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药用植物次生代谢相关酶基因克隆方法综述_战晴晴

药用植物次生代谢相关酶基因克隆方法综述_战晴晴
药用植物次生代谢相关酶基因克隆方法综述_战晴晴

·综述·

药用植物次生代谢相关酶基因克隆方法综述

战晴晴1,2,隋春2,张杰1*,魏建和2 (1.东北林业大学生命科学院,哈尔滨 150040;2.中国医学科学院&北京协和医学院药用植物研究所,北京100193)

摘要:目的综述药用植物次生代谢酶基因克隆可采用的方法策略,为其基因克隆提供参考。方法查阅相关文献进行总结和归纳。结果阐述了用于克隆药用植物次生代谢酶基因的功能克隆方法、表型克隆方法(DD-PCR、cDNA–AFLP、SSH)、转座子标签克隆方法及图位克隆方法。结论适用于药用植物次生代谢相关酶基因克隆的技术方法有很多种,研究者可根据研究基础、目的和实验条件等进行选择。

关键词:药用植物;次生代谢;基因克隆

中图分类号:Q78 文献标志码:A 文章编号:1007-7693(2009)10-0805-05

Review on Gene Cloning Methods Involved in Medicinal Plant Secondary Metabolism

ZHAN Qingqing1,2, SUI Chun2, ZHANG Jie1*, WEI Jianhe2(1. College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Herbin 150040, China; 2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China)

ABSTRACT: OBJECTIVE Reviewing gene cloning methods and strategies that can be used in medicinal plant secondary metabolism, to provide selection references. METHODS Searching and summarizing literatures on gene cloning of plants, especially of medicinal plants. RESULTS Gene cloning methods used in medicinal plant secondary metabolism, such as functional cloning method, phenotype cloning methods, transposon tagging and map-based cloning method were elaborated. CONCLUSION There are many methods used to clone genes in medicinal plant secondary metabolism, researchers should choose the suitable one with different basis, purposes and experiment condition.

KEY WORDS: medicinal plants; secondary metabolism; gene cloning

次生代谢是存在于植物、动物和微生物中有别于初生代谢的一类特殊而又复杂的代谢类型。通常认为次生代谢是生物通过渐变或突变获得的一种适应生存的方式;是生物体在长期进化中对生态环境适应的结果。植物次生代谢物不仅为人类提供了丰富的药物,香料及工业原料,而且一些次生代谢产物还是生物体自身抗性、信号传导、适应性调节、生长发育以及植物花色香味等所需要的。随着分子生物学及生理生化等学科的发展,关于次生代谢的研究也越来越深入。鉴于青篙素、紫杉醇及长春新碱等药用植物有效成分的突出疗效,更显示出了药用植物次生代谢研究的重要性。药用植物次生代谢产物种类繁多,结构各异。次生代谢途径也是多样而复杂的,许多途径目前仍不清楚,只有个别的主要是青篙素、紫杉醇等代谢物的合成途径取得了一定研究进展,但也仅仅是了解了合成途径的大致路线[1]。克隆相关酶基因是药用植物次生代谢研究的重要内容。

分子生物学发展至今,用于植物基因克隆的方法有很多种。主要可分为三类:

一种类型是功能克隆,即根据已知基因产物推断出其相应核苷酸序列,再以此为基础从cDNA文库或基因组文库中调取目的基因;第二种类型是表型克隆,是近年来发展十分迅速的一类方法,例如mRNA差别显示技术(DDRT-PCR)、抑制性差减杂交(SSH)、EST文库筛选技术等;第三类是无基因序列及表达功能信息,但具有转座子标签或基因遗传图谱等条件,常用转座子标签法克隆和图位克隆技术。下面主要针对三类基因克隆方法的基本原理及在药用植物次生代谢研究中的应用情况进行综述,为药用植物次生代谢酶基因的克隆研究提供借鉴。

1 功能克隆方法

这类方法的主要步骤是首先通过生物化学等研究手段分离纯化出有关基因编码的蛋白产物,然后测定蛋白质氨基酸序列,推断出编码该蛋白质的部分基因序列,再通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR制备的探针杂交筛选基因组或cDNA文库最终克隆到目的基因。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,关键是能够分离出纯度很高的单一蛋白质。很多基因尤其是没有任何核酸序列可利用的基因在首次克隆时常采用这种方法达到目的。

Inoue等[2]利用这一方法克隆了闭鞘姜(Costus speciosus)呋甾烷26-O-β-葡糖苷酶基因。首先从闭鞘姜根茎提取酶蛋白,利用HPLC洗脱收集单一峰蛋白。纯化的蛋白用内肽酶Lys-C消化,消化后的肽段经C18柱分离,然后针对收集的不同肽段进行氨基酸序列分析。最后利用从氨基酸序列推测的核酸序列设计引物,结合巢式PCR和RACE方法得到多条片段,拼接成全长cDNA序列。Grothe等[3]从罂粟(Papazer somniferum)悬浮培养细胞系中纯化出Salutaridinol 乙酰转移酶,然后经电泳、蛋白酶消化、肽段分离及序列测定程序,再根据氨基酸序列推测核酸序列,设计引物,RT-PCR获得部分片段后,同样经RACE获得全长序列。

采用功能克隆方法虽然已经克隆了很多基因,但由于绝大多数基因的产物目前还不知道。所以大多数基因难以用这一经典的方法来克隆。尤其是对于药用植物次生代谢途径中的酶类,含量低且常常处于不稳定状态,所以更难以分离纯化。但当其它植物的同类基因已克隆到并且其核苷酸序列保守性较高时,一方面可设计简并引物,PCR扩增得到目标植物中的目的基因片段,制备探针后杂交筛选目标植物基因组或cDNA文库,也可进一步利用RACE方法,克隆到未知新基因;另一方面也可直接利用其它植物同类基因序列制备探针在控制杂交条件下筛选目标植物基因组或cDNA文库。Wallaart等[4]利用这类方法首先比对其它植物中相关基因序列后在保守区设计简并引物,然后将RT-PCR扩增产物作为探针与青蒿的一个cDNA文库进行杂交,从中筛选得到了青蒿素合成途径中的倍半萜环化酶即amorpha-4, 11-diene合酶的全长cDNA。进而开展了后续的基因功能研究。Hotze等[5]也是利用这种方法克隆到了长春花苯丙酸途径中的肉桂酸-4-羟化酶cDNA。肉桂酸-4-羟化酶是参与黄酮类化合物形成的一种P450酶类。Hayashi等[6]是利用异源植物光果甘草(Glycyrrhiza glabra)相关基因序列制备了探针,在低严谨度杂交条件下,筛选目标植物丝瓜的cDNA文库得到isomultiflorenol合成酶(丝瓜中形成拜俄尼酸的一种三萜合成酶)cDNA序列。

随着药用植物次生代谢酶基因获得数目的不断增长,会有更多不同植物种类中的相关基因通过这一方法得到克隆。比较这些同源基因的相似相异点及进行深入的功能分析,将为全面阐明重要药用植物的代谢途径和调控机理奠定基础。

2 表型克隆方法

药用植物次生代谢产物种类繁多、结构迥异,产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性。研究表明一些诱导物如茉莉酸甲酯等的刺激也会导致药用植物次生代谢产物含量增加,代谢产物增长是代谢途径酶基因表达增加,酶活性增强的结果。目前一些药用植物种类已建立了细胞及组织器官离体培养体系,更便于次生代谢途径及调控机理的研究。其中一些次生代谢相关酶基因的克隆就是以代谢产物含量存在明显差异的材料为基础,利用表型差异克隆技术实现的。这类方法中有很多相类似的技术手段,包括差异显示技术(DD-PCR)[7]、cDNA-AFLP法[8]、差减扣除杂交(SSH)法[9]及微阵列杂交(microarry)[10]等。这些方法不仅可用来克隆基因,同时也是研究基因表达特性的重要手段。

2.1 差异显示技术

1992年,Liang和Pardee[7]首次提出差异显示技术(mRNA Differential Display PCR, DD-PCR),该技术具有快速、灵敏、简单和可分析低丰度mRNA 的优点,成为克隆新基因和研究植物基因表达的有力工具。差异显示技术方法是:利用一系列oligo (dT) 引物,以不同处理植物的总mRNA为模板进行反转录得到cDNA,再用此引物和5’端随机引物对反转录产物进行PCR扩增,并利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,从中筛选出差异片段;回收差异片段后再进行第二次PCR,以扩增出的差异片段为探针进行Northern杂交,去掉假阳性片段并对目的片段进行测序;最后以克隆的目的片段为探针,从基因组文库中筛选出相应的全长基因。通常在获得目的基因片段基础上,也可采用5’及3’RACE的方法获得目的基因全序列。

Schoendorf等[11]利用差异显示RT-PCR方法获得了13个相关的P450 cDNA全序列,随后在酵母体系中通过原位分光光度法和添加紫杉烷底物后测定体内氧化酶活性的方法进行了功能分析。首次克隆了紫杉醇生物合成途径中的P450基因。Cao等[12]

也利用mRNA差异显示PCR和RACE方法结合获得了甘蓝(Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino, syn. B. rapa L.)中的一个P450基因。

DD-PCR技术以其快速、灵敏、操作简单,不仅可以大规模地了解已知基因转录的差异,还可以发现新的基因片段等优点受到了药用植物基因克隆工作者的青睐。虽然它本身还有一些的局限性如假阳性高、得到的cDNA 片段也比较短, 但近年来随着对技术环节的不断改进,mRNA差异显示技术将深入到了有关基因差异表达研究的各个领域。2.2 cDNA-AFLP法

1996年,Bachem [8]将DD-PCR法与AFLP(Amplified fragment length polymor-phism)结合,探索马铃薯块茎发育情况,并克隆了2个cDNA片段 (TDF536和TDF531)。其方法步骤是:mRNA反转录形成cDNA 双链,再用两种限制性内切酶消化,一种是常用内切酶Eco RI,一种是稀有内切酶Mse I。然后在消化的cDNA片段上连上接头,再利用与接头相配对的引物进行预扩增。预扩增后,用有2个或3个选择性碱基的引物进行PCR扩增,扩增产物以聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差异片段。与DD-PCR技术相比而言cDNA-AFLP 技术更适合对转录组进行全面的分析[13],结果假阳性低,并且获得的转录衍生片段(TDF)一般也集中在蛋白的编码区或者附近,可最大限度地提供基因编码区的信息。

药用植物的生长周期受到基因的严格调控,在不同生长期伴随着相应的次生代谢产物的合成。通过cDNA-AFLP研究技术,可以建立药用植物在不同生长期转录组学的RNA指纹图谱,阐明药用植物不同生长期的分子调控机制。Goossens等[14]以茉莉酸甲酯处理和未处理的烟草细胞培养体系为材料,利用cDNA-AFLP分析了基因表达变化情况,从中可以得到与尼古丁生物碱合成相关的基因片段。以序列片段为标签,可进一步进行基因编码序列的分离与克隆。同时作者指出这一方法是进行植物次生代谢研究的有效手段。Rischer等[15]也利用cDNA-AFLP 方法并结合LC-MS色谱与质谱联用的化学分析方法研究了长春花(Catharanthus roseus)吲哚生物碱的次生代谢。结果不仅显示了一些已知与吲哚生物碱合成相关的基因的表达,还绘制了以往没有研究过的基因与基因及基因与代谢产物间相互作用的网络结构。为鉴定新基因,了解代谢途径网络和深入的代谢工程研究奠定了基础。

2.3 抑制性差减杂交

抑制性差减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization, SSH)是Diatchenko等人[9]于1996年建立的。Huang等[16-18]对SSH这一技术及其在微生物及植物研究中的应用进行了综述。SSH技术是一种比较和分离不同细胞系、不同组织间或同一细胞系、同一组织间在不同条件下差别表达基因的方法。SSH技术是以抑制PCR作用为基础的cDNA差减杂交。在一个循环过程中完成单链cDNA丰度的均等化及目标群体和对照群体中相同cDNA序列的去除,从而富集差异表达的基因。整个过程既利用了差减杂交技术的差减富集又利用了抑制PCR技术的高效动力学富集。一个典型的SSH过程,可在一个差减杂交的过程中将稀有基因序列富集上千倍。其主要操作过程是提取需要检测的和对照的细胞及组织mRNA,合成cDNA,通过2次消减杂交将检测和对照细胞及组织共同具有的cDNA消减掉,然后利用2次抑制PCR特异性地扩增特异表达的cDNA。

目前,SSH技术已开始应用于克隆药用植物次生代谢相关基因。通过选取不同生长时期、不同部位或不同处理的植物材料建立抑制性差减文库,已经克隆到了部分调控次生代谢物质合成的特异表达基因。罗志勇等[19]利用这一技术构建了四年生和一年生人参根组织的差减cDNA文库,获得了6个可能与人参皂苷生物合成相关的基因。魏小勇[20]也应用这一方法成功构建了四年生和一年生铁皮石斛叶片的差减cDNA文库,为克隆石斛碱生物合成相关功能基因奠定了基础。

2.4 EST文库筛选技术

表达序列标签(expressed sequence tags, ESTs)是指从不同组织来源的cDNA序列,这一概念首次由Adams等于1991年提出。EST文库构建在药用植物次生代谢相关基因克隆方面备受关注,已成为人参次生代谢途径研究的主要技术手段。Jung等[21]构建了5个人参cDNA文库,分别以人参根、根茎、发芽的种子、组织培养的幼苗及土壤中生长的幼苗茎为材料。共测序了12 126条序列,其中高质量序列11 694条,通过序列比对和不同酶基因特异结构域搜索获得了可能参与人参皂苷合成的4个氧化鲨烯环化酶、9个P450和12个糖基转移酶的cDNA序列。表明构建的cDNA文库不仅是发现基因的有效资源,也为研究不同组织器官,不同环境条件下基因的表达提供信息。因此将加速人参皂苷合成途径相关基因的克隆,促进人参皂苷遗传工程的发展。

通过比较分析同一植物不同组织、不同发育阶段及不同环境或处理条件下多个EST文库,不仅可以获得一些与特定生理现象相关的功能基因,而且

可以了解基因表达特性即所谓的in silico分析。Suzuki等[22]利用苜蓿(Medicago truncatula)的基因公共数据资源包括10个EST文库的大量序列信息,进行了三萜皂苷生物合成途径上游相关基因的发掘与功能分析。具体分析了得到的三个酶:鲨烯合成酶、鲨烯环氧酶及β-香树脂合成酶的全长cDNA。

2.5 微阵列(microarray)及芯片技术

微阵列及芯片技术首先发表于Science杂志上,被认为是当年最有影响的文章之一[23]。荆志伟等[24]就芯片技术与中药研究进行了论述,崔光红等[25]将基因芯片技术引入了丹参功能基因研究。这一技术的主要原理是将核酸片段标记后以预先设计排列方式固定在载玻片或尼龙膜上组成生物集成膜片,然后利用核酸杂交原理检测未知分子,并利用荧光信号检测器及处理器根据杂交分子或未杂交分子所发出的不同波长的光检测杂交信号。杂交信号经电脑软件转换处理以测定核酸序列及其变化。芯片技术可用于发现新基因及分析基因表达特性。

Guterman等[26]利用芯片分析了有香气和没有香气的玫瑰栽培品种的基因表达差异,结合两个品种挥发性成分的化学分析,发现了一些与香气相关的基因,其中包括大根香叶酮D合成酶,其生化功能通过大肠杆菌异源表达得到证实。表明功能基因组学高通量芯片技术有利于非模式植物品种特异性状的研究。

崔光红等[25]构建了丹参的cDNA芯片,得到了含有4×12个点阵的芯片,为发掘丹参功能基因,研究丹参道地药材形成机制探索新的思路和方法。随后他们以不同培养时期的丹参毛状根为材料,利用构建的cDNA芯片,研究了基因表达谱。结果得到了一系列丹参次生代谢相关基因包括细胞色素P450和二萜合酶等基因片段,为深入开展丹参功能基因组学研究奠定了基础[27]。

3 转座子标签克隆方法

转座子(transposon)最早在1951年由美国遗传学家McClintock[28]在研究玉米籽粒色斑不稳定现象时提出来的。转座子标签法是将一株携带有功能性转座系统的植物与遗传上有差异的同种植物杂交,因转座因子插入到某一特定的基因序列而破坏了该基因编码的蛋白,进而导致可见表性的破坏或改变,这样就可以在产生后代中筛选出新型的突变体。其克隆植物基因的主要步骤是:①构建含转座子的质粒载体;②将含转座子的质粒载体通过农杆菌介导或其他适当的转化方法导入目标植物中;③转座子插入突变的鉴定与分离;④转座子在目标植物体内的活动性能检测;⑤利用转座子序列作探针,与突变体基因组文库杂交,获得部分基因序列;⑥用部分基因序列作探针,与野生型基因组文库杂交,克隆到完整的目的基因。

1999年Sato等利用Hirchick建立的水稻逆转座子Tos17基因敲除体系克隆了6个水稻knl-型同源异型框基因,发现了引起水稻植株矮化的突变基因OSH15[29]。胡英考[30]就转座子标签法克隆植物基因的研究进展进行了综述,列出了利用这一方法获得的植物基因,包括拟南芥、番茄、矮牵牛、烟草和亚麻植物中与发育和抗性相关的基因。转座子标签法是克隆产物未知基因的有效手段之一,在微生物基因克隆方面也有所应用。目前虽然还未在药用植物上发现建立成熟的转座体系,但可以通过导入异源转座子进行基因克隆,这对于那些已有成熟的转化体系的药用植物种类来说,将是加快功能基因克隆的有效手段。

4 图位克隆

图位克隆也称为定位克隆,是以图谱为基础进行定位克隆的技术。该方法首先利用SSR等分子标记技术进行基因定位,然后以紧密连锁的分子标记为起点,筛选DNA YAC文库,构建目的基因区域的物理图谱,通过染色体步移逐步向目标基因靠近,最终克隆到目的基因并通过遗传转化和功能互补实验证实基因功能。操作前提是具有一个根据目的基因的有无而建立起来的遗传分离群体;构建精细的遗传连锁图谱,能够将目的基因定位到染色体的特定位置;还需要构建含有大插入片段的基因组文库以备以连锁的分子标记筛选目的基因用。图位克隆在一些农作物和经济作物,如水稻、玉米、小麦、甘蓝等的研究中应用广泛。常常用来分离克隆与质量性状如抗病性,数量性状如产量等相关的基因。景润春等[31]和丁效华[32]都对图位克隆技术在分离植物基因中的应用及方法学问题进行了综述。图位克隆需要有很好的前期研究基础和积累,在药用植物基因研究中报道较少。

5 结语

分子生物学发展至今,可用于药用植物关键酶基因克隆的技术方法有很多种,研究者可根据自身研究目的及研究条件等实际情况,选择适宜的研究手段,以取得更好的研究结果。本文尽可能涉及到了目前在基因克隆方面得到应用的技术方法种类,这些方法在药用植物次生代谢酶基因克隆中都有应用。相信随着这些技术的不断成熟,并与其它相关技术相融合,将极大地促进人们对药用植物次生

代谢途径与调控的解析和认识。

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收稿日期:2008-11-26

生物技术与药用植物次生代谢产物_谢静

生物技术与药用植物次生代谢产物 谢静 (成都医学院药学系,四川成都610083) 作者简介:谢静(1979-),女,四川眉山籍,硕士,从事天然药物教学和研究工作。 【关键词】 药用植物;次生代谢产物:生物技术 【中图分类号】 R282.71 【文献标识码】 A 【文章编号】 1672-7193(2007)03-0089-02 药用植物在我国传统医学中具有重要地位。目前我国药用植物有11118种,市售中成药中,从植物中提取的药物或经半合成的药物占商品的20%[1]。药用植物体内的次生代谢产物是细胞生命活动或植物生长发育非必需的一类小分子化合物,其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性。自然界许多药用植物的有效成分都是其次生代谢产物,萜烯、酚、生物碱三类化合物是植物中最重要的次生代谢产物。 20世纪50年代药用植物次生代谢产物的工业化生产开 始利用植物细胞大量培养作为主要手段。目前药用植物的生物技术研究主要集中在药用植物资源学研究、药用植物栽培学研究、药用植物生态学研究、药用植物化学研究、质量控制和药效评价等领域,近年已经取得了一定的进展[2]。下面就生物技术应用于药用植物次生代谢产物方面的研究情况进行综述。 1 细胞培养技术和药用活性成分生产 我国传统药材中88%为植物药。植物单个细胞在适宜的环境下可分化发育成植株,并具有整株植物所具有的合成化合物的能力,也即植物细胞具有全能性,这为通过植物组织和细胞培养来获得其药用活性成分提供了有效途径。 目前利用细胞培养技术生产药用植物有效成分主要有三种方法:液体悬浮培养、固定化细胞培养和发酵工程技术[3]。液体悬浮培养主要用于生产细胞内的有效成分,利用该方法生产植物来源药物最成功的是紫杉醇和紫草宁色素的生产。 紫杉醇是20世纪70年代从短叶红豆杉树皮中提取出来的具有独特抗癌作用的天然产物,被认为是治疗卵巢癌的首选药物,近年不断发现它对其它癌症的治疗作用,是有发展前途的抗癌新药。到目前为止,发现紫杉醇只存在于裸子植物红豆杉科的红豆杉属Taxus L 和澳洲红豆杉属种中。由于红豆杉类植物多属珍稀物种,数量稀少,生长缓慢,紫杉醇的含量又非常低,而全球每年需要紫杉醇200~300kg,所以靠砍伐提取的方法远不能满足人们对紫杉醇的需要[4]。为了克服这一问题研究人员从各个方面探索解决紫杉醇的来源问题,1991年美国研究人员用75000生物反应器生产紫杉醇获得成功 [5] 。 紫草宁色素是一组蒽醌类色素,主要是作为染料和在化妆品中的生产,还兼有抑菌消炎作用,在国际市场上价格十分昂贵[6]。日本三井石化公司1983年用细胞培养法生产紫草宁色素投入市场,成为药用植物细胞工程产品化和商业化的先例[7]。 我国的细胞培养始于20世纪50年代,在我国研究比较成功的例子是人参,1964年中国科学院上海植物生理研究所的罗士韦研究员首先成功地进行了人参的组织培养,随后我国和其他国家的学者将人参的细织培养过渡到工业化生产。目前人参的10L 体积的大规模培养在我国已实现,对其培养细胞进行化学成分和药理活性比较分析,表明与种植人参无明显差异,中国药科大学丁家宜等已将其作为美容保健品投放市场,这是我国药用植物生物技术产品商品化的第一个范例[3]。 据不完全统计,目前已经从400多种植物中建立了组织和细胞培养物,从中分离出600多种代谢产物,其中40多种化合物在数量上超过或等于原植物[8]。其中代表性的研究成果如:紫草、红豆杉、人参、黄连、毛地黄、长春花、曲洋参等细胞培养,但是至今只有少数品种(紫草、人参等)达到了生产规模[9]。和植物栽培比较,尽管它有许多优点,如不受地域及气候条件的影响,可进行特定的生物转化反应,生产人们需要的活性成分、缩短生物合成周期、产量大、不污染环境等[10,11],但由于增殖率不够高,产物不稳定,常低于原植物的水平,导致成本高不能与栽培植物和微生物发酵竞争,成为阻碍细胞培养技术进入商业性开发的主要因素。因此,多年来研究方向一直集中在提高培养物的增殖速度和保持产物的稳定和高产上。 植物组织和细胞培养的工业化生产遇到的主要问题[12]: (1)利用植物组织和细胞培养成本高于采集野生植物或 种植的生产方式,限制了此技术的发展。 (2)植物组织和细胞培养与微生物发酵相比,生长速度 慢、活性物质产量低。利用链霉菌发酵生产抗生素的发酵周期为72~96h,其最终产物高达8000mg/I 。,而植物组织和细胞培养的周期在18天以上,有效成分的含量也较低。 (3)适合植物组织和细胞培养的生物反应器尚有待研究 解决。问题的关键不是受制造生物反应器工程技术的制约,而是人们对植物组织和细胞在离体培养条件下的生长与发育的规律了解甚少。 (4)对植物次生代谢产物合成途径及所参与反应的各种 酶的了解不多,有的甚至连有效成分的化学结构尚未明确,因此对次生代谢的调控存在着很大的盲目性。 2 毛状根培养 利用发根农杆菌感染双子叶植物形成毛状根,是近10年来继细胞培养后又一新的培养系统。发状根的培养对中草药 9 8

植物基因克隆技术的研究进展

植物基因克隆技术的研究进展 随着科学技术的不断发展,人类基因组计划的不断实施,世界生命科技工作者对于植物基因克隆技术的研究不断进步,近年来,我国在基因克隆技术领域也有了长足的进步,在玉米,小麦,大豆,水稻,拟南芥等植物中,已经克隆了许许多多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。文章主要从基因芯片技术,功能克隆、定位克隆、同源序列克隆、PCR擴增技术分别介绍基因克隆技术的现状以及研究进展。 标签:植物;基因克隆技术;研究 植物基因克隆技术在生命科学技术中扮演着越来越重要的角色,而植物基因克隆技术从传统意义上来讲可分为两种不同的方式。正向以及反向的遗传学方式,正向遗传学途径是一种很早的经典的克隆方法,通过研究突变表型性状进行克隆,包括了功能以及表型克隆等较为基本的克隆的方式;反向遗传学途径和正向遗传学途径截然不同,它是通过一些特殊的方法,获得遗传基因片段,然后经过一系列的定位,将之后所研究的基因逆向研究。如定位克隆,同源序列克隆等。除了这两种克隆技术外,随着社会发展,也有一些新的克隆技术产生。 1 基因芯片技术 基因芯片技术是电子克隆技术的典型代表,基因芯片又称DNA芯片、DNA 微阵列,是以预先设计的方式将大量的基因探针固定在玻片、硅片等固相载体上组成的密集分子阵列。基因芯片技术类似于计算机的电子芯片技术,其具有高通量、微型化、连续化、自动化、快速和准确等特点。是一种随着人类基因组计划的进行而发展出的产物,这一发展使得人类对越来越多的微生物和动植物基因组取得了更长远的认识,对其的研究,是全人类对于基因组认识做出的不断地努力的成果,其中不乏许多典型的实例,用cDNA芯片技术对草莓、矮牵牛其基因是如何进行表达的进行研究,进而实现对转基因植物进行形状的观察及控制,可以更好的获悉分子对于基因表达是如何作用以及影响的也有利于获得更为优异更为良好的作物[1]。 基因芯片技术是一种新型的克隆技术,是科技创新和生命科学的很好的结合,代表着人类在基因的克隆方面进展和成就,解决了很多传统克隆不能解决的问题,也讲基因克隆技术引向一种新的思维模式。 2 功能克隆 功能克隆是人类采用最早的基因克隆策略,功能克隆技术从已知蛋白质的功能着手进行研究,其方法原理是先测知基因的编码蛋白质,利用它的信使RNA 进行反转录成cRNA,再利用cDNA做探针,从基因组中获取基因本身,进而完成克隆。

药用植物次生代谢工程研究进展

药用植物次生代谢工程研究概况 摘要高等植物的次生代谢产物是许多天然药物的重要来源,随着对药用植物次生代谢合成途径日渐全面的认识,采取有效的代谢工程策略对植物次生代谢途径进行遗传改良,已经取得了诸多研究成果。本文介绍了黄酮类化合物 ( flavonoids )、萜类化合物 ( terpenoids )及生物碱( alkaloid )这三种重要药用植物次生代谢产物的结构及生物合成途径,说明了次生代谢工程在提取高质量药用植物活性物质中的研究现状,为今后药用植物次生代谢产物的大规模研究和利用提供借鉴。 关键词植物药;次生代谢产物;代谢工程 高等植物的次生代谢产物是许多天然药物的重要来源,植物药在国际医药市场中占有重要的地位。由于许多植物的天然活性物质的结构特殊,很难用化学方法完全合成,因此这类物质的生产必须依赖于天然植物资源。针对植物天然药物可持续发展问题,药用植物次生代谢产物的应用吸引了国内外众多研究者的关注。 植物次生代谢的概念最早于1891年由Kossel 明确提出。次生代谢产物(Secondary metabolites) 是由次生代谢(Secondary metablism) 产生的一类细胞生命活动或植物生长发育正常运行的非必需的小分子有机化合物,其产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性。次生代谢产物可分为苯丙素类、醌类、黄酮类、单宁类、萜类、甾体及其甙、生物碱七大类。还有人根据次生产物的生源途径分为酚类化合物、萜类化合物、含氮化合物( 如生物碱) 等三大类。 代谢工程( Metabolic engineering )是生物工程的一个新的分支,通过基因工程的方法改变细胞的代谢途径,主要是针对提高某种重要的次生代谢物或其前体的含量,以期在较广范围内改善细胞性能,满足人类对生物体的特定需求。随着现代生物工程技术的发展,充分利用基因组学的研究成果,解析和调控植物次生代谢的生物合成途径,进而利用代谢工程的方法大幅度提高药用植物中目标产

整个基因克隆实验流程完整

一、组织总RNA的提取 相关试剂:T rizol;氯仿;苯酚;异丙醇;75%乙醇;RNase-free水 相关仪器:制冰机;液氮&研钵/生物样品研磨仪;高速离心机;移液器(1ml、200μl、100μl/50μl);涡旋振荡仪;恒温金属浴。 相关耗材:解剖工具,冰盒,离心管,离心管架,吸头(1ml,200μl/300μl),一次性手套,实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼,冰上放置一段时间,然后解剖,剪取肠道50~100mg,放入研钵中,加入 液氮迅速研磨,然后加入1ml 预冷TRIzol试剂,充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中,室温放置5min,使细胞充分裂解; 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿,盖上盖子,迅速充分摇匀15s,然后室温放置3min; 4.4℃,,12000g 离心15min; 此时混合物分为三层,下层红色的苯酚氯仿层,中间层和上层无色水相;RNA存在于无色水相中; 5.小心吸取上清液,千万不要吸取中间界面,否则有DNA污染;转移至一个新的离心管, 加入等体积的异丙醇,轻轻混匀; 6.室温放置10min;4℃,,12000g 离心10min; 7.弃上清,加入1ml 75%乙醇洗涤;涡旋,悬浮沉淀;4℃,,12000g 离心5min; 8.弃上清;可以再次用75%乙醇洗涤沉淀; 9.弃上清;用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇,注意不要吸取沉淀;室温放置5min 晾干沉淀;(RNA样品不要过于干燥,否则极难溶解) 10.沉淀中加入30μl RNase-free水,轻弹管壁,使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂:溴酚蓝,TEB/TAE电泳缓冲液,溴乙锭(EB) 相关仪器:(超微量分光光度计,移液器(2.5μl 或2μl 规格,10μl规格),电子天平,电泳仪,电泳槽,凝胶成像仪,微波炉,制冰机) 相关耗材:(无菌无绒纸,吸头,离心管架,PCR管,PCR管架,锥形瓶,烧杯,一次性手套,实验手套,冰盒) (1)RNA纯度的检测:测定其OD260和OD280的值,根据其OD260/ OD280的比值,当其比值在1.9~2.1之间,说明提取的总RNA纯度比较高,没有蛋白质和基因组的污染。 (2)RNA完整性的检测:取2μlRNA,与2μl溴酚蓝混匀,用1%的琼脂糖进行凝胶电泳,20min后,在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰,且亮度比大约是2:1时,5S条带若隐若现,而且没有其它条带时,说明完整性不错,可以用于下游逆转录实验。

基因克隆及转基因方法

基因克隆及转基因 一、基因克隆及转基因过程 1、设计引物 软件是https://www.wendangku.net/doc/2a11519204.html,sergene.v7.1,用到里面的PrimerSelect和EditSeq。 一般原则:1、长度:18-25; 2、GC含量:40-60%,正反向引物相差不要大于5%; 3、Tm值:55以上(到65),实在不行50以上也可以,正反向引物相差不要大 于5; 4、3’端结尾最好是GC,其次是T,不要A; 5、正反向引物连续配对数小于4; 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何; (如果克隆的话不能满足条件也没办法。) 不是必须条件,但可以考虑:多个基因设计引物时,可尽量使Tm值相似,方便PCR。 步骤: 一、打开PrimerSelect和EditSeq。 二、在EditSeq中输入你的序列。 引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’,在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基,如果你是要验证就随便选,如果你是要克隆就在最开始选,不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中,在File中选择Enter New Primer,复制,OK,然后可以看到引物的情况,看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准,不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’,选中序列,在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”,此时序列已反向互补,按照前面F的方法搜索R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小,比如序列是1000bp,你想PCR出来800大小的目的带,那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补,在正向的序列中搜索R在的位置,就是在EditSeq中选择Search,点击第一个Find,开始搜寻。 5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆,所以引物要有酶切位点,酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体,在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点,注意加入时载体的表达的方向,前面的酶切位点在引物F上,后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 2、提取醋栗DNA 3、PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度,找到后回收时就可以多PCR几管,一般我们用20ul的体系,PCR5管就可以回收,就是琼脂糖凝胶回收,将目的基因用刀片切下来,用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR: 20ul体系:灭菌水13.8ul,若模板为质粒灭菌水14.3ul; 2.5mMdNTP2.0ul;

植物次生代谢工程试题

植物次生代谢工程试题 一、简答题(20分) 1. 植物次生代谢产物的概念及分类 2. 植物次生代谢的特点和主要途径 3. 植物次生代谢工程的主要研究策略 二、论述题(40分) 结合近年植物次生代谢的研究进展论述植物次生代谢工程的研究意义。 药用植物次生代谢工程的市场应用前景 植物次生代谢物(plant secondary metabolites)是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物,其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。植物次生代谢物种类繁多,化学结构迥异。现在,已知大约有10,000种次生代谢物,包括酚类、黄酮类、香豆素、木脂素、生物碱、糖苷、萜类、甾类、皂苷、多炔类、有机酸等,可分为酚性化合物、萜烯类化合物、含氮有机物三大类。植物次生代谢是植物在长期进化中对生态环境适应的结果,对植物在其生态系统中的生存起作用,如抗虫、抗病、异株相克、吸引昆虫授粉、与共生微生物相互作用等。 植物次生代谢物的应用,其历史悠久,各民族传统草药和香料的有效成分大多是植物次生代谢物。现在,这些天然产物仍在人的生活中起着重要的作用,尤其是为医药、轻工、化工、食品及农药等工业的发展所必不可少的。以医药为例,至今人们依赖于从植物中提取的重要的药物就有五十多种。随着“重返大自然”的呼声日益高涨,人们已认识到:现在是从高等植物的次生代谢产物中去寻找、开发新药的

时代。然而,长期不当采集致使生态环境受到破坏,许多野生植物趋于濒危,有些需要特殊环境的植物人工引种困难。能够引种栽培的植物要占用大量的农田,加之人工栽培受环境的制约,次生物的含量和质量不稳定。此外,在通常的情况下,天然植株中目的次生产物含量过低(如紫杉醇),在对资源植物有效成分分析的基础上,采用化学合成的方法,又会遇到工艺流程复杂、成本高、合成过程中形成同分异构体及造成环境污染等许多问题。近年来,随着对植物代谢生理生化及生态适应方面认识的深入,以及分子生物学的渗透,将外源新基因转入植物现在已属常规的操作,基因枪轰击和根癌农杆菌介导是最常用的方法,植物次生代谢分子生物学研究发展迅速。以基因工程大规模生产次生代谢产物,其具有诱人的前景。 应用次生代谢工程改良植物性状的可能性有多种多样:使内源性抗性化合物(如植物抗毒素)在高水平上表达,表现出更高的抗虫抗病能力,提高产量和质量;在花卉栽培中培育出新的花色、花香;提高水果的口感;降低食品和饲料中有毒成分的含量;提高有益成分的含量。药用植物的代谢工程是针对提高某种重要次生代谢物或者其前体的含量的,以期解决药源问题。紫杉醇是获得美国FDA(1992)认证的优良抗肿瘤药物。由于紫杉醇结构复杂,化学全合成步骤多,产量低,而且成本很高。目前,临床上使用的紫杉醇,主要是从红豆杉属植物的树皮、枝叶等组织中分离提取获得的,也有部分是以红豆杉组织粗提液中的紫杉烷类物质为前体,通过化学半合成得到。但是红豆杉植物生长缓慢,紫杉醇的含量非常少,大量砍伐、毁坏,会导致红豆杉资源趋于枯竭。为寻找紫杉醇及其半合成前体的继续稳定供应的渠道,人们纷纷把眼光转向生物技术方法,如组织器官培养、细胞大规模培养、微生物发酵等。阐明紫杉醇生物合成途径及其调控机制,实施次生代谢工程,是应用生物技术方法大量生产紫杉醇的重要措施。为此,各国科学家付出艰辛努力寻找新的药源和替代物,其中对紫杉醇生源途径的研究处于核心地位。红豆杉树皮中紫杉醇的含量为万分之二,其在国际市场上售价为20万美元/kg,远远不能够满足市场需求。如果能够用基因工程的方法提高其含量,将具有巨大的经济效益和社会效益。 2. 3 代谢工程 大量的天然产物都由相似的基本骨架经过不同的结构修饰而成, 催化这些修饰过程的酶大多具有底物特异性。近年来对次生代谢途径的研究有了长足的进展, 但是在代谢途径的总体调控以及次生代谢途径之间的协调等方面, 仍然了解甚少。最近, 科学家非常重视预见性代谢工程[20] , 即利用系统生物学的方法来整合代谢组、蛋白组和转录组的分析数据, 从而在代谢网络的水平上进行反复的系统模拟, 最终得到比较接近真实状态的结果。现有的各种数据库和仪器分析手段已经使这样的系统分析在一定程度上成为可能。近年来通过代谢工程改善植物品质已经有一些成功的例子, 如将胡萝卜素代谢途径在稻米的胚乳中表达, 创制了金色稻米( golden rice) , 为提高某些不发达地区人群胡萝卜素摄入量开辟了一个新的途径[21] 。我国唐克轩课题组通过基因工程显著提高了颠茄毛状根莨菪烷类生物碱的合成与积累。最近, 美国加利福尼亚大学伯克利分校的Jay D. Keasling 等采用一系列的转基因调控方法, 通过基因工程酵母合成了青蒿素的前体物质) ) ) 青蒿酸, 其产量超过100 mg/ L, 为有效降低抗疟药物的成本提供了机遇。此外, 植物次生代谢的酶类还可以用于环境修复[ 23] 、工业生物技术等其他目的[ 20] 。

植物基因克隆实验指导

植物基因克隆实验规则 一、植物基因克隆实验课的目标 根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程,实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验,注重科研成果在教学中的应用,我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学,这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。 整套实验围绕洋甘菊倍半萜生物合成途径中关键酶基因HMGR的克隆这一研究课题进 行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性,让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。 我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科 研基础。 二、实验的进行程序和要求 1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节,必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。 2、讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解,让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。 3、独立操作与观察除个别实验分组进行外,一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作,仔细观察,作好记录。有关基本技能的训练,要按操作程序反复练习,以达到一定的熟练程度。

4、演示每次的实验都备有演示内容,其目的是帮助学生了解某些实验中的难点,扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。 5、作业实验报告参照硕士毕业论文的格式写,必须强调科学性,实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。 6、小结每次实验结束后,由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。 三、实验规则和注意事项 1、每次上课前,必须认真阅读实验指导,明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项,熟悉实验内容、方法和步骤。 2、上实验课时必须携带实验指导、记录本及文具等。进入实验室要按规定座位入座。 3、实验时要遵守纪律,听从教师指导,保持肃静。有问题时举手提问,严禁彼此谈笑喧或随意走动,也不得私自进行其他活动。 4、实验时要遵守实验操作规程,严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。操作观察要认真仔细,边做、边看、边想,认真做好实验记录。 5、要爱护仪器和器材设备,注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告并主动登记、说明情况。 6、实验结束后,应清理实验台面,认真清理好仪器、药品及其他用品,放回原处,放好凳子,方可离开实验室。值日生要负责清扫地面,收拾实验用品,处理垃圾,关好水、电、门窗后再离开。

南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆

绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆 南方医科大学学院 摘要 本实验旨在学习基因克隆并检验,绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定,对多数宿主的生理无影响,是常用的报道基因,便于实验。本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后,把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中,从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。 关键词:绿色荧光蛋白克隆表达 实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆 2015- ~ 实验日期 实验地点 2015- 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。 2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。 3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。 4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。 5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方 法。

6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤,以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原 理和方法。 7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤 二、实验原理 1.pEGFP-N1质粒 2.T载体

三、材料与方法: 1.实验材料: 质粒:pEGFP-N1 T载体:pUCm-T 菌种:DH5(克隆菌) PCR引物: F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC Tm=56 实验试剂: 即用型蓝白T载体(pMD18-T vector cloning kit) 快速DNA连接试剂盒 限制性内切酶:EcoR I(Fermentas) Axygen质粒提取试剂盒 抗生素:氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan) X-gal、IPTG等 实验仪器: 超净工作台,恒温摇床,高压灭菌锅,恒温培养箱,台式高速离心机,大容量冷冻离心机,PCR仪,紫外分光光度计,水平电泳槽,垂直电泳槽,电泳仪,凝胶成像系统,制冰机、超低温冰箱等 2.方法 分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子 四、实验具体流程 1.获取外源基因 1)碱裂解法提取质粒 使用Axygen质粒提取试剂盒

基因工程在药用植物次生代谢物研究中的应用

基因工程在药用植物次生代谢物研究中的 应用

基因工程在药用植物次生代谢物研究中的应用 摘要: 目的:药用植物遗传背景基础资料缺乏,对其次生代谢途径及其调控机制的认识不够深入,阻碍了细胞或组织培养、代谢工程等在获取高价值次生代谢物上的广泛应用。功能基因组学方法,尤其cDNA-AFLP 转录轮廓分析和代谢组学的整合运用,将次生代谢物的变化与相关基因的表达相关联,在挖掘次生代谢物生物合成相关基因、探索次生代谢途径方面展现出广阔的应用前景,是植物次生代谢物研究的新趋势和重要手段之一,将有力地促进药用植物资源更好的开发利用。植物在长期进化过程中与环境相互作用,产生大量不同种类的小分子有机化合物——次生代谢物(secondarymetabolites)。 【关键词】次生代谢物;功能基因组学;转录组学;代谢组学;代谢工程 植物在长期进化过程中与环境相互作用,产生大量不同种类的小分子有机化合物——次生代谢物(secondary metabolites)。次生代谢物在植物适应特殊生态环境、对抗生物或非生物压力等方面发挥着重要作用,如抵御病虫害、适应生态环境变化、诱导授粉或防紫外线灼伤等[1-2]。很多次生代谢物化学结构复杂而独特,具有特殊的生物活性,是药用植物的主要活性成分[3]。药用植物在药物研发中应用广泛,是传统中药主要来源,其次生代谢物是新药、新先导化合物(drug leads)、新化学实体(new chemical entities,NCEs) 的重要来源[4-5]。 从生物合成的起源来看,药用植物次生代谢物可分为5大类:多聚酮类(polyketides)、异戊二烯类(isoprenoids)、生物碱类(alkaloids)、苯丙烷类(phenyl propanoids)、黄酮类(flavonoids)。多聚酮类由乙酸-丙二酸途径(acetate-malonate pathway)产生;异戊二烯类(包括萜类和固醇类)由五碳前体异戊烯焦磷酸(isopenteny l diphosphate,IPP)经过经典的甲羟戊酸途径(mevalonic acid pathway,MVA pathway)或MEP 代谢途径 (methyl-erythritol phosphate pathway)产生;生物碱类由不同种类的氨基酸合成;苯丙

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术,与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白,以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展,研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前,这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签,可以满足客户的不同需求,包括各种最新型的标签,如:SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签,如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍,更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签,可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用,一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力,可用于固定化金属螯合层析(IMAC),对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点: 标签的量小,只有~0.84KD,而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD,一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化,前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用,后者在纯化包涵体蛋白时特别有用,用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白,使复性不受其它蛋白的干扰,或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低,可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统,纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK),同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白,其融合表达目的蛋白后具有以下优点: FLAG作为融合表达标签,其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质,这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白,可以直接通过FLAG进行亲和层析,此层析为非变性纯化,可以纯化有活性的融合蛋白,并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白,其可以被抗FLAG的抗体识别,这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。

植物基因的克隆|植物基因克隆的基本步骤

植物基因的克隆 08医用二班姚桂鹏0807508245 简介 克隆(clone)是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段(或基因)的扩增,主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。 关键词 植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法 Plant gene cloning Introduction Cloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes means

based on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. Keywords Plant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy 一、植物基因的结构和功能 基因(gene)是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。一般来说,植物基因都可分为转录区和非转录的调控区两部分。 (一)植物基因的启动子 启动子(promoter)是指在位于结构基因上游决定基因转录起始的区域,植物积阴德启动子包括三个较重要的区域,一时转录起始位点,而是转录起始位点上游25~40bp的区域,三是转录起始位点上游-75bp处或更远些的区域。 (二)植物基因的增强子序列

基因克隆步骤

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 [实验原理](供参考,试剂盒的Solution SS成分未知) 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是:在0℃下的CaCl2低渗溶液中,细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物,此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理(热休克),可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上,37℃培养过夜,这样即可得到转化菌落。[仪器、材料与试剂] (一)仪器1.小型高速离心机2.恒温摇床3.恒温箱4.‐20℃冰箱5.恒温水浴器 (二)材料1.氨苄青霉素2.大肠杆菌DH5a3.pUC194.1.5mL 离心管5.枪头、枪6.试管、培养皿 (三)试剂1.快速感受态细菌制备试剂盒(申能博彩公司产品)2.LB 培养液在950mL去离子水中加入:胰蛋白胨(tryptone) 10g酵母提取物(yeast extract) 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解,用Na0H调节pH至7.0,加入去离子水至总体积为1L,121℃湿热灭菌20min。 3.氨苄青霉素(Amp),用无菌水配制成100mg/mL 溶液,置‐20℃冰箱保存。 [实验步骤]

1.从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中,37℃振荡培养过夜。 2.取50mL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中,37℃振荡培养2小时。以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。 3.用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中,冰上放置3分钟后,加入0.5mL预冷的Solution SS。在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。注意:1mL的取液器设定在500mL。悬浮细胞要轻,防止细胞进入枪内。 4.将上述细胞分装于1.5mL离心管(离心管要在放在冰上预冷) 中,每管0.1mL。细胞可以立即使用或储存。 5.将感受态细胞迅速转移到‐20℃或更低的低温冰中。注意:在转移过程中要防止温度升高,解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块,将细胞迅速转移到塑料里,将整个塑料袋放到低温冰箱内。 转化:1.新鲜制备的或‐20℃下保存的100mL感受态细胞,置于冰上,完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。 2.加入5mL pUC19质粒,DNA浓度为10pg/mL,轻轻混匀。 3.冰上放置30分钟。 4.42℃水浴热激60秒。 5.冰上放置2分钟。 6.加400mL LB培养液,37℃ 250转/分振荡培养30分钟。 7.室温下4000rpm离心5分钟,用枪头吸掉400mL上清液,用剩余的培养液将细胞悬浮。

4植物基因克隆的策略与方法

4植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆确实是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的要紧目标是识不、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传操纵关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速进展,使人们把握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术差不多克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,19 97),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1功能克隆(functional Cloning) 功能克隆确实是按照性状的差不多生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的选择按照情形要紧可用二种方法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针 从cDNA库或基因组文库中选择编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中选择相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,专门多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,能够提升对灰质葡萄孢(B otrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因通过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性专门有意义(H ain等,1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DN A做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因 缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆了编码该

光对药用植物次生代谢产物形成与积累影响的研究进展

光对药用植物次生代谢产物形成与积累影 响的研究进展 植物次生代谢的概念最早于1891 年由Kossel 明确提出,它是相对于初生代谢或基本代谢而言的。植物的次生代谢是植物在长期进化中与环境相互作用的结果,次生代谢产物在植物提高自身保护和生存竞争能力、协调与环境关系中充当着重要角色。 植物生长发育过程中经常受到各种环境胁迫。植物次生代谢产物(Secondarymetabolites)是由次生代谢(Secondarymetablism)产生的一类细胞生命活动或植物生长发育正常运行的非必需的小分子有机化合物,是植物对环境的一种适应。次生代谢产物通常也是中药的主要药效成分,次生代谢产物在药用植物体内的分布和代谢及次生代谢产物的分类、化学、药理药效等已进行了大量研究,但对研究环境胁迫对中药次生代谢产物积累的影响刚刚起步。 研究逆境条件下药用植物次生代谢产物的产生和积累变化以及药效成分变化的机制,可为药用植物栽培环境的选择以及相适应的栽培技术制定提供理论依据,这将有利于传统中药药源植物的标准化和目标化种植,并对中药材质量控制及可持续利用具有重要意义。 光照对药用植物次生代谢的影响 首先,光强不同对药用植物次生代谢的影响也不同。将虎杖愈伤组织分别于暗光、弱光和强光3个条件下进行培养,结果在弱光条件下培养的虎杖愈伤组织中白藜芦醇的含量最高;遮阴条件下培养的长春花叶片中生物碱和黄酮的合成呈下降趋势,单层遮阴条件下2种双吲哚生物碱(长春碱和长春新碱)含量最高,双层遮阴条件下 2 种单吲哚生物碱(文多灵和长春质碱)含量最高;全光照条件下培养的

长春花叶片中总黄酮含量最高。其次,光质对药用植物次生代谢也有很大影响。与同等光合有效辐射强度的白光相比,白光补充蓝光处理和白光补充红光处理均能使丹参根系中丹酚酸B的含量提高。而将冬凌草再生植株置于不同光质的培养箱中培养30d后,绿光照射条件下冬凌草体内冬凌草甲素和迷迭香酸积累量最高,其次为白光,而红光条件下2种次生代谢产物的积累量最低。 此外,光照时间是影响药用植物次生代谢的另一个重要因素,因此根据药用植物开花所需时间的长短将其分为长日照植物、短日照植物和中间性植物。对于某些药用植物来说,适当缩短或延长光照时间,其药用次生代谢物的含量也随之改变,如长日照可提高许多药用植物酚酸和黄酮类化合物的含量。 光照胁迫对次生代谢产物的影响 光照是植物生长所必需的,在植物生长发育及初生代谢中起重要作用。在植物化学生态研究中,光照也是广泛受到重视的生态因子,它影响着许多植物次生代谢过程。很多情况下适当改变光照强度、光照时间及光质,在一定程度上可刺激药用植物体内次生代谢产物的合成和积累。王洋等研究发现喜树幼苗叶片的喜树碱含量随着遮阴程度的增加而增加,当光强为全光照的40%时喜树碱含量显著增加,但光强为全光照的20%时(严重遮阴),喜树碱含量降低,分析认为喜树碱含量的变化是喜树幼苗通过次生代谢过程对不良环境(遮阴)的一种适应性反应。广西莪术为阳生植物,陈旭等研究发现,通过人为的遮阴使其光照强度减少至自然光照强度的85%,该环境条件下莪术挥发油和莪术醇含量最高。王华田等有相似的报道,银杏叶片中的黄酮和内酯含量受光照强度的影响,人为遮阴处理后叶片黄酮和内酯含量发生变化,在42%的自然光照强度条件下,黄酮含量和内酯含量最高。

植物基因克隆

来自dxy 22003luocong 植物基因全长克隆几种方法的比较 基因是遗传物质基本的功能单位,分离和克隆目的基因是研究基因结构、揭示基因功能及表达的基础,因此,克隆某个功能基因是生物工程及分子生物学研究的一个重点。经典克隆未知基因的方法比如通过筛选文库等有个共同的弊病, 即实验操作繁琐, 周期较长、工作量繁重,且不易得到全长序列。又由于在不同植物中目的基因mRNA丰度不同,所以获得目的基因的难易程度又不一样,特别是对于丰度比较低的目的基因即使使用不用的方法也不一定能获得成功。近年来随着PCR技术的快速发展和成熟.已经有多种方法可以获得基因的全长序列, 比如经典的RACE技术,染色体步移法和同源克隆法等,本文主要综述几种重要的克隆方法的原理和运用,并且比较分析这几种方法的优缺点,为你的实验节约时间和成本。 1 RACE技术 1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Mulis等[1]发明的PCR技术使生命科学得到了飞跃性的发展。1988年Frohman等[2] 在PCR技术的基础上发明了一项新技术, 即cDNA末端快速扩增技术( rapid amplification of cDNA ends, RACE), 其实质是长距PCR( long distance, PCR)。通过PCR由已知的部分cDNA 序列, 获得5′端和3′端完整的cDNA, 该方法也被称为锚定PCR ( anchored PCR) [3] 和单边PCR( one-sidePCR) [4]。RACE技术又分为3?RACE和5?端RACE。3′RACE 的原理是利用mRNA 的3′端天然的poly(A) 尾巴作为一个引物结合位点进行PCR, 以Oligo( dT) 和一个接头组成的接头引物( adaptor primer, AP)反转录mRNA得到加接头的第一链cDNA。然后用一个正向的基因特异性引物( gene-specific primer, GSP) 和一个含有接头序列的引物分别与已知序列区和poly(A) 尾区退火, 经PCR扩增位于已知序列区域和poly( A) 尾区之间的未知序列,若为了防止非特异性条带的产生, 可采用巢式引物( nested primer) 进行第二轮扩增, 即巢式PCR( nested PCR) [5,6]。5?RACE 跟3?RACE原理基本一样,但是相对于3?RACE来说难度较大。 5'-RACE受到诸多因素的影响而常常不能获取全长,因此研究者都着手改进它。这些措施主要是通过逆转录酶、5'接头引物等的改变来实现的,因此出现了包括基于“模板跳转反转录”的SMART RACE技术( switching mechanism at 5′ end of RNA transcript) [7] , 基于5′脱帽和RNA酶连接技术的RLM-RACE技术(RNA ligase mediated RACE)[8], 利用RNA连接酶为cDNA第一链接上寡聚核苷酸接头的SLC RACE技术(single strand ligation to single-stranded cDNA)[9] , 以及以内部环化的cDNA第一链为模板进行扩增的自连接或环化RACE技术(self-ligation RACE or circular RACE)[10],和通过末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾后引入锚定引物的锚定RACE技术( anchored RACE)[11]。 笔者主要介绍两种比较新的RACE技术,基于…模板跳转?的SMART RACE 技术和末端脱氧核苷酸转移酶( TdT)加尾技术。 1.1基于‘模板跳转’的SMART RACE技术[7,12]

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