融合蛋白标签

在蛋白质功能及结构研究过程中，研究的首要任务就是利用多种方法获得纯化的具有完整结构及生物学功能并能够正确折叠的高度纯化蛋白质。除了蛋白质的研究，具有特定生物活性的高价值蛋白质的生产也需要对蛋白质产品进行纯化。因此，科研人员和工业生产往往大量采用多种多样的表达系统来获得高表达的蛋白质，对其纯化后进行研究或加工，这些表达系统包括原核表达系统、酵母菌表达系统、昆虫动物细胞表达系统、真核细胞表达系统等。

如何将系统中表达的目标蛋白质与其他蛋白分离，一直是表达纯化中的一个重点。为了克服从复杂样品中纯化单一蛋白质这种困难，科学家利用生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别某种特定物质并与该物质分子特异性结合的能力，利用生物分子间的这种特异性结合能力而形成的亲和纯化技术。亲和标签纯化技术已广泛应用于蛋白质，特别是重组蛋白的分离纯化中。在重组蛋白的亲和纯化中，利用基因工程技术，将经过改造优化的亲和标签与目标蛋白融合表达，通过一步简单快速的亲和层析，直接获得纯度较高的重组融合蛋白，已成为重组蛋白纯化的一个通用方法，具有结合特异性高、纯化步骤简便、纯化条件温和、适用性广泛等优点，为蛋白质的有效纯化提供了一条解决的途径，广泛应用于蛋白质结构与功能的研究及重组蛋白纯化工艺的开发中。

自从20世纪70年代中期融合标签技术出现以来，亲和标签已成为一种重组蛋白纯化十分有效的工具，具有结合特异性高、纯化条件温和、纯化步骤简便、适用性广泛等显著优势。通常，亲和标签定义为对特定的生物或化学配基具有高度亲和力的一段氨基酸序列。到目前为止，已经出现了种类众多、功能各异、用途多样的亲和标签，极大地促进了对重组蛋白的有效纯化。

根据自身分子量大小的不同，亲和标签可以分为两大类：一类是结合固定化配基的短肽标签，如His-tag、FLAG-tag、Strep-tagⅡ等；另一类是识别小分子配基的蛋白标签，如GST、MBP等。

短肽标签：

His-tag：His标签是目前高通量蛋白纯化最普遍使用的亲和标签，广泛用于多种重组蛋白在各种表达系统的表达与纯化中。His标签一般为5~15个组氨酸，被认为是重组蛋白纯化的首选标签，具有以下优点：（1）位于目标蛋白Ｎ端的His标签与细菌的转录翻译机制相互兼容，利于蛋白的表达；（2）His标签几乎

不影响目标蛋白的理化性质；（3）His标签很小，不会改变目标蛋白的可溶性；（4）His标签在目标蛋白结晶后对蛋白结构几乎没有影响；（5）采用固定化金属离子亲和层析纯化His标签融合蛋白时，其操作非常简便。基于上述优点，几乎所有的大型结构基因组研究中心都把纯化His标签融合蛋白的固定化金属离子亲和层析（immobilized metal-ion affinity chromatography，IMAC）作为主要的蛋白纯化方法。

然而，并不是所有的蛋白质都可以与His标签融合后，采用固定化金属离子亲和层析分离纯化。宿主蛋白中含有半胱氨酸及天然发生的组氨酸丰富区域，在固定化金属离子亲和层析时可能会导致其他蛋白的非特异性结合；目标蛋白含有金属离子，一般也不采用His标签与固定化金属离子亲和层析。

FLAG-tag：除了His标签外，另一个广泛使用的小分子短肽标签是FLAG标签。FLAG标签是由8个氨基酸（DYKDDDDK）组成的一个短肽，分子量很小，因而不会遮盖融合蛋白中其他的蛋白表位与结构域，也不会改变融合蛋白的功能、分泌或运输。该标签具有天然的亲水特性，很容易定位于融合蛋白的表面，便于利用抗体检测；同时含有一个肠激酶切割位点（DDDK），可以利用肠激酶切除标签。FLAG标签有3个特异性的单克隆抗体，分别为M1单抗、M2单抗、M5单抗。FLAG 短肽合成成本较高，不适用于大规模纯化，且需要额外步骤除去结合在层析介质上的短肽。

Strep-tag Ⅱ：与His-tag、FLAG-tag相似，Strep-tag Ⅱ也是一个小分子的短肽标签，广泛用于多种目标蛋白在原核表达系统、哺乳动物细胞表达系统等的表达与纯化中。在自然界中，链霉亲和素（streptavidin）与生物素（biotin）之间存在着非常强烈的非共价相互作用，其生物学上的解离常数极低；即使生物素与其他蛋白质共价结合之后，两者仍可以相互作用。基于这两者之间的强烈相互作用，运用一系列蛋白质工程手段，通过对短肽文库的筛选，第一个链霉亲和素结合肽应运而生，即Strep-tag，极大地方便了重组蛋白的一步快速亲和纯化。然而，Strep-tag与链霉亲和素结合时需要一个自由的羧基末端，因而该标签只能位于目标蛋白的C端，限制了它的应用范围。在Strep-tag的基础上，通过对合成短肽的筛选，获得了一个与其相似、由８个氨基酸（WSHPQFEK）组成的链霉亲和素结合肽，即Strep-tagⅡ，可以位于融合蛋白的任意位置，从而弥补了

Strep-tag的不足。同时，通过对链霉亲和素特定氨基酸的定向突变，获得了与Strep-tagⅡ具有更高亲和力的亲和介质Strep-tactin，在Strep-tagⅡ融合蛋白的亲和纯化中表现出良好的纯化效果，且蛋白质产量较高，所需成本适中。Strep-tagⅡ系统的纯化条件比较宽泛，在普通缓冲液下就可与strep-Tactin 层析介质结合，使用2.5mmol/L的脱硫生物素就可将Strep-tagⅡ融合蛋白洗脱下来，螯合剂、去污剂、还原剂及高达1mol/L的盐均可加入到缓冲液中。此外，Strep-tag Ⅱ在纯化过程中不依赖金属离子，十分适合含金属离子蛋白质的纯化。

蛋白标签：

GST：GST标签由211个氨基酸组成，大小约为26kDa，是目前广泛用于重组蛋白融合表达与亲和纯化的一种蛋白标签。大量的表达实验发现，外源蛋白在大肠杆菌表达系统中过量表达时，常会以包涵体的形式形成不溶性的聚合体，大大降低了可溶性重组蛋白的产量，增加了后续蛋白分离纯化的难度。然而，在融合GST 标签进行原核表达的过程中发现，原本用于亲和纯化的GST标签能在一定程度上增大融合蛋白的可溶性，使融合蛋白以可溶形式存在于细胞质中，不仅促进了目标蛋白的正确折叠，提高了蛋白产量，而且有助于后续的蛋白纯化。除了增大融合蛋白的可溶性之外，GST标签还具有高效的翻译起始、纯化条件温和、亲和树脂成本相对低廉等显著优点，成为重组蛋白融合表达经常使用的亲和标签。MBP：MBP标签由大肠杆菌K12的malE基因编码的396个氨基酸组成，大小约为40kDa，是除了GST标签之外又一个很好的增大融合蛋白可溶性的蛋白标签。MBP 标签能够增大在原核表达系统中过量表达的融合蛋白的可溶性，提高其表达量，已在多个表达实验中得到确认。研究发现，当改变MBP“开放”与“关闭”构象之间的平衡时，MBP增大融合蛋白可溶性的能力将受到明显影响，表明 MBP增大融合蛋白可溶性的特性是由其“开放”构象所介导；同时，对MBP配基结合间隙中保守的疏水性氨基酸残基进行定向突变，MBP表现出相似的表型，表明这个配基结合间隙在MBP增大融合蛋白可溶性的机制中具有一定的作用。

然而，从蛋白纯化的角度来看，MBP标签并不是一个最有效的亲和标签；在某些情况下，MBP标签并不能特异性地与亲和树脂有效结合，亲和层析后融合蛋白的纯度也并不合适。

自从上世纪70年代中期亲和标签融合技术出现以来，多种多样的短肽或蛋白亲和标签极大地方便了外源表达重组蛋白的分离与蛋白质复合体的纯化，已成为蛋白质研究领域不可或缺的工具。一般而言，一个完美的亲和标签应该具备以下特性：（1）能够用于纯化任何表达宿主或表达系统所表达的重组蛋白；（2）可以位于目标蛋白的任意位置而不影响其结构；（3）增大目标蛋白的可溶性，促进其正确折叠，提高蛋白表达量；（4）便于重组蛋白的检测。目前，商品化的亲和标签已具备其中诸多特性，但性能更加优越、纯化效果更加显著的亲和标签仍需不断寻找与开发。

重组蛋白表达技术现已经广泛应用于生物学各个具体领域。特别是体内功能研究和蛋白质的大规模生产都需要应用重组蛋白表达载体。

美国GeneCopoeia的蛋白表达载体按照表达宿主的不同新推出3类，分别为表达宿主为大肠杆菌，哺乳动物细胞的，以及慢病毒载体，宿主可以为哺乳动物细胞和原代细胞。

除了必要的复制和筛选的元件，协助表达和翻译的元件外，本文将各类载体分别按照功能标签的不同确定种类并将个标签的功能初步介绍如下：His6：

His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N 末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。

使用His-tag有下面优点：

1.标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能；

2.His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性；

3.His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究；

4.His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体；

5.可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；

6.可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。

Flag:

Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。

FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：

1.FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会

影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。

2.融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。

3.FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。

4.融合在N端的FLAG，其可以被肠激酶切除（DDDK），从而得到特异的目的蛋白。因此现FLAG标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。

MBP:

MBP（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割标签。如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。

纯化：融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。结合亲和力在微摩尔范围。一些融合蛋白在0.2% Triton X-100或0.25% Tween 20存在下不能有效结合，而其他融合蛋白则不受影响。缓冲条件为pH7.0到8.5，盐浓度可高达1M，但不能使用变性剂。如果要去除MBP融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。

检测：可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。

GST:

GST(谷胱甘肽巯基转移酶) 标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26KD。将它应

用在原核表达的原因大致有两个，一个是因为它是一个高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用。GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达，可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。结合的融合蛋白在非变性条件下用10mM 还原型谷胱甘肽洗脱。在大多数情况下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二体。GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测。标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。在大多数情况下GST融合蛋白

是完全或部分可溶的。

纯化：该表达系统表达的GST标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathionesepharose)亲和树脂进行纯化。GST标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力，因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂如：盐酸胍或尿素等。

如果要去除GST融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。

检测：可用GST抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。

HA

HA标签蛋白，标签序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇，9个氨基酸，对外源靶蛋白的空间结构影响小, 容易构建成标签蛋白融合到N端或者C端。易于用Anti－HA抗体检测和ELISA检测。

c-Myc

C-Myc标签蛋白，是一个含11个氨基酸的小标签，标签序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，这11个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。C-Myc tag已成功应用在Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中, 可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。

eGFP/eCFP/eYFP/mCherry

分别是增强型绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/单体红色荧光蛋白,具有不同的激发波长发射波长为，均由野生型荧光蛋白通过氨基酸突变和密码子优化而来。就eGFP而言，相对于GFP，其荧光强度更强、荧光性质更稳定。同时载体中构建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。mCherry是从DsRed演化来的性能最好的一个单体红色荧光蛋白，可以和GFP系列荧光蛋白共用，实现多色标记体内、外实验表明，mCherry在N端和C端融合外源蛋白时，荧光蛋白活性和被融合的目标蛋白功能相互没有明显影响。这些荧光标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：

1.不用破碎组织细胞和不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达情况，而且荧光性质稳定，被誉为活细

胞探针。

2.其自发荧光，不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况。

3.同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测，从而使其检测更显得快速、简便、灵敏度高而且重现性。

4.其低消耗、高灵敏度检测，十分适用于高通量的药物筛选。因此现eGFP 表达标签被广泛地应用于基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。

5.mCherry红色荧光蛋白在标记病毒颗粒，研究病毒和宿主细胞之间更有得天独厚的优势。如用mRFP或mCherry标记HIV病毒颗粒，研究H1V和宿主细胞问的相互作用以及HIV侵染宿主细胞的过程．用mRFP标记慢病毒颗粒，研究慢病毒在小鼠体内的复制过程等。

荧光素酶

来源于生物体内的荧光素，常见的有萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶和Guassia荧光素酶。这些荧光素酶作为“报告蛋白”被用于分子生物学研究中，这种技术被称为报告基因检测法或萤光素酶检测法（Luciferase Assay）。跟普通融合蛋白标签不同，使用荧光素酶构建的报告基因可用作目的基因的定量分析。因此常用于研究启动子、miRNA 3'UTR克隆的功能与调控，因为它们对目的基因的调控可以是渐变的，而不是简单的开和关两种状态。

优点：灵敏度高，检测幅度宽；不是哺乳动物细胞内源性基因；重复性好；与HTS兼容等。萤火虫和海肾荧光素酶已经被广泛应用于协同报告并进行均一化研究。由于它们都是快速，容易和高灵敏的监测方法。而且萤火虫和海肾荧光素酶是理想的双基因报告系统，因为它们来源于不同的生物进化方向，蛋白结构和底物差异都很大，在实验中不会产生相互影响。

基于荧光素酶的特性，我司研发提供的Secrete-Pair? Dual Luminescence Assay Kit可用于分析双报告系统中Gaussia荧光素酶（GLuc）和分泌型碱性磷酸酶(SEAP)活性。GLuc 和SEAP均为分泌型报告蛋白，无需裂解细胞即可便捷的从细胞培养液中取得样本，并对实验结果进行精准的实时分析。

Avi Tag

AviTag标签蛋白是一个15 个氨基酸的短肽，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的N端和C端。融合表达后，可被生物素连接酶生物素化，为了纯化重组蛋白选用低亲和性的单体抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白质分离纯化，还用于蛋白质相互作用研究。

Avi Tag标签系统具有以下几大优点:

1.无论在体外或者体内，几乎所有的蛋白都可以在一个独特的Avi Tag位点轻易且有效地被生物素化；

2.生物素化是通过酶和底物的反应来实现，反应条件相当温和而且标记的专一性极高；

3.生物素AviTag只有15个氨基酸，对蛋白空间结构的影响非常小。

SNAP-Tag

SNAP-Tag是新一代的蛋白标签技术，不仅专一性极高而且稳定，最大的优点是适用于多种环境下的蛋白质检测与纯化，如活细胞内、溶液中、或固态相(如SDS-PAGE gels)等。

SNAP-Tag是从人的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移（O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase）获得。无论体内还是体外，SNAP-Tag 都能与底物高特异性地共价结合，使蛋白标记上生物素或荧光基团（如荧光素和若丹明）。SNAP所带的活性巯基位点接受了苯甲基鸟嘌呤所携带的侧链苯甲基基团，释放出了鸟嘌呤。这种新的硫醚键共价结合使SNAP所带的目的蛋白携带上了苯甲基基团所带的标记物。苯甲基鸟嘌呤在生化条件下稳定，并且没有其他蛋白会和这类物质作用，所以SNAP标签反应是高特异的。

检测：生物素或各种颜色荧光的底物（如荧光素、若丹明）可渗透进入细胞，方便快捷地进行活细胞内SNAP-Tag融合蛋白的标记与检测。它们也可特异性地标记大肠杆菌，酵母和哺乳动物等细胞抽提液或已经纯化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。

将纯化的或未纯化的SNAP-Tag融合蛋白与表面固定了苯甲基鸟嘌呤的基质混合，蛋白即可特异与底物作用，形成共价键，融合蛋白间接被固定在了基质表面上，可以达到更方便快捷地研究蛋白功能或纯化蛋白的目的。

Halo Tag

HaloTag?标签蛋白是一种脱卤素酶的遗传修饰衍生物，可与多种合成的HaloTag?配基有效地共价结合。这个分子量为33KDa的单体蛋白能融合在重组蛋白的N端或C 端，并在原核和真核系统中表达。

HaloTag?配基是小分子化学物，能够在体外或体内与HaloTag?蛋白共价结合。这些配基由两个关键组分组成：(1)一个通用的HaloTag?反应联结子，结合HaloTag?蛋白；(2)一个功能基团,例如荧光染料或亲和媒介。

能够共价和特异性结合多种合成的报告基团和亲和配基的特性，使得HaloTag?蛋白能够用于检测和亲和结合或固相化固定目的蛋白。

SUMO

SUMO标签蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白（Small ubiquitin-likemodifier），是泛素(ubiquitin)类多肽链超家族的重要成员之一。在一级结构上，SUMO与泛素只有18%的同源性，然而两者的三级结构及其生物学功能却十分相似。研究发现SUMO可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不但可以进一步提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。

此外SUMO还有一项重要的应用，就是可用于完整地切除标签蛋白，得到天然蛋白。因为SUMO蛋白水解酶（我公司可提供）能识别完整的SUMO标签蛋白序列，并能高效地把SUMO从融合蛋白上切割下来。切除SUMO后，经过亲和层析，去除标签蛋白部分，就得到和天然蛋白一样的重组蛋白。所以SUMO标签也常用于和其他标签一起应用，作为特异酶切水解位点。

常见tag蛋白标签介绍

蛋白标签 蛋白标签（proteintag ）是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia （复能基因）为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag ?、Halo Tag?、AviTag ?、Sumo等；也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询克隆产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 标签纯化促进溶解度抗体效价细胞标记 His6++/-+/- Flag++/-+ GST+++ MBP++++ His-MBP++++ HA+ eGFP/CFP/YFP+++ Myc+ His-Myc++ His-AviTag ?++++++ Sumo++++ His-Sumo+++++ SNAP-Tag ?++++++ Halo Tag ?++++++ TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特 的结构特征（结合配体）利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析（IMAC），对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的分子量小，只有?0.84KD，而GST和蛋白A分别为?26KD和?30KD，—般不影响目标蛋白的功能； His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性； His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究； His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和； 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK ），同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：

融合蛋白定义

融合蛋白 科技名词定义 中文名称：融合蛋白 英文名称：fusion protein 定义1：融合基因的表达产物，或通过生物学和化学方法融合的两个或两个以上蛋白质。 所属学科：免疫学（一级学科）；应用免疫（二级学科）；免疫学检测和诊断（三级学科） 定义2：通过基因工程方法将编码不同蛋白质的基因片段按照正确的读框进行重组，将其表达后获得的新蛋白质。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科） 定义3：由两段或多段基因序列串联形成的融合基因表达所产生的蛋白质。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 目录

融合蛋白 - 技术概况融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进 行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。 技术特点 融合蛋白 融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌) 也可在真核细胞中进行表达。 原核表达系统的特点是时程短，费用低，是科研中的主要工具。其缺点是真核蛋白表达没有得到确切修饰；大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物，需要复杂的变性和复性过程；大量蛋白的分泌较困难。真核表达系统的特点是蛋白翻译后加工机会多，甚至可被改造成人源型；真核细胞易被转染，具有遗传稳定性和可重复性；产物可被分泌，提纯简单，成本低。 技术内容 构建融合蛋白的基本原则是，将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。具体步骤有： 1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则，设计合适的引物序列，以cDNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。 2.在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。 3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。 4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化。 技术关键 在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的接头序列( Linker )，即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。 一般来说， 3-5 个氨基酸的Linker 可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。有人尝试在融合蛋白间加入一段有疏水性和一定伸展性的较长肽链，如(Gly4Ser1)，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用，并获得了满意的结果。但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融合蛋

FLAG标签融合蛋白纯化试剂盒使用说明书

FLAG标签（DYKDDDDK）融合蛋白纯化试剂盒 Cat#：KAP0064 （本品仅用于科学研究，不可用于诊断及治疗） 1.背景信息 Flag-Tag（DYKDDDDK），常用于真核蛋白质重组表达标记。FLAG标签（DYKDDDDK）融合蛋白纯化试剂盒，主要成分是Anti-Flag亲和纯化凝胶（Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel），由高品质的Flag兔多克隆抗体与Sepharose 4B琼脂糖颗粒共价偶联制成，具有高载量（至少为1.2mg protein/ml凝胶），高特异性，性质稳定，可反复使用的特点，可用于Flag 标签融合蛋白的亲和纯化。 2.性能指标 应用范围：可用于Met修饰的N端Flag融合蛋白（Met-Flag–Protein），N端Flag融合蛋白（Flag–Protein）和C端Flag融合蛋白（Protein-Flag）的亲和纯化。 载量：1ml Sepharose 4B琼脂糖颗粒，共价偶联800μg Anti-Flag 兔多克隆抗体，可纯化至少1.2mg Flag融合蛋白。 强度：重力柱纯化，可反复使用5次以上。 保存方法：在加入了50%甘油和0.2‰叠氮钠的PBS保存液后，预装纯化柱可于-20℃可保存1年。 3.试剂盒组成 50 mM Tris HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, and 1% Triton X-100（说明见5.3）

4.使用方法 4.1细胞裂解液制备 4.1.1悬浮细胞和半贴壁细胞从细胞培养瓶上吹下来后放入离心管中， 1000rpm离心5分钟。贴壁细胞用细胞刮子轻轻从瓶壁上刮下来，放入离 心管中1000rpm离心5分钟。 4.1.2预冷的PBS工作液重悬细胞，1000rpm离心3min，弃上清。重复一次。 4.1.3根据细胞的量加入相应体积的细胞裂解液，反复吹打后冰上放置 10-20min，让细胞充分裂解。 4.1.4用超声破碎仪将细胞裂解液超声，直至细胞裂解液透明，不再粘稠。冰上 放置30min之后，12000rpm，4℃离心10min。取上清，冷冻保存。 4.2装柱及孵育 4.2.110ml（10倍柱体积）PBS清洗Anti-Flag亲和纯化柱。 4.2.2加入含有目标蛋白的真核细胞裂解液，室温孵育或者4℃孵育过夜。 4.2.3根据蛋白质性质选择洗脱方法，具体可参见第5部分问题和建议 5.1。 4.33xFlag peptide洗脱液竞争洗脱 4.3.1用1xPBS配制3×Flag peptide洗脱液，终浓度为100μg/ml。 4.3.2加入10ml 3×Flag peptide洗脱液（10倍柱体积）进行洗脱，每次收集 1ml。 4.3.3用紫外检测仪测定收集液, 合并收集液。 4.3.4SDS-PAGE鉴定蛋白质纯度及浓度，并按照需求处理和保存蛋白质。 4.4酸性洗脱液酸性洗脱 4.4.15ml PBS（5倍柱体积）洗柱三次。 4.4.2预冷的5ml pH 5.0酸性预洗液（5倍柱体积）洗涤纯化柱，除去非特异性 结合蛋白。

His融合蛋白纯化中常见问题解答集锦0

His融合蛋白纯化中常见问题解答集锦（二） GE Healthcare产品专家：查业、朱燕 His标签的纯化方式是最常用的亲和层析的方法之一，镍离子作为纯化His融合蛋白的首选金属离子，镍填料的具体使用方法也成为用户比较关心的问题。继His融合蛋白纯化中常见问题解答集锦第一期収表后，应用户的需求，我们现推出第二 期，内容如下： 1. 使用几次以后发现镍柱的载量下降，挂柱效率降低，如何处理？HisTrap或Ni填料怎么进行有效的再 生或清洗？ 答： 如果镍柱的载量下降或者挂柱效率降低，可能是由于逐渐积累的沉淀、变性或非特异结合的蛋白占据了有效的结合位点，而通过洗脱液无法彻底清洗所致。 建议可以采用不同的清洗方法来提高载量： 1）较温和的清洗方法 为了去除沉淀或变性物质，可以尝试用2倍柱体积的6M盐酸胍或8M尿素洗涤，然后用5倍柱体积的缓冲液洗涤；为去除疏水结合的物质，可以尝试2倍柱体积1%的Triton X-100洗涤，然后用5倍柱体积的缓冲液洗涤。若改变不明显，可以选择下面更强烈的清洗方法。 2) 更强烈的清洗方法 首先用5－10倍柱体积的脱镍缓冲液（20 mM 磷酸钠, 0.5 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7.4）洗涤，迚行脱镍操作，然后用5－10倍柱体积的平衡缓冲液冲洗，最后用5－10倍柱体积的双蒸水冲洗； 随后迚行清洗操作，去除离子型杂蛋白，可以用5倍柱体积的1.5 M NaCl溶液，然后10倍柱体积的双蒸水冲洗；去除沉淀或变性蛋白，可以用1M氢氧化钠溶液，结合1－2小时，然后用10倍柱体积的平衡缓冲液和10倍柱体积的双蒸水迚行冲洗；去除疏水蛋白或者脂蛋白，可以用5－10倍柱体积的30%异丙醇溶液清洗，然后10倍柱体积的双蒸水洗涤； 最后迚行生镍操作，用0.1M硫酸镍上柱，随后5倍柱体积的双蒸水和平衡缓冲液迚行洗涤，如需保存，保存在20%乙醇溶液即可。 2. 通过组氨酸标签纯化的蛋白，杂带比较多，如何改进？ 答： 可能原因1），蛋白酶部分降解目的蛋白，可通过加入蛋白酶抑制剂改进；可能原因2），杂蛋白对金属离子有高亲和力，可用分步洗脱或咪唑浓度线性梯度洗脱来确定在结合和洗涤过程中最优的咪唑浓度。在样品中加入和平衡液相同浓度的咪唑。可能原因3),杂蛋白和目的蛋白结合，可通过超声前加入去垢剂的方式消除。更详细的信息，也可同时参考第I期内容。 另外推荐使用我公司的新产品HisTrap Talon，可获得更高纯度的纯化产物。 3. 镍柱使用中出现棕色是怎么回事? 答： 出现这样的情况，主要是缓冲液中DTT的影响， DTT会对镍柱的颜色和纯化效率有很大的影响,在碱性的缓冲液条件下，镍离子会被DTT还原生成棕色的沉淀，所以所有镍柱的生产商都强调要尽量避免DTT的参与。 对于我公司的普通镍填料，尽管在3mMDTT时颜色会収生变化，但此浓度对填料性能没有任何影响，因此，若您的样品中含有DTT，在上样之前, 我们推荐采用不含还原性试剂的空白运行来除去任何较弱结合的镍离子；当不使用时，勿将 Ni Sepharose 6 Fast Flow保存于含还原性试剂的缓冲液中。空白运行方法（使用不含还原剂的平衡液和洗脱液）1）5倍柱体积的双蒸水洗柱；2）5倍柱体积的平衡液洗柱；3）5倍柱体积的洗脱液洗柱；4）10倍柱体积的平衡液平衡。 另外我公司新推出的镍填料Excel系列（Ni Sepharose? excel，HisTrap? excel 和His Mag Sepharose excel）可以耐受5mMDTT，10mM EDTA，1M NaOH，相信对还原剂有依赖性的样品来说，是非常好的选择；且该新填料支持大规模分泌型上清样品的上样，同时镍离子的螯合不会受到影响。

荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用

荧光标记技术在蛋白质定位及功能研究中的应用 Feb 20, 2010No Comments 随着分子生物学、有机化学以及材料科学等学科的进展，最近我们又获得了好几种新型的荧光蛋白标签，这些标签可以用于细胞生物学成像研究。本文将对荧光标志物在蛋白质研究中的优势及劣势进行一番详细的介绍，文章中将重点介绍如何使用荧光标志物研究活体细胞（而不是固定细胞）中的靶蛋白。使用该方法可以对靶蛋白的表达情况、细胞中的定位情况、活性状态等指标进行研究，还将介绍将荧光显微镜与电子显微镜技术相结合的可行性问题。小分子荧光标志物染料、纳米晶体材料，即所谓的“量子点（quantum dots）”材料、自发荧光蛋白、小分子蛋白质标签等等这些材料都可以作为荧光标志物，而且将这几种材料“混合”起来是一种非常有前途的荧光标志物研究新思路。 我们使用荧光技术来研究细胞生物学已经好多年了，而且在从微小的分子层面到完整的有机体层面等各个层面都可以使用荧光技术进行研究。最开始使用的方法是将小分子有机染料与各种抗体相连接，来研究各种目的蛋白。不过这种使用抗体的方法如果需要对细胞内的蛋白质进行研究时，还需要对细胞进行固定和透化操作。因此后来又发展出可以直接在活体细胞内标记某种细胞器、核酸分子或某些离子的荧光标志物。在最近这10年里，荧光蛋白的出现使得进行非侵入性的活体细胞成像成为了可能。使用这种荧光蛋白标志物，我们可以研究目的基因的表达情况，蛋白质运输情况以及各种细胞内动态的生物化学信号通路。使用经过遗传修饰的小分子有机荧光标志物构建的混合系统，我们还可以对蛋白质的寿命进行研究，如果再结合电镜技术和快速光淬灭技术（rapid photoinactivation）还可以对蛋白质的定位情况进行研究。与此同时，半导体纳米晶体材料技术也得到了高度的发展，现在，这种新型的材料在亮度和光稳定性方面都要比传统的荧光标志物好得多，只不过现在这种材料的靶向性还不是很好。本文中我们将对目前荧光标志物及其相关技术的发展进行介绍，同时还将介绍荧光标志物在蛋白质表达、蛋白质活性以及蛋白质功能研究工作中的作用进行介绍。 ?0?2 荧光标志物 小分子有机染料 小分子有机染料是指分子量小于1KD的小分子物质，这种小分子有机染料可以通过与生物大分子共价连接的方式对其进行标记，我们现在对这种染料的最佳检测波长范围、亮度，即吸光系数、光稳定性和自我淬灭特性都有了比较详尽的了解。利用荧光染料的分子策略包括扩展共轭双键、额外添加环状结构增强其刚性、用氟或磺酸盐这类吸电子性的或带电荷的物质进行修饰等。现在市面上已经有数百种这类荧光染料的商业化产品可供选择，而且还在不断增加之中。不过由于这类染料对蛋白质缺乏特异性，因此多与抗体联用（图1A~C）。?0?2 荧光蛋白 第一批用于细胞生物学的荧光蛋白包括藻胆蛋白（phycobiliproteins）和从蓝藻

融合蛋白标签

在蛋白质功能及结构研究过程中，研究的首要任务就是利用多种方法获得纯化的具有完整结构及生物学功能并能够正确折叠的高度纯化蛋白质。除了蛋白质的研究，具有特定生物活性的高价值蛋白质的生产也需要对蛋白质产品进行纯化。因此，科研人员和工业生产往往大量采用多种多样的表达系统来获得高表达的蛋白质，对其纯化后进行研究或加工，这些表达系统包括原核表达系统、酵母菌表达系统、昆虫动物细胞表达系统、真核细胞表达系统等。 如何将系统中表达的目标蛋白质与其他蛋白分离，一直是表达纯化中的一个重点。为了克服从复杂样品中纯化单一蛋白质这种困难，科学家利用生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别某种特定物质并与该物质分子特异性结合的能力，利用生物分子间的这种特异性结合能力而形成的亲和纯化技术。亲和标签纯化技术已广泛应用于蛋白质，特别是重组蛋白的分离纯化中。在重组蛋白的亲和纯化中，利用基因工程技术，将经过改造优化的亲和标签与目标蛋白融合表达，通过一步简单快速的亲和层析，直接获得纯度较高的重组融合蛋白，已成为重组蛋白纯化的一个通用方法，具有结合特异性高、纯化步骤简便、纯化条件温和、适用性广泛等优点，为蛋白质的有效纯化提供了一条解决的途径，广泛应用于蛋白质结构与功能的研究及重组蛋白纯化工艺的开发中。 自从20世纪70年代中期融合标签技术出现以来，亲和标签已成为一种重组蛋白纯化十分有效的工具，具有结合特异性高、纯化条件温和、纯化步骤简便、适用性广泛等显著优势。通常，亲和标签定义为对特定的生物或化学配基具有高度亲和力的一段氨基酸序列。到目前为止，已经出现了种类众多、功能各异、用途多样的亲和标签，极大地促进了对重组蛋白的有效纯化。 根据自身分子量大小的不同，亲和标签可以分为两大类：一类是结合固定化配基的短肽标签，如His-tag、FLAG-tag、Strep-tagⅡ等；另一类是识别小分子配基的蛋白标签，如GST、MBP等。 短肽标签： His-tag：His标签是目前高通量蛋白纯化最普遍使用的亲和标签，广泛用于多种重组蛋白在各种表达系统的表达与纯化中。His标签一般为5~15个组氨酸，被认为是重组蛋白纯化的首选标签，具有以下优点：（1）位于目标蛋白Ｎ端的His标签与细菌的转录翻译机制相互兼容，利于蛋白的表达；（2）His标签几乎

常见tag蛋白标签介绍

蛋白标签 蛋白标签（proteintag）是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia（复能基因）为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag ?、Sumo等；也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询克隆产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 标签纯化促进溶解 度 抗体效价细胞标记 His6++/-+/- Flag++/-+ GST+++ MBP++++ His-MBP++++ HA+ eGFP/CFP/YFP+++ Myc+ His-Myc++ His-AviTag?++++++ Sumo++++ His-Sumo+++++ SNAP-Tag?++++++ Halo Tag?++++++ TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： ·标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能； ·His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性； ·His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究； ·His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 ·可应用于多种表达系统，纯化的条件温和； ·可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： ·FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 ·融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。·FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。·融合在N端的FLAG，其可以被肠激酶切除（DDDK），从而得到特异的目的蛋白。因此现FLAG标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。

各种蛋白标签汇总

各种蛋白标签汇总标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]

各种蛋白标签汇总 蛋白标签 蛋白标签（proteintag）是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 标签纯化促进溶解度抗体效价细胞标记 His6++/-+/- Flag++/-+ GST+++ MBP++++ His-MBP++++ HA+ eGFP/CFP/YFP+++ Myc+ His-Myc++ His-AviTag++++++ Sumo++++ His-Sumo+++++ SNAP-Tag++++++ Halo Tag++++++ TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的分子量小，只有~，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能； His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性； His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究； His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和； 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。 FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。

蛋白表达标签

蛋白质融合表达的标签及切割研究 蛋白质融合表达的标签及切割研究 摘要：随着蛋白质组学技术的迅猛发展，重组蛋白的使用在近年来大大增加。许多蛋白质、结构域或者肽类能与目标蛋白融合。利用融合蛋白的有助于目标蛋白的纯化和检测这个优点被广泛赞同。本文对多种融合标签及切割方法做了简单的概述。 引言 近年来,一些抗原表位的肽类和蛋白质已被用于大量生产重组蛋白质.这些亲和标签系统具有以下特征:(a)一步的吸附纯化,(b)对三级结构和生物活性影响小,(c)可方便且专一的去除以产生天然蛋白质,(d)在纯化过程中重组蛋白的分析简便准确,(e)适用于大量的不同蛋白质.有几种不同的策略用于大规模生产重组蛋白质.其中一种办法是使用很小的肽标签,这些标签不会与融合的蛋白质发生干扰.使用最为广泛的有多聚精氨酸,FLAG-,多聚组氨酸-, S-, and Strep II-tag等. 对于某些应用,小标签无需去除.这些标签不像大标签具有免疫原性,经常可以直接作为抗原用于产生抗体. 小标签对于融合蛋白的三级结构和生物活性的影响取决于标签的位置和氨基酸组成.另一种方法是使用大的肽类或蛋白质作为融合蛋白.，它们的使用可以增加目标蛋白的溶解性.缺点是对于一些应用如结晶或抗体产生等,标签必须加以去除.一般来说,对于特定的目标蛋白很难决定最佳的融合系统.这取决于目标蛋白本身(如稳定性,疏水性),表达系统,纯化后蛋白的用途. 1．融合标签 融合标签的作用是用于检测和纯化目的蛋白，有时也用来增加目的蛋白在细胞质中的可溶性或帮助将目的蛋白运转到细胞周质中以提高目的蛋白的生物活性。

1 .1多聚精氨酸-标签(Arg-tag) 精氨酸-标签通常由5或6个精氨酸组成.它已被成功用作细菌C末端标签,精氨酸是碱性最强的氨基酸,带5个精氨酸标签的蛋白质可以结合到阳离子交换树脂SP-Sephadex上, 而大部分杂蛋白不结合.结合后,带标签的蛋白质在碱性pH下运行线性NaCl梯度洗脱得到.当C末端为疏水性区域时,多聚精氨酸可能影响蛋白质的三级结构.氨酸残基的C末端序列可用羧肽酶B处理去除.这一酶促处理已被成功用于一些例子,但常常由 于低的切割得率或者在期望的蛋白质序列间发生不必要的切割而受到限制.然而精氨酸标签并不常用,与第二标签联用是很有趣的蛋白质纯化工具. 1．2 多聚组氨酸-标签(His-tag) 已广泛采用的方法是利用固定化金属螯合层析纯化带有由多聚组氨酸残基组成的一个短的亲和标签的重组蛋白质.固定化金属螯合层析的基础是固定在基质上的过渡态金属离子(Co2+, Ni2+,Cu2+, Zn2+)与特定的氨基酸侧链之间的相互作用.组氨酸是与固定化金属离子作用最强

HA标签融合蛋白纯化试剂盒

HA标签（YPYDVPDYA）融合蛋白纯化试剂盒 Cat#：KAP0063 （本品仅用于科学研究，不可用于诊断及治疗） 1.背景信息 HA-Tag（YPYDVPDYA），常用于真核蛋白质重组表达标记。HA标签（YPYDVPDYA）融合蛋白纯化试剂盒，主要成分是Anti-HA亲和纯化凝胶（Anti-YPYDVPDYA (HA) Affinity Gel），由高品质的HA兔多克隆抗体与Sepharose 4B琼脂糖颗粒共价偶联制成，具有高载量（至少为1.2mg protein/ml 凝胶），高特异性，性质稳定，可反复使用的特点，可用于HA标签融合蛋白的亲和纯化。 2.性能指标 应用范围：可用于Met修饰的N端HA融合蛋白（Met-HA–Protein），N端HA融合蛋白（HA–Protein），C端HA融合蛋白（Protein-HA）及中部HA融合蛋白的亲和纯化。 载量：1ml Sepharose 4B琼脂糖颗粒，共价偶联800μg Anti-HA 兔多克隆抗体，可结合至少1.2mg HA融合蛋白。 强度：重力柱纯化，可反复使用5次以上。 保存方法：在加入了50%甘油和0.2‰叠氮钠的PBS保存液后，预装纯化柱可于-20℃可保存1年。3.试剂盒组成 -100（说明见5.3）

注意事项（开箱前必读） 3.1本试剂盒冷藏条件下运输，如果暂时不用，请将纯化柱（空柱）取出，室温保存；亲和凝胶于-20℃ 保存；试剂盒及其它成分保存于4℃。 3.2HA peptide溶解方法：该多肽为轻质粉末，开盖前应离心。建议将40ul 10xPBS溶液加至 1mg多肽粉末中，彻底溶解后，加入160ul双蒸水，制成5mg/ml储存液，-20℃保存。使用 时用1xPBS稀释至需要的浓度。按需求浓度稀释至工作浓度。 3.3有文献显示，与传统的Glycine-HCl洗脱液相比，本试剂盒提供的pH3.0的Arginine-HCl做为 洗脱液，可以减少蛋白质变性，延长抗体亲和纯化柱的使用寿命。客户也可以根据实际情况自行 选用配制 4.使用方法（所有步骤尽可能在冰上进行，以避免目标蛋白质降解。） 4.1细胞裂解液制备 4.1.1悬浮细胞和半贴壁细胞从细胞培养瓶上吹下来后放入离心管中，1000rpm离心5分 钟。贴壁细胞用细胞刮子轻轻从瓶壁上刮下来，放入离心管中1000rpm离心5分钟。 4.1.2预冷的PBS工作液重悬细胞，1000rpm离心3min，弃上清。重复一次。 4.1.3根据细胞的量加入相应体积的细胞裂解液，反复吹打后冰上放置10-20min，让细胞 充分裂解。 4.1.4用超声破碎仪将细胞裂解液超声，直至细胞裂解液透明，不再粘稠。冰上放置30min 之后，12000rpm，4℃离心10min。取上清，冷冻保存。 4.2装柱及孵育 4.2.1温和重悬Anti-HA亲和纯化凝胶，至均匀混合，用剪去末端的枪头吸取适量的凝胶至 空纯化柱中。 4.2.210ml（10倍凝胶体积）PBS清洗Anti-HA亲和纯化柱。 4.2.3加入含有目标蛋白的真核细胞裂解液，4℃旋转孵育过夜。 4.2.45ml PBS（5倍凝胶体积）洗柱三次。

比较蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术

进展评述 比较蛋白质组学研究中的稳定同位素标记技术 刘新1,2　应万涛1,2　钱小红1,23 (1军事医学科学院放射与辐射医学研究所　北京　100850;2北京蛋白质组研究中心　北京　102206) 摘　要　比较蛋白质组学是指在蛋白质组学水平上研究正常和病理情况下细胞或组织中蛋白质表达变化,以期发现具有重要功能的生物标识物,为疾病的早期诊断提供依据。近年来它正成为蛋白质组学研究的热点和发展趋势。比较蛋白质组学的研究方法和策略有多种,本文就最近几年来稳定同位素标记技术(体内代谢标记技术和体外化学标记技术)在比较蛋白质组学研究中的进展进行综述。 关键词　比较蛋白质组学　稳定同位素标记　体内代谢标记　体外化学标记 Application of Stable Isotope Labeling in Comparative Proteomics Liu X in1,2,Y ing Wantao1,2,Qian X iaohong1,23 (1Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing100850; 2Beijing Proteome Research Center,Beijing102206) Abstract　C omparative proteomics is the research of protein expression changing between normal and pathological cell or tissue on the proteome level.P otential biomarkers w ould be discovered from the research by comparative proteomics, which will be helpful to the diagnosis and therapy of diseases.In the recent years,it has been becoming the hot spot of the proteomics research and many strategies used in comparative proteomics have been developed.During those approaches,the strategies based on stable is otopic labeling coupled with mass spectrometry have been extensively used and lots of success ful applications have been reported.In contrast to the traditional radioactive is otope labeling method,stable is otope labeling technique was not radioactive and the operation is simple.Metabolic labeling in viv o and chemical labeling in vitro are tw o parts of stable is otope labeling technique,which both have various advantages and disadvantages.This paper reviewed the progress of stable is otope labeling technique in comparative proteomics. K ey w ords　C omparative proteomics,S table is otope labeling,Metabolic labeling in viv o,Chemical labeling in vitro 随着人类基因组精确图谱的公布,基因组功能的阐明已经成为生命科学研究中一项极重要的任务[1]。蛋白质是基因的最终产物同时也是基因功能的最终执行体,因而人类基因的表达及其功能有待于在蛋白水平上揭示。蛋白质组学的研究目的是分离和鉴定组织或细胞中的所有蛋白质。生物体在生长发育过程中,基因组是相对稳定的,而蛋白表达是高度动态变化的,并且具有严格调控的时间和空间特异性[2]。为了研究生物体在不同状态下表达的所有蛋白质的动态变化,比较蛋白质组学应运而生,即在蛋白组学水平上,研究在正常生理和病理状态,或受到不同的外部环境刺激下,或在突变等因素影响下,蛋白质表达的变化情况,以期发现生物体内关键的调控分子及与疾病相关的蛋白质标志物,最终为疾病的防诊治、新型疫苗的研发等提供理论依据。 为了研究蛋白质表达的动态变化,基因表达检测技术,如微阵列法[3]、DNA(脱氧核糖核酸)芯片法[4]等曾被广泛使用。这些方法虽然能够实现对mRNA(信使核糖核酸)进行定性和定量分析,但 刘新　男,27岁,博士生,现从事比较蛋白质组学研究。　3联系人,E2mail:qianxh1@https://www.wendangku.net/doc/296382043.html, 国家自然科学基金(20505019、20505018)、国家重点基础研究发展规划项目(2004C B518707)和北京市科技计划重大项目(H030230280190)资助项目 2006207220收稿,2006209221接受

蛋白标签技术简介及常用蛋白标签

蛋白标签技术简介及常用蛋白标签 蛋白质作为生命活动的主要执行者，人们对其功能和生物学机能的研究逐步深入。那么如何分离和研究某一特定蛋白呢？蛋白标签技术的广泛应用可以有效的解决这令许多研究者颇为头疼的问题。目前，一些肽类和蛋白质被广泛的用于大量生产重组蛋白，它们与目的蛋白融合表达，以便于目的蛋白表达、检测、示踪和纯化。这类多肽或蛋白，被称为蛋白标签（Protein Tag）。例如MyC、His、GST、HA等。而标签抗体可以高特异地结合对应的标签融合多肽或蛋白，籍以分离纯化和分析检测目的蛋白。目前，云克隆推出了一系列蛋白标签抗体，让您从容面对蛋白实验。 先简单介绍一下系列蛋白标签。 HA标签蛋白，标签序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇，9个氨基酸，对外源靶蛋白的空间结构影响小,容易构建成标签蛋白融合到N端或者C端。易于被Anti－HA抗体检测和ELISA检测。 MYC标签蛋白，MYC标签蛋白是一个含11个氨基酸的小标签，标签序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，这11个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。Myc tag已成功应用在Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中,可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。 FLAG，Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。 GST，谷胱甘肽巯基转移酶在解毒过程中起到重要作用，它的天然大小为26KD。由于GST高度可溶，可增加外源蛋白的可溶性，另外GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达，可提高表达量。GST标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathione sepharose)亲和树脂进行纯化。而且，GST标签蛋白可在温和、非

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。

各种蛋白标签汇总

各种蛋白标签汇总 蛋白标签 蛋白标签（proteintag）是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： ?标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能； ?His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性； ?His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究； ?His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 ?可应用于多种表达系统，纯化的条件温和； ?可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： ?FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 ?融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。

蛋白标记技术详解

蛋白标记技术详解 蛋白质标记的主要目的是监测生物过程、辅助检测（例如化合物的可靠定量、蛋白质修饰的特异性检测）或者纯化蛋白及其结合对象。蛋白质的标记能够提高检测灵敏度以及简化检测工作流程。 目前有多种蛋白质标记技术来帮助我们研究感兴趣的蛋白质的丰度、位置、相互作用、翻译后修饰、功能，乃至监测活细胞中的蛋白质运输等问题。目前有多种类型的标记物和标记方式可供选择，但是针对特定的应用应当选择适合的标记策略。 1.代谢标记策略 代谢标记策略是一种体内标记方法，在这种方法中，细胞被“喂养”了化学标记的营养物，然后这些标记物被掺入新合成的蛋白质、核酸或代谢物中。然后，我们可以收集细胞并分离这些分子以获得细胞生物过程的全局视图。 蛋白同位素标记 原理 蛋白同位素标记是一种经典的蛋白示踪和蛋白组学定量技术，用天然同位素（轻型）或稳定同位素（重型）标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，这样细胞新合成的蛋白质可以在细胞生长期间通过掺入含有不同同位素的氨基酸进行标记。 应用举例 蛋白质组学研究方向流行的代谢标记方法是SILAC（Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture），即细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记。结合质谱技术，SILAC 通过使用重型氨基酸（例如，15N-或13C-赖氨酸）标记其中一组培养物或细胞系，而向另一组添加正常的轻型氨基酸，从而量化两种培养物或细胞系之间蛋白质丰度的差异。然后将在这两种条件下生长的细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定，根据一级质谱图中两个同位素型肽段的

融合蛋白的标签

重组蛋白表达技术现已经广泛应用于生物学各个具体领域, 特别是体内功能研究和蛋白质的大规模生产都需要应用重组蛋白表达载体。蛋白表达载体按照表达宿主的不同分为 3 类，分别为表达宿主为大肠杆菌，哺乳动物细胞的，以及慢病毒载体，宿主可以为哺乳动物细胞和原代细胞。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。除了必要的复制和筛选的元件，协助表达和翻译的元件外，本文将6 个标签的功能初步介绍如下： (一) His 6 His6 是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的 C 末端或N 末端。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层 析(IMAC) ，对重组蛋白进行分离纯化。 使用His-tag 有下面优点： 1. 标签的分子量小，只有~0.84KD ，而GST 和蛋白A 分别为~26KD 和~30KD ，一般不影响目标蛋白的功能； 2. H is 标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯 化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性； 3. H is 标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA 相互作用研究； 4. H is 标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗 体； 5. 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；

6. 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 (二) Flag Flag 标签蛋白为编码8 个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK ），同时载体中 构建的Kozak 序列使得带有FLAG 的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。 Flag 作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： 1. Flag 作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影 响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 2. 融合Flag 的目的蛋白，可以直接通过Flag 进行亲和层析，此层析为非变性 纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 3. Flag 作为标签蛋白，其可以被抗Flag 的抗体识别，这样就方便通过Western Blot 、ELISA 等方法对含有Flag 的融合蛋白进行检测、鉴定。 4. 融合在N 端的Flag ，其可以被肠激酶切除（DDDK ），从而得到特异的目 的蛋白。因此现Flag 标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究 及其蛋白相互作用等相关领域。 (三) MBP MBP（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白大小为40kDa ，由大肠杆菌K12 的malE 基因编码。MBP 可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋 白。MBP 标签可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割 标签。如果蛋白在细菌中表达，MBP 可以融合在蛋白的N 端或C 端。 纯化：融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。结合的融合蛋白可用10mM 麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。结合亲和力在微摩尔范围。一些融合蛋白在0.2% Triton X-100 或0.25% Tween 20 存在下不能有效结合，而其他融合蛋白