最新高效液相色谱使用方法

最新高效液相色谱使用方法

一、流动相准备

将流动相按比例混合，注意混合的流动相必须相互溶解，最好能将流动相混合在一起，若相互溶解性不好，可分成两种。流动相配好后，将管路放入，注意不要将瓶口密封。

二、开机

首先将真空泵打开，待泵的指示灯由黄变绿打；

打开600泵开关，按Direct键，进入操作菜单。

三、抽气

抽取管路A液体：先将注射器旋转插入，将旋钮由Run转至 Draw,抽液，完成后将旋钮由Draw至Run，再将注射器旋转取下，反复1-2次，抽至管路内无气泡。

抽取管路B液体：在泵操作菜单上将B设为100%，给0.2ml/min的流速，听到泵转换的声音后，将流速设为0，以抽取管路A的步骤进行抽气。

四、调节流动相比例与流速

在泵操作菜单上设定流动相比例，并以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml/min的速度逐步升高流速，每次间隔3-5分钟。

五、2410示差检测器的使用

1、打开2410示差检测器开关

2、调整检测器内、外温度

3、实验前一天晚上，使用“purge”状态平衡过夜，若第二天还要做实验，结束工作后不关机，节省第二天的平衡时间，保持0.2ml/min的流速。

六、2487紫外检测器的使用

1、打开2487示差检测器开关，机器自动进入自检过程，约需7分钟。

2、设置检测波长

3、预热30分钟左右，即可注样测定。

试验四、番茄内源激素高效液相色谱法测定

一、样品准备

取新鲜番茄根、茎、叶5克左右，液氮冷冻，放入冰箱储存。配80％甲醇，冰箱冷冻。

二、提取

样品放入预冷研钵，加l0ml 80％的冰冻甲醇研磨至匀浆，转入小烧杯中，再用甲醇清洗研钵2次，每次l0ml，转入小烧杯中。小烧杯放入冰箱(0～4℃)冷藏14小时以上。

三、过滤

取出用漏斗滤纸过滤，并用10m180％甲醇清洗残渣，合并滤液；如果提取液中沉淀物或色素多，则用10000g离心l0~12min，上清液转入冻干瓶中。

四、浓缩

将冻干瓶中的液体用减压蒸干机蒸干(至瓶中液体结冰)，然后用2m1 80％的甲醇冲洗，如果有浑浊物，再次用离心机12000g离心l0min，倒入带有刻度的试管中，为保证试管中的液体有5ml左右，将不足5ml的试管中再加入一些甲醇。

五、萃取

提取液中加入等量石油醚萃取，用力振荡，待静止分层后，用胶头滴管吸取上层液体弃去，此过程反复进行，直至醚层不再有颜色。

六、过柱纯化

萃取脱色后液体吸入针管，通过C18小柱滤除色素，用1~2m1甲醇清洗小柱一次，若滤出色素，将液体吸回，用新小柱重新滤一次（小柱使用前要用甲醇浸泡，用后再用甲醇反复冲洗，再浸泡）。

七、二次浓缩

液体转入蒸发皿中，60℃蒸干，用lml甲醇洗脱。

八、过滤

0．45um滤膜过滤，滤液收集到小瓶中，冷冻待测定。

九、测定与计算

用标样做标准曲线，分别为10，50，100，200，500mg／ml。进样量为20ul。

测定条件：流速为lml／min，柱温设定为35℃，测定波长为260nm，流动相甲醇：3％乙醇＝45：55

计算：通过曲线计算样品中激素浓度。

试验五、葡萄糖、果糖、蔗糖含量的HPLC测定

一、取样

称取样品（番茄(甜瓜)果肉重1～2 g、叶肉（无大叶脉）2g）→置于试管（带玻璃试管塞）→倒入80％乙醇，浸没样品约1cm→80℃水浴1h→冷却后封存。

二、提取

倒出乙醇提取液入25ml容量瓶→再向试管中加入80％乙醇，80℃水浴1h，如此反复提取次→合并提取液后定容

三、浓缩

取10-25ml溶液，加入蒸发皿中，放置在水溶锅上蒸干备用。

四、过滤

用1ml超纯水将蒸发皿中的糖全部溶解，吸入1ml注射器，过0.45μm滤膜。若样品色素较多，需通过C18小柱进行脱色，然后再过滤。

C18小柱使用方法：

C18柱：甲醇（5ml）-----乙醚（5ml）-------80%乙醇（5ml）-----样品--------80%乙醇（样品量的二倍）------乙醚-------80%乙醇-----样品--------80%乙醇

五、HPLC测定

测定方法及色谱条件为：Water 600E高效液相色谱，碳水化合物柱，柱温30-35℃，2410示差检测器，流动相比例为75％乙腈：25％超纯水，流速为1.0ml min-1,Water Millennium软件控制及数据处理。

试验六：蔗糖代谢酶的测定

一、试剂的配置（先溶解、快到1升时调PH值）

1、50m M HePes—NaOH(PH7.5)缓冲液体系配置(1升)

50 m M HePes：11.9150g

NaCl:16.0 g

kCl::0.74

Na2HPO4.12H2O:0.543

葡萄糖：2

1m M EDTA:0.3722

10 m M MgCl:2.0330

2.5 m M DTT :0.3856 ()

10 m M Vc 1.7614

2 、PVPP:固体

3、0.1M NaHPO4-柠檬酸（PH4.8）

0.2M NaHPO4（35.8/500ml 9.86ml ）

0.1M柠檬酸(21.01g/L 10.14ml )

4、0.1M NaHPO4-柠檬酸PH：7.2

0.2M NaHPO4 17.39 ml

0.1M柠檬酸 2.61 ml

5、0.1M蔗糖：3.4229g定容至100 ml

6、2N NaOH:8g NaOH定容至100 ml

7、30%HCl:39.5ml浓HCL加入到10.5 ml 水中

8、0.1%间苯二酚：95%乙醇+0.1 g 间苯二酚定容至100 ml

9、0.05M F-6-P

0.2020g F-6-P+5 ml0.1 N HCl + 数滴10%K2SO4至白色沉淀不在形成，10000g离心10分钟，弃沉淀，上清夜+1N NaOH调PH=7.0 10 ml

10、UDPG：0.205g/25ml

11、Tris:0.1M ,仅是Tris，无盐酸

12、5 nM MgCl2

13、0.1N HCl:0.862 ml HC定容至100 ml

14、0.05M 果糖。

15、DNS试剂

将6.3 gDNS和262ml 2 M NaOH溶液，加到500 ml含有185g酒石酸钾钠的热水混液中，在加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000 ml，贮于棕色瓶中备用。

二、样品测定

.1g样品冰浴研磨(加少量石英沙) 匀浆四层纱

+ 0.5g pvpp + 3mlHePES + 3mlHEPES + 4mlHepes

布过滤12000g(4℃) 弃沉淀上清夜+6.0g硫酸铵(放置15分钟)

20分钟

使之完全溶解12000g(4℃) 弃上清夜 3mlHepes溶解沉淀移到透析

20分钟

袋中用稀释10倍的Hepes(不含pvpp )4℃培养箱中透析20小时(以上操作均在

0～4℃下进行)

㈠、酸性,中性转化酶的测定(μmol Glucos e·h-1·g-1FW)

⒈①酸性转化酶

0.6ml(0.1M Na2HPO4柠檬酸PH4.8 + 0.2ml(0.1M蔗糖) + 0.2ml酶提取液(透析后的)

②中性转化酶

0.6ml(0.1M K2HPO4柠檬酸PH7.2 + 0.2ml(0.1M蔗糖) + 0.2ml酶提取液(透析后的)

⒉总体积为1ml(放在小离心管中)

37℃孵育30分钟后转到试管中+1ml蒸馏水+1.5ml 3,5-二硝基水杨酸（DNS）

空白2ml蒸馏水

沸水浴5分钟流水冷却每管中加21。5ml蒸馏水520nm比色。

㈡、蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶的活性测定(μmol Sucros e·h-1·g-1FW)

⒈①蔗糖合成酶

0.1ml(0.05M F6P)+0.1ml(0.0082 g/ml UDPG)+0.1ml(0.1M Tris)+0。1ml(5mM MgCl2)+0.2ml酶液

②蔗糖磷酸合成酶

0.1ml(0.05M F6P)+0.1ml UDPG+0.1ml(0.1M Tris)+0。1ml(5mM MgCl2)+0.2ml酶液

⒉上述反应在37℃保温30分钟 100℃水浴1分钟定容至1ml

调零1ml蒸馏水

+0.1ml(2N NaOH) 沸水浴10分钟流水冷却转到试管中+3.5ml(30%HCl)

+1ml(0.1%间苯二酚)（用95%乙醇溶液）摇匀80℃水浴10分钟流水冷却480nm比色

蔗糖标准曲线配制

每支试管中+0.1ml(2N NaOH) 沸水浴10分钟流水冷却+3.5ml(30% HCl) 1ml(0.1%间苯二酚) 摇匀80℃水浴10分钟流水冷却540nm比色

Waters_2695_型高效液相色谱仪操作方法

Waters 2695 型高效液相色谱仪操作方法 1 仪器组成及开机 1.1 仪器组成本仪器由Waters 2695 分离单元、2996型二极管阵列检测器、2420蒸发光散射检测器、色谱管理工作站和打印机组成。 2695 分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机（或氦气脱气机），可容纳120 个样品瓶的自动进样系统，柱温箱，内置的柱塞杆密封垫清洗系统，溶剂瓶托盘，液晶显示器，键盘用户界面及软盘驱动器。 1.2 开机依次接通2695 分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。接通2695 分离单元后，约20s 仪器开始自检，约1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化，待主屏幕上方标题区出现“Idle ”时，仪器进入待命状态。 2 溶剂管理系统的准备 2.1 流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按【Menu/Status 】，进入“Status （1 ）”屏幕，光标选“Degasser ”，按【Enter 】，显示选项屏幕，光标下移选“Continuous ”，按【Enter 】。 2.2 启动溶剂管理系统 2.2.1 干启动，当溶剂的管路是干的或是需要更换溶剂时，在“Status （1 ）”屏幕下，按【Direct Function 】，光标选“Dry Prime ”，按【Enter 】，显示“Dry Prime ”屏幕，按欲启动的溶剂管路的屏幕键，如【OpenA 】，光标选“Duration ”，按数字键输入5min ，按【Continue 】，待限定时间结束后，重复操作，使实验所需的各溶剂管路均启动、排气并充满流动相。 2.2.2 湿启动在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Compomtion ”中欲使用的流动相，输入10 0％，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，按【Enter 】，显示“Wet Prime ”屏幕，输入7.5Ml/min 和6min ，按【OK 】，待限定时间结束后，对每种流动相重复操作。 2.2.3 平衡真空脱气机在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Composition ”，输入流动相的组成，按【Enter 】再用光标选“Degasser ”中的“Normal ”，按【Enter 】，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，输入0.000mL/min 和10min. ，按【OK 】。待限定时间结束后，按【Abort Prime 】。 3 样品管理系统的准备 3.1 冲洗自动进样器在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Composition ”，输入流动相的组成。按【Direct Function 】，光标选“PurgeInjector ”，按【Enter 】，显示“Purge Injector ”屏幕，输入“Sample Loop Volumes 6.0 ”，光标下移“Compression Check ”，按任意数字键，按【OK 】。 3.2 冲洗进样针在主屏幕下，按【Diag 】，显示“Diagnositcs ”屏幕，按【Prime Ndl Wash 】，显示“Prime Needle Wash ”屏幕，按【Start 】，30s 内应见溶剂从废液排放口流出。按【Close】、【Exit 】。 3.3 冲洗柱塞杆密封垫在主屏幕下，按【Diag 】，显示“Diagnosities ”屏幕，按Prime Seal Wash ，显示“Prime Seal Wash ”屏幕，按【Start 】，待排放口有水流出，按【Halt 】、【Close】、【Exit 】。 3.4 装入样品与转盘将样品瓶插到样品盘合适的位置，打开样品仓门，显示“Door is Open ”屏幕，装入样品盘，按【Next 】，直至所有样品盘装毕，关仓门。 4 编辑分析方法及执行样品分析表 在主屏幕下，按【Develop Methods 】，显示“Methods ”屏幕。 4.1 编辑分析方法 4.1.1 建立新的分离方法在“Method ”屏幕下，按【New 】、【Separation Methods 】，输入方法名，按【Enter 】，显示分离方法屏幕，该屏幕共有6 页，通过按【Next 】或【Prev 】切换。如需设定梯度，在第（ 1 ）页按【Gradient 】，输入后按【Exit 】；如需设定色谱柱的温度，在第（ 4 ）页输入后按【Exit 】；在第（6 ）页设定检测器的种类，光标选“Absorbance Detector ”，按【Enter 】，光标选“48 6﹨2487 ”，按Abs （1 ）图标，设定检测波长，按【OK 】、【Exit 】、【Save 】。 4.1.2 编辑已建立的分离方法在“Methods ”屏幕下，光标选欲编辑﹨修改的分离方法的图标，按【Edit 】，编辑\ 改各种分析参数，按【Exit 】、【Save 】。 4.2 编辑执行样品分析表 4.2.1 建立新的样品组在“Methods ”屏幕下，按【New 】、【Sample Set 】，输入样品组名，按【Enter 】，显示方法组屏幕，在样品组表中输入待分析样品的信息。在“Vial ”中输入样品放置的位

高效液相色谱仪使用注意事项[1]全解

岛津液相色谱仪使用注意事项 1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。 2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。 3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。 4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。 5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。 6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。 7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。 8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。清洗方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗；⑧用10％稀硝酸清洗。 9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。 10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。 11.要注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。 12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。 液相色谱柱使用经验谈 色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。 1、样品的前处理： a、最好使用流动相溶解样品。 b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。 c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。 流动相的配制 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点： a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。 b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。

高效液相色谱仪操作步骤

高效液相色谱仪操作步骤： 1)．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜(0.45um)。 2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3)．打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 4)．进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。 5)．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。 6)．调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。 7)．设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。 8)．进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 9)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。 10)．填写登记本，由负责人签字。 注意事项： 1)．流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。 2)．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。 3)．所有过柱子的液体均需严格的过滤。

高效液相色谱方法的验证

高效液相色谱方法的验证 ?方法验证的目的 ?方法验证的内容 ?方法验证的项目及测定方法

方法验证的目的 目的：证明采用的方法适合相应检测的要求。 方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案，有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。

方法验证的内容 ?准确度 ?精密度 ?专属性 ?检测限 ?定量限 ?线性和范围 ?耐用性

准确度 定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。一般用回收率%表示。 1. 主成分含量测定 原料药：对照品或方法比对 2. 制剂、中药：标准加样回收 杂质定量 测定：加样回收（n 3 9） 杂质对照品 方法比对 回收率 C-A %=′ B 100% 杂质与主成分的相对含量 A:试验供试品中被测成分的量 （通常为含量测定量的50%） B: 试验供试品中加入的对照品的量 （通常为±20%） C:试验测定值

精密度 定义：在规定测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用偏差，相对偏差和相对标准偏差 1. 重复性（n 9） 3 2. 中间精密度 3. 重复性 测定：HPLC方法的精密度测试，应从样品制备开始，设计3个浓度， 分别平行制备3份，以测定含量计算相对标准偏差；或同一样品平行制备6份供试品，分别进样，以峰面积计算相对标准偏差。 同一份供试品连续进样6次，计算得到的相对标准偏差只能表征进样精密度，不能作为方法精密度。

专属性 定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。 1. 鉴别反应 2. 含量测定 杂质测定 测定： 限量检查 空白制剂，模拟复方 加速破坏试样测试 DAD峰纯度检查

高效液相色谱 质谱联用技术的应用

高效液相色谱质谱联用技术的应用 高效液相色谱(HPLC或LC)是以液体溶剂作为流动相的色谱技术，一般在室温下操作，可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物和大分子化合物（包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等)，分析范围广，而且不需衍生化步骤。质谱是强有力的结构解析工具，能为结构定性提供较多的信息，是理想的色谱检测器，不仅特异，而且具有极高的检测灵敏度。串联质谱（MS/MS）是将一个质量选择的操作接到另一个质量选择的后面，在单极质谱给出化合物相对分子量的信息后，对准分子离子进行多极裂解，进而获得丰富的化合物碎片信息，确认目标化合物，对目标化合物定量等。［1］ 高效液相色谱一质谱(HPLC—MS)联用技术是近几年来发展起来的一项新的分离分析技术，将HPLC 对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、环境分析等许多领域得到了广泛的应用。［2］ 本文着重讲述液相色谱质谱联用仪在药物分析、环境分析上的应用。 1液相色谱质谱联用在药学分析上的应用 1.1LC/MS在药物代谢中的应用 Lee等［3］总结了利用LC／MS鉴定药物代谢产物的方法，主要包括以下几个步骤：测定原形药物的质谱；选择准分子离子、加合离子和主要的碎片离子进行多级质谱分析；选择原形药物的主要中性丢失，测定生物样品的中性丢失谱，图谱中的离子即为原形药物和可能的代谢物的分子离子；选择主要的子离子测定生物样品的母离子谱，所得母离子即为各个代谢物；测定生物样品中所有可能代谢物的子离子谱，解谱得到代谢物的结构。 王宁生等［4］以LC／MS联用技术及标准品对照法，分离检测健康志愿者口服复方丹参滴丸后，血清中水溶性成分及代谢产物，从一级质谱的分子离子峰推测，丹参素及原儿茶醛在体内分别与硫酸及葡萄糖醛酸结合，产生丹参素硫酸结合物及原儿茶醛的葡糖醛酸结合物。 Hsiu SL等［5］研究芍药苷在小鼠体内药代动力学，用LC／MS方法检测体内药物浓度，未检测到芍药苷原形药物；但在血浆及各种排泄物中，均可检测其代谢物，经液相色谱一质谱分析，结合核磁共振(NMR)，确定其为芍药苷的脱糖基代谢物，提示芍药苷给药后，在肠道经细菌转化为PG后，被吸收进入血液循环中发挥作用。 Chen SJ等［6］用LC／DAD／MS／MS联用技术，对山豆根碱在小鼠体内的代谢进行了研究，用ESI ／MSn技术检测山豆根碱的代谢物，并鉴定其主要代谢物为N一去甲基山豆根碱。 1.2LC/MS在药学浓度上的应用 M．Brolis等［7］采用I-IPLC—DAD—MS法从贯叶金丝桃Hyoericum performm中分离鉴定出槲皮素、异槲皮素、金丝桃苷等成分。 Gerthard Brillgma等［8］采用HPLC—NMR和HPLC—ESI—MS—MS法对Habropetalum dawei进行分析，分离鉴定出dioneopeltine、N-methyldioncophylline、N-methyl-7-epi-dioncophylline、tetralone、(1R，3R)和(1S，3R)-N-formyl-8-hydroxy-6-methoxy-l,3-dimthyltetra-hydroisoquinoline等7个已知化合物，以及5’-O-methydioncopeltine、isoquinoline phylline 2个新化合物。 徐智秀等［9］以反相高效液相色谱法分离了9种人参皂苷（I）, 利用三级四级杆质谱研究了9种I的一级质谱（主要给出相对分子质量信息）和二级质谱（提供碎片结构信息），通过它们的质谱图差异对其进行了鉴别, 并将方法用于实际样品中的9种I的定性。 郭继芬等［10］选用Discovery C18柱，以甲醇-水-甲酸(40:60:0.025)为流动相，经紫外检测后，在ESI- 扫描方式下，对HPLC—UV图谱中各色谱峰进行一级和二级质谱分析，与对照品比较鉴定了提取物中4个已知的黄酮类化合物，推断出3个未知黄酮苷类化合物可能的结构。 2液相色谱质谱联用在环境分析上的应用 1

高效液相色谱法测定含量示例的方法再确证

高效液相色谱法测定含量示例的方法再确证作者：张建芝冯顺 来源：《维吾尔医药》2013年第07期 摘要：目的：确证用反相高效液相色谱法测定头孢氨苄含量的方法有效性和准确性。方法：以Diamonsil CLC-ODS（150mm x 6mm，10 lm）为色谱柱，水-甲醇- 3.89% 醋酸钠溶液- 4% 醋酸溶液（700：300：15：3）为流动相，检测波长为254 nm，外标法定量。结果：头孢氨苄浓度线性范围为0.02～0.20mg / ml，相关系数r= 0.9991，方法重复性试验 RSD为 1.42%。结论：该方法可简单高效地完成，结果准确性好、稳定可靠，确证高效液相色谱依然为头孢氨苄制剂的质量控制中有效可靠的方法。 关键词：头孢氨苄高效液相色谱法 头孢氨芐（Cefalexin，又译先锋霉素Ⅳ、头孢力新等）是一种半合成的第一代口服头孢霉素类类抗生素药物，化学名（6R，7R）-3-甲基-7-[（R）-2-氨基-2-苯乙酰氨基]-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸，化学式C16H17N3O4S，在临床上广为使用。其含量测定在旧版的中国药典（ 1995年版）采用碘量法○1。但此法不仅操作步骤繁多，费工费时，干扰因素多；然后人们发明采用高效液相色谱法内标法测定的方法，但内标物保留时间过长，依然存在问题。最后人们又发现采用高效液相色谱法，用外标法测定其含量，方法操作简单方便、数据准确可靠，灵敏度较高，重复性好，最终获得了较为满意的结果○2。现在本文对这个方法进行确证，以确定该方法的有效性和准确性。 1.仪器与试药 分析天平（precisa instrument ltd switzer land xs 225a precisa ），高效液相色谱柱（diamonsic C18 250 * 46mm），检测器（UVD 170v），泵（P680 HPLC pump），头孢氨苄胶囊（广州白云山制药总厂批号：2110102） 2. 色谱条件 用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂：水-甲醇- 3.89% 醋酸钠溶液 - 4% 醋酸溶液（700：300：15：3）为流动相；检测波长为254nm；理论塔板数按头孢氨苄峰计算不低于1500。 3. 实验试剂制备 3.1 对照品储备液的制备：对照品储备液的制备：取头孢氨苄对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，为对照品储备液。 3.2 供试品溶液的制备：去装量差异项下的内容物，混合均匀，精密量取适量（约相当于头孢氨苄0.1g），置于 100ml 容量瓶里，加流动相适量，充分振摇使溶解，再加流动相稀释至

高效液相色谱仪的操作步骤及注意事项

高效液相色谱仪的操作步骤及注意事项 一、操作步骤： 1.开机前先将流动相过滤和超声：水流动相用混合滤膜（0.2μm）过滤,有机流动相用有机滤膜过滤，之后超声脱气15-20分钟。（过滤的目的是除去流动相里的杂质，以免杂质进入色谱柱堵塞色谱柱；超声的目的是排除流动相里面的气体，以防气体进入色谱柱损害色谱柱，影响柱效能） 注：试验过程中由于只有0.45μm的混合滤膜，第一次使用时感觉效果不好，于是过滤水时同时使用两张混合滤膜过滤水流动相。 2.超声结束后，将流动相放置到规定位置（1号泵接水流动相，2号泵接有机流动相），开机逐个排气（先启动泵，排气结束后再打开检测器）。 3.排气结束后，关闭所有排气阀。先用纯有机流动相冲洗色谱柱20-30分钟，基线走稳之后，再打开水流动相（注意：水流动相和有机流动相流速之和为1ml/min），继续走基线，直到基线平稳。 注意：实验结束后，再用纯有机流动相冲洗色谱柱20-30分钟，冲出色谱柱内残留的样品物质，预防长时间不使用仪器样品的残留物质沉积在色谱柱内，导致下次使用难以冲出，色谱柱柱压偏高，基线不稳，出现大量鬼峰。（不同规格的色谱柱其所允许的最大流速之和不同） 4.走基线时，应将进样阀处于Load状态，用注射器进样时应快速进样，进样后将进样阀立即扳回到Inject状态，此时液相系统开始进入采样状态。采样结束后，可在数据分析里面查看分析结果并可进行编辑，也可以在脱机状态下查看样品的分析结果并编辑。 二、使用中常见的问题及注意事项 1.过滤时有时会出现流动相漏液。可能的原因是滤膜放置不正确（有点偏）和接头有点错位，导致流动相从缝隙中漏出。 注意：操作时，应先向滤瓶内倒入少量流动相，观察是否漏液并开始过滤，若未漏液，再向滤瓶中添加流动相。 2.超声时，瓶外液体的液面应高于瓶内流动相的液面，否则流动相内的气体可能无法排出液体，气体仍然残留在流动相内，以致开机排气时无气泡排出。

高效液相色谱仪操作步骤及注意事项汇总

高效液相色谱仪操作步骤及注意事项汇总 1. 过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。 2. 对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3.打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 4进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。 5. 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10?ml/min。 6. 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。 7. 设计走样方法。点击file，选取select?users?and?methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new?method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。 8. 进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 9．填写登记本，由负责人签字。 10．流动相均需色谱纯度，水用20m的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。 11．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。 12．所有过柱子的液体均需严格的过滤。 13．压力不能太大，最好不要超过2000 psi。 选择波长要从以下几个方面考虑： 1. 检测波长要大于溶剂截止波长。如果所选择的波长下溶剂有很强的吸收当然是不合适的。溶剂有强吸收后，基线抬高，减小检测的线性范围而且会加大基线噪声，对溶质的检测灵敏度下降。

高效液相色谱质谱联用 HPLC-MS 实验 含思考题

液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的各种模式探索 一、实验目的 1、了解LC-MS的主要构造和基本原理； 2、学习LC-MS的基本操作方法； 3、掌握LC-MS的六种操作模式的特点及应用。 二、实验原理 1、液质基本原理及模式介绍 液相色谱-质谱法（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry，LC-MS）将应用范围极广的分离方法——液相色谱法与灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的质谱法结合起来，必然成为一种重要的现代分离分析技术。 但是，LC是液相分离技术，而MS是在真空条件下工作的方法，因而难以相互匹配。LC-MS经过了约30年的发展，直至采用了大气压离子化技术（Atmospheric pressure ionization，API）之后，才发展成为可常规应用的重要分离分析方法。现在，在生物、医药、化工、农业和环境等各个领域中均得到了广泛的应用，在组合化学、蛋白质组学和代谢组学的研究工作中，LC-MS 已经成为最重要研究方法之一。 质谱仪作为整套仪器中最重要的部分，其常规分析模式有全扫描模式（Scan）、选择离子监测模式（SIM）。 （一）全扫描模式方式（Scan）：最常用的扫描方式之一，扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是化合物的全谱，可以用来进行谱库检索，一般用于未知化合物的定性分析。实例：（Q1 = 100-259m/z） （二）选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring，SIM）：不是连续扫描某一质量范围，而是跳跃式地扫描某几个选定的质量，得到的不是化合物的全谱。主要用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析。实例：（Q1 = 259m/z） 本实验采用三重四极杆质谱仪（Q1：质量分析器；Q2：碰撞活化室；Q3：

最新高效液相色谱使用方法

最新高效液相色谱使用方法 一、流动相准备 将流动相按比例混合，注意混合的流动相必须相互溶解，最好能将流动相混合在一起，若相互溶解性不好，可分成两种。流动相配好后，将管路放入，注意不要将瓶口密封。 二、开机 首先将真空泵打开，待泵的指示灯由黄变绿打； 打开600泵开关，按Direct键，进入操作菜单。 三、抽气 抽取管路A液体：先将注射器旋转插入，将旋钮由Run转至 Draw,抽液，完成后将旋钮由Draw至Run，再将注射器旋转取下，反复1-2次，抽至管路内无气泡。 抽取管路B液体：在泵操作菜单上将B设为100%，给0.2ml/min的流速，听到泵转换的声音后，将流速设为0，以抽取管路A的步骤进行抽气。 四、调节流动相比例与流速 在泵操作菜单上设定流动相比例，并以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml/min的速度逐步升高流速，每次间隔3-5分钟。 五、2410示差检测器的使用 1、打开2410示差检测器开关 2、调整检测器内、外温度 3、实验前一天晚上，使用“purge”状态平衡过夜，若第二天还要做实验，结束工作后不关机，节省第二天的平衡时间，保持0.2ml/min的流速。 六、2487紫外检测器的使用 1、打开2487示差检测器开关，机器自动进入自检过程，约需7分钟。 2、设置检测波长 3、预热30分钟左右，即可注样测定。

试验四、番茄内源激素高效液相色谱法测定 一、样品准备 取新鲜番茄根、茎、叶5克左右，液氮冷冻，放入冰箱储存。配80％甲醇，冰箱冷冻。 二、提取 样品放入预冷研钵，加l0ml 80％的冰冻甲醇研磨至匀浆，转入小烧杯中，再用甲醇清洗研钵2次，每次l0ml，转入小烧杯中。小烧杯放入冰箱(0～4℃)冷藏14小时以上。 三、过滤 取出用漏斗滤纸过滤，并用10m180％甲醇清洗残渣，合并滤液；如果提取液中沉淀物或色素多，则用10000g离心l0~12min，上清液转入冻干瓶中。 四、浓缩 将冻干瓶中的液体用减压蒸干机蒸干(至瓶中液体结冰)，然后用2m1 80％的甲醇冲洗，如果有浑浊物，再次用离心机12000g离心l0min，倒入带有刻度的试管中，为保证试管中的液体有5ml左右，将不足5ml的试管中再加入一些甲醇。 五、萃取 提取液中加入等量石油醚萃取，用力振荡，待静止分层后，用胶头滴管吸取上层液体弃去，此过程反复进行，直至醚层不再有颜色。 六、过柱纯化 萃取脱色后液体吸入针管，通过C18小柱滤除色素，用1~2m1甲醇清洗小柱一次，若滤出色素，将液体吸回，用新小柱重新滤一次（小柱使用前要用甲醇浸泡，用后再用甲醇反复冲洗，再浸泡）。 七、二次浓缩 液体转入蒸发皿中，60℃蒸干，用lml甲醇洗脱。 八、过滤 0．45um滤膜过滤，滤液收集到小瓶中，冷冻待测定。 九、测定与计算 用标样做标准曲线，分别为10，50，100，200，500mg／ml。进样量为20ul。 测定条件：流速为lml／min，柱温设定为35℃，测定波长为260nm，流动相甲醇：3％乙醇＝45：55 计算：通过曲线计算样品中激素浓度。

高效液相色谱测定法标准操作规程

标准操作规程 1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。 2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。 3责任：QC人员对本SOP实施负责。 4容 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 4.1.1.色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分

离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2?8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。 4.1.2.检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应。结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定围呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 4.1.3.流动相 反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5％，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。 正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。 品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变围为0.7X?1.3X；当X大于33%时，允许改变围为X—10%?X+10% 。

高效液相色谱技术(HPLC)

140 7 高效液相色谱技术（HPLC ） 高效液相色谱（HPLC ：High Performance Liquid Chromatography ）是化学、生物化 学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的 分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题 必不可缺少的工具。国际市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最大 的份额，增长速度最快。 高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精 度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。其缺点 是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗 大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。 7.1 基本原理 固定相 流动相 A B C C B A 固定相 —— 柱内填料，流动相 —— 洗脱剂。 HPLC 是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数 次的交换和分配而达到分离的过程。 通常，按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类： 分配色谱：—— 分配系数 亲和色谱：—— 亲和力 吸附色谱：—— 吸附力 离子交换色谱：—— 离子交换能力 凝胶色谱（体积排阻色谱）：—— 分子大小而引起的体积排阻 分配色谱又可分为：

正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。 固定相（柱填料）： 固定相又分为两类，一类是使用最多的微粒硅胶，另一类是使用较少的高分子微球。后者的优点是强度大、化学惰性，使用pH范围大，pH=1～14，缺点是柱效较小，常用于离子交换色谱和凝胶色谱。 最常使用的全孔微粒硅胶（3～10μm）是化学键合相硅胶，这种固定相要占所有柱填料的80％。它是通过化学反应把某种适当的化学官能团（例如各种有机硅烷），键合到硅胶表面上，取代了羟基（－OH）而成。它是近代高效液相色谱技术中最重要的柱填料类型。 使用微粒硅胶要特别注意它的使用pH范围是2～7.5，若过碱（＞pH7.5），硅胶会粉碎或溶解；若过酸（＜pH2），键合相的化学键会断裂。 键合相使用硅胶作基质的优点是：①硅胶的强度大；②微粒硅胶的了孔结构和表面积易人为控制。③化学稳定性好。 硅胶( SiO2?n H2O) ：OH OH —Si—O—Si— 重要的键合相是：硅烷化键合相，它是硅胶与有机硅烷反应的产物。 最常用的键合相键型是： —Si—O—Si—C R1R1 —Si—OH + X—Si—R —Si—O—Si—R + HX R2R2 硅胶有机硅烷键合相 X ━Cl，CH3O，C2H5O等。 R ━烷：C8H17（即C8填料），C10H21，C18H37等。 R1、R2 ━X、CH3等。 最常用的“万能柱”填料为“C18”，简称“ODS”柱，即十八烷基硅烷键合硅胶填料（Octadecylsilyl，简称ODS）。这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱70～80％的分析任务。由于C18(ODS)是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应用的最为广泛，近年来，为适应氨基酸、小肽等生物分子的分析任务，又发展了 141

高效液相色谱操作手册

转 HP1100高效液相色谱使用说明书注意事项: 1使用前，应申明样品名称和特性以及使用的流动相。 2更换色谱柱应由中级仪器实验室完成。 3溶剂必须经微孔滤膜过滤，所有废弃物(溶液等)请带走自行处理。 4不得在计算机上进行与实验无关的操作。 5注意适时更换废液收集瓶，防止废液溢出。 6认真登记实验记录。 7相关论文发表后，应送一份复印件给中级仪器实验室。 北京大学化学学院中级仪器实验室 一、概述 HPLC1100系统构成如下： 1 流动相A B C D 2 真空脱气装置3、6、9、11 电缆 4 输液泵 5 自动进样器（无）7 柱温箱8 检测器（DAD） 10 数据接收处理控制系统（计算机）12 打印机13 手动进样器 1．指示灯状态 每个部件接通电源后，LED灯显示绿色； 黄色Not Ready 绿色Run 红色Error 2．四元泵系统的工作原理图

3．柱温箱的特征 ●可以在低于室温10℃至80℃间恒温 ●空间大，可以容纳三根30cm长的柱子 ●安装柱识别可以记录进样次数 ●两个单独的加热区 ●可以程序升温 4．检测器 HP1100高效液相色谱仪配置的单光路二极管阵列检测器的光路如下所示： 光源发出的复合光经消除色差透镜系统聚焦后，照射到流通池上，透射光经全息凹面衍射光栅色散后，投射到一个由1024个二极管组成的二极管阵列上而被检测。此光路系统中光闸是唯一的运动部件，它有三个动作位置：（1）光闸将入射光束全部遮挡，以进行暗电流补偿；（2）将氧化钬滤光片插入光路，对衍射后的波长进行精确校正；（3）打开光闸使入 射光通过样品流通池照在光栅上。

HP1100系统所有控制和操作基本在计算机上完成，熟悉软件十分重要。本系统操作是基于Windows NT的多窗口多任务操作系统，要注意窗口之间可能覆盖。 根据所选色谱柱的性能，本系统可用于分子量小于2000的各种化合物的分离分析。目前中级仪器实验室仅备有ODS反相柱（可用于弱极性化合物及弱离子型化合物的分析）。一般要求自备色谱柱。自备色谱柱应使用HP系列接口，大连化物所及天津Autoscience公司可提供，一般分析柱的价格在1600－2000元之间，HP进口柱价格在4000元人民币左右。 本系统可提供多达四元体系的各种梯度淋洗，但在选择溶剂时须十分小心。流动相选择对分离分析有着重要的影响。 二、开机 打开各部分电源，脱气装置、输液泵、柱温控制、检测器的指示灯变黄。 开启计算机，若有选项，选择开启Windows NT4.0。点START－PROGRAM－HPChemStation－Instl online，计算机开始与仪器联接，并打开各控制界面，此时，各单元指示灯变绿，在工具条的View中选择界面为Runcontrol。 在第一个小窗口中利用下拉菜单，选择显示界面为Method and Run Control； 在第二个小窗口中选择已设定的使用方法（若是旧用户则有记录），新用户先编辑实验方法，然后选工具栏中Method－Save Method As（具体见后）。 第三个小窗口中显示LC操作条件。 三、样品分析 1．溶剂的处理和设置 不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶剂过滤器，降低泵的性能。遵从下列建议可以提高性能，延长溶剂过滤器的寿命： ●使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌 ●用滤膜过滤溶剂去除微生物 ●每二天更换或过滤溶剂 ●避免溶剂瓶直接日照 各洗脱液应分别过滤，注意有机相和水相应使用不同的滤膜。 避免使用下列对不锈钢有腐蚀性的溶剂： ●卤化物碱金属溶液和相应的酸溶剂 ●高浓度的无机酸例如：硝酸和硫酸 ●能够形成卤素自由基或酸的卤化物试剂及其混合物 ●含有过氧化物的色谱级醚必须用氧化铝干燥剂过滤吸收氧化物 ●在有机溶剂中的有机酸溶剂 ●含有强络合剂的溶液 ●四氯化碳和异丙醇或THF混合物 溶剂的设置： 在输液泵图标上按鼠标左键，在出现的小菜单中选Setup Pump，在Solvents栏中输入A、B、C、D溶剂名称；点溶剂瓶图标，在Solvent Bottles Filling中输入A、B、 C、D各溶剂的实际体积数。点OK确定并退出。 2．设置泵的参数 点输液泵图标，选Setup Pump，出现流速控制界面。设定流速flow rate（一般ODS

agilent高效液相色谱仪标准操作程序

Agilent 1200高效液相色谱仪标准操作程序1.目的 使操作人员的操作步骤规范化. 适用范围2. 适用于仪器安装、调试、校准后正常状态下进行的操作. 3.责任者 质控科仪器分析员对此规程负责. 4.规程 4.1清洗液、流动相、封柱液预处理 4.1.1所有清洗液、流动相、封柱液在使用前均需过滤、脱气以及混合均匀. 4.1.2甲醇-水（10：90）、乙腈-水（10：90）、超净水、乙腈均需存放在棕色溶剂瓶中. 4.1.3含有乙腈的溶液以及不含乙腈但含有较高比例的其他有机溶剂的溶液在过滤时需使用有机相微孔滤膜，其它溶液在过滤时需使用水相微孔滤膜. 1 / 8 4.1.4存放清洗液、流动相、封柱液的溶剂瓶在每次装入溶液前需用少量过滤好的该溶液清洗数次. 4.2接通电源,开启连机电脑,再接通仪器电源,仪器自检完毕，处于准备进行状态.双击桌面图标“仪器1联机”，打开Agilent 1200化学工作站，在左上角下拉框中选择“方法与运行控制”界面.显示如下图

标： 注意：一定要先双击“仪器1联机”图标，进入联机状态，方可双击“仪器1脱机”图标，同时进入脱机界面.否则，将无法联机. 4.2泵 4.2.1 准备清洗液并装入溶剂瓶中，将吸滤器放入瓶内.安装所需用柱子. 2 / 8 单击泵图标阀）打开，，4.2.3 将吹扫阀（即“Purge”选择“设置泵”，将“流速”设置为3.00ml/min.选择清洗液所在通道（建议为A通道），单击“确定”，在“系统视图”中单击“启动”运行泵，泵运行10分

钟后，观察压力，应小于10bar，若大于此压力，应更换purge阀滤芯，调节流速1.00ml/min. 4.2.4关闭purge阀，观察柱压是否正常. 4.2.5选择“控制”，在“用于泵密封垫清洗的泵”（Seal Wash）中选择“定期清洗”，“周期”设置为5min，“持续”设置为0.1min，同时观察试剂架中10%异丙醇是否充足，相应的废液瓶是否有充足空间. 4.2.6 根据“柱使用记录中所规定的方法”清洗柱子约30分钟后，在“控制”组中的“泵”选项中选择“待机”，待系统压力降到10bar 以下后，更换流动相，在“控制”组中的“泵”选项中选择“启动”改用流动相平衡柱子，约30分钟后柱子处于平衡状态.设定所需流速，在“停止时间”中设定所需运行时间，在“后运行时间”设定所需后运行时间；选择“溶剂”项，设定各通道比例，单击“确定”. 4.2.6 如进行梯度分析，在“设置泵”组中选择“时间表”，单击“追加”，根据具体方法进行时间和相应的参数设置. 4.3 柱温箱 单击柱温箱图标，4.3.1在系统视图中，并从菜单中选择“设置柱温箱”，设置“温度”选项，单击“确定”. 4.3.2在实验开始时，用清洗液清洗柱子时，应同时开启柱温箱；在3 / 8 实验结束时，用清洗液清洗柱子时，应关闭柱温箱，让柱子随着清洗过程慢慢冷却.要避免到封柱过程结束后才关闭柱温箱，这会导致柱的寿命减短.

高效液相色谱使用方法

高效液相色谱使用方法 一、流动相准备 将流动相按比例混合，注意混合的流动相必须相互溶解，最好能将流动相混合在一起，若相互溶解性不好，可分成两种。流动相配好后，将管路放入，注意不要将瓶口密封。 二、开机 首先将真空泵打开，待泵的指示灯由黄变绿打； 打开600泵开关，按Direct键，进入操作菜单。 三、抽气 抽取管路A液体：先将注射器旋转插入，将旋钮由Run转至 Draw,抽液，完成后将旋钮由Draw至Run，再将注射器旋转取下，反复1-2次，抽至管路内无气泡。 抽取管路B液体：在泵操作菜单上将B设为100%，给0.2ml/min的流速，听到泵转换的声音后，将流速设为0，以抽取管路A的步骤进行抽气。 四、调节流动相比例与流速 在泵操作菜单上设定流动相比例，并以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml/min的速度逐步升高流速，每次间隔3-5分钟。 五、2410示差检测器的使用 1、打开2410示差检测器开关 2、调整检测器内、外温度 3、实验前一天晚上，使用“purge”状态平衡过夜，若第二天还要做实验，结束工作后不关机，节省第二天的平衡时间，保持0.2ml/min的流速。 六、2487紫外检测器的使用 1、打开2487示差检测器开关，机器自动进入自检过程，约需7分钟。 2、设置检测波长 3、预热30分钟左右，即可注样测定。

试验四、番茄内源激素高效液相色谱法测定 一、样品准备 取新鲜番茄根、茎、叶5克左右，液氮冷冻，放入冰箱储存。配80％甲醇，冰箱冷冻。 二、提取 样品放入预冷研钵，加l0ml 80％的冰冻甲醇研磨至匀浆，转入小烧杯中，再用甲醇清洗研钵2次，每次l0ml，转入小烧杯中。小烧杯放入冰箱(0～4℃)冷藏14小时以上。 三、过滤 取出用漏斗滤纸过滤，并用10m180％甲醇清洗残渣，合并滤液；如果提取液中沉淀物或色素多，则用10000g离心l0~12min，上清液转入冻干瓶中。 四、浓缩 将冻干瓶中的液体用减压蒸干机蒸干(至瓶中液体结冰)，然后用2m1 80％的甲醇冲洗，如果有浑浊物，再次用离心机12000g离心l0min，倒入带有刻度的试管中，为保证试管中的液体有5ml左右，将不足5ml的试管中再加入一些甲醇。 五、萃取 提取液中加入等量石油醚萃取，用力振荡，待静止分层后，用胶头滴管吸取上层液体弃去，此过程反复进行，直至醚层不再有颜色。 六、过柱纯化 萃取脱色后液体吸入针管，通过C18小柱滤除色素，用1~2m1甲醇清洗小柱一次，若滤出色素，将液体吸回，用新小柱重新滤一次（小柱使用前要用甲醇浸泡，用后再用甲醇反复冲洗，再浸泡）。 七、二次浓缩 液体转入蒸发皿中，60℃蒸干，用lml甲醇洗脱。 八、过滤 0．45um滤膜过滤，滤液收集到小瓶中，冷冻待测定。 九、测定与计算 用标样做标准曲线，分别为10，50，100，200，500mg／ml。进样量为20ul。 测定条件：流速为lml／min，柱温设定为35℃，测定波长为260nm，流动相甲醇：3％乙醇＝45：55 计算：通过曲线计算样品中激素浓度。