ELISA步骤及注意事项

1.蛋白包板：选择合适的蛋白包被浓度梯度，计算上样体积并用包被液稀释（50 μl/孔）。

2. 4 ℃过夜或者37 ℃孵育2 h。

3.用PBST洗涤2～3次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。

4.封闭：

（1）新配1～2% BSA或5% 脱脂奶粉（都用PBS配制）

（2）上样量100μl/孔

（3）37 ℃孵育1～2 h

（4）作用：封闭未被蛋白结合上的位点，防止待测抗体与板上空白位点的结合，减少非特异性反应。

5．用PBST洗涤2～3次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。

6. 封闭期间完成一抗的浓度梯度选择和稀释:

（1）用新配1% BSA 对一抗进行稀释（BSA可以中和一抗中可能存在的抗BSA的抗体，降低非特异性反应），计算所需稀释液体积后配制。

（2）上样量50μl/孔

（3）空白对照和阴性对照孔加等体积PBS

（4）37 ℃孵育1 h

7．用PBST洗涤3次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。

8. 一抗孵育期间配制酶标二抗稀释液

（1）用新配1% BSA进行稀释，计算所需稀释液体积后配制（一般1:5000）

（2）上样量50μl/孔

（3）阴性对照孔也加等体积二抗稀释液

（4）37 ℃孵育45min～1 h(同一批次二抗孵育时间必须固定，如1h)

9. 用PBST洗涤3～4次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。

10.显色：

（1）A液和B液等体积混合，在使用前需在室温下放置30 min。

（2）上样量100μl/孔，计算用量：96孔×100 μl/孔= 10 ml/板（A：B= 5ml: 5ml）

（3）空白对照孔和阴性对照孔也加等体积显色液

（4）显色液上样速度一定要快速并保持匀速

（5）37 ℃孵育10 min或者室温避光15 min(从加完第一块板即开始计时)

11.终止：

（1）2M H2SO4作为终止液

（2）上样量100μl/孔，计算用量：96孔×100 μl/孔= 10 ml/板

（3）空白对照孔和阴性对照孔也加等体积终止液

（4）终止液上样速度一定要快速并保持匀速

12.读数，分析数据

于酶标仪测得各孔OD值（终止后10min内），分析处理数据

(一)注意事项

1.加样

在ELISA中除了包被外，一般需进行4－5次加样。在定量测定中加样量应力求准确，标本和结合物的稀释液应按规定配制。加样时不可太快，应将液体加在孔底，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性；

加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附；溅出会对邻近孔产生污染；出现气泡则反应液界面有差异。

2.保温

在ELISA中一般有二次蛋白抗体反应，即加标本后和加结合物后，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。各ELISA板不应叠在一起。为避免蒸发，板上应加盖，或将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中。湿盒应该是金属的，传热容易。如用保温箱，空湿盒应预先放在其中，以平衡温度，这在室温较低时更为重要。加入底物后，反应的时间和温度通常不做严格要求。如室温高于20℃，ELISA板可避光放在实验台上，以便不时观察，待对照管显色适当时，即可终止酶反应。

3.洗涤

洗涤在ELISA过程中，有时是决定实验成败的关键。洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相蛋白或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯待塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的。因此在ELISA测定的反应过程中应尽量避免非特异性吸附，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。

洗涤如不彻底，特别在最后一次，如有酶结合物的非特异性吸附，将使空白值升高。

另外，在间接法中如血清标本内的非特异性IgG吸附在固相上而未被洗净，也将与酶标抗体作用而产生干扰。

ELISA板的洗涤一般可采用以下方法：①吸干孔内反应液；②将洗涤液注满板孔；

③放置2min，略作摇动；④吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干。洗涤的次数一般为3～4次，有时甚至需洗5～6次。