线位置，铅笔的像将与铅笔垂直 8．（5分）如图所示为“探究平面镜成像特点”的实验装置图，下列有关该实验的说法，正确的是（）

寒假专题——光学平面镜成像作图辅导总结

【本讲教育信息】 一. 教学内容： 寒假专题——光学平面镜成像作图辅导总结 二. 考点点拨： 考点1：平面镜作图题解题指导 考点2：时钟问题 三. 跨越障碍： 考点1、平面镜成像作图 （一）作图依据的原理 1. 光的反射定律： （1）反射光线与入射光线、法线在同一平面上； （2）反射光线和入射光线分居在法线的两侧； （3）反射角等于入射角。 2. 平面镜成像的特点： （1）平面镜所成的像和物体到镜面的距离相等； （2）像与物体的大小相等； （3）像与物体的连线与镜面垂直。 实际中总概况的话就是平面镜所成的像和物关于平面镜对称 （二）作图的规范化要求 1. 平面镜的反射面和非反射面不能混淆，平面镜的非反射面要画上短斜线。 2. 实际光线（入射光线和反射光线）要画成实线，并用箭头表示光行进的方向，实物用实线表示。 3. 虚像、法线和光的反向延长线要用虚线表示。 4. 为了表示实物和虚像的对称点，实物和虚像都要标上箭头或字母。 （三）平面镜作图题的类型和解法 1. 确定平面镜的位置 （1）根据入射光线和反射光线位置确定平面镜的位置，解这类题的一般程序： ①找到入射光线和反射光线及其交点． ②此时的入射光线和折射光线之间的夹角为两倍的入射角或者两倍的反射角大小 根据光的反射定律知，反射角等于入射角，所以反射光线与入射光线的角平分线即为法线． ③画平面镜．平面镜与法线垂直． 例1.在图1中根据入射光线AO和反射光线OB，画出法线和平面镜。

图1 点拨：此时AO，OB分别为入射光线和反射光线，此时两线之间的夹角为2倍的入射角大小，所以过入射点O作角AOB的平分线即为法线，注意法线要用虚线表示，根据法线和平面镜垂直即可作出平面镜。 例2.在图2中，S'为发光点S在平面镜中的像点，在图中画出平面镜的位置． 点拨：根据平面镜成像规律中“像和物的连线跟镜面垂直，它们到镜面的距离相等”这一特点，S'和S的连线的垂直平分线即为平面镜镜面位置（物和像关于平面镜对称）。 例3.小明用平面镜将一束太阳光反射到竖井中，如图3所示。请在图上作出平面镜的位置，并标出镜面与水平面夹角的度数。 图3 点拨：根据光的反射定律中反射角等于入射角可知，反射光线和入射光线的夹角是120°，则反射角和入射角分别是60°，由此可确定出法线，再作出法线的垂线，即平面镜。具体作法如下图。 2. 确定物的位置 例4. 某发光点S发出的两条光线经平面镜反射后分别沿O1A和O2B方向射出，根据平面镜成像规律，在图4中画出发光点S的位置。写出具体步骤：

八年级物理全册 4.2平面镜成像教案 (新版)沪科版

第二节平面镜成像

学点1 探究平面镜成像的特点 阅读教材P58～P59，完成下列问题。 问题1：(1)__表面平整光滑的镜面__叫做平面镜。 (2)平面镜成像的原理：__光的反射__。 问题2：探究平面镜成像的特点 (1)器材：__玻璃板、支架、两支相同的蜡烛、光屏、火柴、方格纸、刻度尺等__。 (2)猜想与假设：利用桌面上的平面镜，观察镜中蜡烛的像，改变蜡烛与平面镜的距离，你认为像的大小和位置怎样变化？说出你的观点：__像的大小不变，位置发生变化(其他合理答案均可)__。 (3)制订计划与设计实验 思考讨论：①把蜡烛放在平面镜前，观察镜中的像，你能比较像和物的大小吗？__不能__。 ②再借助一支相同的蜡烛，能把它放在镜后和像比较大小吗？__不能__。 ③换用玻璃板，你能比较像和物的大小吗？像和物到镜面的距离如何测量？__能比较像和物的大小。记下像和物的位置，用刻度尺测量出像和物到镜面的距离，进行比较__。 ④将一张白纸放在像的位置上，在纸上能呈现出像吗？__不能__。 (4)进行实验与收集证据 (5)分析与论证 ①比较第2、3列数据，可得到的结论是__像和物到镜面的距离相等__； ②比较第2、4列数据，可得到的结论是__像和物的大小相等，且与物距无关__。 ③用一张白纸能承接到玻璃板所成的像吗？____不能__。 (6)实验结论：平面镜所成的像是__虚__像，像与物的大小__相同__，像与物到平面镜的距离__相等__，像与物对于平面镜是对称的。 学点2 平面镜成像特点的应用 阅读教材P59～P60，回答下列问题。 问题1：平面镜的应用：__成像__、__改变光路__。 问题2：使用平面镜的危害：__城市里许多大楼采用玻璃幕墙进行室外装潢，这样会造成一定程度的“光污染”__。 感谢您的支持，我们会努力把内容做得更好！

初二物理第三节平面镜成像练习题

第三节平面镜成像（1） 一、填空题： 1、物体在平面镜中成的像是像，像和物的大小，它们的连线跟镜面，它们到镜面的距离。 2、水池中水深3m，池旁有一高8m的树，池旁的人看到树在池水中的像，则像长 为m，如果月球到地球的距离为380000km，则月亮在水池中的像到水 面的距离是m。 3、用笔尖接触平面镜，笔尖的像距笔尖约5mm，镜子的厚度约为mm。 4、影子和平面镜成像不同的，影子是光的形成的，平面镜成像是由光 的形成的。 5、一束平行光射到某镜面后，如果反射光仍是平行的，则该镜子是，如果反射光变为发散光束，则该镜子是，如果反射光变为会聚光束，则该镜子 是。 6、在距离竖直放的平面镜前 1.5m有一个 1.65m的人，这时像和人的之间距离是m，如果把镜子移到原来的位置时，那么镜子中的像与镜面之间的距离是m，像长是m.。 7、汽车的头灯中用镜做反射面，灯丝应放在上。 8、汽车的观后镜是镜，太阳灶是镜，太阳灶烧水时，水壶应放在上。 9、利用平面镜不但可以成像，还可以改变，在潜水艇里的镜就是利用这一原理。 二、选择题： 10、你在竖直的平面镜前向平面镜走走时，则你的像（） A、变大，像与你的距离变小 B、变大，像与你的距离变大 C、不变，像与你的距离变大 D、不变，像与你的距离不变 12、对于口径相同的平面镜和凸镜来说， 当人离镜同样远时则下列说法正确的是（） A、从平面镜观察到范围要比凸镜范围大 B、从平面镜观察到范围要比凸镜范围小 C、观察到范围相同 D、无法判断观察到的范围大小 13.人站在平面镜前，当他向平面镜走近时，发生的现象是【】 A．像变大，像到镜面的距离变小 B．像变大，像到镜面的距离变大 C．像不变，像到镜面的距离变小 D．像不变，像到镜面的距离不变 14、要使一只铅笔跟它在平面镜的像在一条直线上，这只铅笔跟平面镜的夹角应是（） A、1800 B、600 C、300 D、900 三、作图题：（1）作像（2）完成光路 （1）（2）

浙教版科学七年级下第二章光学之平面镜易错题整理(包含答案)

七下易错题整理：光的反射平面镜练习（含答案） 一、选择题 1．雨后晴朗的夜晚，为了不踩到地上的积水，下面的判断正确的是（） A．迎着月光走时地上发亮处是水，背着月光走时地上暗处是水 B．迎着月光走时地上暗处是水，背着月光走时地上发亮处是水 C．迎着月光走或背着月光走时，都应是地上发亮处是水 D．迎着月光走或背着月光走时，都应是地上暗处是水 2．如图是利用透明玻璃板探究平面镜成像特点的实验示意图，下列说法正确的是（） A．该实验最好在明亮的环境中进行 B．蜡烛远离玻璃板过程中，蜡烛的像始终与蜡烛 等大 C．把光屏放在玻璃板后像所在的位置，像会成在 光屏上 D．玻璃板应选择较厚且涂有水银反光面的镜子 3．某人手持边长为 6cm的正方形平面镜测量身后一棵树的高度。测量时保持镜面与地面垂直，镜子与眼睛的距离始终保持为 0.4m。在某位置时，他在镜中恰好能够看到整棵树的像；然后他向前走了 6.0m，发现用这个镜子长度的 5/6就能看到整棵树的像。这棵树的高度约为（） A． 4.0m B． 4.5m C． 5.0m D．5.5m 4．有一位同学在湖边拍了一张照片。因为湖水平静，岸上景物与湖中倒影在照片上十分相似。下列几种方法中，哪一种不能用来正确区分真实景物与它在湖中的倒影（） A．倒影比真实景物暗一些 B．倒影比真实景物的清晰度略差一些 C．倒影中人物排列左右位置与拍照时的真实位置正好相反 D．景物与倒影对称于水面 5．下列现象中由光的直线传播形成的是（） A.凿壁借光 B. 渔民叉鱼 C.水中倒影 D. 雨后彩虹6．把微小放大以利于观察，这是物理学中一种重要的方法．如右图是一种显示微小形变的装置． A为激光笔， B、 C是平面镜， P为台面，未放重物时，激光束反射在屏上的光斑为点 D，当把重物 M放在台面 P上时，台面将发生微小形变，以下说法正确的是（） A．平面镜 B上的入射角变小，光斑向 D点的左侧移动 B．平面镜 B上的入射角变小，光斑向 D点的右侧移动 C．平面镜 B上的入射角变大，光斑向 D点的左侧移动

应用光学各章知识点归纳

第一章 几何光学基本定律与成像概念 波面：某一时刻其振动位相相同的点所构成的等相位面称为波阵面，简称波面。光的传播即为光波波阵面的传播，与波面对应的法线束就是光束。 波前：某一瞬间波动所到达的位置。 光线的四个传播定律： 1）直线传播定律：在各向同性的均匀透明介质中，光沿直线传播，相关自然现象有：日月食，小孔成像等。 2）独立传播定律：从不同的光源发出的互相独立的光线以不同方向相交于空间介质中的某点时彼此不影响，各光线独立传播。 3）反射定律：入射光线、法线和反射光线在同一平面内，入射光线和反射光线在法线的两侧，反射角等于入射角。 4）折射定律：入射光线、法线和折射光线在同一平面内；入射光线和折射光线在法线的两侧，入射角和折射角正弦之比等于折射光线所在的介质与入射光线所在的介质的折射率之比，即 n n I I ' 'sin sin = 光路可逆：光沿着原来的反射（折射）光线的方向射到媒质表面，必定会逆着原来的入射方向反射（折射）出媒质的性质。 光程：光在介质中传播的几何路程S 和介质折射率n 的乘积。 各向同性介质：光学介质的光学性质不随方向而改变。 各向异性介质：单晶体（双折射现象） 马吕斯定律：光束在各向同性的均匀介质中传播时，始终保持着与波面的正交性，并且入射波面与出射波面对应点之间的光程均为定值。 费马原理：光总是沿光程为极小，极大，或常量的路径传播。 全反射临界角：1 2 arcsin n n C = 全反射条件： 1）光线从光密介质向光疏介质入射。 2）入射角大于临界角。 共轴光学系统：光学系统中各个光学元件表面曲率中心在一条直线上。 物点/像点：物/像光束的交点。 实物/实像点：实际光线的汇聚点。 虚物/虚像点：由光线延长线构成的成像点。 共轭：物经过光学系统后与像的对应关系。（A ，A ’的对称性） 完善成像：任何一个物点发出的全部光线，通过光学系统后，仍然聚交于同一点。每一个物点都对应唯一的像点。 理想成像条件：物点和像点之间所有光线为等光程。

应用光学-北京理工大学

《应用光学》 课程编号：****** 课程名称：应用光学 学分：4 学时:64 (其中实验学时：8) 先修课程：大学物理 一、目的与任务 应用光学是电子科学与技术（光电子方向）、光信息科学与技术和测控技术与仪器等专业的技术基础课。它主要是要让学生学习几何光学、典型光学仪器原理、光度学等的基础理论和方法。 本课程的主要任务是学习几何光学的基本理论及其应用，学习近轴光学、光度学、平面镜棱镜系统的理论与计算方法，学习典型光学仪器的基本原理，培养学生设计光电仪器的初步设计能力。 二、教学内容及学时分配 理论教学部分（56学时） 第一章:几何光学基本原理(4学时) 1.光波和光线 2.几何光学基本定律 3.折射率和光速 4.光路可逆和全反射 5.光学系统类别和成像的概念 6.理想像和理想光学系统 第二章:共轴球面系统的物像关系(14学时) 1.共轴球面系统中的光路计算公式 2.符号规则 3.球面近轴范围内的成像性质和近轴光路计算公式 4.近轴光学的基本公式和它的实际意义 5.共轴理想光学系统的基点——主平面和焦点 6.单个折射球面的主平面和焦点 7.共轴球面系统主平面和焦点位置的计算 8.用作图法求光学系统的理想像 9.理想光学系统的物像关系式 10.光学系统的放大率

11.物像空间不变式 12.物方焦距和像方焦距的关系 13.节平面和节点 14.无限物体理想像高的计算公式 15.理想光学系统的组合 16.理想光学系统中的光路计算公式 17.单透镜的主面和焦点位置的计算公式 第三章:眼睛的目视光学系统(7学时) 1.人眼的光学特性 2.放大镜和显微镜的工作原理 3.望远镜的工作原理 4.眼睛的缺陷和目视光学仪器的视度调节 5.空间深度感觉和双眼立体视觉 6.双眼观察仪器 第四章:平面镜棱镜系统(9学时) 1.平面镜棱镜系统在光学仪器中的应用 2.平面镜的成像性质 3.平面镜的旋转及其应用 4.棱镜和棱镜的展开 5.屋脊面和屋脊棱镜 6.平行玻璃板的成像性质和棱镜的外形尺寸计算 7.确定平面镜棱镜系统成像方向的方法 8.共轴球面系统和平面镜棱镜系统的组合 第五章:光学系统中成像光束的选择(5学时) 1.光阑及其作用 2.望远系统中成像光束的选择 3.显微镜中的光束限制和远心光路 4.场镜的特性及其应用 5.空间物体成像的清晰深度——景深 第六章:辐射度学和光度学基础(10学时) 1.立体角的意义和它在光度学中的应用

光的反射——平面镜成像(一)

二期课改教材分析（第一、二单元）之二 案例分析：我将以第一个光学的案例来结合具体分析活动卡的应用以新教材提倡的探究法的实施。 光的反射——平面镜成像（一） 教材分析： 本节是反射定律后的一个应用知识点。与学生生活息息相关，可以结合课程标准中的理念“从生活到物理，从物理走向社会”的目标达成，在课堂中有效引导学生进行物理规律的探究，并应用于生活中，把课延续到课外。 教学方法： 运用人认识自然规律事物的规律：实践→认识→再实践→再认识。整堂课使学生在教师引导下进行合作探究。 教学目标： （综述）通过团队合作探究，学到平面镜成像规律及其应用的相关知识；解决一个生活中熟视无睹的常见现象问题。体会科学家的观察、提问、实验验证的过程；感受努力后获得成功的喜悦；培养学生对科学的兴趣及好奇心；培养与他人合作的能力；通过小游戏，了解物理知识的广泛应用，培养学生多思考的好习惯。师生一起构建和谐的课堂教师充分尊重学生，从学生的需要出发，也体现了一种生命教育。 1、认知和技能领域： 知道平面镜概念； 掌握平面镜成像规律； 理解虚像概念； 知道平面镜在生活中的运用实例——潜望镜； 2、方法和过程领域： 在教师有效引导下进行合作探究； 3、情感、态度和价值观领域： 体会科学家的观察、提问、实验验证的过程； 感受努力后获得成功的喜悦；培养学生对科学的兴趣及好奇心； 培养与他人合作的能力；通过小游戏，了解物理知识的广泛应用，培养学生多思考的好习惯； 4、重点：平面镜成像规律；平面镜成像的应用。 难点：如何有效地引导合作探究；虚像的概念。 教学器材： 学生实验——两块玻璃板、刻度尺、白纸、自制木块、两支相同的蜡烛和火

《应用光学》课程导学

《应用光学》课程导学 一、课程构成及学分要求 《应用光学》课程主要由三部分构成：48（64）学时的理论教学（3或4学分）、16学时的实验教学（0.5学分）、为期二周的课程设计（2学分）。 二、学生应具备的前期基本知识 在学习本门课程之前学生应具备前期基本知识：物理光学、大学物理、高等数学、平面几何、立体几何等课程的相关知识。 三、学习方法 1．课前预习、课后复习； 2．独立认真完成课后作业； 3．课堂注意听讲，及时记录课堂笔记； 4．在教材基础上，参看多本辅助教材及习题集。 四、课程学习的主要目标 1．掌握经典的几何光学的理论内容； 2．了解部分像差理论的基本思想； 3．掌握典型的光学系统的基本原理及设计方法。 五、授课对象 课程适用于光电信息工程专业、测控技术与仪器专业、生物医学工程专业、信息对抗技术专业、探测制导与控制技术专业及其相近专业等，课程面向大学本科学生第五学期开设。 六、教学内容及组织形式 1、理论课程教学内容 《应用光学》课程理论教学内容共计48学时，其内容主要由三部分构成：几何光学、像差理论、光学系统。 （1）几何光学 应用光学既是一门理论学科又是一门应用性学科，其研究对像是光。从本质上讲光是电磁波，光的传播就是波面的传播。但仅用波面的观点来讨论光经透镜或光学系统时的传播规律和成像问题将会造成计算和处理上的很大困难。但如果把光源或物体看成是由许多点构成，并把这种点发出的光抽象成像几何线一样的光线，则只要按照光线的传播来研究点经光学系统的成像问题就会变得简单而实用。我们将这种撇开光的波动本质，仅以光的粒子性为基础来研究光的传播和成像问题的光学学科分支称为几何光学。几何光学仅仅是一种对真实情况的近似处理方法，尽管如此，按此方法所解决的有关光学系统的成像、计算、设计等方面

计算光学成像的探索者

“计算光学成像的探索者”——中关村企业借你一双慧眼 目前，上亿像素大阵列复眼成像技术的公司，全球范围内仅3家公司。而在北京中关村，就有这样一家公司叫泰邦泰平，他们被称为“计算光学成像的探索者”。这个成立于2013年的年轻企业，不仅是2016年首批中关村前沿技术企业，而且是国家高新技术企业，拥有两项世界首创技术，多项国内外发明专利技术。 科普时间到： 什么是计算成像： 传统的的光学成像的原理就是几何光学成像，核心只在镜头。比如说一个镜头，后面摆一个胶片或者一面屏幕，这样都能看到图像，拍到的是什么像，看到的就是什么像。 而计算成像中的成像首先要运用到光学的组件和技术，第二要运用图片信号处理的技术，把这两个结合到一起做成的成像技术，比如说我们现在要说的复眼成像和光圈景深联合延拓成像等，可以用计算成像做任意高分辨率的成像和光圈景深联合延拓成像。 本文重点来了！

什么是复眼成像？ 复眼成像是仿照昆虫眼睛的成像原理研发的新型成像技术，复眼成像技术相比于传统的单眼成像技术有着无法比拟的优势，比如复眼相机能够实现超高分辨率的成像，几千万到几亿甚至几十亿像素的分辨率都可以达到！其他的如超低照度，超宽视场角的性能也可以同时达到。 传统的单眼相机只能实现宽、远、清成像的三者之二，而复眼相机可以同时实现宽、远、清的成像！进一步，复眼相机具备广角和特写兼备、动态细节长时间跟拍的全新拍摄体验！

如图，通俗的说，传统技术下一个大房子经过镜头成像形成一个小房子的图片 而运用复眼技术后，可以形成更加清晰的大房子的图片 复眼技术分为两种，一是多个眼睛看同一个场景，每个眼睛的分辨率不高，看同一个场景的同时，通过计算，形成一个高分辨率的效果。二是所有的子系统都看同一个画面，形成一个高分辨率。还有一种所有的子系统都看画面的一部分，但是每一个系统的分辨率都比较高，最后的系统分辨率会非常高，就像蜻蜓的眼睛或者苍蝇的眼睛。 下图就是16个复眼监控的摄像头，通过坐标的变换、画面的拼接和融合，颜色的统一后形成一张完整的图片。

光现象第三节平面镜成像

教学设计《第二章光现象第三节平面镜成像》 开原五中 左桂华

《第二章光现象第三节平面镜成像》 开原五中左桂华 一、教材地位和作用 平面镜生活中比较常见。平面镜在本章占有十分重要的地位，它既是光的直线传播延伸，又是光的反射的铺垫。因为平面镜成像的特点正是由于光的直线传播和光的反射引起的。可以说，平面镜在光现象这一章起着承上启下的作用，甚至在整个几何光学中也有着十分重要的地位。 二、教学目标 （一）知识与技能： 1．了解平面镜成像的特点。 2．了解平面镜成虚像，了解虚像是怎样形成的。 3．理解日常生活中平面镜成像的现象。 4．初步了解凸面镜和凹面镜及其应用。 （二）过程与方法： 1．经历平面镜成像特点的探究，学习对实验过程中信息的记录。 2．观察实验现象，感知虚像的含义。 3．通过观察感知球面镜对光线的作用。 （三）情感态度与价值观： 1．在探究“平面镜成像特点”中领略物理现象的美妙与和谐，获得成功的喜悦。2．培养实事求是的科学态度。 3．通过能平面镜、球面镜的应用的了解，初步认识科学技术对人类生活的影响。 三、重点和难点 重点：探究平面镜成像的特点 难点：对虚象概念的理解；探究活动中的难点是如何确定平面镜中像的位置四、教材处理 采用“统放结合”的半开放处理思路（学生对“虚象”和“虚象的位置”的理解普遍感到困难，所以要“统”；对于平面镜成像的其他特点采取“半放”的方法；对于平面

镜成像的次要特点采取“全放”的方法） 五、设计思想 （一）通过探究，使学生经历基本的科学探究过程，学习科学探究方法，发展初步的科学探究能力，领略物理课教学的特点和魅力。 （二）课的重点是：在“探究”和“设计”的过程上,“如何探究像与物是否等大”（实验目的）→怎样比较虚像与物的大小→找一个跟物体完成相等的物体（替身物）与像比较大小→怎样才能同时观察到像与替身物→把平面镜改为白玻璃（实验基本思想方法），从而有意识、有目的、有针对性地训练和提高学生思维的灵活性和技巧性，开拓学生思路，对学生思维的灵活性、深刻性和方向性进行训练，培养其发散思维能力。 六、教学方法 （一）探究法（学生自主探究实验）；（二）引导发现法（学生实验时，教师在教室内走动，引导学生完成实验）；（三）演示法（学生完成实验后，教师在讲台上再完成一遍）；（四）实验法（学生分组实验和演示实验） 七、教学过程： （一）新课引入 提出问题：照镜子平面镜能成像平面镜成像有什么特点呢？（从生活中发现问题,激发学生的好奇心） （二）新课教学 1．提出猜想：平面镜成像有什么特点呢？（教师不做任何暗示，让学生充分想象）学生讨论、归纳可能有下列猜想：（允许有不正确猜想，这有利与学生的发散性思维） （1）成虚像；（2）像与物等大；（3）像与物到平面镜的距离相等；（4）像与物左右相反；（多媒体展示） 2．制定计划与设计实验：多媒体展示 如何来探究像与物的大小是否相等呢？给学生思考空间，学生：思考、分析、讨论、归纳 我们采用什么方法来验证像与物是否相等呢？[设疑——比较像与物的大小。[明确探究方法——找一个跟镜前物体完全相同的物体[替身物体与像比较。3．进行实验与收集证据： 同学们找桌子上的器材试试看，行不行。 学生：思考、分析、讨论、归纳 ——要同时观察到像和替身物体，必须要让物体通过镜面的反射光线和替身物射

光的反射、平面镜成像、光的折射作图专题附答案

光学作图专题 光的反射、平面镜成像、光的折射作图 1.（1）光与平面镜成30°角射在平面镜上，如图1所示，请根据光的反射定律画出它的反射光线，并标 明反射角的大小． 2.（2）画出图2物体AB在平面镜M中所成的像． 3. 4.图中S是一个点光源，S发出的哪一条入射光线经过镜面发射后通过点A，请作出这条入射光线． 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.如图所示，光线垂直射入水面，水里有个平面镜，请画出此题的光路图。 12. 13. 14. 15. 16.~

17.如图所示，由点光源S发出的一束光AB射到镜面MN上，CD是由S发出的另一束入射光的反射光，请 在图中画出点光源S的位置。 18.如图所示，平面镜前有一点光源S发出的一束光线被平面镜反射后经过A点， 请作出该光线的光路图。 19.如图所示,一束光线在空气和水两种介质的界面上 同时发生反射和折射,图中已标出反射光线,请画出 折射光线的大致方向和入射光线． 20. 21. 22. 23.如图所示，根据光的反射定律画出入射光线AO的反射光线OB，并标出反射角的度数． 24. 25.如图所示，一束激光α斜射向半圆形玻璃砖圆心O， ！ 结果在屏幕上出现两个光斑，请画出形成两个光斑的光路图。 26.（1）图1中入射光线与镜面成30度角，请你完成光路图并标出反射角． 27.（2）钱包掉到了沙发下面，没有手电筒，小明用平面镜反射灯光找到了钱包．图2中已经标出了入射 光线和反射光线的位置，请在图中画出法线与镜面． 28. 》

29.如图所示，平面镜前一个发光点S和它的两条光线，请在图中作出S在平面镜中的像， 并作出这两条光线的反射光线． 30. 31. 11.在图中作出物体AB在平面镜中所成的虚像A′B′． 12.如图所示，S是一个发光点，S′是它在平面镜中成的像，SA是S发出的 一条光线，请在图中画出平面镜的位置和SA经平面镜反射后的光线。 13. 如图所示，根据平面镜成像的特点在图中请画出缺少的平面镜． 14.物体AB放在平面镜前，请在图中画出它经平面镜所成的像。 · 15. 如图所示，一束光从空气斜射到三棱镜上，请画出三棱镜内的折射光线（大致方 向）． 16.潭清疑水浅，安全记心间，如图，A是水池底某点，请大致 作出光线AO的折射光线以及人从岸上看到A的像A′。 17.如图所示，发光点S发出一条射向水面的光线，在水面发生反射和折射，反射光线经过P点，请在图中作出入射光线、反射光线及大致方向的折射光线。

应用光学各章知识点归纳

第一章几何光学基本定律与成像概念 波面：某一时刻其振动位相相同的点所构成的等相位面称为波阵面, 为光波波阵面的传播，与波面对应的法线束就是 光束。 波前：某一瞬间波动所到达的位置。 光线的四个传播定律： 1）直线传播定律： 在各向冋性的均匀透明介质中，光沿直线传播，相关自然现象有： 日月食，小孔成像等。 2）独立传播定律： 从不同的光源发出的互相独立的光线以不同方向相交于空间介质中 的某点时彼此不影响，各光线独立传播。 3） 反射定律：入射光线、法线和反射光线在同一平面内，入射光线和反射光线在法线 的两侧，反射角等于入射角。 4） 折射定律：入射光线、法线和折射光线在同一平面内；入射光线和折射光线在法线 的两侧，入射角和折射角正弦之比等于折射光线所在的介质与入射光线所在的介质的折射率 （折射）光线的方向射到媒质表面，必定会逆着原来的入射方 向反射（折 射）出媒质的性质。 光程：光在介质中传播的几何路程 S 和介质折射率n 的乘积。 各向同性介质： 光学介质的光学性质不随方向而改变。 各向异性介质：单晶体（双折射现象） 马吕斯定律：光束在各向同性的均匀介质中传播时， 始终保持着与波面的正交性， 并且入射 波面与出射波面对应点之间的光程均为定值。 全反射临界角：C = arcsin 全反射条件： 1） 光线从光密介质向光疏介质入射。 2） 入射角大于临界角。 共轴光学系统： 光学系统中各个光学兀件表面曲率中心在一条直线上。 物点/像点：物/像光束的交点。 实物/实像点： 实际光线的汇聚点。 虚物/虚像点： 由光线延长线构成的成像点。 共轭：物经过光学系统后与像的对应关系。（ A , A'的对称性） 完善成像：任何一个物点发出的全部光线， 通过光学系统后，仍然聚交于同一点。每一个物 之比，即 sin I sin I n' n 简称波面。光的传播即 光路可逆：光沿着原来的反射 费马原理： 光总是沿光程为极小，极大，或常量的路径传播。 n 2 n i

八年级物理全册4.2平面镜成像同步测试新版沪科版

4.2平面镜成像 一、单选题 1.如图所示是某同学画出的潜望镜的示意图，使用这样的潜望镜看到的物体AB的像是（） A. 放大的倒立的实像 B. .缩小的倒立的实像 C. .等大的倒立的实像 D. 等大的倒立的虚像 2.如图4所示的是从平面镜中看到的钟面虚象，则实际时间是（） A. 9时40分 B. 2时20 分 C. 4时10 分 D. 7时50分 3.在比较狭小的房间内挂一面大镜子，会产生增大空间的感觉，这主要是利用平面镜的哪个特点 （） A. 能成虚像的特 点

B. 物像距离总是物镜距离2倍的特点 C. 改变光线传播方向的特 点 D. 能成正立像的特点 4.如图所示是在镜中看到的钟面指针位置，则实际时刻是（） A. 9：30 B. 2： 30 C. 6： 15 D. 12：15 5.小猫在平静的池塘边欣赏自己在水中的像，图中正确的是（） A. B. C. D. 6.一个人走近挂在墙上的平面镜时（） A. 人在平面镜中所成的像大小不变 B. 人在平面镜中所成的像变大 C. 人在平面镜中所成的像变 小 D. 人在平面镜中所成的像先不变，后变大 7.下列说法中正确的是（）

A. 汽车的车头灯是用平面镜 B. 汽车的观后镜是用凸面镜 C. 太阳灶用的是凸面 镜 D. 牙科医生用来观察患者不易看到的部位的镜是用凹面镜 8.检查视力的时候，视力表放在被测者头部的后上方，被测者识别对面墙上镜子里的像．如图所示，则如下说法正确的是（） A. 视力表在镜中的像与视力表相距4.7m B. 视力表在镜中的像与被测者相距4.4m C. 视力表在镜中的像与被测者相距4.7m D. 视力表在镜中的像与被测者相距5.3m 二、填空题 9.小立身高1.60m，站在镜前0.50m处，则他在镜中的像离镜面________m；当他慢慢远离镜子时，像的大小________（选填“变大”、“变小”或“不变”）。 10. 如图是“探究平面镜成像特点”的情景：竖立的透明玻璃板下方放一把直尺，直尺与玻璃板垂直；两支相同的蜡烛A、B竖立于玻璃板两侧的直尺上，以A蜡烛为成像物体 ⑴为便于观察，该实验最好在________ 环境中进行（选填“较明亮”或“较黑暗”）；此外，采用透明玻璃板代替平面镜，虽然成像不如平面镜清晰，但却能在观察到A蜡烛像的同时．也能观察到 ________ ，巧妙地解决了确定像的位置和大小的问题 ⑵点燃A蜡烛，小心地移动B蜡烛，直到与A蜡烛的像为止，这时发现像与物的大小________ ；进一