杨树叶片离体再生系统的构建

山东农业科学 2010,5:8~10Shandong Agricu ltural Sc iences

收稿日期:2010-01-19;修回日期:2010-02-24

作者简介:张 颖(1984-),女,山东济宁人,硕士研究生,研究方向:杨树耐盐机理的研究。E -m ai:l spri ng1002@t o m 1co m

杨树叶片离体再生系统的构建

张 颖1

,王 猛2

,柴 娜

1

(11天津师范大学化学与生命科学学院,天津 300387;21山东理工职业学院图书馆,山东济宁 272100) 摘 要:以杨树叶片为外植体,M S 为基本培养基,使用不同激素不同浓度配比,建立了杨树叶片离体培养植株再生体系。结果表明:叶片的最佳诱导培养基为:M S+2,4-D 110m g /L +6-BA 110mg /L;不定芽培养基为:M S+NAA 110mg /L +6-B A 015m g /L 。NAA 与BA 对愈伤组织诱导有调控作用,NAA /BA 比值增大有利于不定芽的诱导,但不能超过4B 1;BA 与2,4-D 关系比较复杂,当2,4-D 和6-B A 的浓度均为110m g /L 时,愈伤组织诱导效果最好。

关键词:欧美108杨叶片;组织培养;植物生长调节剂

中图分类号:S792111015 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2010)05-0008-03

Establis h m e nt of i n V itro Regeneration Syste m of Poplar Leaves

Z HANG Y i n g 1

,WANG M eng 2

,C HA I Na

1

(1.C olle ge of Che m is try and L i fe Science ,T ianjin N or m al Univers it y,T i anj i n 300387,China ;

2.L ibrary of Shandong P ol y technic V ocational C olle ge ,J i ning 272100,China )

Abst ract The tender leaves of P o pulus euram ericana 108as the explantsw ere cu ltured i n t h e M S basic m edi u m supp le m ented w ith d ifferent concentrations of p lant gro w th regulators to establish the in vitro regenera -ti o n syste m 1The results sho w ed that the opti m a l i n ducti o n m ed i u m w asM S+2,4-D 110m g /L+6-BA 110m g /L and the m ed i u m suitab le to i n duce the adventiti o us buds w asM S+NAA 110m g /L+6-B A 015m g /L 1NAA and BA had the regulati o n effects on t h e i n ducti o n o f call,i that was to say ,the i n creasi n g ratio notm ore t h an 4B 1w as bene ficial to induce the adventitious buds ;wh ile the relationsh i p s of B A w ith 2,4-D w ere m ore co m plex ,the i n duction effect w as the best w ith 2,4-D and 6-BA of 110m g /L,respectively 1

K ey w ords Leaf of P o pulus euram ericana 108;T issue cu lture ;Plant gro w th regulator 杨树是世界上广泛栽培的重要造林树种,因其速生丰产、无性繁殖能力强、基因组较少而成为林木遗传改良的理想模式植物

[1]

。自1964年

M athes 获得杨树试管苗以来,国内外许多学者采用杨树茎尖、叶片、茎段和腋芽做外植体,均获得成功,但以叶片培养增殖倍率高

[2]

。笔者采用欧

美108杨的嫩叶为外植体,M S 为基本培养基,使用不同激素不同浓度配比,建立了杨树叶片离体培养植株再生体系。

1 材料与方法

111 试验材料

以欧美108杨一年生枝条为材料,扦插土培一个月后,取刚刚生长出的幼嫩叶片作为外植体。

112 外植体的灭菌、接种、培养

以叶片为外植体,自来水冲洗30m in ,10%酒精消毒10s ,无菌水冲洗2次,每次1m in ,011%H gC l 2浸泡4m i n ,无菌水漂洗4遍,每次2m i n 。叶片切成015c m @015c m 大小方块,叶背向下平放于培养基中。培养温度25e ,光照14h /d ,光照强度2000l x 。

113 培养基

基本培养基为MS 培养基,添加不同激素组合、30g /L 蔗糖、615g /L 琼脂,配制成M 1~M 6共6种培养基(表1)。在灭菌前调节培养基p H

值到518,并且在011MPa(121e)的条件下保持20m in,以达到灭菌的效果。

表1培养基代号与激素组合

代号组合

M1M S+2,4-D110m g/L+6-BA015mg/L

M2M S+2,4-D015m g/L+6-BA015mg/L

M3M S+2,4-D110m g/L+6-BA110mg/L

M4M S+NAA110mg/L+6-BA015m g/L

M5M S+NAA015mg/L+6-BA015m g/L

M6M S+NAA210mg/L+6-BA015m g/L

2结果与分析

211杨树叶片愈伤组织的诱导

将经处理的外植体均匀接种于M1、M2、M3、M4、M5、M6培养基上诱导愈伤组织。表2表明,在M1、M2、M3、M4、M5培养基上几天后大部分外植体开始膨大,2~3周后长出绿色或红色的愈伤组织。其中,M2、M3培养基上出现大量愈伤组织,基本为绿色,少量为红色,致密,数量明显多于M1培养基;M4、M5培养基上出现较多的不定芽,愈伤组织很少,且M4诱导产生的不定芽明显多于M5;但M6培养基上的外植体只表现为轻微膨大,两周后褐化死亡。

NAA与BA对愈伤组织的诱导有调控作用, NAA/B A比值增大有利于不定芽的诱导,但当NAA与BA比值为4B1时,无愈伤组织出现,也不诱导不定芽,这表明生长素含量过高的培养基不适合诱导愈伤组织。B A与2,4-D关系比较复杂,当2,4-D和6-B A的浓度均为110m g/L 时,愈伤组织诱导效果最好。另外,带叶柄的叶片出现愈伤组织所需的时间短,并且通常在叶柄处先出现白色膨大,逐渐长出绿色的愈伤组织

表2欧美108杨叶片愈伤组织的诱导

代号诱导情况

M1产生红色愈伤组织,愈伤组织生长较慢,数量较少

M2产生较多的愈伤组织,大部分为绿色,伴有少量红色愈伤组织

M3产生的愈伤组织较多,基本为绿色,伴有少量不定芽

M4产生大量不定芽,愈伤组织少

M5愈伤组织少,诱导出不定芽,数量少于M4

M6外植体轻微膨大,最终褐化死亡

212杨树叶片不定芽的诱导

将在M3培养基上诱导得到的愈伤组织接种于M4培养基上进行不定芽的诱导培养,4周后,愈伤组织诱导出大量不定芽。

213杨树不定芽的继代和生根培养

将在不定芽诱导培养基上获得的丛生芽单个接种在继代培养基(M S+6-B A011m g/L+ NAA0102m g/L+GA3012m g/L)上继代增殖培养,3~4周后选长势良好的不定芽接种于生根培养基(M S+I BA015mg/L),4周后得到生根的完整小植株。

3讨论

欧美108杨扦插繁殖简便易行,但受制于季节因素,利用组织快繁能打破这种限制。其它杨树品种的组培快繁已有一些研究报道[3,4],孙宇飞等(2004)[5]成功建立了欧美107杨组织培养再生系统,但欧美108杨组织培养再生系统研究未见报道。较其它品种杨树而言,该品种具有显著的速生性能和优良的品质,进行耐盐转基因研究有广泛的应用开发前景。因此,该系统的建立具有重要的理论和实践意义。

试验中,幼嫩叶片和叶柄切口处虽然有少量褐色物质渗出,但幼嫩外植体的细胞分裂能力很强,在切口处依然有愈伤组织形成,基本上不会影响愈伤组织的诱导率。若以较老的叶片、叶柄做外植体,则切口处褐变现象严重,随着培养时间的延长,褐变面积会从切口处扩展到整个外植体,进而影响愈伤组织的诱导率。造成这种后果的原因可能有:1外植体的成熟程度影响诱导率。通常情况下,褐变随材料的年龄和组织木质化程度的增加而增加。o取材时期不合适。很多关于组织培养的报道都提出取材时期会影响外植体的褐变[6~9]。李昆(2007)[6]研究发现,在3~4月间取刚萌发的叶片、叶柄甚至茎段作外植体,消毒工作很容易进行,所用消毒时间较短,向外渗出的褐色物质很少,而且外植体分化能力很强,基本上在外植体边缘发生的小部分褐变不会影响到诱导率。另外,在超净工作台上切割外植体时,手术刀要锋利,切割要迅速准确,切口保持平整,避免伤害过大。同时,外植体切下后,要迅速接入培养基,避免其切口与空气长时间的接触。

参考文献:

[1]林善枝,肖基浒,张志毅1杨树分子标记研究进展[J]1北

9

第5期张颖等:杨树叶片离体再生系统的构建

山东农业科学2010,5:10~14Shandong Agricu ltural Sc iences

AFLP分子标记的发展及应用

刘静

(曲阜师范大学生命科学学院,山东曲阜273165)

摘要:扩增片段长度多态性(A FLP)是一种高效的DNA分子标记技术,近年来其研究方法和检测技术不断改进和优化,并由此衍生出多种相关技术,使其在遗传多样性、种质鉴定、遗传图谱构建、基因定位等研究中得到广泛的应用。本文即对AFLP的原理、衍生技术及其应用等进行了介绍。

关键词:分子标记技术;A FL P;应用

中图分类号:Q503文献标识号:A文章编号:1001-4942(2010)05-0010-05

分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段,直接体现基因组DNA间的差异。在过去30多年,DNA分子标记得到了迅速发展。扩增片段长度多态性(Am pl-i fied Frag m ent Length Po ly m orphis m,AFLP)技术为第二代分子标记技术,是在随机扩增多态性(Rando m Am plifi e d Poly m orphic DNA,RAPD)和限制性片段长度多态性(Restriction Frag m ent Length Po l y m orph is m,RFLP)技术上发展起来的DNA多态性检测技术,同时拥有RFLP的高重复性和RAPD简便快捷的特点。同其他以PCR为基础的标记技术相比,AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记,具有覆盖面广、高保真性、高效性、高分辨率、DNA用量少、事先勿需知道序列任何信息、可在全基因组产生标记、标记的分离遵循孟德尔遗传规律等优点,自1995年由Zabeau和Vos[1]创建以来,已在动物、植物和微生物的分子系统学研究中得到应用,具有广阔的发展前景。1AFLP标记的基本原理、操作流程及技术关键

111AFLP标记的原理

AFLP标记的原理是对基因组总DNA酶切后经PCR进行选择性扩增。先将基因组DNA用两种限制性内切酶酶切成大小不等的片段,并与含有粘性末端的人工接头相连,形成酶切位点不同的限制性酶切片段,然后用与接头和位点相匹配的引物进行预扩增,预扩增产物作为进一步PCR扩增的模板,再选用特异引物进行选择性扩增,扩增后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳将特异的限制性片段分离。由于不同来源DNA的酶切片段存在差异,因而产生了扩增产物的多态性[2]。

112操作流程

AFLP标记的具体操作流程[3]为:1DNA提取和质量检测;o双酶切和酶切片段连接;?酶切连接片段的预扩增;?选择性扩增;?扩增产物

收稿日期:2010-01-15

作者简介:刘静(1979-),女,硕士,讲师。E-m ai:l li u ji ng9712@1631co m

京林业大学学报,2000,22(6):79-831

[2]马同富,马宗新1杨树叶片高效离体再生系统的构建[J]1

中国农学通报,2007,23(12):88-921

[3]王学聘,韩一凡,戴莲韵,等1抗虫转基因欧美杨的培育

[J]1林业科学,1997,33(1):69-741

[4]杜宁霞,李云,于海武,等1毛白杨叶片再生系统的建立

(英文)[J]1中国林学(英文版),2002,2(4):48-511 [5]孙宇飞,高秀华,赵彦修,等1欧美107杨组织培养再生系

统的建立[J]1山东师范大学学报,2004,19(2):85-871[6]李昆1I-63杨和I-69杨组织培养研究[D]1武汉:华

中农业大学硕士论文,20071

[7]王玉珍,刘香玲,罗景兰1大叶饲料型刺槐组培技术体系的

研究[J]1山东农业科学,2005,4:9-111

[8]蔡小宁,杨阳,杨平,等1盐芥叶片组织培养再生植株

的研究[J]1安徽农业科学,2008,36(1):42-431

[9]于志水,金红,王丽钧,等1黑杨派杨树组培再生系统的

研究[J]1辽宁林业科学,2002,6:11-131

烟草植物组织培养

烟草植物组织培养实验 一实验目的学习和掌握植物组织培养技术。深刻理解植物细胞的全能性。 二实验原理 植物组织培养是从20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术。由于其拥有占地少、繁殖系数大等特点，现以在全世界的园林植物尤其是花卉的种苗繁育上得到广泛应用。本文着重介绍组织培养技术的理论原理、操作过程、生产技术以及经济核算等方面的内容，使大家对组织培养在园林植物尤其是花卉的种苗繁育的应用有所了解，为以后的实际操作提供依据。 在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。①起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素（如机械损伤、改变光照强度、增加氧等）和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出现愈伤组织。在植物组织培养中沿用了愈伤组织这一名词，但是植物组织培养中诱导外植体细胞分裂形成的愈伤组织，大都不是损伤的结果。外源的生长素类物质对诱导细胞开始分裂效果很好，因此生长素类物质在植物组织培养中得到广泛应用，常用的有生长素（2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、萘乙酸NAA、萘乙酰胺NAD和吲哚乙酸IAA、吲哚丙酸IPA和吲哚丁酸IBA）细胞分裂素（6-苄氨基嘌呤6-BA、6-糠氨基嘌呤（KT）氯吡苯脲（KT-30，CPPU））等。分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。处于分裂期的愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。外植体的脱分化因植物种类、器官来源及其生理状况的不同而有很大差别。例如，烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难。分化期是指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞，等等。外植体的细胞经过起动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（如2～4周）将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。愈伤组织的形态发生方式经过起动、分裂和分化期产生的愈伤组织，其中虽然发生了细胞分化，但是并没有器官发生。只有满足某些条件，愈伤组织的细胞才会发生再分化，产生芽和根，进而发育成完整植株。愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式（器官发生型）和胚状体方式两种。不定芽方式是在某些条件下，愈伤组织中的分生细胞发生分化，形成不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。胚状体方式是由愈伤组织细胞诱导分化出具有胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。这种由愈伤组织中的薄壁细胞不经过有性生殖过程，直接产生类似于胚的结构，叫做胚状体。在植物组织培养中，不定芽方式和胚状体方式是愈伤组织形态发生的两种最常见和最重要的方式。胚状体方式比不定芽方式有更多的优点，如胚状体产生的数量比不定芽多，胚状体可以制成人工种子，等等。 培养基的主要指标为营养的组分，植物生长物质的浓度，特别是后者对外植体的分化起着极其重要的作用。培养基的组织成分主要包括：1. 矿质营养。矿质营养又叫无机营养，

烟草植物组织培养

烟草植物组织培养实验实验目的一学习和掌握植物组织培养技术，理解植 物细胞的全能性。实验原理二年代初期发展起来的一项生物技术。由于其拥有占地世纪30植物组织培养是从20少、繁殖系数大等特点，现以在全世界的园林植物尤其是花卉的种苗繁育上得到广泛应用。本文着重介绍组织培养技术的理论原理、操作过程、生产技术以及经济核算等方面的内容，使大家对组织培养在园林植物尤其是花卉的种苗繁育的应用有所了解，为以后的实际操作提供依据。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。①起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素（如机械损伤、改变光照强度、增加氧等）和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出现愈伤组织。在植物组织培养中沿用了愈伤组织这一名词，但是植物组织培养中诱导外植体细胞分裂形成的愈伤组织，大都不是损伤的结果。外源的生长素类物质对诱导细胞开始分裂效果很好，因此生长素类物、萘乙4-D4-二氯苯氧乙酸2，，质在植物组织培养中得到广泛应用，常用的有生长素（2）细胞分裂素IBA、吲哚丙酸IPA和吲哚丁酸NAA酸、萘乙酰胺NAD和吲哚乙酸IAA））等。分裂期是，KT-30CPPU糠氨基嘌呤（KT）氯吡苯脲（6-（苄氨基嘌呤6-BA、6-指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。处于分裂期的愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。外植体的脱分化因植物种类、器官来源及其生理状况的不同而有很大差别。例如，烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难。分化期是指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞，等等。外植体的细胞经过起动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（如2～4周）将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。愈伤组织的形态发生方式经过起动、分裂和分化期产生的愈伤组织，其中虽然发生了细胞分化，但是并没有器官发生。只有满足某些条件，愈伤组织的细胞才会发生再分化，产生芽和根，进而发育成完整植株。愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式（器官发生型）和胚状体方式两种。不定芽方式是在某些条件下，愈伤组织中的分生细胞发生分化，形成不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。胚状体方式是由愈伤组织细胞诱导分化出具有胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。这种由愈伤组织中的薄壁细胞不经过有性生殖过程，直接产生类似于胚的结构，叫做胚状体。在植物组织培养中，不定芽方式和胚状体方式是愈伤组织形态发生的两种最常见和最重要的方式。胚状体方式比不定芽方式有更多的优点，如胚状体产生的数量比不定芽多，胚状体可以制成人工种子，等等。 培养基的主要指标为营养的组分，植物生长物质的浓度，特别是后者对外植体的分化1 / 5 矿质营养。矿质营养又叫无机营起着极其重要的作用。培养基的组织成分主要包括： 1. 、养，是指植物在生长发育的过程中所需要的各种化学元素，其中包括大量的元素如N、P 2. Mn、Zn、Cu等，其对植物的生长发育中有着重要的生理作用。FeK和微量元素如、B、维生素。维生素能够以辅酶的形式参与多种酶系的反映，直接影响到蛋白质、糖、脂肪等植物生长物质。其

烟草组培苗实验步骤

烟草叶片的组织培养 一、实验原理与实验步骤 在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。 植物材料：烟草植株 药品：（2,4-D、NAA、6-BA浓度均可）、1mol/L NaOH、1mol/L HCL 蒸馏水、70%酒精0.01%升汞 仪器：玻璃杯、玻璃棒、pH试纸(5.5-9.0) 、1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1包无菌滤纸、 1个无菌白瓷板、培养瓶若干移液器、微波炉、灭菌器、超净工作台、酒精灯、解剖刀、镊子 二、实验方法与步骤

注意： 1、大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2·2H2O单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。 2、微量元素母液的配制 按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O 和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签 3、铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。 4、有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。（1）制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。 （2）称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。 生长调节剂母液配制： 为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。 不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。 称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，配制后一般要求在低温（0~4℃）保存，配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取1ml母液即可。 三、培养基配制和灭菌 本次实验使用 （1）愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:MS+2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L；（2）幼芽增殖培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L； （3）生根培养基：MS+NAA 0.2 mg/L。 注意事项：上述培养基均在MS固体培养基溶化后降低到50左右后，加入相应激素所得， MS固体培养基的配置过程在此不作过多赘述

愈伤组织诱导及观察

实验二愈伤组织诱导及观察 一.实验目的 通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。 二.实验内容 （一）、实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。 愈伤组织的形成 从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。 起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照

烟草的组织培养技术

烟草的组织培养技术 一、目的与要求 1.验证“植物细胞全能性”理论。 2.学习用生长调节剂对植物器官发生的诱导方法。 二、实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，分离、并在培养基中培养离体植物组织（器官或细胞）的技术。植物组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个活细胞都有相同的遗传组成，在适当条件下具有繁殖出完整植株的能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，组织、器官一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出细胞的全能性，从已经分化的细胞通过脱分化，成为重新具有分裂能力的胚性细胞，并能再分化重新生长发育成完整的植株。 愈伤组织：是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的细胞团。 脱分化：已经分化的细胞，发生生理、生化的改变，退回到胚性细胞的过程。 再分化：经过脱分化的细胞或组织再次获得分化成不同功能的细胞、组织、器官或完整植物体。 三、材料和用具 1.材料：无菌烟草叶盘（已经诱导成芽），拟南芥。 2.用具：超净工作台、高压灭菌锅、培养箱、电子天平、移液器、手术解 剖刀、大、小镊子、30ml烧杯、500ml烧杯、药勺、玻璃棒、培养 瓶、平皿、试纸（PH5.4-7），报纸等。 3.试剂：MS培养基、0.5mol/LNaOH、1mol/L HCl。 四、操作步骤 （一）诱导培养基配制（见表1）

1.加MS储液（储液配置见附表） 大量元素和微量元素的母液都是高浓度的，为防止混合后发生沉淀，建议加完大量元素后先加水（约总体积3/4），再加各微量元素和有机成分。 铁盐也是微量元素，因为易发生沉淀，所以与其它微量元素分开配。储液中的铁盐存于棕色瓶中。配好的储液应当4℃保存。表1是4瓶培养基（1组）的配置方案。 表1 诱导培养基配制表 成分实际称取量 蒸馏水120 ml MS母液15 mL 蔗糖 4.5 g 用蒸馏水粗略定容至100ml pH值 5.8 琼脂 1.2 g 2.加蔗糖（3%）（m/v）。蔗糖是碳源，同时起到维持渗透压的作用。 3.调pH=5.8。pH过低，高温处里时间过长，都可能会使培养基不凝。 4.加琼脂（0.7-0.8%）（m/v）琼脂粉是固化剂、支持物。 （二）灭菌 1.培养基、解剖刀、镊子、平皿需在高压灭菌锅120℃，灭菌15min。 2.接种前打开无菌间和超净台紫外灯照射30min。 3.用肥皂洗手和手腕。进入无菌间，先用70%酒精或新洁尔灭喷手。关掉 无菌间棚顶紫外灯，打开超净台风机，关掉超净工作台上的紫外灯。（三）接种 1.坐在超净工作台前，用70%酒精棉球擦拭双手、培养瓶和超净台面。 2.待手上的酒精干了，点燃酒精灯。 3.将培养瓶的盖子旋松，但不要打开，放到无菌风道侧面备用。 将镊子、解剖刀在酒精灯外焰上灼烧，待其冷却后，放到培养皿上备用。 4.用镊子和解剖刀取出一块叶盘，放到平皿上，切取烟草叶芽1-2块，插 入培养基。

植物烟草实验

烟草叶片愈伤组织诱导 摘要用不同成分培养基，附加0.8%琼脂，3%蔗糖，调pH5.8—6.0，取烟草叶片 作为外植体进行愈伤组织诱导培养，计算污染率、诱导率以及诱导情况，观察愈伤 组织的发生情况。实验表明，养分较高的培养基，外植体生长情况较好。当细胞分 裂素高于生长素的浓度时，有利于分化出芽；细胞分裂素低于生长素的浓度时，有 利于分化出根；当细胞分裂素及生长素的浓度适合时，愈伤组织不分化，但是生长 旺盛。 关键词：烟草叶片愈伤组织诱导 前言 烟草（Nicotiana tabacum）又名草烟，属茄科烟草属的一年生草本植物，本属约有60种，原产于美洲和大洋洲[1]。烟草是重要的经济作物和工业原料作物，其体内所含的烟碱等生物碱是非常宝贵的医药及化工原料[2]。有报道烟草细胞悬浮培养物获得细胞分裂素类物质，因此很有必要对烟草的组培快繁进行研究，以获得更有效的方法提高产率和产量。柯善强综述植物细胞的遗传全能性与组织培养形态发生控制[3]，戴冕进行了烟草叶肉原生质体再生植株的研究[4] ,徐瑞娟等通过烟草花序苞叶的离体培养分化出花芽[5],战淑敏用烟草叶组织培养直接获得再生植株[6]。本实验以烟草叶片组织为外植体进行组织培养，诱导愈伤组织，观察愈伤组织诱导情况。 1.材料与方法 1.1 配置培养基母液，每2人为一个小组，配置以下培养基，并分装，灭菌，然后室温下放置一周。 1.2 取烟草叶片取烟草的嫩叶片作外植体。先用自来水冲洗干净，再用蒸馏水洗2次后，置于超净台上，于无菌条件下先用75%的酒精浸泡30秒，然后置于无菌瓶中用10%次氯酸钠溶

液浸泡20分钟至30分钟，再用无菌水冲洗4次，最后在无菌培养皿中将嫩叶片切成1cm见方小块，接种在培养基中。 1.3.1 观察污染情况：观察是否有细菌性污染（菌斑呈粘液状,接种后1-2天出现）和真菌性污染（出现不同颜色霉菌,接种后3-10天出现），并计数。计算污染率。 污染率(%)=污染的材料数/总接种材料数×100%[7] 1.3.2 观察各培养基中的外植体产生愈伤组织的情况，愈伤组织出现时间和愈伤组织形态特征（颜色和质地等），计数形成愈伤组织的材料数，并计算诱导率。 诱导率(%)=形成愈伤组织的材料数/总接种材料数×100%[7] 2.结果及分析 2.1愈伤组织诱导情况 三天后发现部分组有细菌性污染（如图1），7天后发现部分有真菌性污染。计算出污染率和如表1所示： 表1. 愈伤组织诱导的污染情况 造成污染的可能原因有：叶片消毒灭菌不彻底，接种室超净工作台消毒不彻底，接种操作时操作不规范等等。 叶片在第4天后边缘慢慢上卷，外植体开始膨胀，于接种后第7 天膨大成圆拱型，愈伤首先发生在叶片边缘, 为黄绿色颗粒状，有些呈现半透明。随着进一步培养, 10天愈伤组织不断加大。 排除褐变及感染的外植体后，诱导情况如表2所示： 表2.愈伤组织诱导情况

烟草遗传转化实验

实验八植物细胞悬浮培养 实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。 实验器材： 超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。 配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。 实验材料：烟草叶片愈伤组织。 实验方法： 1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等 放入工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。 2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入 150ml三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。 3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速 100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。 4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养 基时称取重量。 5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。 6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图： 鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标， 绘制鲜重增长曲线。 烟草遗传转化实验 实验目的

烟草是遗传转化的模式植物，已经建立了一套完善的转化再生体系。本实验以烟草为实验材料，了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。实验要求： 掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。 实验原理 根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒，简称为Ti质粒。野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T－DNA 区，含致瘤基因；另一个是毒性区，在T－DNA的切割、转移与整合过程中起作用。用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建，是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除，并在T－DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点。 p BI121载体是常用的植物表达载体，载体的骨架是pUC18，以CaMV35S启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素（kan）抗性选择标记基因，含有卡那霉素抗性基因作为筛选基因。β－葡萄糖苷酶gus基因作为报告基因，转化的获得的转基因细胞、组织或植株，具有抗卡那霉素的特性，经组织化学染色呈蓝色。 实验器材 摇床、超净工作台、小型离心机、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、酒精灯、棉球、培养皿、三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签。 实验材料 植物材料：烟草无菌苗 农杆菌与载体：农杆菌LBA4404 p BI121 YEB培养基：牛肉膏(5 g/L)、蛋白胨(5 g/L)、酵母提取物(1 g/L)、蔗糖(5 g/L)、MgSO4 (0.5 g/L)、pH 7.0 烟草分化培养基：MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA 烟草生根培养基：MS + 0.5mg/L IAA 卡那霉素（Kan）母液：50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。 头孢霉素（cef）母液：300mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。 利福平(rif): 50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。 实验步骤 1. 农杆菌感受态的制备： 1)接菌于5 ml YEB液体培养基(Rif 50 mg/L)中，28℃，200转/分钟，培养1～2天； 2)取1mL活化的菌液接种于50mlYEB液体培养基中，同样条件下培养至OD600值为

烟草组织培养实验方案

烟草组织培养实验方案 摘要本实验通过配制四种培养基来实现烟草种子萌发，种子苗叶片诱导、分化及植株再生，从而获得课题所需要的基因受体植株。 关键词烟草组织培养 前言 组织培养不仅是一种植物快速繁殖的手段,同时也是植物改良、种质保存和次生物质生产的理想途径。烟草是典型的基因工程模式植物,易于进行组织培养, 容易得到再生的转化植株。 一实验植物：华烟6号 二实验材料：华烟6号种子 三实验方法与步骤 1．培养基的配制 本次实验使用（1）种子萌发培养基：MS培养基+GA30.7mg/L；（2）愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:MS+2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L；（3）幼芽增殖培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L；（4）生根培养基：MS+NAA 0.2 mg/L。上述培养基均附加3%蔗糖，0.8%琼脂，pH5.8，培养温度25±2℃，光照强度2 000 lx。 2. 培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法） 3. 无菌苗的获得 把烟草种子用市售丝袜（或纱布）包好，先分别用75%乙醇或无菌水浸泡30 s，用无菌水洗净表面抑制种子萌发的药物，待洗涤的水清澈透明，然后将烟草种子用70%酒精浸泡1 min, 10%NaClO消毒10 min,经无菌水漂洗后，在超净工作台处（紫外灭菌20～30min）接种于以配置好的（1）培养基,放入(27±1)℃的光照培养架中培养。光照周期为10 h(8:00~18:00)光照,12 h暗培养。种子苗具4~5叶时继代扩繁备用。 4. 烟草叶片愈伤诱导及不定芽分化 在超净工作台上取上述烟草无菌苗幼嫩叶片1~2片于无菌培养皿中，将叶片切成1.0～1.5平方厘米的小方块，接入（2）中培养。约2～3d后，叶片外植体卷曲、增厚、膨胀，15d后外植体脱分化形成疏松絮状浅黄绿色的愈伤组织，愈伤组织诱导率为100%。30d后，从叶片外植体产生的疏松愈伤组织上分化出许多浅黄绿色芽点。60d后，不仅从愈伤组织上分化出越来越多幼芽，芽诱导频率(芽数/块愈伤组织)为25～35，而且还可观察到，该愈伤组织较早分化产生的幼芽叶片呈现不同程度白化（或缺绿）。但此时若将此缺绿幼芽切下，转接至不加2,4-D的幼芽增殖培养基（3）上，3～5d后即可恢复正常，缺绿症状消失，并可不断增殖，发育成绿色健壮的小苗。光照时间8～12小时，温度通常在23～28℃之间。 5. 诱导生根及移栽 取约3～4cm长的无根小苗接种于生根培养基（4）中，约7～8d后，几乎所有外植体均从其基部产生白色幼根，根诱导频率为3～5，部分在培养基表面的根具大量白色根毛。当试管苗长至5～6cm高时，打开瓶口，在散射光下放置2d后取出，洗去根部残留培养基，种植于经过消毒的珍珠岩、泥炭土和菜园土等量混合的基质中，成活率可达95%以上。 四数据记录：

植物组织培养

烟草的再生 前言：广义上的植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织。器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。狭义上的植物组织培养指用植物各部分组织，如形成层。薄壁组织。叶肉组织。胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。目前广泛应用于科研及生产上的一种技术手段。 实验目的：对植物组织培养原理及过程有一个初步的了解，学习实验过程中的各种操作和方法。 实验原理：一个植物细胞能产生一个完整植株的固有能力称这为细胞的全能性（Cell totipotency）。换句话说，细胞全能性是指植物细胞具有全套遗传信息，不管是性细胞还是体细胞，在特定环境下仍能进行表达，而产生一个独立完整的个体。 细胞一旦脱离了母体植株，拜托了原来所受到的遗传上的控制和生理上的制约，在一定的培养条件下，就会发生一种回复变化，从而失去分化状态，变为分生细胞，实现脱分化过程。然后，这些脱分化细胞经过连续的有丝分裂，形成愈伤组织，即指在人工培养基上外植体长出来的一团无序生长的薄璧细胞。 脱分化细胞不断进行分裂，从而形成了愈伤组织，愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。这个过程叫做继代。 当试管苗在瓶内长满并长到瓶塞，或培养基利用完时就要转接，进行继代，可迅速得到大量试管苗，以便到一定数量时进行移栽。能否保持试管苗的继代培养，是能否得到大量试管苗和能否用于生产的重要问题。 因此，按培养过程可分为初代培养和继代培养两种类型： （1）初代培养（Primary culture）：指外植体的最初培养。

细胞工程实验-烟草叶片的组织培养

细胞工程学实验报告 专业：_ 09级生物技术一班__ 姓名：___ __ 学号：____ 09121007_ _

实验一实验室的设计及基本设备 一、实验室的设计 1、实验室设计的原因： 植物细胞工程实验室的流程是：清洗玻璃器皿、配制培养基、高压气灭菌、无菌操作、培养室培养植物、植物材料的检测。因此实验室需要有清洁器皿和配制培养基的准备室，无菌操作室或超净工作台，供培养材料用的培养室，检查培养情况并做记录的实验室。 一般在设计上，每个组分最好按工作的自然程序连续排列，如：准备室、灭菌室、无菌操作室、植物材料培养室、检测室。实验室的安排应合理简洁，并要求无尘、灭菌、光洁、清净。 2、实验室的布局要求： （1）准备室 准备室可以是一大间或几小间，主要用于进行一切与实验有关的准备工作：完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、器脿醮涤、培养基配制与分装、培养基和培养器皿的灭菌、培养材料的预处理等。必要的设备有:准备室应具备实验台、药品柜、水池、仪器、药品、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器等。 洗涤灭菌区 功能：完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。 要求：洗涤灭菌室根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在30-50m2。在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿。中央实验台还应配置2个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以购置一台洗瓶机。准备1-2个洗液缸，专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿，地面应耐湿并排水良好。 设备：水池、落水架、中央实验台、高压灭菌锅、超声波清洗器、干燥灭菌器（如烘箱）等。 （2）无菌室（接种室） 进行植物细胞、组织培养操作的关键是无菌条件。室内的墙壁要求光滑平整；地面为光洁的水磨石，平坦无缝，避免灰尘积累，便于清扫。紫外灯一般在3到4平方米内安装1到2只；在工作台下安置紫外灯紫外灯可使灭菌彻底。同时，工作台上方安装平板玻璃，以防操作时落灰。 条件不好时，用无菌箱代替无菌室，箱内用紫外灯灭菌。 功能：也叫接种室，主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序，是植物离体培养研究或生产中最关键的一步。 设备：紫外灯、空调、解剖镜、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针），实验台、搁架，还有超净工作台和整套灭菌接种仪器、药品等。 （3）培养室 功能：对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料进行控制条件下的培养，无论是研究性实验室还是生产性实验材料进行培养的场所。 要求：约需 10-20平方米左右，培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定，其设计以充分利用空间和节省能源为原则。基本要求是能够控制光照和温度，并保持相对的无菌环境，因此，培养室应保持清洁和适度干燥；为满足植物培养材料生长对气体的需要，还应安装排风窗和换气扇等培养室的换气装置；为节省能源和空间，应配置适宜的培养架，并安装日光灯照明。 室内温度由空调控制，光照由日光灯控制。天花板和内墙最好用塑料钢板装修，地面用水磨石或瓷砖铺设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊。

组培实验报告——烟草的再生

植物组织培养 题目：烟草的再生 姓名： 专业班级： 学号： 指导老师： 2012年10月13日

烟草的再生 前言 植物组织培养是指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养或试管培养。细胞全能性是指植物体的每一个具有完整细胞核的细胞都具有该物种全部遗传的物质，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。细胞全能性是植物组织培养的理论基础。 一个细胞一旦沿着某一条特定的途径分化发育后，一般不会再回复到未分化状态，但在组织培养条件下，可能发生脱分化和再分化。脱分化：将已分化的不分裂的静止细胞，放在培养基上培养后，细胞重新进入分裂状态。一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。再分化：经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型，形成完整植株的过程。 植物组织培养的过程： 植物组织培养的类型，按材料分为：愈伤组织培养、器官培养（胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织的培养）、细胞培养（悬浮细胞培养和单细胞培养）、原生质体培养。本次实验采用的就是器官培养，以烟草叶作为培养材料。 植物组织培养可以分为初代培养和继代培养。初代培养是指外植体的最初培养。继代培养是将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中这种反复多次移植的培养，成为继代培养。 植物组织培养的特点：1、培养条件可以人为控制。2、生长周期短，繁殖率高。 3、管理方便，利于工厂化生产和自动化控制。故植物组织培养具有良好的前景，可用于快速繁殖、种苗脱毒、远缘杂交、突变育种、单倍体育种等。 一、实验目的

1、了解掌握组织培养的基本概念和基本原理。 2、了解开展组织培养工作的基本设施。 3、了解无菌操作和组织培养的操作技术。 二、实验原理 植物体细胞具有细胞全能性。细胞一旦脱离了母体植株，拜托了原来所受到的遗传上的控制和生理上的制约，在一定的培养条件下，就会发生一种回复变化，从而失去分化状态，变为分生细胞，实现脱分化过程。然后，这些脱分化细胞经过连续的有丝分裂，形成愈伤组织，即指在人工培养基上外植体长出来的一团无序生长的薄璧细胞。当试管苗在瓶内长满并长到瓶塞，或培养基利用完时就要转接，进行继代，可迅速得到大量试管苗，以便到一定数量时进行移栽。 三、实验材料、药品及仪器 实验材料：烟草的叶片 实验药品：MS培养基所需的各类药品、蔗糖、琼脂条、1mol/LNaOH、70%酒精、升汞、蒸馏水 实验仪器：烧杯、玻璃棒、电子天平、电炉、容量瓶、pH计、塑料瓶、搪瓷杯、量筒、移液管、洗耳球、锥形瓶、漏斗、牛皮纸、棉线、高压蒸汽灭 菌锅、超净工作台、酒精灯、镊子、手术刀、接种针、培养皿、滤纸、 酒精棉培养箱、记号笔 四、实验步骤 （一）MS基本培养基贮备液的配制 在植物组织培养工作中，配制培养基是日常必备的工作。为了使用方便和用量准确，通常先配制一系列母液，即贮备液。所谓母液是欲配制液的浓缩液，这样不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏。一般母液配成比所需浓度高10-100倍。 按表1所示数据分别配制：①大量元素贮备液，②微量元素贮备液，③铁盐贮备液，④除蔗糖以外的有机物质贮备液和⑤CaCl2贮备液。

烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生

烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生 时光（200113813） 刘超（200113821） （01生物技术(2)班） 摘要: 植物组织培养是指在无菌的条件下，分离并在培养基中培养离体植物组织、器官或细胞的技术[1]。包括：器官培养，花药和花粉培养，组织培养，胚胎培养细胞培养，原生质体培养。其培养基是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节剂和有机附加物等五类物质。激素是植物组织培养的关键因素, 离体培养物的根芽分化取决于生长素/细胞分裂素的比值。另外，光照还影响到愈伤组织细胞之间的结合的紧密度和愈伤组织的色泽，以及再生植株的颜色,对芽的分化有显著性的影响。（摘要应概括论文试验主要结果） 关键词: 烟草，愈伤组织，诱导，植株再生 1．前言 细胞是生物体的结构单位和功能单位。细胞工程就是利用细胞的全能性，采用组织与细胞培养技术对动、植物进行修饰，为人类提供优良品种、产品和保存珍贵物种[2]。细胞工程主要包括体细胞融合，核移植，细胞器摄取和染色体片段的重组等。 植物组织培养是植物细胞工程中研究得比较早、也比较成熟的技术。试管苗的快速繁殖、无病毒植物的培育等研究成果已经处在应用、推广阶段[3]。 离体的植物器官、组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织。愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者叫做去分化。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化[4]。再分化形成的试管苗，移栽到地里，可以发育成完整的植物体。植物组织培养的过程可以简要归纳为： 影响植物细胞脱分化产生愈伤组织的一个重要因素是植物激素。当细胞分裂素与生长素共同使用时，能强烈地刺激愈伤组织的形成。植物激素还会影响到再分化过程中芽和根的发生。早在20世纪50年代初，我国植物生理学家崔徵等人就发现细胞分裂素与生长素之间的浓度比，可以调控植物组织培养过程中芽和根的形成[5]。当细胞分裂素与生长素的浓度比高时，有利于芽的发生；当浓度比低时，则有利于根的发生。 植物细胞只有脱离了植物体，在一定的外部因素作用下，经过细胞分裂形成愈伤组织，才表现出全能性，由愈伤组织细胞发育、分化出新的植物体[6]。 植物组织培养技术的应用范围是很广的，除了必修课中介绍过的快速繁殖、培育无病毒植物外，还可以通过大规模的植物细胞培养来生产药物、食品添加剂、香料、色素和杀虫剂等。例如，从大量培养的紫草愈伤组织中提取的紫草素，是制

彭勇 烟草组织培养实验报告

烟草组织培养 实验报告 单位：华中师大一附中 姓名：彭 勇 完成时间：2016.10.14

烟草组织培养 （彭 勇 华中师大一附中） 一 实验目的 1．熟悉植物组织培养技术的基本原理 2．掌握培养基制备、外植体处理、接种、培养观察等技术方法 3．理解外植体脱分化及再分化过程 二 实验原理 植物体细胞具有细胞全能性。在无菌且光照、温度、营养等培养条件适宜的情况下，离体的植物组织会经过脱分化过程形成愈伤组织，经再分化形成丛芽、生根最终发育成新的幼苗。 三 实验材料、药品及仪器 1．实验材料：脱毒烟草幼苗（川布兰公司提供） 2．实验药品：70%酒精、超纯水、MS培养基试剂盒等（试剂盒包含MS培养基干粉、pH试纸、激素A/B，川布兰公司提供） 3．仪器设备：微波炉、高压蒸汽灭菌锅、光照培养箱、电子天平、pH计、超经工作台、酒精灯等 4．器械及用具：镊子、手术剪、酒精灯、记号笔等 5．玻璃器皿：培养瓶（川布兰公司提供）、量筒、容量瓶、烧杯、培养皿等

四 实验简要过程与操作 1．操作间超净工作台的准备 将组培室操作间、超净工作台、光照培养箱等打扫清理干净，并用70%酒精对超净工作台等设备进行擦拭消毒，然后将操作间和超净工作台的紫外灯和风机打开，消毒30-60min。 2．培养基的制备 按照试剂盒附带说明书称量、溶解培养基干粉并用微波炉煮沸，定容后浓度浓度为42g/L；然后调节pH至6.0。其中用叶片诱导愈伤组织时，1L培养基需添加激素A 2mL、激素B 20μL；愈伤组织诱导丛芽、根的分化，以及用带芽的茎段直接诱导培养幼苗时，则无需添加激素A和B。 3．培养基的分装 将煮沸并定容后的培养基（呈现澄清透明状），冷却至约50℃（不烫手）时分装至培养瓶，每瓶分装约20-30mL，适当拧紧培养瓶盖。 4．器具及培养基的高压蒸汽灭菌 将分装好的培养瓶以及用牛皮纸包好的镊子、手术剪、培养皿等一并放入高压蒸汽灭菌锅内，121℃加热20min；灭菌完成后取出置于消毒好的超净工作台，待其自然冷却，培养基灭菌后在瓶底有少量铁锈色颗粒沉淀。 5．接种与培养

烟草叶片愈伤组织的诱导与植株再生

烟草叶片愈伤组织的诱导与植株再生 2001级生物科学1班 200113515 黄麟飞 摘要：在MS培养基上,接种烟草无菌苗的叶片,分别放在光照和黑暗条件下诱导愈伤组织,接种于MS分化培养基上,在光照下分化再生植株。结果表明:光照和植物生长调 节剂对植物愈伤组织的诱导和植株再生产生影响。 关键词: 烟草 愈伤组织 植株再生 Callus Inducement and Plant Regegeration Of Tobacco Huang Linfei Abstract: culture the leaves of tobacco into MS inducing medium separately under light and darkness. Then culture the induced callus into MSregeneration medium under under light. The result sayed that callus inducement and plant regeneration of tobacco was effected by light and plant grow regulators. Key Word: tobacco callus plant regeneration 二十一世纪是生命科学的时代，这一上世纪末科学家的语预言现在已经真切地在众多科技领域强大背景下款款而来了。1998年8月12日美国总统克林顿发表了美国生物物质研究战略,决定2000年拨款2.1亿美元作为研究经费。 日本于2000年制定了“21世纪生物技术发展规划”，并提出了“生物产业利国”的口号[1]。生物技术在医疗、保健、农业、环保、轻化工、食品等重要领域对改善人类健康与生存环境，提高农牧业与工业产量与质量都开始 发挥越来越重要的作用。 生物技术涵盖的技术领域范围很广，包括遗传工程、细胞融合、细胞组织培养、胚胎及细胞核移植等技术。其中细胞组织培养是诸多技术的基础。它又分为植物和动物的细胞组织培养。所谓植物细胞组织培养是指在无菌条件下利用人工培养基对植物细胞组织进行的培养。它在作物育种、花果蔬菜及中草药的脱毒和快繁方面具有其他技术[2]手段都无可比拟的优势。目前已经广泛应用于工农业生产、濒危植物的营救以及种质资源的保存、低等植物的生态研究等方面，为保护生态提供了理论依据[3]。 早在1902年，德国科学家哈伯兰特就预言植物细胞具有全能性，经过几十年的不断探索，美国人斯图尔德在20世纪50年代初，用胡萝卜体细胞经胚状体途径培养成完整植株，首次证明了植物细胞全能性。此后，植物细胞和组织培养发展迅速，目前大约有1500种植物能进行组织培养，其中包括烟草，早期的许多科学家就是把它作为研究对象。 烟草（tobacco），茄科烟草属（Nico tianal L.）含有尼古丁的叶用一年生作物，是烟草加工业的重要原料，同时也是医药、食品和饲料工业的原料之一。人类使用烟草大约有1500年的历史。印地安人于1519年开始在墨西哥栽培烟草。现在烟草的栽培种植已遍布世界，成为一种重要的经济作物[4][5]。 在本实验中，通过对烟草叶片愈伤组织诱导及植株再生，学习植物细胞组织培养责这 一技术以及观察分析外界条件对外植体生长发育的影响。 1材料与方法 1．1材料 将烟草种子用消毒液84#消毒后，无菌水反复洗3次，无菌吸水纸吸干水分，接种在

探究不同激素浓度配比与烟草叶片愈伤组织诱导的关系

组织培养报告 探究不同激素浓度配比与烟草叶片愈伤组织诱导的关系 姓名：郭林 学号：10121910202 组员：覃治祯 日期：2014年11月13日

目录 摘要 (2) 关键词 (2) 0背景 (2) 1材料和方法 (3) 1.1实验材料 (3) 1.2组织培养环境 (3) 1.3试剂和器材 (3) 1.3.1实验试剂 (3) 1.3.2实验仪器 (4) 1.4实验方法 (4) 1.4.1培养基的配制 (4) 1.4.2外植体前处理与接种 (4) 1.4.3观察产生愈伤组织 (5) 1.4.4愈伤组织的培养 (5) 2结果 (5) 2.1诱导率 (5) 2.2形态学 (5) 3讨论与分析 (7) 3.1外植体的选择 (7) 3.2内源激素对愈伤组织诱导的关系 (8) 3.3外源激素对愈伤组织诱导的影响 (9) 参考文献 (10) 附录 (12)

探究激素浓度配比与烟草叶片愈伤组织诱导的关系 摘要：本实验以MS培养基为基础培养，分别在MS+6-BA 1 mg/L +NAA 0.2 mg/L 和MS+6-BA0.1mg/L+NAA 0.5mg/L两种培养基上对烟草叶片进行愈伤组织的诱导，探究相同烟草叶片不同激素6-BA和NAA浓度配比对烟草叶片愈伤组织诱导的关系。结果表明在MS+6-BA 1 mg/L +NAA 0.2 mg/L培养基上诱导出的愈伤组织更利于叶的分化，且诱导出的愈伤组织的体积较大，在MS+6-BA0.1mg/L+NAA 0.5mg/L培养基上诱导出的愈伤组织更利于根的诱导，且诱导出的愈伤组织的体积较小。 关键词：烟草，脱分化，愈伤组织，培养基，激素 0背景 我国大多数师范院校都普遍开设植物生理学或植物生物技术类实验课程，其中植物组织培养技术作为一项基础技术成为必修实验。我校植物组织培养实验属于《植物生理学实验》课的一部分，实验内容以诱导叶片脱分化形成愈伤组织为主。实验部分仍然按照传统的教学环节进行培养基配制（3学时）和无菌操作（3学时），着重实验技术的指导与学习。 根据植物细胞全能性的原理，特别是在生长素和细胞分裂素的作用下，植物可以脱分化成愈伤组织。烟草（Nicotiana tabacum），茄科，多年生植物，是重要的模式生物，因此也被我校选为植物组织培养的材料。众所周知，生长素在植物体内分布是不均匀的，嫩叶中生长素分布较多，老叶中分布较少，在诱导植物形成越伤组织的过程中，内源激素在一定程度上也起着重要的调节作用。除此之外，选取的外源激素的浓度配比不同都会对愈伤组织有一定影响。胡伟、陈豫、伍洋等人在对不同激素浓度配比对萝卜愈伤组织形成的影响中发现，在以萝卜直根为实验材料，不同激素NAA、2,4-D、6-BA浓度配比对萝卜外植体形成愈伤组织诱导率和质量有一定的影响。[1]20世纪50年代以来，烟草愈伤组织的诱导遵循Skoog-MiUer分化模式：培养基内生长素和细胞分裂素的浓度和比值制约芽