酸乳中乳酸菌的测定

实验乳及乳制品中乳酸菌的测定

一、目的

1、解酸乳中乳酸菌分离原理

2、学习并掌握酸乳中乳酸菌菌数的检测方法。

二、原理

活性酸奶需要控制各种乳酸菌的比例，有些国家将乳酸菌的活菌数含量作为区分产品品种和质量的依据。由于乳酸菌对营养有复杂的要求，生长需要碳水化合物、氨基酸、肽类、脂肪酸、酯类、核酸衍生物、维生素和矿物质等，一般的肉汤培养基难以满足其要求。测定乳酸菌时必须尽量将试样中所有活的乳酸菌检测出来。要提高检出率，关键是选用特定良好的培养基。采用稀释平板菌落计数法，检测酸奶中的各种乳酸菌可获得满意的结果。

三、材料

1、培养基

改良MC培养基（MRS培养基，改良CHALMERS培养基，M17培养基）。

2、仪器和器具

无菌移液管（25ml,1ml），无菌水（225ml带玻璃珠三角瓶，9ml试管），无菌培养皿，旋涡均匀器，恒温培养箱。

四、流程

酸奶→稀释→制平板→培养→检查计数

五、方法

1、样品稀释

先将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品25ml加入盛有225ml无菌水的三角瓶中，在旋涡均匀器上充分振摇，务必使样品均匀分散，即为10-1的样品稀释液，然后根据对样品含菌量的估计，将样品稀释至适当的稀释度。

2、制平板

选用2~3个适合的稀释度，培养皿贴上相应的标签，分别吸取不同稀释度的稀释液1ml 置于平皿内，每个稀释度作2个重复。然后用溶化冷却至45℃左右的MC培养基倒平皿，迅速转动平皿使之混合均匀，冷却成平板。

3、培养和计数

将平皿倒置于37℃恒温箱内培养72h，观察长出的细小菌落，计菌落数目，按常规方法选择30~300个菌落平皿进行计算。

六、结果

1、指示剂显色反应

乳酸菌的菌落很小，1~3mm，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色。由于产酸菌落周围能使CaCO3产生溶解圈，酸碱指示剂呈酸性显色反应。

2、镜检形态

必要时，可挑取不同形态菌落制片镜检确定是乳杆菌或乳链球菌。保加利亚乳杆

菌呈杆状，成单杆、或双杆菌或长丝状。嗜热链球菌，呈球状，成对、或短链、或长链状。

七、数据计数及处理

作平皿内菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板的平均菌落总数。

将各稀释平板上的菌落数填入下表。

根据试验结果，报告检测结果：

每1ml酸奶中的乳酸菌数是____________________________。

MTT法测定乳酸菌活菌数的研究

62 MTT法测定乳酸菌活菌数的研究 黄立坤，杜鹏2，霍贵成* 乳品科学教育部重点实验室（东北农业大学） (哈尔滨 150030) 摘要建立一种快速、稳定、灵敏并可反映细菌活性的细菌计数方法。以乳酸菌中的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌为研究对象，探讨MTT法用于细菌计数的可行性及测量细菌数量的范围、反应时间、MTT 的用量、是否加入溶解剂等实验条件。结果：保加利亚乳杆菌在(1.0×105～2.18×107) cfu/mL内测出的OD 570值与细菌浓度呈良好的正相关，反应时间1.5 h，MTT添加量20 μL，测量前用DMSO溶解；嗜热链球菌在(2.0×105～5.12×107) cfu/mL范围内测出的OD 570值与细菌浓度呈良好的正相关，反应时间2.0 h，MTT添加量20 μL，可不添加溶解剂直接测量。MTT比色分析法可用于检测乳酸菌活菌数量。关键词MTT；保加利亚乳杆菌；嗜热链球菌；活菌计数 Inquiring into the Method of Counting Live Germ with MTT Abstract To establish a rapid, steady and sensitive bacteria-counting method that could reflect the bacteria’s activity. Lactabacillus delbrueckii ssp. bulgaricus and St reptococcus thermophilus were employed to discuss the feasibility of application of MTT method to bacteria-counting and determine the conditions of the assay, including linear range, reaction time, MTT dosage and whether solvent is added etc.. Results: The optical density at 570 nm is positively related to the concentration of L.delbrueckii ssp. bulgaricus when the number of the bacteria is in the range of (1.0×105~2.18×107) cfu/mL, and reacting time is 1.5 h, MTT dosage is 20 μL, and DMSO is used as solvent before assay; For St.thermophilus , the optical density at 570 nm is positively related to the concentration of the bacteria when the number of the bacteria is in the range of (2.0×105~5.12×107) cfu/mL, and reacting time is 2.0 h, MTT dosage is 20 μL and solvent is not added.. Conclusion: MTT colorimetry could be used to measure the viability of lactic acid bacteria. Keywords MTT colorimetry ；lactobacillus bulgaricus ；Streptococcus thermophilus ；live germ counting 基金项目：国家科技基础条件平台项目（2005DKA21204-08）资助。* 通讯作者 活菌计数在科研生产中有着广泛的应用，用于细菌计数的常规方法有平板稀释计数法(SPC)，自动菌数测定仪法，浊度法，菌体干重法等。SPC法为经典方法，但方法繁琐，耗时长，不能及时反映菌体生长情况，不适合于做大批量的实验；后几种方法不能区分细胞的死活，且测定结果受培养基、代谢产物的影响较大[1]。试验用MTT快速活菌计数法，以克服上述缺点，且工作量小，操作简单，快速，重复性好，能区分死活菌等。 MTT是一种噻唑盐，化学名3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑，结构式如图1。MTT法基本原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT的四唑环还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲臜（Fonmazan），而死细胞无此作用[2]。形成的甲臜颗粒沉积于细胞内或细胞周围，在一定细胞浓度范围内，其生成量与细胞数目和/或细胞活性呈正相关，用二甲亚砜(DMSO)溶解所生成的甲臜，通过检测光密度值变化，可间接反映细胞生长及增殖活性[3]。1 材料与方法 1.1 材料 图1 MTT的分子结构式 1.1.1 菌种 保加利亚乳杆菌（L . delbrukki subsp. bulgaricus ，L.b ）1.8501菌株和嗜热链球菌（S .thermophilus ，S.t ）3.8501菌株，均为乳品科学教育部重点实验室（KLDS ）提供。1.1.2 试剂及溶液 （1）试剂：MTT，二甲亚砜(DMSO)。 （2）MTT溶液配制：称取100 mg MTT (Amresco 分装)于小烧杯中。加20 m L P B S (0.0l m o l /L ，pH=7.2)，使其充分溶解，用0.22 μm微孔过滤器除菌，分装于1.5 mL的EP管中，4℃避光保存。两周内使用，时间过长，溶液中易进微生物起反应，改变MTT溶液的浓度。

常用乳酸菌培养基

常用乳酸菌培养基 SANY GROUP system office room 【SANYUA16H-

M R S培养基的组织成分（百度知道）：组成成重量(g) 牛肉蛋白粉10 鱼肉汁10 酵母浸出汁粉5 葡萄糖20 醋酸钠5 柠檬酸二铵2 吐温800.1 硫酸镁0.58 硫酸锰0.28 蒸溜水1000ml 备注：用高压锅在121℃灭菌15min，调节pH6.2～6.4 1．改良的MRS培养基（用于保加利亚乳杆菌的生长繁殖）： 胰陈10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、吐温80ml、K2HPO42g、乙酸钠5g、柠檬酸胺2g、MgSO4·7H2O0.02g、MgSO4·4H2O0.05g、蒸馏水1000ml、pH(5.6～5.8)。 3.葡萄糖-酵母膏培养基（用于嗜热链球菌的生长繁殖）： 酵母膏2.5g,蛋白胨5g,葡萄糖1g,蒸馏水1000ml,pH7.0。 4.改良M17基础培养基(用于嗜热链球菌的平板计数):

胰陈10g、牛肉膏5g、酵母膏2.5g、磷酸甘油二钠10g、MgSO4·7H2O0.25g、异维C0.5g、琼脂15g、蒸馏水950ml、pH(7.1～7.2)。 2.M17培养基(2号)：大豆胨5g；蛋白胨2.5g；酪蛋白胨2.5g；酵母浸粉2.5g；牛肉粉5g；乳糖5g；抗坏血酸钠0.5g；β-甘油磷酸钠19g；MgSO40.25g；琼脂12.75g；蒸馏水1000ml，pH7.0～7.4；121℃，15min灭菌。 LBS培养基(5号)：酵母浸粉5g；胰酪蛋白胨10g；葡萄糖20g；柠檬酸铵2g；KH2PO46g；FeSO40.034g；MgSO40.575g；CH3COONa25g；MnSO40.12g；Tween801ml；冰乙酸1.3ml；蒸馏水1000ml，pH5.5±0.2；118℃，15min灭菌。 改良MC琼脂（g/l）：用于乳酸菌的培养和计数。大豆蛋白胨5.0，牛肉膏粉5.0，酵母粉5.0，葡萄糖20.0，乳糖20.0，碳酸钙10.0，琼脂粉14.0，中 性红0.05，pH6.0±0.1，121℃、15分钟灭菌 SL培养基：蛋白胨10g；酵母粉5g；葡萄糖20g；柠檬酸二铵2g；醋酸钠 25g；硫酸镁0.58g；硫酸锰0.15g；吐温-80ml；磷酸二氢钾6g；硫酸亚铁 0.03；琼脂15——20g Elliker琼脂培养基（用于乳球菌的分离）：胰蛋白胨20g；蔗糖5.0g；酵母粉5g；氯化钠4.0g；明胶2.5g；乙酸钠1.5g；葡萄糖5g；抗坏血酸0.5g；乳糖5.0g；琼脂15—20g 明串球菌的分离和培养，选择性培养基： 1.HP培养基 植物蛋白胨20g；柠檬酸铵5g；酵母粉6g；硫酸亚铁0.04g；牛肉膏10g硫酸镁0.2g；吐温801ml；硫酸锰0.05g；葡萄糖10g

乳酸菌在泡菜生产中的应用

乳酸菌在泡菜生产中的应用 作者：杨春哲， 冉艳红 作者单位：杨春哲(山东省酿酒葡萄科学研究所,济南,250100)， 冉艳红(华南理工大学食品与生物工程学院) 刊名： 中国食物与营养 英文刊名：FOOD AND NUTRITION IN CHINA 年，卷(期)：2003(1) 被引用次数：18次 引证文献(18条) 1.王琳琳.郑一敏.胥秀英.傅善权.李杰.周慧.曾品涛肠膜明串珠菌的最适发酵培养基筛选[期刊论文]-重庆理工大学学报（自然科学版） 2010(9) 2.盛海圆.郭艳萍.常艳.张明传统泡菜中乳酸菌多样性的分析[期刊论文]-中国微生态学杂志 2010(7) 3.陈飞平微生物发酵对蔬菜腌制品品质的影响[期刊论文]-中国食物与营养 2009(9) 4.刘永娜.燕平梅.李锐绵白糖对发酵白菜中微生物区系的影响[期刊论文]-中国调味品 2009(4) 5.罗凤莲.欧阳建勋.夏延斌.王燕发酵辣椒中主要风味物质的研究进展[期刊论文]-食品工业科技 2009(7) 6.吴海波.张兰威.黄艳玲不同地域发酵蔬菜分离的乳酸菌抑菌效果及降亚硝酸盐能力的研究[期刊论文]-食品工业科技 2009(2) 7.李锐.燕平梅.刘永娜不同贮藏条件下白菜中亚硝酸盐含量的研究[期刊论文]-食品工程 2008(4) 8.胡书芳.王雁萍乳酸菌在泡菜生产中的应用[期刊论文]-安徽农业科学 2008(21) 9.姜彬.陈一.冯志彪黄瓜在纯菌接种恒温发酵过程中的化学成分变化[期刊论文]-食品工业科技 2008(12) 10.孙锦婷.陈一.姜彬.张艳梅.高晨晨发酵过程中蔬菜化学成分的变化研究[期刊论文]-食品工程 2007(2) 11.田永峰.吴天祥.胡晓瑜.赵飞乳酸菌在酿造和食品工业上的应用[期刊论文]-酿酒科技 2007(4) 12.蔡永峰.熊涛.岳国海.李绩.张贵林直投式生物法快速生产泡菜工艺条件的研究[期刊论文]-食品与发酵工业2006(6) 13.杨荣玲.肖更生.吴晓玉.刘学铭我国蔬菜发酵加工研究进展[期刊论文]-保鲜与加工 2006(2) 14.吴祖芳.刘璞.翁佩芳榨菜加工中乳酸菌技术的应用及研究进展[期刊论文]-食品与发酵工业 2005(8) 15.张坤生.刘晨.任云霞复配型防腐剂延长巴氏杀菌鸡肉香肠货架期的研究[期刊论文]-食品科学 2005(8) 16.刘哲君.王海伟.霍建伟.周锐.姜莹.丁玉萍肠膜明串珠菌,植物乳杆菌,短乳杆菌的最适培养基的筛选[期刊论文]-佳木斯大学学报（自然科学版） 2005(4) 17.乳酸菌在果蔬及谷物制品中的应用[期刊论文]-现代食品科技 2005(4) 18.张岩.肖更生.陈卫东.张友胜发酵蔬菜的研究进展[期刊论文]-现代食品科技 2005(1) 本文链接：https://www.wendangku.net/doc/2a17238801.html,/Periodical_zgswyyy200301011.aspx

食品中乳酸菌地检测

1 围 本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lactic acid bacteria）的检验方法。 本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。 2 规性引用文件 本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 3 术语和定义 3.1 乳酸菌 lactic acid bacteria 一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属（Lactob acillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和链球菌属（Streptococcus）。 4 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 4.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 4.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。 4.3 均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。 4.4 天平：感量0.1 g。 4.5 无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。 4.6 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。 4.7 无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。 5 培养基和试剂 5.1 MRS（Man Rogosa Sharpe）培养基及莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）改良MRS培养基：见附录A中A.1。 5.2 MC培养基（Modified Chalmers 培养基）：见附录A中A.2。 5.3 0.5%蔗糖发酵管:见附录A中A.3。 5.4 0.5%纤维二糖发酵管:见附录A中A.3。 5.5 0.5%麦芽糖发酵管:见附录A中A.3。 5.6 0.5%甘露醇发酵管:见附录A中A.3。 5.7 0.5%水苷发酵管:见附录A中A.3。 5.8 0.5%山梨醇发酵管:见附录A中A.3。

乳酸菌的筛选

乳酸菌的筛选（初筛） 一、实验目的 对采集的仔猪粪便进行梯度稀释和平板涂布，对猪粪中的肠源菌进行初步的筛选。 二、实验材料 PBS、2mL离心管、MRS肉汤、琼脂、冰袋、保温盒、封口膜、200μL 枪头等。 三、实验步骤 1、实验前准备：用MRS肉汤配置MRS固体培养基（内含有1.5%琼脂，1%CaCO3），121℃灭菌15min后倒平板，备后面涂布使用，2mL 离心管中加入1mLPBS备后面实验使用。 2、采样：使用已灭菌的200μL枪头挑取仔猪猪粪适量，放入事先准备好的2mL加有PBS的离心管中，取样标准为每窝仔猪取5个样品，采完样品后，用封口膜将离心管口封住，并放入准备好的装有冰袋的保温盒中保存。 3、涂布：将采好的样品用螺旋振荡器混匀，取100μL样品混匀液，加入900mL的离心管中进行梯度稀释，取10- 4、10-5梯度菌液进行平板涂布。 4、培养：将涂布好的平板依次标好时间、稀释浓度和样品编号后，置于厌氧培养箱中37℃培养24h。 5、培养完成后，对所涂布的平板进行拍照留底。

乳酸菌的筛选 一、实验目的 利用平板划线的原理，对涂布出的单菌落进行划线纯化。 二、实验原理 平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。 四、实验步骤 1、MRS培养基的配置：用MRS肉汤按每升48g计算配置，向其中加入1.5%的比例加入琼脂，按1%的比例加入CaCO3后，121℃灭菌15min。 2、倒平板：培养皿灭菌，烘干后，取灭菌的MRS固体培养基倒平板（每个平板倒10mL左右），放入4℃冰箱备用。 3、划线：于超净工作台中，将涂布平板中的单菌落用接种环挑取，按图1中所示的方法与平板上划线。 4、将接种好的平板置于37℃厌氧培养箱中培养24h。 5、培养期间，注意观察菌的生长情况，培养结束后，拍照留底。

常用乳酸菌培养基

常用乳酸菌培养基 集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-

M R S培养基的组织成分（百度知道）：组成成重量(g) 牛肉蛋白粉10 鱼肉汁10 酵母浸出汁粉5 葡萄糖20 醋酸钠5 柠檬酸二铵2 吐温800.1 硫酸镁0.58 硫酸锰0.28 蒸溜水1000ml 备注：用高压锅在121℃灭菌15min，调节pH6.2～6.4 1．改良的MRS培养基（用于保加利亚乳杆菌的生长繁殖）： 胰陈10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、吐温80ml、K 2HPO 4 2g、 乙酸钠5g、柠檬酸胺2g、MgSO 4·7H 2 O0.02g、MgSO 4 ·4H 2 O0.05g、蒸馏水 1000ml、pH(5.6～5.8)。 3.葡萄糖-酵母膏培养基（用于嗜热链球菌的生长繁殖）：酵母膏2.5g,蛋白胨5g,葡萄糖1g,蒸馏水1000ml,pH7.0。 4.改良M17基础培养基(用于嗜热链球菌的平板计数):

胰陈10g 、牛肉膏5g 、酵母膏2.5g 、磷酸甘油二钠10g 、 MgSO 4·7H 2O0.25g 、异维C0.5g 、琼脂15g 、蒸馏水950ml 、pH(7.1～ 7.2)。 2.M17培养基(2号)：大豆胨5g ；蛋白胨2.5g ；酪蛋白胨2.5g ；酵母浸粉2.5g ；牛肉粉5g ；乳糖5g ；抗坏血酸钠0.5g ；β-甘油磷酸钠19g ；MgSO40.25g ；琼脂12.75g ；蒸馏水1000ml ，pH7.0～7.4；121℃，15min 灭菌。 LBS 培养基(5号)：酵母浸粉5g ；胰酪蛋白胨10g ；葡萄糖20g ；柠檬酸铵2g ；KH 2PO 46g ；FeSO 40.034g ；MgSO 40.575g ；CH 3COONa25g ； MnSO 40.12g ； Tween801ml ；冰乙酸1.3ml ；蒸馏水1000ml ，pH5.5±0.2；118℃，15min 灭菌。 改良MC 琼脂（g/l ）：用于乳酸菌的培养和计数。大豆蛋白胨5.0，牛肉膏粉 5.0，酵母粉5.0，葡萄糖20.0，乳糖20.0，碳酸钙10.0，琼脂粉14.0，中 性红0.05，pH6.0±0.1，121℃、15分钟灭菌 SL 培养基：蛋白胨10g ；酵母粉5g ；葡萄糖20g ；柠檬酸二铵2g ；醋酸钠25g ；硫酸镁0.58g ；硫酸锰0.15g ；吐温-80ml ；磷酸二氢钾6g ；硫酸亚铁0.03；琼脂15——20g

乳酸菌应用的意义

：乳酸菌饮料以蛋白质、有益活菌及口味独特吸引了众多消费者。近年来,添加各种果蔬汁的乳酸菌饮料更是受到研究者和消费者的关注。将苹果汁和乳酸菌饮料合理配伍,可以制造经济实惠、营养更为全面的饮品。本文重点研究以苹果为原料，乳酸菌为菌种，采用正交实验设计优化苹果汁饮料的发酵工艺，为发酵苹果汁的工业化生产提供理论依据。 关键词：正交实验乳酸菌发酵苹果汁优化 1本课题的研究目的和意义 1.1目的和意义 有史以来，蔬菜就是人类食品的一个不可缺少的重要组成部分。由于食品化学家和营养学家们的不懈努力，目前人们已经基本认识了蔬菜果汁的化学成分，并根据化学成分研究了蔬菜汁饮料的营养生理意义。蔬菜汁饮料特有的营养生理和健康方面的意义表现在3方面：首先，蔬菜汁饮料内一些重要营养物质含量相当高；其次，它含有一些其他食品比较缺乏甚至非常缺乏的对人体组成有利的化学成分；再有就是一些食品所含有的不利于人体健康的化学成分，在蔬菜汁饮料中的含量相当少，甚至不含有。例如各类酒、咖啡或有些茶，均含有数量不等的乙醇或咖啡因，而蔬菜汁饮料不含。 蔬菜汁饮料含有许多对人体营养非常重要和有价值的化学成分，例如碳水化合物、植物酸、矿物质、维生素和微量元素等等，所以他们往往具有一些治疗疾病的能力。例如，在古代，人们把甜菜原汁当作治疗肾脏或肝脏功能失调的药物，或者当作利尿药物。人民还发现萝卜和萝卜原汁可以用来治疗食欲不振；后来，人们又发现甘蓝能治疗坏血病等等。从热量的标准来衡量，蔬菜汁饮料的营养生理意义在于他的营养成分能够迅速被人体吸收，因此对运动员，病后恢复健康的人和脑力劳动者具有特殊意义。现在人们进一步发现，许多蔬菜以及用它们制成的饮料都有保健作用。尽管目前还不能完全解释它们的保健机理，但是它们大部分的保健机理已经被现代科学所证实。 1.2 生物技术与饮料工业 饮料做为食品工业的支柱产业，具有市场广阔、经济效益显著等特点。在个中传统饮料产品继续得到发展的同时，多种各具特色的新型饮料产品不断问世，极大的促进了饮料工业的发展。传统的饮料生产工艺各具特色，产品丰富多样。生物技术的采用，给现代饮料工业注入了新的活力。 生物技术应用与饮料生产，可以在资源、开发产品、改进生产工艺以及提高产品质量等方面发挥巨大的作用。 1.2.1 乳酸菌及其发酵制品 近年来，乳酸菌发酵食品日益受到消费者青睐，特别适宜作婴儿辅助食品和老年食品。乳酸菌是一类可发酵利用碳水化合物而产生大量乳酸的细菌。人们应用乳酸菌的历史非常悠久，保加利亚酸奶、马奶酒及酱腌菜等均是传统的乳酸菌发酵制品。近年来，随着乳酸菌尤其是双歧杆菌、嗜酸乳杆菌的肠道有益菌的许多重要生理功能的确认，各种乳酸菌发酵制品更是风行全世界。 通过对乳酸菌及其代谢产物的大量研究，目前认为乳酸菌之所以有益于人体健康是由于它具有如下一些主要生理功能。 （1）对肠道菌群的改善作用；乳酸菌可抑制肠道内病原菌和有害于人体健康的细菌的成长繁殖，增加人体诶有益菌的数量，维持肠道菌群的平衡，对保持人体健康、预防疾病具有十分重要的作用。 （2）与普通乳相比，发酵乳制品的消化吸收性和营养价值及其风味都已大大提高。 （3）乳酸菌能降低血清胆固醇水平，可以预防由冠状动脉硬化所引起的心脏病。 （4）乳酸菌具有防癌、抗癌作用。 （5）乳酸菌对常见至病菌有拮抗作用。

乳酸菌之检验

食品微生物之檢驗方法－乳酸菌之檢驗 101年6月7日署授食字第1011902050號公告 1. 適用範圍：本方法適用於食品中乳酸菌之檢驗。 2. 檢驗方法：檢體經系列稀釋後，以選擇性培養基培養及計數之方法。 2.1. 工作環境：工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為100呎燭光以上，密閉室內換氣良好， 儘可能沒有灰塵及流動空氣。每15分鐘落菌數不得超過15 C FU／培養皿。 2.2. 器具及材料 2.2.1. 乾熱滅菌器。 2.2.2. 高壓滅菌釜。 2.2. 3. 冰箱：能維持5 ± 3℃者。 2.2.4. 培養箱：能維持內部溫度溫差± 1.0℃以內者。 2.2.5. 水浴：能維持水溫溫差± 1.0℃以內者。 2.2.6. 攪拌均質器（Blender）或鐵胃（Stomacher）：能適用於無菌操作者。 2.2.7. 天平：可稱量到2000 g ，靈敏度為0.1 g ；可稱量到120 g ，靈敏度為5 mg。 2.2.8. 旋渦混合器（Vortex mixer）。 2.2.9. 酸鹼度測定儀（pH meter）。 2.2.10. 菌落計數器：適用於菌落之計算者。 2.2.11. 厭氧缸（Anaerobic jar）或厭氧培養箱：適用於厭氧培養者。 2.2.12. 吸管輔助器（Pipette aid）。 2.2.1 3. 吸管（Pipette）：已滅菌。 1 m L吸管應有0.01 m L之刻度； 5 m L及10 m L吸管應有0.1 m L 刻度。 2.2.14. 培養皿：已滅菌，內徑約90 mm ，深度約15 mm ，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮痕或其他 缺點。 2.2.15. 稀釋用容器：無菌袋或有1000 mL、500 mL、99 m L及90 m L標記附蓋（栓）之可滅菌廣口瓶。

乳酸菌维持肠道菌群的微生态平衡

乳酸菌维持肠道菌群的微生态平衡 乳酸菌表面有能与肠粘膜细胞牢固结合的特异性物质，推测可能是脂磷壁酸或肽聚糖，或细胞蛋白，或者其中二者，或三者全部。这些特异性物质被称为粘附素，乳酸菌通过粘附素与肠粘膜紧密结合，在肠粘膜表面定植占位，是形成生理屏障的主要组成部分。该屏障可以抵御外来细菌的入侵，维持肠道内微生态平衡。定植后的乳酸菌在体内发酵乳糖，产生大量的乳酸、乙酸等有机酸，使肠道pH值降低。肠内处于酸性环境，对志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等致病菌有拮抗作用。低pH值有利于肠道蠕动，维持正常生理功能，阻止致病菌的定植。嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌产生的H2O2能抑制葡萄球菌等致病菌的生长。双歧杆菌和某些乳杆菌产生的孢外糖苷酶，可降解肠粘膜上皮细胞的复杂多糖，由于这些糖是致病菌素的潜在受体，所以通过酶的作用，将其分解，阻止致病菌毒素对上皮细胞的粘附。不少乳酸菌产生细菌素如乳酸毒素、双歧杆毒素，对葡萄球菌、棱状芽孢杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌有拮抗作用。此外双歧杆菌还可将结合的胆酸分解为游离胆酸，游离胆酸对致病菌也有一定的抑制作用。 易位是肠道微生态失衡的主要原因之一，易位有纵向转移和横向转移，纵向转移是指正常菌群由原位向周围转移，横向转移是指正常菌群由原位向组织的不同层次转移[3]。正常情况下，只有少量的细菌发生纵向或横向转移，但在原籍菌的生物拮抗和宿主的免疫机制的作用下，不会引起微生态失衡。如果机体免疫功能下降，或者是滥用抗生素，使常驻菌的定植抗力下降，菌群的平衡失调，使致病菌大量繁殖、增生，并不断向周围扩散，使转移的数量过大，易位成为可能，一旦易位发生，微生物屏障就遭受破坏、导致体内微生态平衡的失调、紊乱从而引起疾病发生。易位的另一种情况是，有些细菌在正常情况下对人体是有益的，易位后反而成了致病菌——机会致病菌，对人体有害。如肠球菌在肠道和口腔部位是正常菌群，但由于菌群失衡或宿主免疫功能下降，该菌可通过粘膜渗透，易位（纵向转移）于心脏、脑、尿道、胆道等部位则可分别引起心内膜炎、脑膜炎、尿道炎及胆道炎等疾病。 乳酸菌可防止肠道菌群发生易位，其作用机理有以下几个途径。第一，乳酸菌直接参与构成肠道定植抗力，阻止病原菌的定植和入侵；第二，对肠道有营养作

乳酸菌菌种的分离筛选方法

乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养

常用乳酸菌培养基

常用乳酸菌培养基 MRS培养基的组织成分： 组成成重量(g) 牛肉蛋白粉10 鱼肉汁10 酵母浸出汁粉 5 葡萄糖20 醋酸钠 5 柠檬酸二铵 2 吐温80 0.1 硫酸镁0.58 硫酸锰0.28 蒸溜水1000ml 备注：用高压锅在121℃灭菌15min，调节pH6.2～6.4 1．改良的MRS培养基（用于保加利亚乳杆菌的生长繁殖）： 胰陈10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、吐温80ml、K2HPO4 2g、乙酸钠5g、柠檬酸胺2g、MgSO4·7H2O 0.02g、MgSO4·4H2O 0.05g、蒸馏水1000ml、pH(5.6～5.8)。3.葡萄糖-酵母膏培养基（用于嗜热链球菌的生长繁殖）： 酵母膏2.5g, 蛋白胨5g, 葡萄糖1g, 蒸馏水1000ml ,pH7.0。 4.改良M17基础培养基(用于嗜热链球菌的平板计数): 胰陈10g、牛肉膏5g、酵母膏2.5g、磷酸甘油二钠10g、MgSO4·7H2O 0. 25g、异维C0.5g、琼脂15g、蒸馏水950ml、pH(7.1～7.2)。 5. M17培养基(2号)： 大豆胨5g；蛋白胨2.5g；酪蛋白胨2.5g；酵母浸粉2.5g；牛肉粉5g；乳糖5g；抗坏血酸钠0.5g；β-甘油磷酸钠19g；MgSO 4 0.25g；琼脂12.75g；蒸馏水1000ml，pH7.0～7.4；121℃，15min灭菌。 6. LBS培养基(5号)：酵母浸粉5g；胰酪蛋白胨10g；葡萄糖20g；柠檬酸铵2g；KH2 PO4 6g；FeSO4 0.034g；MgSO4 0.575g；CH3COONa 25g；MnSO4 0.12g；Tween80 1ml；冰乙酸1.3ml；蒸馏水1000ml，pH5.5±0.2；118℃，15min灭菌。 7. 改良MC琼脂（g/l）：用于乳酸菌的培养和计数。大豆蛋白胨5.0，牛肉膏粉5.0，酵母粉5.0，葡萄糖20.0，乳糖20.0，碳酸钙10.0，琼脂粉14.0，中性红0.05，pH6.0±0.1，121℃、15分钟灭菌 8. SL培养基：蛋白胨10g；酵母粉5g；葡萄糖20g；柠檬酸二铵2g；醋酸钠25g；硫酸镁0.58g；硫酸锰0.15g；吐温-80 ml；磷酸二氢钾6g；硫酸亚铁0.03；琼脂15——20g 9. Elliker琼脂培养基（用于乳球菌的分离）：胰蛋白胨20g；蔗糖5.0g；酵母粉5g；氯化钠4.0g；明胶2.5g；乙酸钠1.5g；葡萄糖5g；抗坏血酸0.5g；乳糖5.0g；琼脂15—20g 10.明串球菌的分离和培养，选择性培养基： 1）. HP培养基植物蛋白胨20g；柠檬酸铵5g；酵母粉6g；硫酸亚铁0.04g；牛肉膏10g 硫酸镁0.2g；吐温80 1ml；硫酸锰0.05g；葡萄糖10g 2）. 蔗糖硫胺培养基蔗糖100g ；磷酸氢二钾5g；酵母粉2.5g；硫酸镁0.2g；硫酸铵0.2g；氯化钠0.6g；琼脂15—20g 。

乳酸菌在发酵食品中的应用

乳酸菌在发酵食品中的应用 段振楠梁华忠罗国超王沁峰谢建将曾泽生 （四川高福记生物科技有限公司，四川成都 611732）摘要：乳酸菌是食品发酵工业中重要的细菌，本文主要阐述了传统发酵泡菜、郫县豆瓣、传统豆酱、酱油、发酵肉制品中乳酸菌所起到的作用及其使用现代生物技术制造的制剂通过人工接种在发酵过程所显现出的效果。同时，阐述了乳酸菌在发酵乳制品中的发酵机理和一些特性功能。并对乳酸菌的应用前景进行了展望和建议。 关键词：乳酸菌，发酵食品，泡菜，豆酱，郫县豆瓣，肉制品发酵 Application Of Lactobacillus In The Fermented Food DUAN Zhen-nan, LIANG Hua-zhong,LUO Guo-chao, WANG Qin-feng, ZENG Ze-sheng,XIE Jian-jiang (SiChuan Gaofuji Biotechnology CO.,Ltd,Chengdu 611732,China) Abstract：Lactic acid bacteria is a important bacteria in food fermentation industry. The article focuses on the function of lactic acid bacteria in traditional fermented kimchi , Bean paste, Pixian traditional miso, soy sauce, fermented meat product and the use of modern biotechnology manufacturing by artificial inoculation in the fermentation process as demonstrated in the results. The article also demonstrate the ferment mechanism and certain features of lactic acid, prospect its applications and provide recommendations. Key words:Lactobacillus; Fermented Food; Kimch; Bean paste ;

食品中乳酸菌的检测

1 范围 本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lactic acid bacteria）得检验方法。 本标准适用于含活性乳酸菌得食品中乳酸菌得检验。 2 规范性引用文件 本标准中引用得文件对于本标准得应用就是必不可少得。凡就是注日期得引用文件，仅所注日期得版本适用于本标准。凡就是不注日期得引用文件，其最新版本（包括所有得修改单）适用于本标准。 3 术语与定义 3、1 乳酸菌lactic acid bacteria 一类可发酵糖主要产生大量乳酸得细菌得通称。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）与链球菌属（Streptococcus）。 4 设备与材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其她设备与材料如下： 4、1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 4、2 冰箱：2 ℃～5 ℃。 4、3 均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。 4、4 天平：感量0、1 g。 4、5 无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。 4、6 无菌吸管：1 mL（具0、01 mL刻度）、10 mL（具0、1 mL刻度）或微量移液器及吸头。 4、7 无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。 5 培养基与试剂 5、1 MRS（Man Rogosa Sharpe）培养基及莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）改良MRS培养基：见附录A中A、1。 5、2 MC培养基（Modified Chalmers 培养基）：见附录A中A、2。 5、3 0、5%蔗糖发酵管:见附录A中A、3。 5、4 0、5%纤维二糖发酵管:见附录A中A、3。 5、5 0、5%麦芽糖发酵管:见附录A中A、3。 5、6 0、5%甘露醇发酵管:见附录A中A、3。 5、7 0、5%水杨苷发酵管:见附录A中A、3。 。3、A中A见附录:山梨醇发酵管5%、08 、5． 5、9 0、5%乳糖发酵管:见附录A中A、3。 5、10 七叶苷发酵管:见附录A中A、4 5、11 革兰氏染色液：见附录A中A、5。 5、12莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）：化学纯。 5、13 半胱氨酸盐酸盐（Cysteine Hydrochloride）：纯度＞99%。 6 检验程序 乳酸菌检验程序见图1。

乳酸菌的分离培养

乳酸菌的分离培养 保加利亚乳杆菌 组长： 组员： 实验目的： 1.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术及微生物形态观察； 2.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握乳酸菌的简单染色法及无菌操作接种技术； 3.通过对培养基的配制，了解配制培养基的一般步骤和方法，掌握微生物实验常用的器皿的清洗与包扎、培养基的制备、消毒灭菌。 4.了解各种灭菌的基本原理和应用范围，以及实验室中常用的灭菌方法。 5.了解酸奶中乳酸菌分离原理, 观察乳酸菌的基本形态,掌握用显微镜测微尺测量微生物细胞大小、数目的测定的方法。 6.了解稀释平板计数的原理，熟练掌握混合平板培养法。明确显微镜计数的原理并学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。 7．初步学会乳酸菌培养的基本技术，了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理和方法，掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。 8.了解并掌握微生物菌种保藏的常用方法及其优缺点，并了解不同微生物对不同的生物大分子的分解利用情况，认识微生物代谢类型的多样性。 实验原理：乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，本实验中 用革兰氏染色法进行染色，革兰氏染色法是根据细菌细胞壁成分不同,脱色效果不同从而可以将细菌区分为G+和G-菌。通过革兰氏染色以及形态学观察，乳酸菌呈紫色，为革兰氏阳性菌；乳酸菌应为乳杆菌和乳球菌的混合体。酸奶中含有乳酸菌，而且目前市场上销售的酸奶中通常含有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌四种菌。细菌及其它一些微生物的大小，通常用测微计来测量，测微计分接目测微计与镜台测微计；培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组份的营养物质调制而成的营养基质；灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物，包括芽孢；自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物的特性或者要大量培养或者使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这些获得纯培养的方法称为微生物的分离和纯化。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。 实验器材： 样品：含乳酸菌的酸奶 ①培养基：改良MRS固体培养基 蛋白胨5g 牛肉膏5g 酵母提取物 2.5g 柠檬酸二铵1g 水500mL 乙酸钠2.5g K2HPO4 1g MnSO4·4H2O 0.125 吐温80 0.5mL 琼脂12.5g MgSO4·7H2O 0.29g CaCO3 5g 葡萄糖10g 。 仪器用品：500ml烧杯一个100ml量筒一个无菌培养皿12个 250ml容量三角瓶2个5ml无菌移液管1ml无菌移液管6只 15ml试管7只高压灭菌锅天平

乳酸菌农业中的应用

乳酸菌生物农业 一、中国农业发展和现状，存在哪些问题，是怎样解决的？ 中国农业发展现状 我国农业科技的水平，部分领域已跃居世界先进行列。科技进步对农业增长的贡献率已从20世纪70年代末的27％提高到现在的43％。但是，与世界先进水平相比（发达国家的科技进步贡献率均在60％以上，有的甚至高达80％），我国的农业科技还存在较大差距，远远不能适应农业现代化的要求。但是所取得的显著进步是不可否认的。现代农业技术与常规技术结合不断促进农业生产发展，农业整体科技进步贡献率已经达到43％；建立了生物技术与杂交育种技术为代表的新品种培育体系，杂交水稻和抗虫棉等6000多个动植物新品种投放农业生产中，为粮食生产，特别是肉、蛋等的保障起到了重要作用；生物技术以及种养、机械化和病虫害综合防治等技术的应用，大大提高了农业的生产率和土地的使用效率，2007年全国粮食单产达到每亩350公斤，总产达到5亿吨，已经达到了丰年有余的水平；建立了畜牧水产等良种繁育、集约化养殖及疾病防治技术体系。目前，我国畜牧总产跃居世界首位，科技贡献率达50％，肉、蛋等产量在全世界排在第一位。 目前，我国农业资源利用率、生产效率、劳动产比率偏低、生产和经营方式较落后。一方面我国资源短缺，另一方面我国资源利用率编低。如：我国农业有很多地方仍采取漫灌措施，灌溉利用效率不到40％，比先进国家低1倍；肥料利用效率不到35%，低于世界一般水平1 5％～20％；农药利用效率也不到30％；高产稳产田只占耕地总面积的35％。 此外，农业生态受到很大威胁。我国农作物病虫害每年造成35％的减产，畜禽疾病每年造成的死亡率达10％～15％；农药、化肥和抗生索等的施用过量和残留问题等加剧了农业生产环境的恶化，并影响到农产品质量。由于品种类型单一、产品质量偏低，粮食单产仅是发达国家的50％～70％。 农业科研投入不足。世界每万农业经济活动人口所拥有的农业科研人员为140人，我国还不到80人。科技成果转化率低。目前。我国农业科技成果转化率仅为30％到40％，比发达国家低20～30个百分点。农业科技成果转化机制不尽合理。农业科研与农业技术推广分属不同的行政部门管理，二者之间联系不够紧密；农技推广和农民教育工作多头进行，使得有限的经费“撒胡椒面”，难以达到快速提高农民科技水平的目的。 据中国农业科学院初步估测，我国农业科技水平同世界先进水平总体差距达15到2O年。 中国农业面临的挑战 1．农业资源匮乏制约了未来农业的增长 中国农业发展所依赖的农业资源总量位居世界前列，但是人均占有量大大低于世界平均水平，并且日益减少，前景堪忧。如中国耕地总面积为15亿亩，但人均耕地面积不到1.2亩，只相当于全球平均水平的1／3；水资源总量为2．8万亿m3，人均占有量不足2 700 m3 ，只有世界人均水平的1／4。据估计，在

乳酸菌检验方法

河北世翔生物有限公司 乳酸菌检验方法 前言 1.本检验方法针对公司各种形式（固态、液态）的乳酸菌菌微生物添加剂； 2.本标准的制定依据GBT 23181-2008 、SNT 1941.1-2007、GB 478935-2010等 国家标准制定； 3.本标准由研发部起草，经公司总经理批准，公布之日起实施。 一、检验前的准备 1.培养基及其试剂 1.1盛有若干玻璃珠的无菌水225ml， 1.2MRS琼脂培养基： 牛肉膏10g 蛋白胨10g 酵母膏5g 121℃，灭菌15-20min 1.3培养皿12个，试管12个，涂布棒1个，用报纸包扎后灭菌 1.4打开超净工作台，用消毒水或者酒精喷洒，工作台台面，打开紫外灯杀菌30分钟，打开风机，5分钟后，打开照明 二、取样 按照GB/T14699.1进行取样：用灭菌的铲子，选取有代表性的样品适量放入取样袋中，标注好取样日期，批次备用；液体取样使用灭菌的试管，在火焰保护下进行，完成后放入低温冰箱储藏。

三、检测步骤 1. 以无菌操作称取试样25g（ml），加入225ml有玻璃珠的无菌水中，放在摇床上，200r/min，摇动30min，制成1：10的初始菌悬浮液。取1：10的初始菌悬浮液0.5ml，加入4.5ml无菌水，经充分混匀后，制成1：100的稀释液。依次方法依次稀释到1：108 2.选择107 、108 二个稀释度，用移液枪分别吸取0.1ml，接种到3个营养琼脂平板上，使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布棒不得接触平皿边缘，涂布好的平皿改好，置室温中放置15min使接种物完全被琼脂吸收。翻转上述平皿置于36±1℃培养箱中培养48±2h。从样品稀释到涂布完成要求在15分钟内完成。 3.培养后，选取菌落数在30到300个之间的平板计数，低于30 CFU 平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。若平板中有较大片状菌落生长时，则不宜计数；若片状菌落步不到平板的一半，而其余一半分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 四、计数 1.若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）中菌落总数结果。 2.若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算