双水相萃取相图制作实验

实验一：双水相萃取的相图制作

一、试验目的

1了解双水相萃取的原理和发展历史、趋势

2 掌握用浊点法制作双水相系统相图的方法。

二、试验原理

某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分占很大比例，即形成双水相。常见的双水相系统可分为两类，即双聚合物体系和聚合物/盐体系。双水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，它是研究双水相萃取的基础。相图是一根双节线，当成相组分的配比在曲线的下方时，系统为均匀的单相，混合后溶液澄清透明，称为均相区；当配比在曲线的上方时，能自动分成两相，称为两相区；若配比在曲线上，混合后，溶液恰好由澄清变为浑浊。

连接双节线上的两点的直线称为系线，它由三点确定,即M(初始混合物组成情况)、T(上相组成情况)、B(下相组成情况)，其中T/B互为共扼相。系线越长，两相间的差别越大，当系线长度趋向零时，两相差别消失。系线上系统的总浓度不同，但均分成组成相同体积不同的两相，两相体积服从杠杆规则：ＶＴ／ＶＢ＝ＢＭ／ＭＴ

三、主要仪器设备

漩涡振荡器、微量滴管装置、电子天平

四、试验步骤

1 双水相系统的制作

精确配制43%（g/ml）的(NH4)2SO4溶液，并测定其密度。另精确称取PEG400液体0.7g 于试管中，按表格中所列第一号数据，用吸管加入0.5毫升水，缓慢滴加已配制好的(NH4)2SO4溶液，并在混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶液开始出现浑浊为止，记录(NH4)2SO4的加入量，根据密度求出重量。然后按下表列出的第2号数据加入水，使其澄清，继续向试管中滴加(NH4)2SO4溶液，使其再次达到浑浊。如此反复操作，计算每次达到浑浊时PEG400和(NH4)2SO4在系统总量中的百分含量。

2 相图的绘制

以PEG400的重量百分比浓度为纵坐标，(NH4)2SO4的重量百分比浓度为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。

五、注意事项

1、微量滴定管在使用前必须先洗涤干净，否则容易产生气泡或发生堵塞现象。洗涤时，不用去污粉，可用铬酸洗液或洗涤液先浸泡一段时间后，用一根细长的刻度移液管刷刷洗刻度处，最后用蒸馏水反复冲洗数次。

2、清洗干净的微量滴定管必须先用蒸馏水试漏，如有漏液，可涂少量凡士林（过量的凡士林会堵塞滴定管）。试漏成功的滴定管要润洗两次，即注液杯、支管、刻度管和出液尖嘴用滴定液洗涤两遍。

3、由于支管拐弯处易藏气泡，一般待滴定液放满刻度管后打开支管旋塞用洗耳球将溶液中气泡刚好吹入贮液杯中即可，也可缓慢倾斜滴定管使气泡从口部溢出。

4、滴定过程要注意爱护仪器，轻拿轻放。用(NH4)2SO4滴定时，在接近滴定终点左右时一定要每滴一滴，便彻底混匀后方可滴定下一滴。

六、思考问题

1 双水相萃取中相图有何意义？

2 双水相萃取在分离生物大分子物质时有何意义？

双水相萃取法

双水相萃取法的应用及研究进展 摘要:双水相萃取技术作为一项新的分离技术日益受到重视，它与传统的萃取及其它分离技 术相比具有操作条件温和、处理、量大、易于连续操作等优点，从而使其能广泛应用于生物分离工程中。本文介绍了双水相的形成、双水相萃取技术的基本原理以及影响物质分配系数的因素。同时对双水相萃取技术的研究进展及其应用进行了综述。 关键词：双水相萃取分离纯化进展 一：方法 随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、代谢工程等高新技术研究工作的广泛开展，各种高附加值的生化新产品不断涌现，对生化分离技术也提出了越来越高的要求。包括精馏、吸收、萃取、蒸发、结晶在内传统的分离技术有三大特点:分离过程伴随有相的变化;筛分过程不能实现分子级别的分离;精制过程成本极高，这些特征对于节约能源、生物分离、环境 保护、资源开发、替代能源、高纯材料等当代化学工程与科学技术发展不相适应。围绕以上几个问题的讨论就构成了分离技术研究与发展的主流，即新型分离技术产生的背景。双水相萃取技术始于20世纪60年代，从1956年瑞典伦德大学Albertsson发现双水相体系[2]到1979年德国GBF的Kula等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离，虽然只有20多年的历史，但由于其条件温和，容易放大，可连续操作，目前，已成功的应用于蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离和纯化，双水相体系也已被成功的应用到生物转化及生物分析中。 双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相溶性，使得聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成不相溶的两相，因使用的溶剂是水，因此称为双水相原则上，无论是天然的还是合成的亲水聚合物，绝大多数在与另一种聚合物水溶液混合时都可分成两相，构成双水相体系。 双水相萃取与水一有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同。对于某一 物质，只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件，就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化之目的。 二：讨论 双水相萃取是一项可以利用不复杂的设备，并在温和条件下进行简单的操作就可获得较高收率和有效成分的新型分离技术。因此，广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域。然而有关双水相分配的基础研究还不够，工业化的一些关键问题还没有解决。为此，有必要加强这方面的基础研究，解决大规模萃取生物活性物质的工艺条件和设备方面的问题，促进双水相萃取技术的不断发展。 影响双水相萃取的因素比较复杂，主要包括静电作用、疏水作用和界面张力等。通过对各个因素的调节，可以极大地提高蛋白质的选择性，达到向一相富集的目的。A 1}'帅的组分性质千差万别，从晶体到无定形聚合物、从非极性到极性、从电解质到非电解质、从无扫L 小分子到有扫L高分子甚至生物大分子，这些都不可避免地造成理论计算的复杂性，以至 于现在还没有一套比较完善的理论来衡量各个影响因素之问的关系和解释生物大分子在体 系中的分配扫L理.有关A丁PS分配模型的研究中，较为成功的有的渗透维里模型，以及晶格模型。前者在预测聚合物的成相行为和蛋白质的分配上有较高的准确度;后者在粒子的能

双水相体系萃取(精)

双水相萃取技术 早在1896年,Beijerinck发现,当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时,得到一个混浊不透明的溶液,随之分为两相,上相富含明胶,下相富含琼脂(或淀粉,这种现象被称为聚合物的不相溶性(incompatibility,从而产生了双水相体系(Aqueous two phase system,ATPS。 传统的双水相体系是指双高聚物双水相体系,其成相机理是由于高聚物分子的空间阻碍作用,相互无法渗透,不能形成均一相,从而具有分离倾向,在一定条件下即可分为二相。一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异,混合时就可发生相分离,且憎水程度相差越大,相分离的倾向也就越大。可形成双水相体系的聚合物有很多,典型的聚合物双水相体系有聚乙二醇(polyethylene glycol,略作PEG/葡聚糖(dextran,聚丙二醇(polypropylene glycol/聚乙二醇和甲基纤维素(methylcellulose/葡聚糖等。另一类双水相体系是由聚合物/盐构成的。此类双水相体系一般采用聚乙二醇(polyethylene glycol作为其中一相成相物质,而盐相则多采用硫酸盐或者磷酸盐。 萃取原理 双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配。当萃取体系的性质不同时,物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等的存在和环境因素的影响,使其在上、下相中的浓度不同。物质在双水相体系中分配系数K可用下式表示: K= C上/ C下 其中K为分配系数,C上和C下分别为被分离物质在上、下相的浓度。 分配系数K等于物质在两相的浓度比,由于各种物质的K值不同,可利用双水相萃取体系对物质进行分离。其分配情况服从分配定律,即,“在一定温度一定压强下,如果一个物质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里,达到平衡后,该物质在两相中浓度比等于常数”,分离效果由分配系数来表征。

第七章 双水相萃取

第七章双水相萃取 第一节概述 基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固—液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感，由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，而且大部分蛋白质分子有很强的亲水性，不能溶于有机溶剂中，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离。因此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。其中双水相萃取技术，又称水溶液两相分配技术是近年来出现的引人注目、极有前途新型分离技术。双水相萃取就是针对生物活性物质的提取所开发的一种新型液一液萃取分离技术。 双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可以连续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质2～5倍，与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率上还是成本上都要优越得多见表11．1所示。双水相萃取法和传统的酶粗分离方法(如 盐析或有机溶剂沉淀等)相比也有很大的优势，如以 -半乳糖苷酶为例，用沉淀或双水相萃 取纯化的比较见表11．2。除此以外，处理量相同时，双水相萃取法比传统的分离方法，设备需用量要少3～10倍，因此已被广泛地应用在生物化学、细胞生物学和生物化工领域，进行生物转化、蛋白质、核酸和病毒等产品的分离纯化和分析等。用此法来提纯的酶已达数十种，其分离过程也达到相当规模，如甲酸脱氢酶的分离已达到几十千克湿细胞规模，半乳糖苷酶的提取也到了中试规模等。 近年来又进行了双水相萃取小分子生物活性物质，如红霉素、头孢菌素C、氨基酸的研究和亲和双水相萃取的研究，大大扩展了应用范畴并提高了选择性；使双水相萃取技术具有更大的潜力和宽阔的前景。 双水相萃取现象最早是1896年由Beijerinck在琼脂与可溶性淀粉或明胶混合时发现的这种现象被称为聚合物的“不相溶性”。本世纪60年代瑞典Lund大学的AlbertssonPA及其同事们最先提出双水相萃取技术并做了大量的工作。70年代中期西德的KulaMR和KronerKH 等人首先将双水相系统应用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，大大改善了胞内酶的提取效果。虽然双水相技术在应用方面取得了很大的进展，但几乎都是建立在实验基础上，至今还没有一套比较完善的理论来解释生物大分子在体系中的分配机理。1989年，Diamond等以Ftory—Huggins理论为基础，推导出生物分子在双水相体系中的分配模型，但尚有局限性，仍需继续探索，不断完善。 双水相萃取技术真正工业化的例子也很少，其原因是成本较高，使它在技术上的优势被削弱。双水相萃取中，原材料成本占了总成本的85％以上并且总成本随生产规模的扩大而增加很多。因此产业化成了问题，若要发挥其技术优势，降低原材料成本是关键。合成价格低廉并且具有良好的分配性能的聚合物及将其从后续的操作过程中回收是双水相萃取技术研究中的一个主要方向。 一、双水相的形成 在聚合物—盐或聚合物—聚合物系统混合时，会出现两个不相混溶的水相，典型的例子如在水溶液中的聚乙二醇(PEG)和葡聚糖，当各种溶质均在低浓度时，可以得到单相匀质液体，但是，当溶质的浓度增加时，溶液会变得浑浊，在静止的条件下，会形成两个液层，实际上是其中两个不相混溶的液相达到平衡，在这种系统中，上层富集了PEG，而下层富集了葡聚糖。

双水相萃取分离

双水相萃取技术应用 摘要：双水相萃取技术作为一种新型的分离技术日益受到重视，它与传统的萃取方法相比有独特的优点。本文总结了双水相萃取形成的原理，萃取过程的基本理论、萃取体系的特点，综述了双水相萃取技术在生化工业、分析检测、稀有金属分离等方面的应用，介绍了该技术的最新进展，指出了该技术工业化存在的问题，并对今后的发展作了展望。 关键词：双水相萃取分离应用 引言 双水相萃取技术（Aqueous two—phase extraction，简称ATPE）与传统的萃取分离技术不同，有其独特的优点，是一种新型的分离技术。双水相萃取在诸多方面有着广泛的应用，具有良好的应用前景。 1、双水相萃取技术的基本原理 1．1双水相体系的形成 当一定浓度的某种有机物水溶液与其它有机物水溶液，或者有机物水溶液与无机盐水溶液以一定体积比混合时，能够自然分相并形成互不相溶的双水相或者多水相体系，这就是双水相体系。 从溶液理论来说，当2种有机物或者有机物与无机盐混合时，是分相还是混合成一相，取决于混合时的熵变和分子间的相互作用力。由于双水相体系本身的复杂性，体系的熵很难准确计算，分子间的相互作用力也不清楚，所以双水相的形成机理很复杂。对于高聚物／高聚物双水相体系，用传统的理论来解释，是由于界面张力等因素形成两相之间的不对称，使得在空间上产生阻隔效应，使两相之间无法相互渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，一般这种分离倾向的大小和形成双水相的2种物质的疏水性成线性关系。对于有无机盐存在的双水相体系，以及新开发的表面活性剂双水相体系，这种解释就无能为力了。 表1是各种双水相体系的成相原理。由表1可知，不同的成相原理可以解释不同组成的双水相体系．但各种原理并不能普遍适用。而且各种原理问的相互关

双水相萃取

实训1 双水相萃取相图的制作 一、实训目的 1. 学习双水相分离萃取的原理和方法 2. 学习双水相萃取相图的制作 二、实训原理 双水相萃取法是利用物质在互不相容的两个水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。 两水相的形成：高聚物与无机盐在水中由于盐析的作用会形成两个相，如PEG 与硫酸盐或碱性磷酸盐。两种亲水性高聚物在水中由于聚合物的不相容性也会形成两个相。但是它们只有达到一定的浓度时，才能形成两相，双水相形成的定量关系可用相图来表示。 相图是一根双节线, 把均匀区和两相区分隔开来。 当成相组分的配比取在：线的下方时，为均相区； 曲线的上方时，为两相区；在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为浑浊。 相图中TMB 称为系线；T 代表上相组成；B 代表下相组成；同一条系线上各点分成的两相具有相同的组成，但体积比不同。 V T / V B = BM / MT 三、实训器材、试剂、材料 1.器材：试管，离心机，天平，离心管，三角瓶，滴定管。 2.试剂：聚乙二醇2000（PEG2000），硫酸铵。 四、实训操作步骤 1.PEG2000（NH 4)2SO 4双水相体系相图的测定 （1）取10%（g/ mL ）PEG2000溶液10mL 于三角瓶中。 （2）用40%（g/mL ）（NH 4)2SO 4溶液装入滴定管中滴定至三角并中溶液出现浑浊，记录）NH4)2SO 4溶液消耗的体积。加入1mL 水使溶液澄清，继续用（NH 4)2SO 4溶液滴定至浑浊，重复7～8次，记录每次（NH 4)2SO 4溶液消耗的体积，计算每次出现浑浊时体系中PEG2000和（NH 4)2SO 4的浓度（g/mL ）。 （3） 以（NH 4)2SO 4的浓度（g/mL ）为横坐标，PEG2000的浓度（g/mL ）为纵坐标，绘制PEG2000- （NH 4)2SO 4双水相体系相图。 2. 相图制作表 10%PEG2000 10mL 温度T=20℃ PEG2000 % (NH 4)2SO 4 % 两相 均相

双水相萃取技术

双水相萃取技术 D09生物张燊睿092203112 内容提要:本文主要叙述双水相萃取技术的概念，原理，操作，未来发展方向以及在生物、食品工业中的应用。 Abstract:This paper mainly describes the two aqueous phase extraction technology concept, principle, operation, the future development direction as well as in the biological, food industry application 关键词：萃取、分离、双水相体系、提取、生物分离、未来发展、亲和作用。 引言：随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、、代谢工程等高新技术研究工作的广泛的开展，各种高附加值得食品生化新产品不断涌现，对食品、生化等分离技术提出了越来越高的要求。包括精馏、吸取、萃取、蒸发、结晶在内传统的分离技术的三大特点：分离过程伴随有相的变化；筛分过程不能实现分子级别的分离；精制过程成本极高，这些特征对于节约能源、生物分离、环境保护、资源开发、替代能源、高纯材料等当代化学工程与科学技术不相适应。围绕以上几个问题的讨论就构成了分离技术研究与发展的主流，即新型分离技术产生的背景。 双水相系统：基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固－液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。当两种聚合物、一种聚合物与一种亲液盐或是两种盐（一种是离散盐且另一种是亲液盐）在适当的浓度或是在一个特定的温度下相混合在一起时就形成的。 例如用聚乙二醇（PEG Mr为6000）/磷酸钾系统从大肠杆菌匀浆中提取β-半乳糖苷酶。这是一个很有前途的新的分离方法，特别适用于生物工程得出的产品的分离。 一．双水相萃取原理： 双水相萃取技术又称水溶液两相分配技术（partition of two aqueoue phase system）近年来发现的、引人注目的、极有前途的新型分离技术。早在1896年，荷兰微生物学家Beijerinck[1]发现，把明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液混合时得到一种不透明的混合溶液，静止后风味两相，上相含大部分水，下相含大部分琼脂，而两相的主要成分都是水，人们把这种现象称为聚合物的不相溶性，由此产生了双水相萃取。1955年，瑞典伦德大学的Albertsson[2]首次利用双水相技术从单细胞藻类中分离淀粉核，从此开创了双水相分配技术。1979年德国GBF 的Kula和Kroner等[3]水相体系用于提取酶和蛋白质，使胞内酶提取过程大为改善。几十年来，国内外的研究者们已经就双水相分配技术的各个方面展开了系统的研究，包括新型双水相体统的开发，成相机理研究、系统物性的测定、热力学性质的研究生物大分子及小分子活性物质的分配、萃取工艺流程的设计、工业化大生产中的应用以及聚合物的回收等等，并取得很大进展。 双水相萃取的聚合物不相容性：根据热力学第二定律，混合是熵增过程可以自发进行，但分子间存在相互作用力，这种分子间作用力随相对分子质量增大而增大。当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大

双水相萃取实验

一、双水相系统的相图绘制 1.实验目的 了解制作双水相系统的相图的方法，加深对相图的认识。 2.实验原理 相图是研究两水相萃取的基础，双水相形成条件和定量关系常用相图来表示。图1是典型的高聚物-高聚物-水双水相体系的直角坐标相图，两种聚合物A、B以适当比例溶于水就会分别形成有不同组成、度的两相，上相组成用T点表示，下相组成用B点表示，由图1可知上下相所含高聚物有所偏重，上相主要含B，下相主要含A。曲线TCB称为结线，直线TMB称为系线。结线上方是两相区，下方为单相区，若配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为混浊。组成在系线上的点，分为两相后，其上下相组成分别为T和B，T、B量的多少服从相图的杠杆定律。即T和B相质量之比等于系线上MB与MT的线段长度之比。又由于两相密度相差很小，故上下相体积之比也近似等于系线上MB与MT线段长度之比。 图1 A-B-水双水相体系相图 O aqueous two-phase system Figure 1 The phase diagram of the A-B-H 2 3.实验器材和试剂 （1）器材：电子台秤，漩涡混合器，大试管，滴定管，密度计，温度计。（2）试剂：聚乙二醇，硫酸铵，硫酸镁。 4.操作方法 （1）溶液的配制 配制40%的盐（硫酸铵或硫酸镁）溶液 配制40%的聚乙二醇溶液，液体聚乙二醇可用纯溶液。 （2）相图的制作

精确称取一定质量（0.7000g 左右）PEG 溶液于大试管中，按表1所列第1列数据，加入0.5mL 去离子水，用滴定管缓慢滴加已配好的40%的盐溶液，并不断在漩涡混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内液体出现浑浊为止。记录盐溶液的加量(g)。然后，按表格所列第2列数据加入水，溶液澄清，继续向试管中滴加盐溶液并不断混匀，直至再次达到浑浊，如此反复操作。计算每次达到浑浊时，PEG 和盐在系统总量中的质量分数，将实验数据填入表中，以PEG 的质量分数为纵坐标，某种盐的质量分数为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。 表1相图制作表 编 号 水 /g (NH 4)2SO 4溶液加量/g 纯(NH 4)2SO 4累计量/g 溶液累计总量/g (NH 4)2SO 4质量分 数/% PEG 质量分数/% 1 0.5 3.1315 0.895 4.3786 20.4 4.79 2 0.3 2.1792 1.5186 5.9511 21.85 3.02 3 0.3 2.0456 2.1 9.2867 22.65 2.26 4 0.3 3.1372 3.0 12.6738 23.68 1.65 5 0.5 6.0769 4.7 19.3276 24.52 1.08 6 0.5 6.1909 6.5 26.0138 25.02 0.8 7 0.5 6.8585 8.5 33.4596 25.32 0.62 根据以上数据以(NH 4)2SO 4质量分数为横坐标，以PEG 质量分数为纵坐标即可做出相图。 二、双水相系统比例的选择 根据相图，选择五个成相比例。 三、蛋白酶酶活标准曲线的绘制—— Folin 酚法或紫外分光光度法 PEG4000与MgSO4双水相图 y = 0.0995x 2 - 5.3887x + 73.334 2012345 6 20 21 22 2324 25 26 MgSO4% P E G 4000%

双水相萃取和超临界萃取的方法与特点

双水相萃取和超临界萃取的方法与特点 专业生物工程092 课程酶工程 老师王明力 学生吴志洪 学号 0908110342 2012年12月25日

双水相萃取和超临界萃取的方法与特点 摘要：双水相萃取技术是一种高效温和的新分离技术，它与传统的萃取及其它分离技术相比具有操作条件温和、处理量大、易于连续操作等优点，从而使其能广泛应用于生物分离工程中。同时文章简要介绍了超临界流体萃取的基本原理和特点及其应用，其中超临界CO2萃取是最常用的.随着研究的深入和认识的加强，超临界流体技术作为一项可持续的绿色工艺，将具有广泛的应用前景。 关键词：双水相萃取超临界流体萃取 Abstract: Phasepartitioning technology is a kind of high efficient mild new separation technique ，and the traditional extraction and other separation technology compared with mild conditions, large quantity of operation, easy for operation, which makes its advantages such as extensively applied in biological separation engineering.And his article introduces the basic principle of supercritical fluid extraction and it,s application ,The supercritical CO2extraction is the most commonly used.With the deepening of research and understanding of the strengthen, supercritical fluid technology as a sustainable green technology, has a broad prospect of application.

双水相萃取研究(论文)

双水相萃取技术 姓名：小行星学号： 20128888专业：化工工艺 摘要：双水相萃取是一种新型的萃取分离技术，本文介绍了双水相体系的形成 及特点，重点介绍了双水相萃取技术的应用和双水相萃取的主要设备， 对双水相萃取技术应用前景及展望 关键字：双水相萃取分离技术应用展望 1、引言 溶剂萃取法是分离技术中最重要的方法之一。传统的溶剂萃取分离是依据被分离物质在两个互不相溶液相中的溶解性不同而达到分离目的。一般的萃取体系包括有机相和水相两部分,迄今为止,已有若干种分类方法。随着近年来分离技术在生命科学、天然药物提纯及各类抗生素药物等方面应用的迅速发展,新型的萃取技术应运而生。例如对于生物物质来说,分离的对象复杂,既包括可溶物,如蛋白质和核酸,也包括悬浮的小颗粒,如细胞器和整个细胞;由于生物物质极易变性和失活,传统的有机相和水相的两相萃取不能解决生物物质失活等问题，给分离带来很大的难度，而双水相萃取技术能够很好的解决这一难题。 双水相萃取(Aqueoustwo-phase extraction, ATPE)[1]是两种水溶性不同的聚合物或者一种聚合物和无机盐的混合溶液,在一定的浓度下,体系就会自然分成互不相容的两相，被分离物质进入双水相体系后由于表面性质、电荷间作用和各种作用力(如憎水键、氢键和离子键)等因素的影响,在两相间的分配系数K不同,导致其在上下相的浓度不同,达到分离目的，这种现象在1896年被 B eijerinck首次发现,随后双水相萃取技术作为一种新型的分离技术日益受到重视,与传统的萃取及其他分离技术相比具有操作条件温和、处理量大、易于连续操作等优点,随着生物、医药等行业的蓬勃发展，从而使双水相萃取技术能越来越广泛应用于生物工程、药物分析和金属分离等方面。 2、双水相体系

第8章双水相萃取技术

第8章双水相萃取技术 第8章双水相萃取技术 1双水相萃取现象：最早是1896年由Beijernek在琼脂和可溶性淀粉或明胶混合时发现的，这种现象称之为聚合物的“不相溶性”。70年代中期西德的Kula和Kroner等人首先将双水相系统应用于从细胞匀浆 液中提取酶和蛋白质，大大地改善了胞内酶的提取效果。 双水相萃取技术：某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统。利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质进行物质分离的方法称双水相萃取技术，又称水溶液两相分配法。 2双水相萃取技术基本原理：①双水相的形成一聚合物的不相容性：混合是熵增加的过程，可自发进行。但是，分子间的相互作用力也会随分子量的增大而增大。当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于分子量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相容性。 双水相的形成一系统举例：绝大多数天然的或合成的亲水性聚合物水溶液，在与第二种亲水性聚合物混合，并达到一定浓度时，就会产生两相，两种高聚物分别溶于互不相溶的两相中。如用等量的 1.1 %右 旋糖酐溶液和0.36 %甲基纤维素溶液混合，静止后产生两相，上相中含右旋糖酐0.39 %，含甲基纤维素 0.65 %;而下相含右旋糖酐 1.58 %，含甲基纤维素0.15 %。聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相，例如，PEG^磷酸钾、PEG^磷酸铵、PEG^硫酸钠等常用于生物产物的双水相萃取。PEG^无机盐系统的上 相富含PEG下相富含无机盐。 Dextran-PEG体系的相图：（1）TKB称为双节线，双节线以下的区域为均相区，以上的区域为两相区。（2）TMB称为系线，是连接双节线上两点的直线，在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体积不同的两相。 萃取原理：双水相萃取与水-有机相萃的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配。当萃取体系的性质不同时，物质进入双水相系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如疏水键、氢键和离子键等）的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。 几个常用的术语：（1）分配系数:、二G/C2 = C_/C=.（分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各种物质的K值不同，可利用双水相萃取体系对物质进行分离）。（2）萃取率： 该相中被提取物质的量 Y%= 100% %=体系中被提取物质的总量％ 双水相体系萃取分离的特点：条件温和；操作方便；回收率高、提纯的倍数可达2-20倍,如体系选择 适当，回收率可达80%-90%A上,且分离速度快。 3双水相相图的操作：①把刻度离心管放置于电子天平上，调零；②向刻度离心管滴加一定量50% PEG-6000（简称A），记录重量；③调零，再滴加40%硫酸铵溶液（简称B），振荡，继续滴加B,直到混合物 呈现混浊状态，显示已形成不溶的两相，记录B的重量；④电子天平调零，然后，向混合物滴加一定重量 的水（0.4-0.5ml），经振荡后，重新呈现澄清状态，此现象表明溶液又回复成单相，记录此时的W重量；⑤ 电子天平调零。接着，再一次滴加B;⑥重复上述步骤。最后可得一系列成单相的点。 双水相相图的绘制：以PEG-6000和硫酸铵构成的双水相系统的相图曲线可根据如下公式计算获得： X=［0.4B/（A+B+W）］100% , 丫二［0.5A/（A+B+W）］100% （公式符号含义：Y :在某成单相点时 PEG-6000占总量的百分数；X :在某成单相点时硫酸盐占总量的百分数； A :在某成单相点时PEG-6000溶 液在系统中的总量（g）；B:在某成相点时硫酸铵溶液在系统中的总量（g）；W：在某成单相点时水在系统中的总量（g））。以丫为纵坐标，X为横坐标，丫对X作图得双水相系统相图。相图中曲线左边部分为单相区（含 曲线），曲线以右为双相区。 4双水相萃取的应用：①分离和提取各种蛋白质（酶）:PEG /硫酸铵双水相体系提取 a -淀粉粉酶和蛋白酶时a -淀粉粉酶收率90%分配系数为19.6，蛋白酶的收率高于60%分离系数高达15.1 :②提取抗生素；③双水相电泳分离氨基酸、蛋白质④基因工程药物的分离与提取：用PEG 4000/磷酸盐从大肠杆 菌碎片中提取人生长激素，用PEG -磷酸酯/磷酸盐提取a 1-干扰素和3 -干扰素。 5双水相萃取分离技术的发展方向：①新型双水相体系的开发：用变性淀粉取代葡聚糖；用羟基纤维 素取代聚乙二醇。②后续色谱纯化工艺研究：双水相萃取与层析技术。③金属亲和双水相萃取技术：利用金属离子和蛋白质中精氨酸、组氨酸的亲和作用。

双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究(精)

化学与生物工程 2006,Vol.23N o.10 Ch emistry &B ioengin eerin g 7 收稿日期:2006-04-17 作者简介:郑楠(1982-,女,陕西人,硕士研究生,主要从事生化制药方面的研究。E -mail:zheng nan1982@https://www.wendangku.net/doc/2010607819.html, 。 双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究 郑楠,刘杰 (南昌大学环境科学与工程学院,江西南昌330029 摘要:阐述了双水相萃取原理,详细分析了影响双水相萃取分离纯化蛋白质的各种因素,探讨了双水相萃取技术在蛋白质分离纯化中的应用并对其前景进行了展望。 关键词:双水相;蛋白质;分离纯化;影响因素 中图分类号:T Q 02818 Q 512+11 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(200610-0007-03 液-液萃取技术是化学工业中普遍采用的分离技术之一,在生物化工中也有广泛的应用。然而,大部分生物物质是有生物活性的,需要在低温或室温条件下进行分离纯化,而采用传统萃取技术无法完成。双水相萃取就是考虑到这种现状,基于液-液萃取理论并考虑保持生物活性所开发的一种新型液-液萃取分离技术。

与传统的液-液分离方法相比,双水相萃取技术分离纯化蛋白质具有以下优势:体系含水量高,可达80%以上;蛋白质在其中不易变性;界面张力远远低于水-有机溶剂两相体系的界面张力,有助于强化相际间的质量传递;分相时间短,一般只需5~15min;易于放大和进行连续性操作;萃取环境温和,生物相容性高;聚合物对蛋白质的结构有稳定和保护作用等。正是由于双水相萃取技术的诸多优势,现已被广泛用于蛋白质、核酸、氨基酸、多肽、细胞器等产品的分离和纯化。 1 双水相萃取原理 双水相体系是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间,在水中以适当的浓度溶解后形成的互不相溶的两相或多相水相体系。高聚物-高聚物-水体系主要依靠高聚物之间的不容性,即高聚物分子的空间阻碍作用,促使其分相;高聚物-盐-水体系一般认为是盐析作用的结果。 双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配,不同之处在于萃取体系的性质差异。当生物物质进入双水相体系后,由 于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等的存在和环境的影响,使其在上、下相中的浓度不同。分配系数K 等于两相中生物物质的浓度比,由于蛋白质的K 值不相同(大致在011~10之间,因而双水相体系对各类蛋白质的分配具有较好的选择性。 2 双水相萃取中影响蛋白质分配的因素 211 聚合物的分子量 同一类聚合物的疏水性随分子量的增大而增强[1] ,当聚合物的分子量减小时,蛋白质易分配于富含该聚合物的相。如在PEG -Dex tr an 系统中,PEG 的分子量减小或Dextran 的分子量增大都会使分配系数变大,相反PEG 的分子量增大或Dex tran 的分子量减小会使分配系数变小。这是由于PEG 分子量增大时,它的疏水性显著增强,使蛋白质在上相的表面张力增大,从而易于向下相

双水相萃取实验设计方案

双水相萃取地豆蛋白实验设计方案 史庚林 一、引言 地豆又名金果，长寿果、长果、番豆、金果花生、无花果、地果、地豆、唐人豆、花生豆、落花生和长生果。花生滋养补益，有助于延年益寿，所以民间又称之为“长生果”，并且和黄豆一同被誉为“植物肉”、“素中之荤”。花生的营养价值比粮食高，可以与鸡蛋、牛奶、肉类等一些动物性食物媲美。它含有大量的蛋白质和脂肪，特别是不饱和脂肪酸的含量很高，很适宜制作各种营养食品。 双水相萃取系统通常是由水溶性的两种聚合物或一种水溶性聚合物与一种盐和水构成的三组分双相体系。近年来, 该萃取技术受到研究者的青睐, 尤其是它对蛋白质、酶、核酸等生物活性物质的分离纯化等方面受到广泛重视, 双水相萃取在提取生物活性物质方面有如下优点: 含水量高;分相时间短; 界面张力小; 不存在有机溶剂残留问题; 大量杂质能与所有固体物质一同除去; 易于工程放大和连续操作 ; 更重要的是双水相萃取避免了传统液- 液萃取中生物活性物质与有机溶剂的直接接触, 保护了其活性, 有研究表明聚合物对颗粒或生物分子的结构不但没有破坏作用, 反而有稳定作用。 本实验以PEG/ ( NH 4) 2 SO 4 双水相体系为考察对象, 比较了不同浓度的PEG 和 ( NH 4 ) 2 SO 4 组成的双水相体系对地豆蛋白的萃取效果, 并考察了影响萃取效果 的各种因素。 二、实验仪器与试剂 1 仪器：离心机,电热恒温水浴锅，分光光度计,磁力搅拌器，电子天平，超声波仪 2 试剂：PEG( 分子量分别为600、1000，2000、4000、6000) , 硫酸铵，Nacl， NaH 2PO 4 ，K 2 HPO 4 ，考马斯亮蓝（G-250） 三、方法 1 粗蛋白的提取 1.1 用前面超声波处理的方法提取蛋白质1.2 用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量

双水相萃取技术

三、双水相萃取 3.1 双水相萃取的原理及特点 3.1.1 双水相萃取的原理 双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各种物质的K值不同，可利用双水相萃取体系对物质进行分离。 3.1.2 双水相萃取的特点 双水相体系萃取具有如下特点：(1)含水量高(70%~90%)，是在接近生理环境的温度和体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；(2)分相时间短，自然分相时间一般为5~15min； (3)界面张力小(10-7~10-4mN/m)，有助于强化相际间的质量传递；(4)不存在有机溶剂残留问题； (5)大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程更经济；(6)易于工程放大和连续操作。由于双水相萃取具有上述优点，因此，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。 3.2 双水相萃取在分离和提取各种蛋白质(酶)上的应用 用聚乙二醇(PEG)/羟丙基淀粉酶(Reppal PEG)体系经两步法可从黄豆中分离磷酸甘油酸激酶(PGK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。在黄豆匀浆中加入PEG4000，可絮凝细胞碎片及大部分杂蛋白。在上清液中加入PEG4000(12%)-ReppalPES(40%)，PGK在上相、GAPGH在下相的收率均在80%以上。萃取过程的放大采用离心倾析机连续处理匀浆液，用离心萃取器完成双水相体系的两相分离，整个工艺具有处理量大、接触时间短、酶收率高的特点。用PEG/(NH4)2SO4双水相体系，经一次萃取从A-淀粉酶发酵液中分离提取α-淀粉酶和蛋白酶，萃取最适宜条件为PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%)，pH=8，α-淀粉酶收率为90%，分配系数为19.6，蛋白酶的分离系数高达15.1。比活率为原发酵液的1.5倍，蛋白酶在水相中的收率高于60%。通过向萃取相(上相)中加进适当浓度的(NH4)2SO4可达到反萃取。实验结果表明，随着(NH4)2SO4浓度的增加，双水相体系两相间固体物析出量也增加。固体沉淀物既可干燥后生产工业级酶制剂，也可将固体物加水溶解后用有机溶剂沉淀法制造食品级酶制剂. Harris用双水相体系从羊奶中纯化蛋白，研究了牛血清清蛋白(OSA)、牛酪蛋白、β-乳球蛋白在PEG/磷酸盐体系中的分配以及PEG相对分子质量、pH值和盐的加入对3种蛋白分配的影响。实验结果表明。增加NaCl浓度，可提高分配系数，最佳pH为5。对OSA和牛酪蛋白，可得到更高的分配系数。在含有疏水基葡聚糖中，蛋白质和类囊体薄膜泡囊的分配研究表明，苯甲酰基葡聚糖和戊酰基葡聚糖具有疏水性。疏水基影响氨基酸、蛋白质和薄膜泡囊在双水相体系中的分配，在只有磷酸盐缓冲溶液的PEG8000/葡聚糖双水相体系中，大部分β-半乳糖苷酶被分配在上相，但在下相中加入少量的苯甲酰基葡聚糖(取代程度为0.054)或戊酰基葡聚糖(取代程度为0.12)时，β-半乳糖苷酶的分配系数就降低了100倍。在对牛血清清蛋白、溶菌酶、脂肪酶和β-乳球蛋白的分配进行的观察中发现具有相似的现象。类囊体薄膜泡囊的分配受疏水基的影响特别大，薄膜泡囊被分配在含有疏水基的一相中。在含有N，N-二甲基甲酰胺的聚合物双水相中，利用逆流分配可对玉米醇溶蛋白进行分级分离。Miyuki在PEG/K3PO4双水相体系中用两步法对葡糖淀粉酶进行了萃取纯化。用第一步萃取后含有酶的下相和PEG组成双水相作为第二步萃取体系，称作两步法。葡糖淀粉酶的最佳分配条件是PEG4000(第一步)、PEG1500(第二步)，pH=7，纯化系数提高了3倍。

双水相萃取技术及其应用

题目：双水相萃取技术及其应用 学院：化学化工学院 专业：生物工程班级：0801 学号：200806030106 学生姓名：李夫 教师姓名：谢涛 完成日期：2011年10月30日

双水相萃取技术及其应用 摘要：介绍了双水相萃取技术(ATPE)的应用现状，综述了近年来取水相萃取技术的相关研究进展。针对双水相系统(ATPE)的经济适用性问题，对新型A TPS相组成材料的研究取得了极大的发展；为了提高双水相萃取技术的选择性和分离效率，在组成传统ATPS的聚合物上偶联亲和配基的亲和ATPS也得到关注；双水相萃取技术的发展趋势还体现在与其他生物分离技术的结合以及萃取机理和热力学模型的优化上。 关键词：双水相萃取;原理;应用 The Techniques and Application of the Aqueous Two-Phase Extraction Abstract：The applications of the aqueous two-phase extraction(ATPE) in the years were summarized, and the advances on the research of A TPE were reviewed The novel aqueous two-phase systems were developed by using the cheaper phase forming polymer. In order to improve the selective and separation efficiency，the affinity extraction using aqueous two-phase systems(ATPS) which links affinity ligand to polymer In traditional A TPS got progressed. The integration with related techniques was also the development direction of A TPE, which overcame some shortcomings in the single A TPE. Although the application of the extraction equipments and continuous operation technique in A TPE indicated that the industrializations of APTE were growing up, establishing the thermodynamic model and theories about the partioning of solute in A TPS need to be optimized. Key words: aqueous two-phase extraction; principle; application 双水相萃取(Aqueous two-phase extraction，AIPE)技术始于20世纪印年代，从1956年瑞典伦德大学的Albensson发现双水相体系到1979年德国GBF的Kula等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离，虽然只有20多年的历史，但由于其条件温和，容易放大，可连续操作，目前，已成功地应用于蛋白质、核酸和病毒等生物产品的分离和纯化，双水相体系也已被成功的应用到生物转化及生物分析中。双水相技术作为一种新型的分离技术，因其体积小，处理能力强，成相时间短，适合大规模化操作等特点，已经越来越受到人们的重视。双水相萃取技术作为一种新型的萃取分离技术，有着很多的优点，但也存在着一定的局限性。一是成相聚合物的价格，如PEG/Dextran体系，葡聚糖比较昂贵，而且体系黏度大。[1]

双水相萃取的特点

双水相萃取的特点 双水相萃取是一种可以利用较为简单的设备, 并在温和条件下进行简单操作就可获得较高收率和纯度的新型分离技术。与一些传统的分离方法相比, 双水相萃取技术具有以下独有的特点。 ( 1) 两相间的界面张力小, 一般为10- 7—10- 4mN·m- 1 ( 一般体系10- 3—2×10- 2mN·m- 1 ) ,因此两相易分散, 而且它比一般的有机萃取两相体系界面张力低的多, 这样有利于强化相际间的物质传递。 ( 2) 操作条件温和, 由于双水相的界面张力大大低于有机溶剂与水相之间的界面张力, 整个操作过程可以在常温常压下进行, 对于生物活性物质的提取来说有助于保持生物活性和强化相际传质。 ( 3) 双水相体系中的传质和平衡速度快, 回收率高, 分相时间短, 传质过程和平衡过程速度均很快, 自然分相时间一般为5—15min, 因此相对于某些分离过程来说, 能耗较低, 而且可以实现快速的分离。 ( 4) 大量杂质能够与所有固体物质一起去掉, 与其他常用固液分离方法相比, 双水相分配技术可省去1—2 个分离步骤, 使整个分离过程更经济。 ( 5) 含水量高, 一般为75%—90% , 在接近生理环境的体系中进行萃取, 不会引起生物活性物质失活或变性。 ( 6) 一般不存在有机溶剂的残留问题, 现已证明形成双水相的聚合物( 如PEG) 对人体无害, 可用于食品添加剂、注射剂和制药, 因此

对环境污染小。 ( 7) 聚合物的浓度、无机盐的种类和浓度, 以及体系的pH 值等因素都对被萃取物质在两相间的分配产生影响, 因此可以采用多种手段来提高选择性和回收率。 ( 8) 易于连续化操作, 设备简单, 并且可直接与后续提纯工序相连接, 无需进行特殊处理。例如可以采用高分配系数和高选择性的多级逆流分配操作。 ( 9) 分配过程因素较多, 可以采取多种手段来提高分配选择性或过程收率。

双水相萃取

双水相萃取 一实训目的掌握双水相萃取的原理 及方法。 学习双水相萃取相图的制作。 二实训原理 双水相萃取法（aqueous two-phase extraction）是利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。高聚物PEG和盐（硫酸铵）形成的互不相溶的两相，倒入牛奶中，蛋白质富集在一相中。 三实训仪器和药品 试管，离心机，天平，离心管，三角瓶，滴定管，聚乙二醇2000 （PEG2000），硫酸铵，牛奶。 四实训步骤 1 PEG2000-硫酸铵双水相体系相图的测定（1） 取10%PEG2000溶液10mL于三角瓶中； （2）用40%硫酸铵溶液装入滴定管中滴定至三角瓶中溶液出现浑浊，记录硫酸铵消耗的体积。加入1mL水使溶液澄清，继续用硫酸铵滴定至浑 浊，重复7~8次，记录每次硫酸铵消耗的体积，计算每次出现浑浊时体 （3）以硫酸铵的浓度（W/V）为横坐标，PEG浓度（W/V）为纵坐标，绘制出PEG2000-硫酸铵双水相体系相图。 2PEG2000-硫酸铵双水相体系的配制 自行在相图中双水相区选择一个点，根据该点的PEG2000浓度和硫酸铵浓度，分别量取适量的10%PEG2000溶液和硫酸溶液，混合均匀后以2500rpm/min离心5min后分相，得到双水相体系（总量约3mL）。 3利用PEG2000-硫酸铵双水相体系萃取分离牛奶中的蛋白质 取1mL 牛奶装入上述双水相体系中，搅拌均匀，于2500rpm/min 离心5min，静置分层，分别量取上下相的体积。 萃取完成后，如果牛奶中的蛋白质不能被萃取到上相，则证明所选的

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PEG2000 与硫酸铵浓度不对，应重新选择。 五结果与讨论 1如果正确地绘制相图。 2如何根据相图配制双水相体系，并对混合物进行分离。 2