重组门冬酰胺酶制备表达纯化

重组门冬酰胺酶II的表达及制备

重组天冬酰胺酶II研究进展 摘要L-天冬酰胺酶Ⅱ因能够水解L-天冬酰胺而具有抗肿瘤活性，在急性淋巴母细胞白血病的治疗方面应用甚广。目前，利用重组DNA技术产生的重组菌表达产生的L-天冬酰胺酶Ⅱ是临床应用的一个重要来源，本文主要对这类重组菌的构建、表达研究及后续产物的分离纯化进行综述。 关键词L-天冬酰胺酶Ⅱ；大肠杆菌；基因工程；分离纯化 Ⅰ引言 L-天冬酰胺酶（Asparaginase，门冬酰胺酶或天冬酰胺酶；EC3.5.1.1）用于急性淋巴母细胞性白血病的治疗已有30年了[1]。L-天冬酰胺酶可催化L-天冬酰胺（L-Asn）水解成L-天冬氨酸（L-Asp）和氨（NH3），此外它还能催化L-谷氨酰胺发生类似反应[2]。由于某些肿瘤细胞缺乏L-天门冬酰胺合成酶（正常人体细胞含有该酶），而细胞存活需要外源天冬酰胺的补充，L-天冬酰胺酶对天冬酰胺的降解作用恰好切断了门冬酰胺的血源性供给，肿瘤细胞由于缺乏该氨基酸不能进行蛋白质合成而死亡[1,3]。 目前，L-天冬酰胺酶分为I型和II型，尤其是II型，因其具有肿瘤抑制活性而被广泛研究[2]（下文如无特别说明，天冬酰胺酶即指L-天冬酰胺酶II）。天冬酰胺酶的谷氨酰胺水解活性给其临床应用带来了严重的副反应，因此筛选低谷氨酰胺酶活性的天冬酰胺酶是研究重点之一[2]。本文主要就L-天冬酰胺酶II的表达与制备进展进行综述。 Ⅱ工程菌的构建，发酵和分离纯化研究 1961年豚鼠血清中的抗肿瘤因子被证实为L-天冬酰胺酶[4]，随后科学家们又在大肠杆菌中发现了具有抗肿瘤活性的天冬酰胺酶，之后该酶又陆续在产气杆菌，芽孢杆菌，欧文氏菌，变形杆菌，链霉菌，曲霉，酵母等等微生物中被发现[5]。目前，临床使用的L-天冬酰胺酶主要从大肠杆菌，菊欧文菌和胡萝卜软腐欧文菌菌株中分离得到，这些来源的天冬酰胺酶其肿瘤抑制作用机制相同，差别主要在于药代动力学性质[1]。 尽管有很多菌株能产生天冬酰胺酶，国内外也已经构建了多株天冬氨酸酶高效表达的基因工程菌[6]，但是其中以大肠杆菌的研究最为充分[7]，接下来本文主要围绕表达天冬酰胺酶的大肠杆菌的研究进行展开。 1．表达菌株的构建 1995年，为了填补国内空白，刘景晶[8,9,10]等率先进行工程菌E.coli天冬酰胺酶ansB 基因的克隆和表达研究，并首次在国内成功构建了天冬酰胺酶高效表达的基因工程菌

植酸酶在饲料中的应用及其研究进展(精)

植酸酶在饲料中的应用及其研究进展 植酸酶是一种新型的、可作为动物饲料添加剂的重要酶制剂。它对提高饲料中磷利用率，提高动物的生产性能，以及减轻高磷粪便对环境水域的磷污染有重要意义。本文综述了植酸酶在饲料中的应用现状及工业化生产方法，讨论了其进一步的研究发展方向。 植酸酶是一种水解酶，它能将植酸磷（六磷酸肌醇）降解为肌醇和无机磷酸。此酶分两类：3-植酸酶和6-植酸酶。植酸酶广泛存在于植物和微生物中。磷在植物中的主要存在形式为植酸磷，由于植酸磷不能被单胃动物直接利用，从而造成磷源浪费和形成高磷粪便污染环境。另外，植酸磷还是一种抗营养因子，它在动物胃肠道的消化吸收过程中会与多种金属离子如Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+等以及蛋白质螯合成不溶性复合物，降低了动物对这些营养物质的利用。因此，开展饲用植酸酶的研究，对提高畜禽业生产效益及降低磷对环境的污染有重要意义。１植酸酶的来源及酶学性质 早在1907年Suzuki等就在谷粮中发现了具有植酸酶活性的磷酸酶。第一个纯化的植酸来源于麸皮，研究发现它虽具有植酸酶活性，但植酸并不是它特异性底物。来源于植物的植酸酶均属于６－植酸酶，最适pH范围在5.0~7.5，在单胃动物酸性的胃环境中不起作用。60年代末植酸酶的研究转向最适pH为酸性、酶含量较高的微生物来源的植酸酶。 许多微生物都能产生植酸酶，尤其在曲霉属中。1968年Shien等从68个土样中对2000个菌株进行考察发现，在所用的22株黑霉菌中有21株能产生植酸酶。第一个被分离纯化的植酸酶来源于Aspergillus terreus NO.9A-1,它的最适pH为 ４.5，最适反应温度为70℃,此酶在pH1.2~9.0均能稳定维持活性。从此以后，陆续从十几种微生物中分离得到植酸酶，其中来源于Ａ.ficcum NR-RL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶phyA具有较好的耐热性，在酸性的条件下有较高酶活性，被认为是目前最具应用前景的饲用植酸梅，其酶学性质的研究也较为深入。 植酸酶phyA属于３－植酸酶，是一种糖基化蛋白，表观分子量为85KD。它的最适pH为2.5和5.5,最适反应温度为55℃。在37℃、pH2.5的条件下，以植酸为底物的Ｋm值为50mmol,Ca2+、Fe2+对酶活性无影响,Mn2+、Co2+有激活作用，能使酶活性分别提高30%和13%。Cu2+、Zn2+、Fe2+、Cu+对酶活性有抑制作用，其中前两种为非竞争性抑制，后两种为竞争性抑制。对酸性磷酸酶有抑制作用的抑制剂如Ｌ（＋）－酒石酸对它却没有抑制作用。它是目前发现的比活性最高的植酸酶之一，它降解植酸磷形成的终产物是单磷酸肌醇和无机正磷酸。 ２植酸酶在饲料中的应用效果

培门冬酶在儿童急性淋巴细胞白血病临床应用中的安全性评估

·论著· 培门冬酶在儿童急性淋巴细胞白血病临床应用中的安全性评估 李颖宪莹苏庸春温贤浩管贤敏肖莉王玥于洁 作者单位：400014重庆医科大学附属儿童医院血液肿瘤科 通讯作者：于洁，Email ：yujie167@yahoo．com 【摘要】目的评估培门冬酶在儿童急性淋巴细胞白血病（ALL ）临床应用中的安全性。方法本研究中所有ALL 患儿都使用CCLG 2008方案规范诊治；接受培门冬酶治疗的条件是：（1）左旋 门冬酰胺酶（L- Asp ）皮试阳性；（2）L-Asp 使用后出现不良反应。先后共有32例患儿由于对大肠杆菌L- Asp 过敏而使用培门冬酶替代化疗共46次。使用培门冬酶治疗前和治疗后1周检查肝肾功能、凝血功能、淀粉酶、心肌酶谱、心电图和腹部B 超，临床观察和检测使用培门冬酶后脏器功能和不良反应发生的情况。结果46例次中无一例发生致死性不良反应。8例（17%）有转氨酶异常；总胆红素增高4例，以直接胆红素升高为主；血清总蛋白降低5例。8例（17%）有血浆纤维蛋白原 浓度异常，7例降低，临床无凝血功能障碍和血栓等表现。7例（15%）有心血管系统受累，包括血 压升高（1例）、 心率减慢（2例）、CK-MB 增高（5例）、肌钙蛋白增高（1例）、心电图异常（4例）。7例（15%）出现肾功能异常，以尿素氮增高（6例）为主，临床未发现肾功能不全的表现。3例（7%）发生高血糖症，无急性胰腺炎的病例发生。46例次培门冬酶治疗中，仅1例（2%）发生了典型的过 敏反应， 以明显的风团样皮疹伴瘙痒为主要表现，有一过性喉头异物感，经吸氧、镇静等处理后很快缓解。结论培门冬酶在很大程度上克服了L- Asp 过敏反应致使用受限的弱点；培门冬酶的不良反应发生率低，发生不良反应的程度轻，安全性较高。推荐培门冬酶作为对L- Asp 过敏的ALL 患儿的替代治疗。其疗效有待进一步观察。 【关键词】培门冬酶；急性淋巴细胞白血病；儿童；安全性 Safety assessment of pegaspargase in the clinical treatment of acute lymphoblastic leukemia in children LI Ying ，XIAN Ying ，SU Yongchun ，WEN Xianhao ，GUAN Xianmin ，XIAO Li ，WANG Yue ，YU Jie．Department of Hemooncology ，Children's Hospital ，Chongqing Medical University ，Chongqing 400014，China Corresponding author ：YU Jie ，Email ：yujie167@yahoo．com 【Abstract 】Objective To observe and evaluate the safety of pegaspargase in the clinical treatment of acute lymphoblastic leukemia （ALL ）in children．Methods All the patients in our study were treated with CCLG2008．The indications of pegaspargase is ：（1）positive skin test of L-Asp ；（2）adverse reaction after L-Asp treatment．A total of 32cases with Escherichia coli L-asparaginase allergy were treated with pegaspargase 46times instead of chemotherapy．The liver and renal functions ，coagulation ，amylase ，myocardial enzyme spectrum ，electrocardiogram （ECG ）and abdominal ultrasound were detected before and after treatment．The adverse reactions of pegaspargase was also observed．Results All the patients were treated with pegaspargase．No fatal adverse reaction was observed．Abnormal transaminase levels were · 751·中国小儿血液与肿瘤杂志2012年8月第17卷第4期J China Pediatr Blood Cancer ，August 2012，Vol 17，No．4

培门冬酶治疗ALL患者过程中的不良反应分析

培门冬酶治疗ALL患者过程中的不良反应分析 发表时间：2017-12-29T09:39:03.630Z 来源：《中国误诊学杂志》2017年第24期作者：吕丽娜 [导读] 左旋门冬酰胺酶是一种用于化疗的关键药物之一，在应用于治疗ALL患者中具有重大的意义[1]。 右江民族医学院附属医院广西百色 53300 摘要：目的：观察培门冬酶（PEG-ASP）应用于初治急性淋巴白血病患者（ALL）中，并对其不良反应发生进行分析。方法：随机选取本院自2014年12月至2016年12月间诊断为急性淋巴细胞白血病（BCR-ABL阴性）的80例成人患者作为研究对象，并根据诱导化疗中培门冬酶的用药次数将其分为培门冬酶1次组（n=40）与培门冬酶2次组（n=40），对预后差组患者应用2次培门冬酶，对预后好组患者应用1次培门冬酶，观察并记录化疗后疗效，以及治疗期间培门冬酶的不良反应发生及严重程度。结果：经VDCLP化疗后，两组疗效无显著差异（P>0.05），且所有患者均未出现较为严重的不良反应发生。结论：在诱导化疗ALL患者的VDCLP方案之中，应用1次与2次培门冬酶治疗患者均具有治疗效果，但应用2次培门冬酶不良反应较为明显。 关键词：急性淋巴细胞白血病；培门冬酶；不良反应 左旋门冬酰胺酶是一种用于化疗的关键药物之一，在应用于治疗ALL患者中具有重大的意义[1]。国内外被广泛应用的门冬酰胺酶制剂为天然大肠杆菌源性L-asp、天然菊欧文菌源性L-asp以及培门冬酶。培门冬酶是新一代的门冬酰胺酶制剂，为聚乙二醇与L-asp的共价结合物。它既保存了L-asp的活性，同时又显著的降低了L-asp免疫原性[2]与半衰期较长[3]等的特点。本次研究，通过对培门冬酶应用诱导化疗ALL患者过程中的不良反应进行观察分析，取得了满意效果，报告如下。 1 一般资料与方法 1.1 一般资料 随机选取本院自2014年12月至2016年12月间诊断为急性淋巴细胞白血病（BCR-ABL阴性）的80例成人患者作为研究对象，并根据诱导化疗中培门冬酶的的用药次数将其分为培门冬酶1次组（n=40）与培门冬酶2次组（n=40），对预后差组患者化疗过程中应用2次培门冬酶，对预后好组患者化疗过程中应用1次培门冬酶。其中男47例，女33例，年龄为22-70岁，平均年龄为（36.44±3.13）岁，按预后危险度分组预后好组40例，预后差组40例。经核实，两组ALL患者基线资料无显著差异（P>0.05），具有可比性。 1.2 方法 对所有患者进行VDCLP方案进行化疗，其中培门冬酶1次组具体方案为：应用药物长春新碱，剂量为1.4mg/m2，方式为静脉注射，应用时间为d1与d8；应用药物柔红霉素，剂量为40mg/㎡，方式为静脉注射，应用时间为d1、d2、d3；应用药物环磷酰胺，剂量为750mg/㎡，方式为静脉滴注，应用时间为d1；应用药物强的松，剂量为40mg/m2?d，方式为口服，应用时间为d1-d14；应用药物培门冬酶，2500U/（m?次），方式为肌内注射，应用时间为d7。 培门冬酶2次组具体方案为：应用药物长春新碱，剂量为1.4mg/m2，方式为静脉注射，应用时间为d1、d8、d15、d22；应用药物柔红霉素，剂量为40mg/㎡，方式为静脉注射，分别于d1、d2、d3、d15、d16、d17应用；应用药物环磷酰胺，剂量为750mg/㎡，方式为静脉滴注，应用时间为d1、d15；应用药物强的松，剂量为40mg/m2.d，方式为口服，应用时间为d1-d28，d15开始减量；应用药物培门冬酶，2500U/（m?次），方式为肌内注射，应用时间为d7、d21。 1.3 判定标准 观察并记录两组患者在化疗过程中出现的相关消化道症状、皮肤粘膜损伤及过敏等常见的不良反应。根据《血液病诊断及疗效标准》，对患者诱导缓解情况进行记录，分为完全缓解、复发以及死亡。 1.4 统计学处理 SPSS19.0处理数据，计量资料以（ ±s）计量资料以表示，行t检验，计数资料以（%）表示，行X2检验，检验标准以P<0.05为数据比对有统计学意义。 2 结果 2.1 两组疗效比较 根据结果表明，两组疗效比较无统计学差异（P>0.05），对比详情见表一。 2.2 两组不良反应比较 两组患者在接受培门冬酶治疗期间，d7、d15及d21各时间的血尿淀粉酶及血脂肪酶均为正常水平，且无胰腺炎发生。血糖检测未发现有血糖增高病例，而2次组有14例（35.00）与1次组有10例一过性低血糖（25.00）。2次组共发现有7例（17.50）恶心呕吐与4（10.00）例厌食，1次组共发现5例（12.50）恶心呕吐与2例（5.00）厌食，组间比较无显著差异（P>0.05）。 3讨论 L-ASP是通过将门冬酰胺水解为门冬氨酸与氨，从而将血浆中的Asn消耗殆尽，以此对肿瘤细胞蛋白质合成进行阻断，有效的发挥抗肿瘤效应。由于正常人细胞中含有Asn合成酶，自身能够进行蛋白质合成且不会受到血浆中Asn水平的影响[4]，因此L-ASP对正常细胞不会造

植酸酶的来源与应用1

植酸酶的来源与应用 1 植酸酶的来源 1. 1 植物来源的植酸酶植酸酶最早是在植物中发现的,早期的研究都集中在植物和动物器官中。尽管植酸酶存在于多种植物的种子和花粉中,其活性却因植物的种类不同而有很大差别, 如在豆类、谷类和油料作物中,植酸酶的活力一般都较低。许多谷物饲料中含有一定数量的植酸酶,如小麦来源的植酸酶可以使含小麦日粮中的植酸磷降解,但它们的酶活性变异很大。在机械制粒过程中小麦的植酸酶活性并未被破坏。在含豆科籽实的日粮中,鸡可以产生利用植酸的适应性,肉鸡降解植酸磷的能力受日粮钙[3]和磷[4]水平的影响,但玉米、高粱和油籽饼中的植酸酶活性很低[5] 。Viveros 等[6] 测定了24 种饲料的植酸酶活性,发现黑麦籽实的酶活性在所有谷物籽实中最高,其活性超过5 000 U/ kg ,黑小麦2 030 U/ kg ,小麦1 500 U/ kg ,而玉米胚、燕麦和高粱籽实几乎无植酸酶活性(小于100 U/ kg) 。此外,来源于植物的植酸酶多属于62植酸酶, 最适pH 值在5. 0～7. 5 , 不适合在单胃动物的酸性胃中起作用, 而且植酸酶在植物中含量较低,因而从应用角度出发,自20 世纪60 年代末植酸酶的研究转向最适pH值为酸性、酶含量较高的微生物来源的植酸酶。 1. 2 动物来源的植酸酶动物植酸酶存在于哺乳动物的红血球和血浆原生质中。比起植物和微生物植酸酶, 动物植酸酶方面的研究非常少,Patwardhan[7]首先证实小白鼠有从植酸磷释放磷的能力,从此,大量研究证实不同动物的小肠黏 膜具有植酸酶活性[8] 。植酸酶活性存在于小肠黏膜的刷状缘,十二指肠的酶活性最高。尽管在小鼠、鸡和牛的肠粘膜上植酸酶降解植酸盐的活性已得到证实,已测定了人体部分组织中植酸酶的活性,但仍不了解植酸酶在人胃和小肠中降解植酸盐的活性如何。有学者认为哺乳动物小肠中的植酸酶与碱性磷酸酶相同,因为碱性磷酸酶确实有水解植酸磷的作用,而且两种酶有类似的亚细胞分布,它们对镁、锌的依赖性以及最适pH 值也类似,两种酶的活性都受日粮因素如维生素D 或低磷水平的修饰。但是其他的一些证据又支持两种酶是不同的酶,如酶的底物依赖性不同,被苯丙氨酸和氟化钠的抑制特性不同。还有一个值得探讨的问题就是动物来源的酶是否是动物体内的微生物产生的。动物来源的植酸酶活性受动物的遗传特性和日粮营养因素的影响,如小白鼠的酶活性比兔的高[9] 。小白鼠成年后的酶活性比幼鼠的低,相反,猪和鸡则随年龄的

培门冬酰胺酶化疗的不良反应及其护理

培门冬酰胺酶化疗的不良反应及其护理 发表时间：2013-04-25T13:30:00.200Z 来源：《医药前沿》2013年第8期供稿作者：赵静徐晓军严桂芳 [导读] 培门冬酰胺酶是近年来应用于急性淋巴细胞白血病（ALL）化疗的新药。 赵静徐晓军严桂芳（浙江大学医学院附属儿童医院血液肿瘤科浙江杭州 310003） 【摘要】培门冬酰胺酶是近年来应用于急性淋巴细胞白血病（ALL）化疗的新药。本文通过对我院20例应用培门冬酰胺酶化疗的ALL患儿临床资料的回顾性分析明确护理要点。培门冬酰胺酶注射后90%患儿出现低纤维蛋白原血症，一般在注射后7天左右降至最低点。此外还可出现过敏反应、低蛋白血症、高血糖等表现，严重者出血过敏性休克。因此，培门冬酰胺酶化疗过程中应警惕过敏反应。要定期监测凝血功能、生化指标、血糖，做好饮食控制及对症支持治疗。 【关键词】急性淋巴细胞白血病培门冬酰胺酶护理儿童 【中图分类号】R473.73【文献标识码】B【文章编号】2095-1752（2013）08-0234-02 左旋门冬酰胺酶是急性淋巴细胞白血病治疗中的关键药物，对于提高患者的长期生存率具有重要作用[1]。但由于其为异种蛋白，化疗过程中需要反复应用，因此存在较高的过敏率（可达25～30%）[2]。培门冬酰胺酶（PEG-Asp）是由水溶性人工合成的化学聚合体PEG与门冬酰胺酶蛋白共价连接而成，它能有效降低门冬酰胺酶过敏反应的发生，且疗效相当[3]。本文总结了本院近半年来20例应用培门冬酰胺酶化疗的病例，对其副反应及护理措施报道如下。 1.临床资料 1.1 病例：201 2.7-2012.11在我院血液肿瘤科住院应用培门冬酰胺酶化疗的急性淋巴细胞白血病患儿20例。其中男性13例，女性7例，中位年龄7.3岁（2.1岁～15.3岁）。 1.2 应用方法：培门冬酰胺酶根据体表面积给药，剂量为2500 IU/m2，每14天应用一次。用法为肌内注射（一般选择双臀部肌肉），单一部位注射剂量应小于2ml，若使用量超过2ml，则需要多部位注射。 1.3 不良反应监测：注射后严密观察有无过敏反应表现。每日监测血糖，每周至少两次监测生化（白蛋白、球蛋白、肝功能、肾功能、淀粉酶）、凝血谱（纤维蛋白原，凝血酶原时间[PT]，活化的部分凝血活酶时间[APTT]，出血时间，D-二聚体）和血气电解质。 1.4 结果：20例患儿中，18例（90%）患儿在培门冬酰胺酶注射后1-2周内出现不同程度的低纤维蛋白原血症，15例患儿的最低水平在1.0g/L以下。纤维蛋白原一般在注射后7天左右降至最低点，虽然反复输注血浆或纤维蛋白原，但90.9%患儿的低纤维蛋白原血症持续至2周或更长时间（图1）。14例患儿出现APTT延长，5例患儿出现出血时间延长，本组患儿汇总并未出现PT延长的患儿。3例患儿出现低白蛋白血症。1例患儿出现继发性高血糖，经过饮食控制后血糖降至正常水平。3例患儿出现过敏反应，2例为皮疹，1例出现过敏性休克。本组病例未出现急性胰腺炎表现。 2.护理体会： 2.1 过敏反应： 2.1.1 药物准备：根据药物说明书，培门冬酰胺酶在注射前无需进行皮试。但临床应用过程中确实存在一定比例的过敏反应，严重者出现过敏性休克。因此在注射的时候，应准备好抢救用的药物和设备。如地塞米松等糖皮质激素类药物、肾上腺素、苏打等药物及供氧系统、吸痰器、加压面罩等设备。 2.1.2 过敏反应的观察：药物过敏反应的表现比较多样。轻者出现皮肤潮红、风团样皮疹伴瘙痒、眼睑口唇肿胀。有喉头水肿者出现刺激性咳嗽、胸闷、气急及喘憋症状。有过敏性休克者可表现为心悸、出汗、面色苍白、四肢厥冷、脉搏细速及血压下降。部分患者甚至以意识状态改变及神经系统症状为主要表现。 2.1.3 过敏反应的处理：对于单纯皮肤黏膜表现者，可根据医嘱口服非那根等抗过敏药物，外用炉甘石洗剂，继续观察有无病情进展。对于呼吸道症状者，立即给予吸氧，监测血氧饱和度，必要时根据医嘱给予激素、肾上腺素及支气管扩张剂的雾化吸入，乃至静脉应用激素及肾上腺素等抗过敏药物。对于出现过敏性休克者，应立即生理盐水扩容、静脉应用激素及肾上腺素等药物、吸氧、勤监测血压至病情缓解，并继续观察至少48小时以防病情反复。对于有过敏表现者，应常规监测血压。 2.2 凝血功能异常： 培门冬酰胺酶应用后，90%的患儿可以出现凝血功能异常，因此，需要加强凝血谱的监测，每周至少检查2次凝血谱，持续2周以上。对于单纯低纤维蛋白原血症者，可补充法布莱士或血浆，对于纤维蛋白原降低合并PT、APTT延长者，应积极输注血浆。护理过程中注意观察患儿有无鼻衄及牙龈出血、消化道及泌尿道出血、颅内出血征象。尽量减少有创操作机会，集中采血，采血后注意局部延长按压时间。但另一方面，由于门冬酰胺酶导致活性蛋白C的合成减少，从而引起纤维蛋白溶解能力下降，机体处于高凝状态，有导致深静脉血栓的风险[4]。因此，应用过程中需要测量深静脉置管附近及对侧肢体的周径，观察有无肿胀及疼痛不适。 2.3 继发性高血糖： 在化疗方案中，培门冬酰胺酶常与激素合用。因此，在应用培门冬酰胺酶前应检查血糖和/或尿糖，排除原发性糖尿病或化疗引起高血糖可能。应用过程中，每日晨起监测血糖，若 >7.0 mmol／L，立即报告医生进行必要的处理。出现血糖异常增高者，根据医嘱必要时停用化疗。一般首先采用饮食疗法进行控制，饮食应有规律，定时定量，少量多餐，控制每日摄入的热卡，宜食各种清淡新鲜蔬菜和豆类、低脂、高蛋白、适量纤维素的食物，禁忌进食辛辣刺激、油炸、食物。饮食控制不佳者，需要静脉应用胰岛素控制者。同时对于化疗后胃纳差的患儿应警惕发生低血糖。 2.4 急性胰腺炎： 临床研究表明培门冬酰胺酶应用期间胰腺炎的发生率在1.5%左右[4]。其主要的临床表现为腹痛，上腹部为主。故化疗期间应注意观察患儿有无腹部症状，必要时告知医生查血尿淀粉酶、腹部B超或CT。培门冬酰胺酶化疗期间的合理的饮食管理对于胰腺损害的预防具有重要作用。在应用培门冬酰胺酶过程中及用药前后应选择低脂蛋白、清淡易消化食物，然后逐步过渡到普通饮食。 2.5 出院宣教： 培门冬酰胺酶应用比较方便，只需一次肌注，效应可维持2周。部分病人会在化疗方案中其他药物疗程结束时选择出院，而此时培门

左旋门冬酰胺酶治疗小儿急性淋巴白血病的观察及护理

左旋门冬酰胺酶治疗小儿急性淋巴白血病的观察及护理 发表时间：2013-10-12T08:44:55.670Z 来源：《医药前沿》2013年第27期供稿作者：王娟 [导读] 10例患儿有1例会出现过敏反应，4例胃肠道反应，2例肝功能损害，6例骨髓抑制，2例皮肤粘膜损害，无其它不良反应。王娟（山东省枣庄市市中区枣庄市立医院内六科 277100） 【摘要】观察左旋门冬酰胺酶治疗急性淋巴白血病毒副作用并实施有效护理。方法对10例小儿急性白血病患者进行门冬酰胺酶药物化疗，门冬酰胺酶是治疗急性淋巴细胞白血病关键药物之一，并能提高疾病缓解率和患儿生存率但存在毒副作用。结果本组患儿病情缓解有效延长生存期。结论对应用左旋门冬酰胺酶的得患儿形精心护理，是减少毒副作用的主要措施。 【关键词】白血病急性左旋门冬酰胺酶毒副作用护理 【中图分类号】R473.72 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2013）27-0303-02 门冬酰胺酶是治疗急性淋巴性白血病的关键药物之一，在提高儿童急性白血病的持续完全缓解起着重要作用，并与ALL患儿的无病长期存活有着密切关系，但是门冬酰胺酶有多方面不良反应，如坏死性胰腺炎、血糖升高、血液系统异常、消化道反应、门冬酰胺酶相关脑病、过敏反应等。现我院血液科至2010年1月—2011年6月对10例患儿采用门冬酰胺酶治疗ALL进行观察及护理现报告如下： 1、资料与方法 1.1 临床治疗与方法：本组男4例、女6例，年龄3-10岁，平均6.5岁，10例均为两次使用门冬酰胺酶，均在诱导缓解巩固治疗阶段后，骨髓化验检查完全缓解后应用门冬酰胺酶治疗。 1.2 方法：于巩固治疗1—3周，血常规、尿常规，肝肾功能正常后经行10天一疗程。 2、结果 10例患儿有1例会出现过敏反应，4例胃肠道反应，2例肝功能损害，6例骨髓抑制，2例皮肤粘膜损害，无其它不良反应。 3、护理 3.1 心理护理：注射前医生与家属应进行沟通将门冬酰胺酶治疗的重要性及可能发生的不良反应告知家属，征得同意后方可进行，此时患儿及家长缺乏相关知识认识有局限性。尤其是儿童心理独特性在化疗过程中护士要体贴患儿及家属做好耐心细致的解释工作，分散患儿注意力与患儿交谈消除患儿恐惧，陪伴看图书，鼓励患儿及家属表达其情绪并耐心解答他们提出的相关问题，树立患儿及家属治疗的信心，并安排患儿信赖熟悉有良好沟通技巧的护士进行护理，使患儿对护士产生信赖感。 3.2 病情观察：门冬酰胺酶溶液是一种酶类制剂易容起变态反应。首先要严格执行无菌操作，正确配制皮试液现配现用，准确判断门冬酰胺酶皮试结果，每次门冬酰胺酶注射剂量严格标准执行，不能够过量，准确及时调节滴速，严密观察患儿病情变化及患儿反应，用药开始20分钟内有专门护士守护在床边进行观察，如无不良反应以后每15-20分钟巡视一次护士要与患儿沟通。听取不适主诉，询问时尽量不使用暗示性语言如是否感到心慌、胸闷、憋气、瘙痒等。主要通过客观表现观察患儿的过敏症状，观察患儿生命体征变化，如若出现皮肤发痒、心慌、面色苍白、烦躁不安等症状要立即停药，通知医生及早处理。因此用药后密切观察患儿病情变化以防过敏反映的发生。 3.3 皮肤粘膜损害：应用门冬酰胺酶化疗时如若多次注射或药物外渗会引起静脉炎或皮肤坏死固应注意：（1）保护血管：首先要选择大血管使用BD小号静脉留置针以防患儿易动而引起血管损伤，安排穿刺技术精湛，患儿信赖熟悉的护士给予穿刺，确保一次成功。静脉注射时要先用生理盐水冲洗，确定针头位置完全在静脉内方能注射药物。如果出现或疑有外渗，应立即停止注射并迅速回抽，由原位抽取3ml 血液后局部冷敷，然后用25%MgSO4湿敷，以防发生坏死，应用L-Asp化疗后引起口腔黏膜损害的要交替使用双氧水，洗必泰和制霉菌素护理口腔感染疗效好，能有效抑制口腔溃疡发生。 3.4 胃肠道反应：本组患儿有4例不同程度地恶心、呕吐和演示，要安慰患儿，分散患儿注意力，与患儿交谈，看图画书，用和蔼的语言与患儿交流（给患儿家属饮食指导，配合工作）用药前给予胃复安类药物静滴，较重者使用止吐剂口服恩丹西酮片或静推恩丹西酮。指导家属注意饮食卫生，少食多餐，宜进清淡、新鲜、少渣，刺激性小的饮食，勿进甜食和易产气食物如牛奶成豆制品等，进食前后休息一段时间，当患儿恶心、呕吐的不要让其进食。 3.5 肝功能受损，L-Asp对肝功能有损害作用，本组有2例用药后一至二月转氨酶升高，因此用药时应观察患儿患儿有无黄疸，用药前要检测肝功能，转氨酶偏高者慎用或不用，鼓励患儿饮水利于毒素排出，并使用护肝药物如甘利欣或谷胱肝肽等药物治疗，本组两例经治疗后肝功能恢复正常。 3.6 骨髓抑制：任何化疗药物均可引起，多数化疗药物抑制骨髓至最低点时间为7～14天，护肤时间为之后的5～10天，要将患儿安排在单人房间，限制过多谈事，保持环境舒适、安静，每天给予空气流通、紫外线消毒病室，从化疗开始到停止化疗2周应加强消防感染和出血措施，护理人员在操作时要严格无菌操作化疗中必须定期查血常规，每次疗程结束必要时做骨髓穿刺，及时观察疗效及骨髓受抑制情况，但白细胞<2.0X109/L，血小板<300×109/L时应给予提升白细胞药物，并加强营养。 参考文献 [1]贺秋平，张春霞.小儿左旋门冬酰胺酶过敏反应的抢救与护理8例，中原医刊，2005，32（22）：93. [2]卢愿，孙立荣，吕淑华等.左旋门冬酰胺酶的副作用及处理（附43临床病例分析），中国小儿血液，2004，9（1）：25-27.

注射用左旋门冬酰胺酶

注射用左旋门冬酰胺酶 【药品名称】 通用名称：注射用左旋门冬酰胺酶 英文名称：L-Asparaginase for Injection 【成份】 LEUNASE注，系1瓶中含左旋门冬酰胺酶冷冻干燥品5000K.U.临用时溶解的注射剂。LEUNASE注，系1瓶中含左旋门冬酰胺酶冷冻干燥品10000K.U.临用时溶解的注射剂。（1K.U.是指LEUNASE在37C分解左旋门冬酰胺并在1分钟产生μmole时的量。）【适应症】 急性白血病（包括慢性白血病的急性转化例）、恶性淋巴瘤。 【用法用量】 通常，将1日量每公斤体重50-200 KU连日或隔日静脉滴注。应随年龄及全身状态适宜增减。 【不良反应】 成人似较儿童多见。1较常见的有过敏反应、肝损害、胰腺炎、食欲减退等，过敏反应的主要表现为突然发生的呼吸困难、关节肿痛、皮疹、皮肤瘙痒、面部水肿。严重者可发生呼吸窘迫、休克甚至致死。在用肌注给药的晚期儿童白血病，虽其轻度过敏反应的发生率较高，但有报告认为其严重过敏反应的发生率较静注给药为低。过敏反应一般在多次反复注射者易发生，但曾有在皮内敏感试验(简称皮试)阴性的患者发生。另在某些过敏体质者，即使注射做皮试剂量的门冬酰胺酶时，偶然也会产生过敏反应。肝脏损害通常在开始治疗的2周内发生，可能出现多种肝功能异常，包括血清丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、胆红素等升高、血清白蛋白等降低，曾有经肝穿刺活检证实有脂肪肝病变的病例。患者如感觉剧

烈的上腹痛并伴有恶心、呕吐，应疑有急性胰腺炎，其中暴发型胰腺炎很危重，甚至可能致命。其他尚有食欲减退、恶心、呕吐、腹泻等。2少见的有血糖过高、高尿酸血症、高热、精神及神经毒性等。血糖过高患者有多尿、多饮、口渴症状，其血浆渗透压可能升高而血酮含量正常。高血糖经停用本品，或给适量胰岛素及补液可以减轻或消失，但少数严重的可以致死。高尿酸血症常发生在开始治疗时，由于大量肿瘤细胞快速破坏，致使释放出的核酸分解的尿酸量增多，严重的可引起尿酸性肾病、肾功能衰竭。取自大肠杆菌的门冬酰胺酶含的内毒素可引起高热、畏寒、寒战，严重的甚至可致死。精神及神经毒表现为程度不一的嗜睡、精神抑郁、精神错乱、情绪激动、幻觉，偶可发生帕金森综合征等。其他尚有白细胞减少、免疫抑制、口腔炎等。3罕见的有低纤维蛋白原血症、凝血因子Ⅴ、Ⅷ等减少、颅内出血或血栓形成、下肢静脉血栓及骨髓抑制等。凝血因子减少与本品抑制蛋白质合成有关。4其他：尚有血氨过高、脱发等。对出现的不良反应的性质要仔细分析，凡有可能引起严重后果的，应立即停用本品，并结合具体表现给相应的治疗措施，危急的要积极抢救。食欲不振，恶心，呕吐，腹泻，头晕，头痛，嗜睡，精神错乱.血浆蛋白低下和血脂质过高或过低，氮质血症和肝功损害。骨髓抑制，白细胞及血小板减少，贫血，凝血障碍，局部出血，感染等.有心血管系统症状，脱发，蛋白尿。个别可发生胰腺炎。可引起过敏反应，用前须作皮试。本品可引起过敏反应，且可发生于最初疗程，皮试并不能完全预测过敏反应的发生。反应包括：皮疹、荨麻疹、关节炎、呼吸窘迫等，半数患者可出现骨髓抑制症状。其他副作用包括发热、出血、消化道反应、肝肾功能损害、胰腺功能障碍、精神神经症状等。因可出现过敏反应，初次使用及经1周或1周以上间隙再次使用时，均应作皮内试验。皮试阳性反应者作初次治疗以及对过敏反应属高危对象而仍有必要再次使用本药作重点治疗者，给予首剂前均应进行脱敏。一旦发生过敏应即用肾上腺素、吸氧和静注类固醇。用此酶治疗期间有发生各种感染的危险性，特别是革兰阴性菌感染增多。

酶制剂——植酸酶

酶制剂——植酸酶 早在1915年，Anderson提出天然植酸磷利用率不同于化学分离纯化产品的一个可能原因是饲料成分中存在水解植酸磷为无机磷的酶——植酸酶，并对植酸酶的来源、理化特性及作用机理进行了研究，从而引起了许多学者的广泛关注。近年来，随着发酵工程和生物技术的迅速发展以及人们环境保护意识的提高，采用DNA重组技术使微生物产生植酸酶活性大幅度提高，大大降低了植酸酶生产成本，从而使之得到广泛应用。植酸酶现已成为饲料酶制剂研究的一个热点，尤其在一些畜禽饲养密度大、环境污染严重的国家如美国、加拿大、芬兰、荷兰、法国、瑞士等。许多科学家对这一课题的研究很感兴趣，欧洲、北美和其它地区对此的兴趣也与日俱增。1994年欧共体、美国、芬兰、丹麦、德国等国的生产企业均前后推出各种植酸酶制剂,并利用DNA重组技术获得生产植酸酶的工程菌,为广泛应用植酸酶提供了可能。 一、植酸酶结构及性质 植酸酶，又称为肌醇六磷酸水解酶，是一种可使植酸磷复合物中的磷变成可利用磷的酸性磷酸酯酶。植酸酶广泛存在于动植物组织中，也存在于微生物（细菌、真菌和酵母）。目前分离出的植酸酶主要有两种：3-植酸酶（EC 3.1.3.8）和6-植酸酶（EC 3.1.3.26），前者最先水解的是肌醇3号碳原子位置的磷酸根，主要存在于动物和微生物；后者最先水解的是6号碳原子的磷酸根，主要存在于植物组织。因此，动物胃肠道可能有三种来源的植酸酶，但主要来源于饲料本身以及来源于微生物合成。 大量高浓度的植酸酶主要存在于无花果曲霉和黑曲霉与小麦麸的培养物中。因此饲料植酸酶的生产目前主要使用微生物曲霉菌株。霉菌植酸酶分子量一般在60 ~ 100KDal之间，曲霉植酸酶分子量较大。如土曲霉为214Kdal，无花果曲霉为85 ~ 100KDal，黑曲霉为200KDal。细菌植酸酶分子量一般较小，如大肠杆菌为42Kdal，枯草杆菌为38KDal。霉菌植酸酶通常有一个最适pH，在4.2 ~ 5.5范围内。细菌植酸酶最适pH稍高一些。据报道,某些霉菌植酸酶，特别是曲霉植酸酶具有多个最适pH值。酶的最适温度因酶来源不同而有差异。霉菌植酸酶适宜温度通常在45 ~ 57℃范围内，黑曲霉为53℃，无花果曲霉为55℃。

重组门冬酰胺酶表达制备纯化方法

重组门冬酰胺酶Ⅱ的表达纯化与分析 【引言】 左旋门冬酰胺酶(Lasparaginase, L SP) 是淋巴系统恶性肿瘤化疗方案中的一个很主要的药物,应用日趋广泛。然而,L SP 可产生多种毒副作用,包括急性胰腺炎、药物性糖尿病、过敏反应、凝血功能障碍、肝功能损害等,在一定程度上限制了L SP 的临床应用,尤其对于曾出现上述不良反应的患儿的后续治疗还能不能再用L SP,就成为一个急需解决的问题。 目前国内所有化学治疗中应用的EC II 主要是依赖进口, 完成表达EC II 的基因工程菌株构建, 并逐步进行EC II 的工业化生产, 对于国内ALL 的临床化疗有积极意义。为此, 我们克隆了EC II 的基因, 在大肠杆菌中获得了高效表达, 并探讨了其突变复性及后续纯化 的简便方法。国内亦开展了类似的工作。 【目的要求】 1．了解基因工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白及表达酶蛋白纯化、分析鉴定的基本原理。 2．掌握以基因工程菌种pANS2为材料进行工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白重组门冬酰胺酶Ⅱ及表达酶蛋白制备和酶活力测定、SDS-PAGE电泳分析鉴定的工作原理和技术方法。 【实验原理】 L-门冬酰胺酶(L-asparaginase，3.5.1广泛存在于动物的组织、细菌、植物和部分啮齿类动物的血清中，但在人体的各种组织器官中的分布未见报道。L-门冬酰胺酶活性形式为一同源四聚体，每一亚基由330个氨基酸组成，分子质量为34 564u，能专一地水解L-门冬酰胺生成L-门冬氨酸和氨。由于某些肿瘤细胞缺乏L-门冬酰胺酶合成酶，细胞的存活需要外源L-门冬酰胺的补充，如果外源门冬酰胺被降解，则由于蛋白质合成过程中氨基酸的缺乏，导致肿瘤细胞的死亡。因此，L-门冬酰胺酶是一种重要的抗肿瘤药物，多年来一直是小儿急性成淋巴细胞性白血病(Acute Lumphoblastic Leukaemia,ALL)和淋巴肉瘤(Lymphosarcoma)临床化疗中重要的配伍药物之一。 用微生物，特别是大肠杆菌来生产L-门冬酰胺酶已有广泛深入的研究。大肠杆菌能产生2种天冬酰胺酶，即L-门冬酰胺酶Ⅰ和L-门冬酰胺酶Ⅱ，分别由其染色体上基因ansA和ansB 编码。只有L-门冬酰胺酶Ⅱ才有抗肿瘤活性。美、德、日均有L-门冬酰胺酶Ⅱ商品出售。我国天津生化厂曾于1974年投产，后因菌种退化，产量降低而停产。国内目前用药全靠进口。1995年，本院构建了高效分泌表达L-门冬酰胺酶Ⅱ的基因工程菌，重组L-门冬酰胺酶Ⅱ(rL-ASPⅡ)在大肠杆菌细胞中合成后分泌到细胞周质中。表达的rL-ASPⅡ相对分子质量为138 356 Da，pI为，紫外最大吸收值在278nm处。 本实验以此工程菌为材料采用蔗糖溶液渗透振扰提取法和酶解法联用提取周质中的rL-ASPⅡ，再用硫酸铵分级沉淀、DEAE-52阴离子纤维素交换层析等步骤提取和纯化，得到较高纯度表达产物rL-ASPⅡ。并对rL-ASPⅡ进行酶活力分析和12%SDS-PAGE电泳分析。 rL-ASPⅡ酶活性的测定参照Peterson的方法修订。取1 mol/L L-门冬酰胺，1 ml mol/L 硼酸-硼酸钠缓冲液，ml细胞悬液或酶液于37℃保温15 min，速加1 ml 50%三氯乙酸终止反应，4 000 r/min离心沉淀细胞。取上清液1 ml，加奈氏试剂2 ml和双蒸水7 ml，放置15 min 后，于500 nm波长比色。在上述规定条件下，将每分钟催化L-门冬酰胺水解释放1μg分子氨所需的酶量定义为1个酶活力单位（OD500=时为1 U）。

植酸酶

植酸酶的研究 一：植酸酶的概念 植酸酶又称肌醇六磷酸水解酶，是一种能降解植酸及其盐类的酯酶，属于蛋白质，是磷酸单脂水解酶。其具有特殊空间结构，能够依次分离植酸分子中的磷，将植酸（盐）降解为肌醇和无机磷，同时释放出与植酸（盐）结合的其他营养物质。 二：植酸酶的发现 植酸酶广泛存在于动物、植物和微生物中，而植物、动物中的植酸酶含量低，所以人们对植酸酶的研究重点转向了酶含量较高的微生物。 目前市场所售植酸酶制剂绝大多数属于微生物植酸酶。自然界中许多微生物（丝状真菌、酵母和细菌等）都能产生植酸酶，尤其是米曲霉和黑曲霉都能分泌具有高活力的植酸酶。 三：菌种选育 以黑曲霉霉菌为例从中得到植酸酶： 1.) 采样：可以从植株、果实中采样。 2). 产植酸酶菌株的分离筛选 分离培养基（%）：植酸钙0.1，葡萄糖3.0，硝酸铵0.5，硫酸镁0.05，硫酸锰0.005，硫酸亚铁0.005，氯化钾0.05 分离样品稀释后涂平板，一定温度培养2—5天，产植酸梅的菌株水解植酸钙形成透明圈，以透明圈与菌落直径之比为粗筛的依据。粗筛菌株发酵，测定发酵产物植酸酶的活性，保留活性高的菌株进一步研究。 3). 产酶菌株的诱变 采用紫外线照射对分离菌株进行诱变，将诱变后的菌体做适当稀释后涂布于平板上，培养2—3d后，挑取单菌落接种到活化斜面上，用摇瓶进行初筛和复筛。 细胞破碎提取粗酶液，适当稀释后测酶活（植酸酶活性单位定义：37摄氏度，pH5.5的条件下，1分钟从底物释放1mol无机磷所需要的植酸酶量）。 4). 产酶条件优化 （1）原料配比对产酶的影响麸皮和米糠为畜禽常用的饲料，具有来源广泛价廉等特点，同时还富含植酸盐，对植酸酶的产生有一定的诱导作用。用不同比例麸皮和米糠混合物配制发酵培养基，接种后培养96h，测其酶活。 （2）起始pH值对产酶的影响选用不同起始pH值（4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0）发酵培养基，接种后培养96h，测其酶活。 （3）培养温度对产酶的影响在不同温度（25,30,35,40,45摄氏度）下接种培养96h，测其酶活。 (4)培养基含水量对产酶的影响培养基加水量选用10个（40,45,50,55,60,65,70,75,80,85%）梯度，接种后在30摄氏度培养96h，测其酶活。 （5）硫酸铵的流加量对产酶的影响在发酵过程中采用流加硫酸铵的形式补充一定的N 源 四：酶的提取及分离纯化 1）提取方法：

门冬酰胺酶的制备与分析

重组天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定 赵雅嫱黄妤璠龙益如王敏敏白华山 1 原理 本实验主要是利用基因工程手段构建L-天冬酰胺酶基因工程菌。L-天冬酰胺酶的生理作用主要体现于其抗癌抗肿瘤活性，特别是对非霍奇金淋巴瘤和ALL 的有很强的抑制作用，目前适用于治疗黑色素瘤、非何杰金病淋巴瘤等，也可以用于治疗急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病等。 目前，我国虽已投入生产L-天冬酰胺酶，但是较国外生产成本高、菌种产酶活性低，提取纯化工艺落后。针对这些问题，本实验对大肠杆菌重组L-天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定进行了系统性的探究，意图改进重组L-天冬酰胺酶的表达，优化其纯化工艺，分析其鉴定方法与性质。 本实验主要进行了重组克隆载体和表达载体构建、表达与鉴定的摸索；酶蛋白的诱导表达条件分析；酶蛋白分离纯化手段的比较和选择，如蔗糖溶液提取、硫酸铵分级沉淀、CM-Sephadex和DEAE-Sepharose离子交换层析以及亲和层析；重组蛋白酶活力监控与本底蛋白活力测定等等。 2 实验材料 实验仪器见表1.1。型号和生产厂家根据实验室现有条件核定。 表1.1 实验仪器或装置 仪器名称型号生产厂家 超净工作台 PCR扩增仪

恒温培养箱 超低温冰箱 台式离心机 恒温摇床 涡轮振荡器 高压灭菌锅 蛋白电泳仪 核酸电泳仪 凝胶成像仪 紫外分光光度计 高效液相色谱仪 扫描型紫外分光光度 计 制冰机 超声清洗机 实验试剂和材料见表1.2。材质或规格以及来源根据实验需求以及实验室现有条件核定。 表1.2 试剂和材料 试剂或材料材质或规格来源 E.coli 野生型菌株CPU21009 实验室储存 pMD18-T 50ng/μl 宝生物工程有限公司 pET-22b 50ng/μl 宝生物工程有限公司 Nde Ⅰ10U/μl 宝生物工程有限公司 Xho Ⅰ10U/μl 宝生物工程有限公司T4 DNA Ligase 350U/μl 宝生物工程有限公司 DNA纯化试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司Ni-NTA树脂纯化试剂盒离心柱型天根生化科技（北京）有限公司