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2002抗Liberty杂交籼稻的应用研究

收稿日期:2002-03-11

基金项目:农业部科技跨越计划项目(1999-01-11);浙江省政府“8812”项目(961112063-0002)作者简介:王建军(1965-),男,浙江常山人,副研究员,浙江大学在职博士生,主要从事水稻遗传育种及分子生物学研究。

浙江农业学报Acta Agriculturae Zhejiangensis 14(5):249~254,2002

抗Liberty 杂交籼稻的应用研究

王建军1,2,张利华1,王林友1,黎恒庆3

(1浙江省农业科学院作物研究所,浙江杭州310021;2浙江大学农业与生物技术学院,浙江杭州310029;3中国科学院华南

植物研究所,广东广州510650)

摘要:根据5个抗Liberty 杂交籼稻喷施0.3%Liberty 后的农艺性状表现分析抗除草剂杂交组合

在生产上应用的可行性。结果表明:(1)苗期经Liberty 处理的转基因组合,成株期大田中未发现不育系株。说明利用抗除草剂基因和相应的除草剂,可有效杀死因机械混杂和生物学混杂混入抗Liberty 杂交稻中的不育株;

(2)抗Liberty 杂交籼稻,生育期、株高等植株形态与原组合相仿,但产量构成因子则差异较大,最终多数组合产量水平不及原组合。本文还提出以超纯杂交技术来统称利用抗除草剂基因提高杂交种纯度的技术,并提出了如何选育转基因亲本配合力的两种方法。关键词:水稻;杂交稻;转基因;抗除草剂中图分类号:S511.2+1;S334.5

文献标识码:A

文章编号:1004-1524(2002)05-0249-06

Study on exploration of Liberty (glufosinate )resistant hybrid rice :WANG Jian-jun 1,2

,ZHANG Li-hua 1,WANG Lin-you 1,LI Heng-qin 3(1

Crop Institute ,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences ,Hangzhou 310021,China ;2Agricultural and Biotechnology Gollege ,Zhejiang University ,Hangzhou 310029,China ;3

The South

China Institute of Botany ,China Academy of Sciences ,Guangzhou 510650,China )

Abstract :A comparative study was made between five herbicide resistant (R )rice hybrids and their controls under the treatment of herbicide Liberty was conducted.After spraying Liberty at the seedling stage ,the plots of R rice hybrids did not have any plants of their male sterile lines all the way to maturity.Four hybrids were pur-posely mixed with seeds of their sterile lines at a rate of 10%,respectively and all the mixed sterile plants were killed by Liberty in nursery.Result showed that using R rice and corresponding herbicide ,all the male sterile plants that were resulted from incomplete sterility in hybrid seed production due to genetic ,environmental and chemical factors ,mechanical contamination in operation ,and biological mutations could be eliminated.Howev-er ,yield components of herbicide resistant hybrids were different from their original hybrids ,although heading and plant height were similar.Grain yields of most R hybrids were inferior to their controls.The result of resis-tant Xiangyou 63having equivalent yield with the control suggests opportunity for the breeding.Two breeding strategies to improve combining ability in herbicide resistant hybrids were proposed in this paper.Liberty did not have negative effect on agronomic performance including grain yield.Key words :rice ;hybrid rice ;transgenic line ;herbicide resistance

在一定的环境条件诱发下,杂交水稻的某些细胞质不育系育性会出现波动,发生雄蕊散粉[1]或同质恢现象[2],造成杂交稻制繁种种子生物学混杂,轻则种子纯度下降,混杂大量不育株,导致减产;重则所生产的种子全部报废,造成重大损失[3]。尤其是不育性表达受温度控制的光温敏核不育系,由不育系育性波动而导致杂交种子生物学混杂的潜在危险更为严重[4]。因此,急需一种简便、有效的方法,以克服这一严重影响杂交稻生产和发展的技术难题。

20世纪80年代,针对这一问题,相继有学者提出一些提高杂交种纯度的技术或方法。如遗传提纯法、核心种子技术、花培提纯技术、人工去杂技术、化学杀雄技术、叶色标记技术以及特殊标记的利用等[5]。但这些方法都存在技术复杂、成本高、周期长、环节繁琐等问题,有时甚至因为其中某一环节出了差错,生产的种子就只能报废。随着抗除草剂基因的克隆与利用,为简便、高效地保障杂交稻种子纯度开辟了一条新途径。至今,在水稻上已获得抗草丁膦(glufosinate)的Bar 基因[6],抗草甘膦(glyphosate)的EPSP基因及抗谱杀特(pursurt)的Clearfield水稻等3类抗除草剂植株[7]。其中抗Liberty水稻和非转基因的抗谱杀特的Clearfield水稻品系在美国已进入生产示范[8,9]。有研究表明,上述3个抗除草剂性状,在遗传行为上表现为受1个显性基因调控[10,11]。严文贵提出将抗除草剂基因导入杂交稻恢复系中,其配制的杂交组合抗相应的除草剂,通过秧苗期施用除草剂来杀死感除草剂的假杂种。从理论上讲,该方法可获得100%纯度的杂交种子。1997年严文贵在美国申请了技术专利[12]。国内的肖国樱、黄大年等也提出了类似的设想,薛石玉等利用抗Bastar材料,回交转育获得密阳46的同型恢复系[13~15]。浙江省农业科学院与中国科学院华南植物研究所联合开展了抗除草剂转基因杂交籼稻育种研究,已育成若干稳定的抗Liberty恢复系。本研究采用这些恢复系与育性不稳定的不育系配组,分析抗Liberty杂交籼稻的主要农艺性状表现及其生产应用的可行性。

1材料与方法

1.1材料

供试的2个抗Liberty恢复系特青R和明恢63R,由中国科学院华南植物研究所黎恒庆教授提供。其中特青R为两系恢复系,明恢63R为三系恢复系。这2个恢复系是以转Bar基因的美国水稻品种Bengal Hu-10为供体,我国杂交稻骨干恢复系特青和明恢63为受体,经多代回交转育获得[16,17]。其除草剂抗性可以稳定地遗传,且主要农艺性状与受体亲本基本相近。

选用存在自交结实现象的1个两系不育系———培矮64S和3个三系不育系———Ⅱ-32A、香2A、龙特甫A,及一个育性较稳定的不育系珍汕97A,分别与特青R和明恢63R杂交配组,获得5个抗Liberty杂交籼稻组合:培杂特青R、Ⅱ优63R、香优63R、特优63R和汕优63R。同时,以相应的原恢复系与这5个不育系配制5个对照组合:培杂特青、Ⅱ优63、香优63、特优63和汕优63。

对不育系存在自交结实现象的4个组合,培杂特青R、Ⅱ优63R、香优63R、特优63R及各自的对照组合,每个组合中人为添加10%的不育系种子。由于珍汕97A没有自交结实问题,因而在汕优63中不掺不育系种子,而设立汕优63R喷药与不喷药及原组合的对比试验(表1)。

化学除草剂Liberty原液含有效成份膦丝菌素(phosphinothricin,PPT)200g/L。

1.2方法

采用大区对比试验设计,设处理区和对照区,每区面积72m2。处理区为抗除草剂组

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?浙江农业学报第14卷(2002)

合,对照区为相应的对照组合。根据试验田块土壤肥力差异的梯度,将抗除草剂组合与相应的对照组合平行排列,其中汕优63R组合的喷和不喷Liberty两种处理,平均布置于处理区内(各占36m2),且两者与对照呈平行排列。所有试验材料于5月30日播种,6月19日(秧龄为3.5~4.2叶)对5个抗Liberty 杂交组合均匀喷施0.3%的Liberty水溶液,一周后调查喷药组合的死苗率。6月28日移入大田,单本插植,株行距为16.5cm×22. 2cm。施肥水平中上,其它管理与一般大田相同。

每个试验区定10株调查生育动态,齐穗后调查杂株率,成熟期每区取5株测定株高、单株有效穗数、每穗总粒数、每穗实粒数、结实率、千粒重。成熟后,剔除区内病虫危害株和其它非正常生长植株,收获测产,按区内实

表1参试组合与处理方法

Table1Herbicide resistant(R)hybrids in the treat-ments with sterile seeds and herbicide Liberty

材料组合草丁膦

抗性添加10%

不育系

喷药

处理

培杂特青R培矮64S/

特青R

抗加喷

培杂特青培矮64S/

特青

感加不喷

Ⅱ优63RⅡ-32A/

明恢63R

抗加喷

Ⅱ优63Ⅱ-32A/

明恢63

感加不喷

香优63R香2A/

明恢63R

抗加喷

香优63香2A/

明恢63R

感加不喷

特优63R龙特甫A/

明恢63R

抗加喷

特优63龙特甫A/

明恢63R

感加不喷

汕优63R珍汕97A/

明恢63R

抗不加喷

汕优63R珍汕97A/

明恢63R

抗不加不喷

汕优63珍汕97A/

明恢63感不加不喷

收株数统计单株产量,并折算单位面积的产

量。

2结果与分析

2.1抗除草剂杂交稻喷施Liberty除杂效果

5个抗Liberty杂交组合秧龄在21天时,

叶龄在3.5~4.2叶之间。用0.3%的Liberty

水溶液均匀喷施,3天后部分植株出现黄叶,

5天出现死亡,7天后出现黄叶的植株全部枯

死。说明除草剂Liberty的杀除效果是极其

明显的。调查喷药组合的死苗率,培杂特青

R为8.7%,Ⅱ优63R为7.5%,香优63R为

8.1%,特优63R为9.3%。其死苗率与掺入

的不育系种子比例接近而并非相等,可能是

杂交种子与不育系种子的发芽率和成苗率存

在差异的缘故。

移栽后,大田调查每一处理的不育株率。

结果表明(表2),抗Liberty杂交籼稻组合汕

优63R苗期未经Liberty处理,成株期田间的

不育株率为0.53%。相应的对照汕优63成

株期田间的不育株率为0.67%。说明生产

上大面积应用的不育系珍汕97A,在较严格

的制种条件下,所生产的杂交种子仍有5‰

~6‰的不育株。换言之,严格的制种条件下

生产的种子,大田种植时每666.67m2中会

有60~100株的不育株。不育程度较差的

Ⅱ-32A、香2A和龙特甫A,不育株率在2%~

5%左右,比珍汕97A要严重得多。5个抗

Liberty杂交籼稻组合苗期经Liberty处理后,

成株期田间未发现1株不育系株。而相应的

混入10%不育系的对照组合,成株期不育株

率为11.1%~13.3%。说明抗Liberty的杂

交籼稻,幼苗期通过喷施Liberty杀除无抗性

基因的不育系株,成株期田间不育株率为零,

从而可使田间不育株率接近于零。

2.2抗Liberty杂交籼稻组合与各自对照组

合的农艺性状比较

对抗Liberty杂交籼稻与各自对照的农

?

1

5

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?

王建军等:抗Liberty杂交籼稻的应用研究

表2抗Liberty杂交稻与对照组合的主要农艺性状比较

Table2Comparison of main agronomic traits between herbicide resistant(R)hybrid rice and their controls

组合处理抽穗期

(m-d)株高

/cm

单株

有效穗

穗长

/cm

着粒密度

/粒?cm-1

每穗

总粒数

每穗

实粒数

结实率

/%

千粒重

/g

不育株

率/%

培杂特青R+08-20103.3011.20**21.4111.16*238.80**192.07**80.43*20.870.00

培杂特青-08-21105.1014.2021.838.45184.47152.4782.6522.2012.70

Ⅱ优63R+08-30117.90**11.6024.957.87**196.33**149.53**76.1625.100.00

Ⅱ优63-08-30108.7012.2025.39 6.44163.4025.8076.9926.7712.50

香优63R+08-18116.00**12.0023.83** 5.55**132.20**107.73**81.49*26.50**0.00

香优63-08-18109.5011.4026.91 6.84184.07155.5384.5026.2011.10

特优63R+08-19112.80**9.80*21.78** 5.43*118.19**90.69**76.73**26.730.00

特优63-08-19105.2012.8023.40 5.81135.93118.9387.4926.0313.30

汕优63R+08-27109.7013.00**23.80** 5.79137.80117.4085.2024.480.00

汕优63R-08-27111.4010.4023.67** 5.38**127.27**97.93**76.95**24.33*0.53

汕优63-08-27111.1010.8024.26 5.73139.07112.5380.9224.780.67注:“+”表示喷Liberty,“-”表示不喷Liberty;“*”和“**”分别表示抗除草剂组合与各自对照组合比较,差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)。下同。

艺性状进行比较,发现有的性状在各组合之间有共同的趋势,有的性状在不同组合中则有特异的表达(表2)。从抽穗期来看,抗除草剂杂交组合与其对照完全相同或仅差一天,无明显变化。而千粒重仅香优63R喷施除草剂比对照增加,其它组合增减均不显著。3个穗部性状———着粒密度、每穗总粒数、每穗实粒数,处理后与对照比较有趋同的变化,汕优63R处理与对照无显著差异,培杂特青R和Ⅱ优63R表现比对照增加,而其它2个组合表现为减少。单株有效穗、株高、穗长和结实率这4个性状,其变化趋势因组合不同而有较大差异。其中单株有效穗,培杂特青R和特优63R比对照显著减少,而汕优63R 反而显著增加;株高,有3个组合比对照显著增高,另3个组合比对照有所降低,但不显著。结实率,Ⅱ优63R和汕优63R增减不显著,其它3个组合均比对照显著减少。由上可见,抗Liberty杂交籼稻与对照相比,穗型大小差异较大,有增有减。株高则有增高的趋势,穗长和结实率有减少的趋势,抽穗期和千粒重无明显变化。

2.3汕优63R不同处理与汕优63的农艺性状比较

汕优63R+Liberty、汕优63R及汕优63相互比较结果表明(表2),3个处理的抽穗期完全一致。汕优63R与汕优63的株高相仿,但汕优63R喷施Liberty后株高降低1.7 cm,未达显著水平。相反,在汕优63R与汕优63单株有效穗数相仿的情况下,喷施Lib-erty的汕优63R单株有效穗数增加2.6个。穗长,汕优63R+Liberty与汕优63R相近,但两者比对照汕优63缩短0.46~0.59cm,差异达极显著。着粒密度、每穗总粒数、每穗实粒数、结实率、千粒重5个性状,汕优63R 均比对照减少或降低,并达显著或极显著。但经喷施Liberty的汕优63R,上述5个性状均有所增加,与对照汕优63相仿。说明经回交转育的汕优63R,植株形态与对照汕优63相似,但在产量构成因子上,与对照仍有差异。这暗示着Bar基因对杂交籼稻组合的产量构成因子有一定影响,同时也说明喷施Liberty似乎有提高汕优63R产量的趋势。2.4抗Liberty杂交籼稻的产量水平

对各处理的单株产量和小区产量测定结果表明(表3),所有转基因组合的单株产量

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?浙江农业学报第14卷(2002)

和小区产量均不及相应的对照。以单株产量为例,经Liberty处理的Ⅱ优63R和汕优63R,单株产量分别比相应对照减产0.69%和4.25%,未达显著水平。经Liberty处理的香优63R、特优63R、培杂特青R和未经Liberty处理的汕优63R分别比对照减产11.16%,15.39%,26.17%,25.95%,其中前二者达显著,后二者达极显著。说明转基因恢复系的产量配合力不及原恢复系。实测产量结果与单株产量的结果相似,所有处理均比对照减产,减幅为0.84%~31.68%。

3讨论

本试验结果表明,所有抗Liberty杂交籼稻转入的Bar基因得到高效表达,苗期喷施除草剂Liberty,杀除了所有不带Bar基因的不育株,使大田中不育株率为零,从而控制了由不育系育性不稳定造成的种子纯度问题。严文贵、王建军、黎恒庆等合作将这项技术命名为超纯杂交技术(super pure hybridization technology,SPHT),并开展了Bar基因的遗传分析,转Bar基因材料后代的抗性表达与酶蛋白的检测、抗Liberty杂交籼稻的选育及

表3抗Liberty杂交稻的产量比较

Table3Comparison of grain yields between herbicide re-sistant(R)hybrid rice and their controls

组合处理单株产量

产量±%大田产量

产量±%

培杂特青R+25.78-26.17**514.28-9.09培杂特青-34.91565.72

Ⅱ优63R+21.45-0.69412.72-7.69Ⅱ优63-21.60447.12

香优63R+21.08-15.39*472.65-0.84香优63-24.92476.68

特优63R+25.57-11.16*368.20-31.68特优63-28.78538.96

汕优63R+18.20-4.25437.69-3.01汕优63R-14.07-25.95**414.18-8.28汕优63-19.01451.28

注:单株产量为g/株;大田产量为kg/6667m2。

本文的抗Liberty杂交籼稻应用等系列研究。这项工作较全面地阐述了SPHT的理论基础和实践方法,并从理论走向实践,从实验室步入大田,部分材料已进入中试和试应用阶段。表明该技术理论与方法已渐趋成熟。

据黎恒庆报道,回交转育获得的抗Lib-erty的水稻恢复系特青R、明恢63R、测64 R,其主要农艺性状与原亲本相仿[17]。说明采用回交法可获得主要农艺性状与原始亲本相似的恢复系。本研究结果表明,特青R、明恢63R两个恢复系所测配的组合,主要农艺性状与原组合相比仍有较大差异,如着粒密度、每穗总粒数、每穗实粒数、结实率、单株产量5个性状都存在显著差异。这说明恢复系的配合力尚待改进。对此,可通过改进育种方法来实现:(1)回交与配合力测定同步进行。在回交的后代群体中同时进行目标不育系的配合力测定,以同步获得配合力和主要农艺性状与原始亲本相似的转基因恢复系;但该方法所获得的材料,可能因原恢复系已无应用前景而遭淘汰。(2)人工配制转基因恢复系。即在构建杂交一代时,所用的亲本之一应携有Bar基因,并在低世代即喷施Liberty,以筛选抗Liberty材料,高代开展恢复力及配合力测定,这样经测交获得的新恢复系可同步具有了Bar基因。

本研究中汕优63R未喷Liberty的产量比对照组合减产达25.95%,差异达极显著。但汕优63R+Liberty处理,产量水平得到提高,比对照组合减产仅4.25%,差异不显著。分析增产的原因是,主要是由于Liberty处理后,单株有效穗数增加、穗型变大、结实率也有提高。这暗示着Liberty处理可能有一定的增产作用,这有待于作进一步的试验验证。

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(责任编辑陈世明=========================================

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?452?浙江农业学报第14卷(2002)