荧光比率探针及其应用研究进展
７
前 言
荧光比率技术是荧光分析中的一项重要技术。该技术在生物染色剂中，可被紫外线或蓝紫光（短波长光）激发而发射荧光的染料，称为荧光染料（荧光色素）。可被长波长光激发，这些荧光色素常称为荧光探针。荧光探针通常用于固定组织和细胞的染色，以及或活细胞中的应用， 此外还包括应用于体内荧光探针。
分子荧光探针按用途分类包括离子探针、极性探针、粘度探针、ＰＨ值探针、膜荧光探针、细胞活性探针、细胞器探针、位点特异性荧光探针等等。探针通过与分析物（如生命金属离子）进行结合后，引起荧光特性发生变化，通过测定荧光的激发波长、发射波长、荧光强度、峰位、荧光寿命、荧光量子产率和各向异性等，获得相关信息。
荧光方法测定中，荧光探针在与反应物结合后，出现激发或发射光谱移位的探针，可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率进行测定，称为比率测量。因为通过二个选择性的波长的荧光强度变化可作为定量的依据， 通常指在波长范围内有荧光强度明显的变化。同普通荧光探针相比，比率测量探针可以被分为两部分。
一种是荧光比率效果是通过原来荧光谱的迁移。通常，这些迁移的背景是荧光探针激发态的电子转移。它被激发通过改变发色团同周围分子或原子交互作用的能量改变（溶剂化显色迁移），同外部电场的交互作用（电致显色迁移）和在发色团中的双电弛豫（双电弛豫迁移）。
另外一种结合探针，荧光谱包括２个或更多的谱带。通常，是这些谱带相对强度的改变，激发态同荧光探针发色团反应。这些反应在不连续的能量状态。
荧光比率探针及其应用研究进展
杨柳＊ ，郭成海，张国胜
（防化研究院第四研究所，北京 １０２２０５）
摘要 本文介绍了荧光比率探针，包括阳离子探针、阴离子探针、ｐＨ值探针、极性探针、氧化性和分子的比率测量探针的应用及近几年的研究进展。关键词 荧光分析，比率测量
＊作者简介：杨柳（１９７５－），男，助理研究员，博士研究生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｌｉｕｊｉｎｊｉｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
所以在初始和产物状态都随着能量转移而发射荧光。
荧光比率测定法可消除光漂白和探针负载和留存及设备因素（照明稳定性）引起的数据的失真。如阴离子探针可通过有机离子载体从细胞排除，如ＡＭ酯可被Ｐ糖蛋白多药载体排出荧光比率测定法可减少探针渗漏对实验结果的影响。探针与离子结合后，出现激发或发射光谱移位的探针可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率校准，可克服由于离子浓度的变化而造成的荧光信号人工假象。
Ｂｒｉｇｈｔ等（１９８９）发现比率测量减少或消除几种决定因素的变化对测量荧光强度的影响，包括探针浓度、激发光的光路长度、激发强度、和检测效率。消除的人工假象包括光漂白、探针渗漏、细胞厚度、探针在细胞内（区室化作用引起）或不同细胞群之间（负载效率差异造成）的不均匀分布。
比率测量探针已经应用于不同的测量领域：离子探针（阳离子探针Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋，Ｚｎ２＋，Ａｇ＋等）阴离子探针（Ｃｌ－，ＣＮ－，Ｆ－等），膜探针、活性氧和一氧化氮探针，极性探针、ＰＨ值探针等等。
１应用比率测量的阳离子探针：
各种各样的阳离子在生命活动中起重要的作用， 如构成细胞和生物体某些结构的重要成分，参与并调节生物体的代谢活动等，荧光方法通常用来测定阳离子在生物体不同组织的含量和分布。阳离子比率测量探针也在不断发展。
１．１ Ｃａ２＋检测的比率测量探针：
探针与Ｃａ２＋结合后出现光谱移位的探针可进行比率测量。主要包括：Ｆｕｒａ－２、双－ Ｆｕｒａ－２、Ｆｕｒａ－４Ｆ、Ｆｕｒａ－５Ｆ、Ｆｕｒａ－６Ｆ、 ｉｎｄｏ－１、ｉｎｄｏ－５Ｆ、ｍａｇ－Ｆｕｒａ－２
（ｆｕｒａｐｔｒａ）、Ｆｕｒａ－２ＦＦ、香豆素苯并噻唑ＢＴＣ、绿荧光蛋白、ＢＡＰＴＡ和３－苯并咪唑基亚氨基香豆素结合的探针、钙绿－１和ＢＳ混合组成的双波长Ｃａ２＋比率测量探针、Ｆｌｕｏ－３／ＡＭ和ＦｕｒａＲｅｄ混合的使用双波长Ｃａ２＋比率测量探针等。
Ｓｈｉｍｏｚｏｎｏ等应用绿荧光蛋白作为Ｃａ２＋比率测量探针，探针有双激发荧光谱，４１５ ｎｍ ｔｏ ４９４ ｎｍ。探针可应用于游动的细胞。可比率测定海拉细胞中的Ｃａ２＋浓度［１］。
Ｌｉｅｐｏｕｒｉ等用ＢＡＰＴＡ和３－苯并咪唑基亚氨基香豆素结合的探针结合形成在细胞膜附近测量Ｃａ２＋比率测量探针。它是同Ｃａ２＋结合能力低的探针［２］。
Ｅｌｓ Ｃｉｅｌｅｎ等２００２年报道了Ｃａ２＋ ａｎｄ Ｍｇ２＋的比率测量探针［３］。三铯盐 ｏｆ ｛２－［双（羰基甲基）氨］－５－（５－苯－２－噻吩）苯氧基｝乙酸， 巯基－Ｈ合成作为Ｃａ２＋ ａｎｄ Ｍｇ２＋阳离子的比率测量探针，并报道了在生理条件下的结合能力。巯基－Ｈ可增强与Ｃａ２＋的结合能力，强于其它的比率测量Ｃａ２＋探针Ｍａｇ－ｆｕｒａ－２， Ｍａｇ－ｆｕｒａ－５， Ｍａｇ－ｉｎｄｏ－１， Ｆｕｒａ－ＦＦ， ａｎｄ ＢＴＣ。
１．２ Ｎａ＋比率探针：
Ｋａｒｌ Ｈ报道了苯并呋喃、异邻苯二甲酸盐（ＳＢＦＩ）作为与Ｎａ＋结合的荧光比率测定探针，该探针用于活体检测，可以检测７５－１５０ｍＭ的Ｎａ＋。
１．３ Ｚｎ２＋比率探针：
由于Ｚｎ２＋在生物体内有特殊的功能，如明显抑制多种因素诱导的凋亡等功能，因此Ｚｎ２＋的探针被不断研究。
Ｍａｇｅｄ Ｍ． Ｈｅｎａｒｙ在２００４年报道了，在中性ＰＨ条件下，已合成的２－（２ －苯亚磺酰氨基苯基） 苯并咪唑的一系列衍生物用作Ｚｎ２＋荧光比率测定探针，通过同阳离子结合引起分子内质子传导机制（ＥＳＩＰＴ）［４］。
Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｊ． Ｃｈａｎｇ等２００４年报道了（ＺＮＰ１）作为荧光探针，与Ｚｎ２＋结合后单激发波长，双发散波长 （６２４／ ５４８）强度改变。该探针存在醌和羟基的互变异构体。文章报道了该探针应用于ＣＯＳ－７细胞中Ｚｎ２＋的测量［５］。
Ｒｏｎｇｈｕａ Ｙａｎｇ老师等报道了采用了卟啉组装的β－环糊精通过双发射荧光比率测定Ｚｎ２＋，同Ｚｎ２＋结合后６５６－ｎｍ波长强度减小６０６ ｎｍ波长强度增加［６］。
Ｃａｒｏｌｙｎ等发现了一系列双发色团的Ｚｎ２＋比率探针在可见光区被激发的荧光。探针Ｃｏｕｍａｚｉｎ－１是由ｃｏｕ－ｍａｒｉｎ ３４３和ＺＰＡ－１两种荧光发色团通过酯化连接。它本身是无荧光的，通过酯水解释放出发色团。在４８８
ｎｍ （ ｅｘｃ ＝ ４４５ ｎｍ） 同ＺＰＡ－１ 激发的５３４ ｎｍ （ ｅｘｃ ＝ ５０５ｎｍ）进行比率测量［７］。
Ｍａｒｕｙａｍａ Ｓ等合成了一系列Ｚｎ２＋比率探针ＺｎＡＦ－Ｒｓ，它是第一种可在生物体使用的比率测量的Ｚｎ２＋探针，可渗透细胞的Ｚｎ２＋比率探针，可通过数据Ｋｄ看其应用方面有合适的连接能力［８］。
Ｓｈａｗｎ等２００２年报道了［９］合成一系列Ｚｎ２＋比率探针，合成了ＲＦ－１（９－（ｏ－羰基苯基）－２－氯－６－［双（２－吡啶基甲基）氨基］－３－黄原胶，Ｒｈｏｄａｆｌｕｏｒ－１和ＲＦ－２。探针的检测浓度为＜１ｎｍ。在一定的ＰＨ条件下发散波长从５０７ｎｍ转移到５２９ｎｍ。
１．４ Ａｇ＋的荧光比率探针：
Ａｇ＋可以和探针形成１∶２的配合键，引起激发态的强度变化，从而进行比率测量［１０］。
１．５ 其它阳离子比率探针：
Ｚｈｅｎ－Ｃｈａｎｇ Ｗｅｎ等２００５年报道了用硫脲衍生物通过分子内质子传导机制（ＥＳＩＰＴ）同阳离子结合，进行双波长荧光比率测定［１１］。
２应用比率测量的阴离子探针：
２．１ 氰离子比率测量探针：
三种水溶性的荧光探针用于检测游离的氰离子，不同取代的探针ＤＳＰＢＡ（４－［４－Ｎ，Ｎ－二甲基－氨基］苯乙烯基－１－（ｘ－－硼酸基苯甲基）吡啶溴代物，其中ｘ＝２，３，４取代。与氰离子螯合后荧光波长发生了移动，探针可以通过激发和发射荧光谱感知氰离子，并进行比率测量，可应用于氰离子的远程传感［１２］。
Ｒ．Ｂａｄａｇｕ等２００５年报道了［１３］合成数种硼酸化合物作为检测ＣＮ－的比率荧光探针，探针的设计通过不同的机理引发波长转移，激发态质子转移（ＣＴ），光致电子转移（ＰＥＴ），共振交换（ＲＩ）。可在致命中毒浓度下限以下检测。
Ｒ．Ｂａｄａｇｕ等２００４年报道［１４］合成数种不同类型的ＢＡＱＢＡ化合物作为检测ＣＮ－的比率荧光探针，可在致命中毒浓度下限以下检测。ＢＡＱＢＡ探针还可在复杂的生理背景下使用，如在葡萄糖，Ｃｌ－，果糖下背景下使用形成比率测量。
Ｒ．Ｂａｄａｇｕ等２００４年报道［１５］合成数种不同类型的ＢＭＯＱＢＡ化合物作为检测ＣＮ－的比率荧光探针。２．２ 氯离子比率测量探针：
Ｃｌ－比率荧光探针是拥有ＳＰＱ 发色团（Ｎ－取代 ６－甲氧基喹啉；激发谱为３５０ ｎｍ， 发射谱４５０ ｎｍ）和 Ｎ－取代 ６－氨基喹啉（ＡＱ） 发色团共同结合。形成的Ｃｌ－双波
８
长比率测定探针。与Ｃｌ－结合在３８０ ｎｍ和５４６ ｎｍ处响应。２．３ 氟离子比率测量探针：
Ｙｏｈｅｉ Ｋｕｂｏ等２００３年报道了新型荧光探针测定Ｆ－离子的荧光比率测定探针，三芳基硼烷－卟啉Ｔｒｉａｒｙｌｂｏｒａｎｅ－ Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ 同Ｆ－离子结合后会产生三个发散波长变化［１６］。
Ｒ．Ｂａｄａｇｕ等２００５年报道了［１７－１８］水溶性的喹啉和硼酸的ＢＡＱＢＡ化合物作为检测Ｆ－的比率荧光探针，探针表现出了波长转移，和荧光强度变化。ＢＡＱＢＡ探针还可在复杂的生理背景下使用，如在５０ｍＭ葡萄糖，５０ｍＭＣｌ－，５ｍＭ果糖下使用形成比率测量。
３ｐＨ、极性、氧化性比率探针：
３．１ ｐＨ检测的比率测量探针：
应用于ｐＨ测量的比率测量探针主要有ＢＣＥＣＦ 和ＳＮＡＲＦ ＳＮＡＦＬ－２［１９］。
Ｒ．Ｂａｄａｇｕ等２００４年报道了［２０］水溶性的喹啉和硼酸的ＢＡＱＢＡ化合物Ｎ－（２－硼酸基苯甲基）－６－氨基喹啉溴代物作为ＰＨ响应的比率荧光探针，探针表现出了波长转移，和荧光强度变化。ＢＡＱＢＡ探针同ＢＡＱ进行了比较，ＢＡＱＢＡ探针还可在复杂的生理背景模拟使用，形成比率测量。荧光强度随ＰＨ增加在４５０ｎｍ升高在６５０ｎｍ降低。
Ｓａｎｄｒｉｎｅ Ｃｈａｒｉｅｒ在２００４年报道了［２１］探针化合物作为ＰＨ探测的荧光比率探针，检测范围在ＰＨ值３．４－９．１。
Ｋｅｒｍｉｓ ＨＲ等２００２年报道了８－羟基－１，３，６－三磺酸芘用于ＰＨ探测的荧光比率探针［２２］，在ＰＨ值６－９的条件下，在４０８ ｎｍ 到４６８ ｎｍ 激发５１５ ｎｍ发散，该探针是固定在树脂上的非加入的比率探针且响应迅速＜９ ｍｉｎ，该探针可用于封闭环境的比率检测。
Ｈａｎｓｏｎ ＧＴ等２００２年报道了不同的绿荧光蛋白（ＧＦＰ）用作ＰＨ探测的荧光比率探针［２３］。该探针是可用于活体测量的探针，在ＰＨ值６－９的范围内，发射波长随ＰＨ的酸化，从绿色５１５ｎｍ转移到蓝色４６０ｎｍ。
极性比率探针：
３．２ 极性比率测量探针：
６－Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ－２，３－ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ （６ＤＭＮ）用于生物探针在５００－６００ ｎｍ处有激发荧光［２４］，并随着环境极性不同而改变。荧光发射谱强度改变并且波长改变了近１００ｎｍ在甲苯中４９１ ｎｍ到水中的 ５９２ ｎｍ 。荧光产率减少了超过１００倍在氯仿中 （ ＝ ０．２２５） 在水中（ ＝ ０．００２ ）。文章中提到了探针用于测定一系列溶剂甲醇、乙醇、ＤＭＦ、氯仿、甲苯、ＴＨＦ等系荧光波长变化和强度变化。
３．３ 氧化性比率测量探针：
ｇｅｏｒｇｅ Ｔ等２００４年报道了［２５］绿荧光蛋白（ＧＦＰ）作为线粒体氧化性的比率探针。该探针利用了氧化还原条件下的结构中距离的变化，而对于氧化条件下，荧光在４００ｎｍ强度增加在４７０ｎｍ强度减少。
４一氧化氮和其它分子比率荧光探针：
４．１ 一氧化氮分子检测探针：
ｎｏｂｕａｋｉ ｓｏｈ等２００２报道了［２６］采用二硫代氨基甲酸盐－铁和２，２，６，６－四甲基哌啶－Ｎ－氧化物（ＴＥＭＰＯＬ）作为第一种检测ＮＯ的荧光比率探针。该探针与ＮＯ结合后，通过ＦＲＥＴ产生波长和强度的变化，荧光强度在４１０ｎｍ降低在４７０ｎｍ升高。
４．２ 化学战剂模拟剂分子检测探针：
Ｓｈｉ－Ｗｅｉ Ｚｈａｎｇ等２００３年报道了采用作为比率荧光探针检测化学战剂模拟剂２－异丙基氟磷酸（ＤＦＰ）。共设计了三个化合物，母体为噻吩基取代的吡啶、苯取代的吡啶和萘取代的吡啶。其中最好的一种为萘取代的吡啶，用它来检测２－异丙基氟磷酸（ＤＦＰ） 在３７５ｎｍ处荧光强度减小在４３８ ｎｍ处荧光强度增强。
参考文献
［１］Ｓｈｉｍｏｚｏｎｏ Ｓ， Ｆｕｋａｎｏ Ｔ；Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｄｕａｌ－ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｂａｓｅｄ
ｏｎ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］Ｓｃｉ ＳＴＫＥ． ２００２ Ｍａｒ ２６；２００２
（１２５）： ＰＬ４
［２］Ｌｉｅｐｏｕｒｉ Ｆ， Ｄｅｌｉｇｅｏｒｇｉｅｖ ＴＧ；Ｎｅａｒ－ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｍｉｎｏｃｏｕｍａｒｉｎ－ｂａｓｅｄ ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｃａ（２＋） ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ［Ｊ］ Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ．
２００２ Ｍａｙ；３１（５）：２２１－７．
［３］Ｅｌｓ Ｃｉｅｌｅｎ ， Ａｇｎｉｅｓｚｋａ Ｓｔｏｂｉｅｃｋａ；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆ Ｔｈｉｏ－Ｈ， ａ ｎｅｗ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｒａｔｉｏａｂｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ［Ｊ］Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， Ｐｅｒｋｉｎ
Ｔｒａｎｓ． ２， ２００２， （６）， １１９７ – １２０６
［４］Ｍａｇｅｄ Ｍ． Ｈｅｎａｒｙ； Ｚｉｎｃ（ＩＩ）－Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＳｅｎｓｏｒｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｃｉｔｅｄ－Ｓｔａｔｅ Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｔｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ［Ｊ］Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ － Ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ；Ｖｏｌｕｍｅ １０，
Ｉｓｓｕｅ １２， Ｄａｔｅ： Ｊｕｎｅ ２１， ２００４， Ｐａｇｅｓ： ３０１５－３０２５
［５］Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｊ． Ｃｈａｎｇ ， Ｊａｃｅｋ Ｊａｗｏｒｓｋｉ；Ａ ｔａｕｔｏｍｅｒｉｃ ｚｉｎｃ ｓｅｎ－ｓｏｒ ｆｏｒ ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｎｉｔｒｉｃ
ｏｘｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｚｉｎｃ［Ｊ］ＰＮＡＳ ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ
３， ２００４ ， ｖｏｌ． １０１ ；ｎｏ． ５ １１２９－１１３４
［６］Ｒｏｎｇｈｕａ Ｙａｎｇ， Ｋｅ＇ａｎ Ｌｉ； Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｎ β－Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｆｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｚｉｎｃ Ｉｏｎ
Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｄｕａｌ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒａｔｉｏ［Ｊ］Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．，
７５ （３）， ６１２ －６２１， ２００３．
９
［７］Ｃａｒｏｌｙｎ Ｃ． Ｗｏｏｄｒｏｏｆｅ；Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｊ． Ｌｉｐｐａｒｄ ； Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｔｗｏ－Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ Ｓｅｎｓｉｎｇ ｏｆ Ｚｎ２＋ ［Ｊ］Ｊ． Ａｍ．
Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２５ （３８）， １１４５８ －１１４５９， ２００３
［８］Ｍａｒｕｙａｍａ Ｓ， Ｋｉｋｕｃｈｉ Ｋ；Ａｎｏｖｅｌ， ｃｅｌｌ－ｐｅｒｍｅａｂｌｅ， ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｚｉｎｃ ｉｏｎ；［Ｊ］ Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，
１２４ （３６）， Ｓｅｐ １１， １０６５０ －１０６５１， ２００２
［９］Ｓｈａｗｎ Ｃ Ｂｕｒｄｅｔｔｅ；Ｔｈｅ Ｒｈｏｄａｆｌｕｏｒ ｆａｍｉｌｙ． Ａｎ Ｉｎｉｔｉａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆＰｏｔｅｎｔｉａｌ ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｅｎｓｏｒｓ ｆｏｒ Ｚｎ２＋； ［Ｊ］Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；（２００２），Ｖｏｌ．４１．Ｎｏ．２５．６８１６－６８２３
［１０］Ｒｏｎｇ－Ｈｕａ Ｙａｎｇ， Ｗｉｎｇ－Ｈｏｎｇ Ｃｈａｎ ；Ａ Ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ Ｆｌｕｏｒｅｓ－ｃｅｎｔ Ｓｅｎｓｏｒ ｆｏｒ ＡｇＩ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ； ［Ｊ］Ｊ．
Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２５ （１０）， ２８８４ －２８８５， ２００３．
［１１］Ｚｈｅｎ－Ｃｈａｎｇ Ｗｅｎ， Ｙｕｎ－Ｂａｏ Ｊｉａｎｇ； Ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ Ｄｕａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓ－ｃｅｎｔ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ Ａｎｉｏｎｓ ｕｎｄｅｒ Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｒｇｅ Ｔｒａｎｓ－
ｆｅｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ； ［Ｊ］ＣｈｅｍＩｎｆｏｒｍ Ｖｏｌｕｍｅ ３６， Ｉｓｓｕｅ １０， Ｄａｔｅ：
Ｍａｒｃｈ ８， ２００５
［１２］Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｍ Ｂａｄａｇｕ；Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ；Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｃｙａｎｉｄｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｌｅｔｈａｌ ｌｅｖｅｌｓ：ｒｅｄｕｃｅｄ ＩＣＴ－
Ｂａｓｅｄ ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］ Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １２７ （１０）， ３６３５
－３６４１， ２００５．
［１３］Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｍ Ｂａｄａｇｕ；Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ；Ｃｙａｎｉｄｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏ－ｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ［Ｊ］ Ｄｙｅｓ ａｎｄ ｐｉｇｍｅｎｔｓ；６４ （２００５）４９－５５［１４］Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｍ Ｂａｄａｇｕ；Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ；Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ Ｃｙａｎｉｄｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ
ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｎｓｉｎｇ ［Ｊ］Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ；３２７ （２００４）８２－９０
［１５］Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｍ Ｂａｄａｇｕ；Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ａｎｄｌｉｆｅｔｉｍｅ－ｂａｓｅｄ Ｃｙａｎｉｄｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｎｓｉｎｇ
［Ｊ］Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ；５２２ （２００４）９－１７
［１６］Ｙｏｈｅｉ Ｋｕｂｏ， Ｍａｓａｓｈｉ Ｙａｍａｍｏｔｏ；Ａ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｎｄ ＲａｔｉｏｍｅｔｒｉｃＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒ ｗｉｔｈ Ｔｈｒｅｅ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｃｈａｎｇｅｓ： Ｆｌｕｏ－
ｒｉｄｅ Ｉｏｎ Ｓｅｎｓｉｎｇ ｂｙ ａ Ｔｒｉａｒｙｌｂｏｒａｎｅ－ Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ［Ｊ］
Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｖｏｌｕｍｅ ４２， Ｉｓｓｕｅ １８，
２００３， Ｐａｇｅｓ： ２０３６－２０４０
［１７］Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｍ Ｂａｄａｇｕ；Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ；Ａ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ－ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃｆｌｕｏｒｉｄｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｒｏｂｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ ｎｕｃｌｅｕｓ ａｎｄ
ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｉｅｔｙ［Ｊ］ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ；１０４ （２００５）１０３－１１０ ［１８］Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｍ Ｂａｄａｇｕ；Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ；ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ－ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌｕｏｒｉｄｅ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ６－
Ａｍｉｎｏｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ ｎｕｃｌｅｕｓ ａｎｄ ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｉｅｔｙ［Ｊ］Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．６ （２００４）６９３－７０３
［１９］Ａｓｌａｎ Ｋ， Ｌａｋｏｗｉｃｚ ＪＲ；Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｐＨ ｓｅｎｓｉｎｇ ｕｓｉｎｇＳＮＡＦＬ－２ ｏｎ ｓｉｌｖｅｒ ｉｓｌａｎｄ ｆｉｌｍｓ： ｍｅｔａｌ－ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ｓｅｎｓｉｎｇ；［Ｊ］Ｊ Ｆｌｕｏｒｅｓｃ． ２００５ Ｊａｎ；１５（１）：３７－４０
［２０］Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｍ Ｂａｄａｇｕ；Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ；Ａ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ－ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃＰＨ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｒｏｂｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｉｅｔｙ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ
ｓｕｇａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ［Ｊ］ Ｄｙｅｓ ａｎｄ ｐｉｇｍｅｎｔｓ；６１ （２００４）２２７－２３４［２１］Ｓａｎｄｒｉｎｅ Ｃｈａｒｉｅｒ， Ｏｄｉｌｅ Ｒｕｅｌ；Ａｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｆｏｒ Ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｐＨ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｉｎ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ［Ｊ］Ａｎｇｅｗ
Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｖｏｌ４３， Ｉｓｓｕｅ ３６， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １３， ２００４， Ｐａｇｅｓ：
４７８５－４７８８
［２２］Ｋｅｒｍｉｓ ＨＲ， Ｋｏｓｔｏｖ Ｙ；Ｄｕａｌ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐＨ ｓｅｎｓｏｒ ｆｏｒ ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ： ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ． ２００２ Ｓｅｐ－Ｏｃｔ；１８（５）：１０４７－
５３．
［２３］Ｈａｎｓｏｎ ＧＴ， ＭｃＡｎａｎｅｙ ＴＢ；Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｖａｒｉａｎｔｓａｓ ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｄｕａｌ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｐＨ ｓｅｎｓｏｒｓ． １． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃ－
ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２００２ Ｄｅｃ
３１；４１（５２）：１５４７７－８８
［２４］Ｖａｚｑｕｅｚ ＭＥ， Ｂｌａｎｃｏ， Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ Ｂ， Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ－ＳｅｎｓｉｔｉｖｅＦｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ ６－Ｎ，Ｎ－
Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ－２，３－ｎａｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ［Ｊ］Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，１２７
（４）， １３００ －１３０６， ２００５
［２５］ｇｅｏｒｇｅ Ｔ Ｈａｎｓｏｎ；Ｒｏｂｅｒｔ ａｇｇｅｌｅｒ；Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｒｅｄｏｘ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｗｉｔｈ ｒｅｄｏｘ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ［Ｊ］ ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；２００４ Ｖｏｌ．２７９．
Ｎｏ １３．１３０４４－１３０５３
［２６］ｎｏｂｕａｋｉ ｓｏｈ，Ｔｏｓｈｉｈｉｋｏ Ｉｍａｔｏ；Ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｎｏｖｅｌ ｓｉｇｎａｌ－ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ［Ｊ］
Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２００２， （２２）， ２６５０－２６５１
［２７］Ｓｈｉ－Ｗｅｉ Ｚｈａｎｇ，Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｍ． Ｓｗａｇｅｒ；Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｗａｒｆａｒｅ Ａｇｅｎｔｓ： Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ
Ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒｓ［Ｊ］Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ Ｍａｒｃｈ １２５（１２）， ２００３，３４２０－３４２１
Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｂｅｓ
Ｌｉｕ Ｙａｎｇ ，Ｃｈｅｎｇｈａｉ Ｇｕｏ，Ｇｕｏｓｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ
（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｆｅｎｃｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０２２０５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｒｅｃｅｎｔ ｙｅａｒｓ． Ｗｈｉｃｈ ｉｎｃｌｕｄｅ ｃａｔｉｏｎ ， ｉｏｎｉｃ， ｐＨ， ｐｏｌａｒｉｔｙ， ｒｅｄｏｘ ａｎｄｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｂｅ ｕｓｅｄ ｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ，Ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ
１０
荧光探针设计原理
荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图 1.1)：1．识别结合基团(R),能选择性地与被分析物结合,并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。２．信号报告基团(发色团, F），把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号（荧光等)。3.连接基团(S),将信号报告基团和识别结合基团连接起来,根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。 图1．1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理 (1) 结合型荧光探针[２1］ +
Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1．２ 共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针,是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中,必须充分考虑下列三个方面的因素。(ａ） 受体分子的荧光基团设计、合成:考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性）,Ｓｔｏｋｅs 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象)，荧光发射最好要在长波长区(最好位于5０0 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰,另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力(如氢键、范德华力等）作为理论指导,多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(ｃ) 荧光超分子受体的组装:组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团通过共价键连接在一起,要充分考虑到识别基团和荧光
荧光比率探针及其应用研究进展
７ 前 言 荧光比率技术是荧光分析中的一项重要技术。该技术在生物染色剂中，可被紫外线或蓝紫光（短波长光）激发而发射荧光的染料，称为荧光染料（荧光色素）。可被长波长光激发，这些荧光色素常称为荧光探针。荧光探针通常用于固定组织和细胞的染色，以及或活细胞中的应用， 此外还包括应用于体内荧光探针。 分子荧光探针按用途分类包括离子探针、极性探针、粘度探针、ＰＨ值探针、膜荧光探针、细胞活性探针、细胞器探针、位点特异性荧光探针等等。探针通过与分析物（如生命金属离子）进行结合后，引起荧光特性发生变化，通过测定荧光的激发波长、发射波长、荧光强度、峰位、荧光寿命、荧光量子产率和各向异性等，获得相关信息。 荧光方法测定中，荧光探针在与反应物结合后，出现激发或发射光谱移位的探针，可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率进行测定，称为比率测量。因为通过二个选择性的波长的荧光强度变化可作为定量的依据， 通常指在波长范围内有荧光强度明显的变化。同普通荧光探针相比，比率测量探针可以被分为两部分。 一种是荧光比率效果是通过原来荧光谱的迁移。通常，这些迁移的背景是荧光探针激发态的电子转移。它被激发通过改变发色团同周围分子或原子交互作用的能量改变（溶剂化显色迁移），同外部电场的交互作用（电致显色迁移）和在发色团中的双电弛豫（双电弛豫迁移）。 另外一种结合探针，荧光谱包括２个或更多的谱带。通常，是这些谱带相对强度的改变，激发态同荧光探针发色团反应。这些反应在不连续的能量状态。 荧光比率探针及其应用研究进展 杨柳＊ ，郭成海，张国胜 （防化研究院第四研究所，北京 １０２２０５） 摘要 本文介绍了荧光比率探针，包括阳离子探针、阴离子探针、ｐＨ值探针、极性探针、氧化性和分子的比率测量探针的应用及近几年的研究进展。关键词 荧光分析，比率测量 ＊作者简介：杨柳（１９７５－），男，助理研究员，博士研究生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｌｉｕｊｉｎｊｉｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ 所以在初始和产物状态都随着能量转移而发射荧光。 荧光比率测定法可消除光漂白和探针负载和留存及设备因素（照明稳定性）引起的数据的失真。如阴离子探针可通过有机离子载体从细胞排除，如ＡＭ酯可被Ｐ糖蛋白多药载体排出荧光比率测定法可减少探针渗漏对实验结果的影响。探针与离子结合后，出现激发或发射光谱移位的探针可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率校准，可克服由于离子浓度的变化而造成的荧光信号人工假象。 Ｂｒｉｇｈｔ等（１９８９）发现比率测量减少或消除几种决定因素的变化对测量荧光强度的影响，包括探针浓度、激发光的光路长度、激发强度、和检测效率。消除的人工假象包括光漂白、探针渗漏、细胞厚度、探针在细胞内（区室化作用引起）或不同细胞群之间（负载效率差异造成）的不均匀分布。 比率测量探针已经应用于不同的测量领域：离子探针（阳离子探针Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋，Ｚｎ２＋，Ａｇ＋等）阴离子探针（Ｃｌ－，ＣＮ－，Ｆ－等），膜探针、活性氧和一氧化氮探针，极性探针、ＰＨ值探针等等。 １应用比率测量的阳离子探针： 各种各样的阳离子在生命活动中起重要的作用， 如构成细胞和生物体某些结构的重要成分，参与并调节生物体的代谢活动等，荧光方法通常用来测定阳离子在生物体不同组织的含量和分布。阳离子比率测量探针也在不断发展。 １．１ Ｃａ２＋检测的比率测量探针： 探针与Ｃａ２＋结合后出现光谱移位的探针可进行比率测量。主要包括：Ｆｕｒａ－２、双－ Ｆｕｒａ－２、Ｆｕｒａ－４Ｆ、Ｆｕｒａ－５Ｆ、Ｆｕｒａ－６Ｆ、 ｉｎｄｏ－１、ｉｎｄｏ－５Ｆ、ｍａｇ－Ｆｕｒａ－２
2017肿瘤检测相关公司汇总
厦门艾德 K-ras ；BRAF ；PIK3CA ；NPM1； 突变检测或多态性检测；荧光定量/毛细管电泳 EGFR ；EML4-ALK 有无医疗器械证 江苏为真 EGFR ;KRAS ;EML4-ALK ;KRAS ;BRAF ;PI3K ;C-kit ;P DGFRA Taqman-ARMS qPCR-HRM ERCC1; BRAC1; TUBB3; BRAC1; STMN1; RRM1; RRM1; EGFR 荧光定量PCR CYP19A1；UGT1A1；CYP2D6；MTHFR ；DPD ；ERCC1；GSTP1； XRCC1 荧光定量PCR+高分辨率熔点曲线 分析（HRM ） EML4-ALK 融合基因检测试剂盒 通过RT-PCR 方法检测EML4-ALK 的多种融合突变 武汉友芝友 人类EGFR 基因29种突变检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 采用ARMS-PCR 荧 光定量技术 人类KRAS 基因7种突变检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 采用ARMS-PCR 荧 光定量技术 人类BRAF V600E 突变检测试剂盒（PCR-荧光探针法） 采用ARMS-PCR 荧光定量技术 北京雅康博 人EGFR 基因突变检测试剂盒（荧光PCR 法） 采用荧光PCR 技术 人KRAS 基因突变检测试剂盒（荧光PCR 法） 采用荧光PCR 技术 人PIK3CA 基因突变检测试剂盒（荧光PCR 法） 人EML4-ALK 融合基因检测试剂盒（荧光PCR 法） 人VEGF 基因表达量检测试剂盒（荧光PCR 法） 人RRM1基因表达量检测试剂盒（荧光PCR 法） 人ERCC1基因表达量检测试剂盒（荧光PCR 法）
【CN109942508A】一种比率型一氧化碳荧光探针及其制备方法和应用【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910299561.9 (22)申请日 2019.04.15 (71)申请人 内蒙古大学 地址 010000 内蒙古自治区呼和浩特市赛 罕区大学西路235号 (72)发明人 王建国 姜国玉 李纯斌 (74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569 代理人 瞿晓晶 (51)Int.Cl. C07D 277/64(2006.01) C07D 455/04(2006.01) C09K 11/06(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (54)发明名称 一种比率型一氧化碳荧光探针及其制备方 法和应用 (57)摘要 本发明提供了一种比率型一氧化碳荧光探 针及其制备方法和应用，涉及生物化学材料领 域。本发明提供的比率型一氧化碳荧光探针具有 式I所示结构，该比率型一氧化碳荧光探针具有 合成原料易得，合成简单，目标化合物荧光量子 产率高，抗光漂白能力强及比率型响应等优点， 避免了传统荧光探针不宜在高浓度下检测及单 一发射在检测过程中易受浓度、温度、pH值及仪 器等外界因素干扰的缺点，并且能够用于检测细 胞内一氧化碳。权利要求书2页 说明书10页 附图5页CN 109942508 A 2019.06.28 C N 109942508 A
1.一种比率型一氧化碳荧光探针，其特征在于， 具有式I所示结构： 式I中，R为 2.权利要求1任一项所述比率型一氧化碳荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 将化合物1、烯丙基溴、碱性化合物和第一有机溶剂混合，进行取代反应，得到化合物2；所述化合物1为 所述化合物2为R -CHO；R为 将所述化合物2与苯并噻唑-2-乙腈、有机碱、有机酸和第二有机溶剂混合，在保护气氛下进行Knoevenagel反应，得到具有式I所示结构的比率型一氧化碳荧光探针。 3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述化合物1、烯丙基溴和碱的摩尔比为1:(1.5～2.5):(2.5～ 4.0)。 4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述取代反应的温度为60～100℃。 5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述取代反应完成后，将所得取代产物体系进行后处理，所述后处理包括以下步骤： 将取代产物体系进行固液分离，得到液态混合物； 将所述液态混合物萃取后干燥、浓缩，得到浓缩物； 将所述浓缩物进行柱层析，得到化合物2。 6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述化合物2与苯并噻唑-2-乙腈、有 权 利 要 求 书1/2页2CN 109942508 A
荧光探针汇总
1.Fluo-3 AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3 AM的荧光非常弱，进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，和细胞内游离 的钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长506nm 发射波长526nm （绿色） 备注推荐使用 2.Mag-fura-2 AM（钙离子荧光探针） 原理Fura-2 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura-2 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fura-2，从而被滞留在细胞内。Fura-2可以和钙离子结合，结合 钙离子后在330-350nm激发光下可以产生较强的荧光，而在380nm激发光下则会 导致荧光减弱。这样就可以使用340nm和380nm这两个荧光的比值来检测细胞内 的钙离子浓度，可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异，荧光探针的渗 漏，细胞厚度差异等一些误差因素。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长为340nm和380nm 发射波长510nm （蓝色） 备注仪器滤光片不适用 3Fluo-4-AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo 4 是一种将Fluo 3结构中的Cl替换成F的钙荧光探针。由于将Cl替换成了电子吸引力更强的F，它的最大激发波长会向短波长处偏离10 nm左右。所以用氩 激光器激发时，Fluo 4的荧光强度比Fluo 3强1倍。由于Fluo 4与钙离子的亲和力 和Fluo 3近似，所以使用上和Fluo 3也基本相同 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长494nm 发射波长516nm （绿色） 备注用激光器激发时荧光强度强，因此不推荐 4.DCFH-DA （活性氧荧光探针） 原理DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长485nm 发射波长520nm （绿色） 备注推荐使用 5.DHR 123 （活性氧荧光探针） 原理本身无荧光, 在超氧化酶存在时可被过氧化氢(H2O2)氧化, 转变成发射绿色荧光的罗丹明123 (Rhodamine 123), 因此广泛应用于检测细胞内活性氧(ROS), 如过氧化物, 次氯酸和过氧亚硝基阴离子等。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长507nm 发射波长529nm （绿色） 备注氧化后成罗丹明123，荧光强度可能受到线粒体膜电位的影响 6.RhodamineI23 （线粒体膜电位荧光探针） 原理细胞膜通透的阴离子绿色荧光染料, 能够迅速被活线粒体摄取, 而无细胞毒性。 生理意义标记线粒体膜电位 激发波长488nm 发射波长515 ~ 575nm （绿色） 生理意义检测线粒体膜电位
荧光探针研究新进展
《生物工程进展》2000,Vol.20,No.2 荧光探针研究新进展 章晓波 徐 洵 (国家海洋局第三海洋研究所,厦门 361005) 摘要 自从Southern(1975)首次进行DNA探针杂交后,至今核酸分子杂交已成为分子生物学的最基本方法。Matthews和Kricka[1]总结了各种杂交方法,将其归为两大类:一是异相杂交(hetero2 geneous assay)即固相杂交,目的核酸结合于不溶性支持物上;二是同相杂交(homogeneous assay)即液相杂交,一般同时使用两个探针。为了检测杂交,寡核苷酸探针需要标记,探针的标记物有放射性同位素和非放射性标记物。固相杂交常使用放射性同位素,荧光素是一种非放射性标记物,它能检测到的DNA浓度比吸收减色测定方法所需DNA浓度低100-1000倍[2],在同相杂交中广泛用于探针的标记。最近,荧光探针研究获得了新的进展,Tyagi和Krammer(1996)建立了一种新的荧光探针-分子信标探针,并得到许多应用,我们实验室也开展了这方面的研究。本文拟对荧光探针的研究进展作一综述。 关键词 荧光探针 分子信标探针 荧光PCR 1 常规荧光探针 固相杂交中,探针非特异结合于支持物表面,降低了灵敏度。Heller等(1982)以及Heller和Morri2 son(1985)[3]最早进行了同相杂交试验,同相杂交不需支持物,减少了固定目的DNA及除去未杂交探针等操作。他们的试验中使用了两个探针,这两个探针分别与目标DNA的两个相邻区域互补,第1探针在3′末端标记,第2探针在5′末端标记,根据标记物的光谱特性,使第1标记物为第2标记物的能量供体。当探针与目标DNA杂交时,二探针彼此靠近,光吸收或化学反应激发供体标记物,通过能量转移引起受体标记物的激发,这样,第1标记物发射光的减少以及(或)第2标记物发射光的增加标志着目标DNA的存在。 后来Morris on等[3]扩展了这一方法,他们使用的两个探针互补且相应于目标DNA上同一碱基序列,一个探针在5′末端标记荧光素,另一互补探针在3′末端标记荧光素发射的淬灭剂芘丁酸(pyrenebutyrate)或磺基若丹明101(sulforhodamine101)。无目标DNA 时,两探针结合,荧光素的能量转移至淬灭剂,不产生荧光。存在目标DNA时,探针与目标DNA之间竞争杂交,由于探针与目标DNA的结合,在494-496nm 光照下,产生荧光,目标DNA浓度越高,荧光信号越强,最低可检测到4pM的目标DNA,此方法得到一些应用[2,4,5]。Cardullo等[4]在应用Morris on方法的同时,提出在两个互补探针的5′末端分别标记荧光素和四甲若丹明(T etramethylrhodamine),因为荧光共振能量转移(fluorescence res onance energy trans ferr FRET)的效率随供体和受体之间距离的-6次方而减少,当两者相距20个核苷酸(70!)即产生不明显的能量转移,因此此方法中所使用的探针长度较短,特异性降低。 2 分子信标探针 同相杂交一般同时采用两个标记探针,Tyagi 和Kramer(1996)[6]首次建立了分子信标探针(molecular beacon probe),在同一寡核苷酸探针的5′末端标记荧光素、3′末端标记淬灭剂(DABCY L)。分子信标探针能形成发夹结构,探针的噜扑环与目的DNA碱基互补,噜扑环两侧为与目的DNA无关的碱基互补的臂。无目的DNA时,探针形成发夹结构,荧光素靠近淬灭剂,荧光素接受的能量通过共振能量转移至淬灭剂,DABCY L吸收能量后以热量形式消失,结果不产生荧光。当探针遇到目的DNA 分子时,形成一个比两臂杂交更长也更稳定的杂交,探针自发进行构型变化,便两臂分开,荧光素和淬灭剂随之分开,此时在紫外照射下,荧光素产生荧光。 影响分子信标探针构型变化的参数主要有[6]:臂长、臂序列GC含量、噜扑环长度和溶液盐浓度,尤其是二价阳离子如Mg2+对两臂形成的杂交茎有较强的稳定作用,在Mg2+存在条件下,4～12个核 41
荧光探针汇总
精心整理 1. Fluo-3AM （钙离子荧光探针） 原理Fluo-3AM 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3AM 的荧光非常弱，进入细胞后可以 被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，和细胞内游离的钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。 生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度 激发波长506nm 发射波长526nm （绿色） 备注推荐使用 2. Mag-fura-2AM （钙离子荧光探针） 原理Fura-2AM 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fura-2 AM 进入细胞后可以被细胞内的酯 3 4. 成5. 原理本身无荧光,在超氧化酶存在时可被过氧化氢(H2O2)氧化,转变成发射绿色荧光的罗丹明 123(Rhodamine123),因此广泛应用于检测细胞内活性氧(ROS),如过氧化物,次氯酸和过氧亚硝基阴离子等。 生理意义检测细胞内活性氧表征细胞损伤程度 激发波长507nm 发射波长529nm （绿色） 备注氧化后成罗丹明123，荧光强度可能受到线粒体膜电位的影响 6. RhodamineI23（线粒体膜电位荧光探针） 原理细胞膜通透的阴离子绿色荧光染料,能够迅速被活线粒体摄取,而无细胞毒性。 生理意义标记线粒体膜电位 激发波长488nm 发射波长515~575nm （绿色） 生理意义检测线粒体膜电位
备注正在使用 7.Hoechst33342（DNA荧光探针） 原理Hoechst33342是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测。Hoechst 染料可透过细胞膜在聚AT序列的富集区域的小沟处与DNA结合并对DNA染色而发出强 烈的蓝色荧光。 生理意义标记双链DNA 激发波长355nm发射波长465nm（蓝色） 备注正在使用 8.FDA 原理FDA可透过细胞膜并作为荧光素积蓄在活细胞内。 生理意义反映细胞膜完整性和细胞活力 9.PI（ 倍。 10.EB 11.DAPI 20 12.CalceinAM 原理Calcein-AM由于在Calcein(钙黄绿素)的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein(钙黄绿素)留在细胞内,发出强绿色 荧光，且细胞毒性很低，适合用于活细胞染色。 生理意义检测细胞膜完整性 激发波长494nm发射波长517nm（绿色） 备注跟FDA功能类似，细胞毒性很低，可以长时间标记细胞，但价格比较贵 13.BCECF-AM(pH荧光探针) 原理BCECF-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，BCECF-AM没有荧光，进入细胞后被细胞内的酯酶水解成BCECF，从而被滞留在细胞内。BCECF在适当的pH值情况下可以被激发 形成绿色荧光。 生理意义检测细胞内pH
基于EET机理比率型荧光探针的研究进展
有机化学 Chinese Journal of Organic Chemistry ARTICLE * E-mail: yuhaibo@https://www.wendangku.net/doc/2912689311.html, Received September 23, 2014; revised November 18, 2014; published online December 2, 2014. Project supported by the National Natural Science Foundation of China (21302080). Program Funded by Liaoning Province Education Administration (L2014010). 国家自然科学基金(No.21302080)，辽宁省教育厅科研项目(No.L2014010)资助项目. DOI: 10.6023/cjo201409036 研究论文 基于EET 机理比率型荧光探针的研究进展 陈忠林a 李红玲a 韦驾a 肖义b 于海波a ,* (a 辽宁大学 环境学院 沈阳 110036) （b 大连理工大学 精细化工国家重点实验室 大连 116024) 摘要 激发态能量转移（Excitation Energy Transfer, EET ）作为一类重要的光物理现象，被广泛用于比 率型荧光探针和分子灯标的设计以及DNA 检测等多个领域。影响EET 效率的两个重要因素是供受体间的空间距离和光谱交盖，通过调节供受体间的空间距离或光谱重叠程度来调控能量转移过程，实现对目标客体的双波长比率检测。本文综述了基于不同供受体荧光团的EET 体系、供受体间的连接方式对能量转移效率的影响，以及通过调控供受体间光谱重叠程度或空间距离，获得识别不同客体的比率型荧光探针，并对EET 机理的比率型荧光探针的设计以及未来在生物成像和医学检测等领域的应用进行了展望。 关键词 荧光探针; 激发态能量转移; F?rster 能量转移; 比率型荧光探针; 荧光发色团 Recent Progress in Ratiometric Fluorescent Probes Based on EET Mechanism Chen Zhonglin a Li Hongling a Wei Jia a Xiao Yi b Yu Haibo a * (a College of Environmental Sciences, Liaoning University, Shenyang) (b State Key Laboratory of Fine Chemicals, Dalian University of Technology, Dalian) Abstract Excitation Energy Transfer (EET) is one of the vital photophysical phenomenons, which is wide-ly used in many applications, such as the design of ratiometric fluroesent probes, molecular beacon and DNA analysis, and so on. The process of energy transfer from donor to acceptor can be regulated by two factors: the spatial distance between donor and acceptor, and the spectral overlaps between donor’s emission and acceptor’s absorption, which results that there is a wide variety in the ratio at two different wavelengths of ratiometric fluo-rescent probes. In this review, noticeable EET systems with different donor fluorophore, connection form and energy transfer efficiency between donor and acceptor, and the modulation of spatial distance or spectral overlap are summarized. Finally, as a promising tool, the future developing prospects of EET fluorescent probes in bioi-maging and medical diagnostics are discussed and highlighted. Keywords Fluorescent probe, Excitation energy transfer, F?rster resonance energy transfer, Ratiometric probe, Fluorophore 随着荧光显微成像技术和时间分辨技术的迅速发展，基于超分子化学和有机染料的荧光探针现已成为研究生物学和医学领域相关问题的重要工具。荧光探针在与目标客体相互作用过程中荧光信号会发生改变，借助于荧光信号的变化，荧光探针能够对目标客体进行实时在线的检测或监测，并被广泛用于分析化学，生物化学，医学和环境监测等多个领域[1]。荧光探针主要有三种类型：淬灭型、增强型和比率型。由于增强型荧光探针在与目标客体作用后，荧光输出信号增强，在荧光显微成像中比淬灭型荧光探针更为灵敏，故增强型荧光探针是目前荧光探针领域设计的主流[2]。 与增强型荧光探针相比，比率型荧光探针在定量检测方面具有明显的优势，近些年来，比率型荧光探针的设计
SNP检测方法汇总
现在SNP的常用检测方法主要有：Taqman法、质谱法、芯片法、测序法。Taqman法：准确性高，适合于大样本、少位点，价格比较贵；质谱法：准确性高，适合于大样本、多位点（能检测25个位点）；芯片法：准确性较低，适合于超多位点分析；测序法：非常准确，但是价格也非常的高，但是对于少样本、超多位点还是非常好的选择。 SNP检测方法汇总 分析SNP的方法有许多种，本文收集目前还在用的方法，按通量从高到低排列： 全基因组测序 这是最贵的方法，但也是看SNP最全的方法 大概一个人样本，花2万元 外显子组测序 外显子组测序，也可以得到较全面的SNP信息 大概一个人样本，花1.5万元 随着人全基因组测序的价格降到2万元左右，外显子组测序会很快退出市场 全基因组SNP芯片 原理，核酸杂交，荧光扫描
Illumina和Affymetrix都有很著名的全基因组SNP芯片，例如： Affymetrix: CytoScan，SNP 6.0， Illumina: 660，中华，450K等 SNP芯片，在2000~5000元每样本，还是比全基因组测序的2万元一个样本的价格要低质谱法 原理，精确测量PCR产物的分子量，就可以知道SNP位点上是A/C/G/T中的哪一个Sequenome MassArray法测中等通量的SNP位点是十分准确的 单个位点、单个样本的费用约2元人民币 无需预制芯片、预订荧光探针,只要合成常规的PCR引物就可以做实验了 如果测几十个点，到上百个点，是很方便的方法 SNPseq法 此方法为天昊公司所创，一次测几百个位点 原理： 用Goldgate法做出针对某些位点的多重PCR片段
荧光定量pcr法原理汇总
我们前面比较详细地介绍了荧光染料法做定量PCR的有关技术和产品，显然，作为定量PCR的初期阶段的荧光染料法还是有局限性的，比如，由于染料不能区分特异性PCR产物和引物二聚体等非特异产物，也不能区分不同探针，所以检测的特异性始终不如后来出现的探针法；需要在PCR后进行熔链曲线分析；也不能做多重PCR检测（Multiplex）。 上个世纪90年代原美国Perkin Elmer( PE)公司开发出了Taqman荧光探针定量技术，将定量PCR带入了更广阔的应用空间。Taqman探针法的出现是定量PCR技术的重要里程碑，之后在此基础上发展出了杂交探针法，以及荧光引物法，是对探针法的不断改进和简化。如果希望全面掌握定量PCR技术的研究人员就不能错过这些定量检测技术。 要提到荧光探针或者荧光引物，有一个基础概念需要首先明确，那就是荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)：一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体 (donor) 和能量受体 (acceptor) 对, 其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，当它们在空间上相互接近到一定距离(1—10 nm)时，激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。能量传递的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等有关。定量PCR所涉及的荧光探针和荧光引物的检测都这个FRET原理相关。 实时荧光PCR中另一个很重要的概念，即Ct值.C代表循环(Cycle)，T代表阈值(Threshold).Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数.。一般取PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线.因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 一：水解探针法 TaqMan技术
双光子荧光探针的研究进展
有机双光子材料的研究进展 随着以光电子学为中心的信息时代的到来，具有特殊信息处理功能和超快响应的光电材料将成为未来信息材料发展的主体，而非线性光学材料就是其中发展较为迅猛的一种。非线性光学是强光光学，研究的是物质在强光作用下产生的输出光强度与原入射光的非线性关系。非线性光学材料在强光作用下，反映介质性质的物理量（如极化强度P等）不仅与场强E的一次方有关，而且还决定于E的更高幂次项，从而导致许多在线性光学中不能解释的新现象，表现出独特的非线性光学性质。双光子吸收属于三阶非线性光学效应的一种，有着独特的光学和电学效益，使得双光子技术在未来光电子集成、生物分子探测、医学诊断等领域具有巨大的应用潜力和广阔前景[1]。 一、双光子吸收的基本概念 双光子吸收属于三阶非线性光学效应，该理论最早是由Goeppert- Mayer于1931年首次提出的。它是指在强激光激发下，利用近两倍于样品的线性吸收波长的光源激发该样品，使其通过一个虚中间态(virtue state)直接吸收两个光子跃迁至高能态的过程，所吸收的两个光子的能量可以相同(ω1=ω2，简并吸收)，也可以不同(ω1≠ω2，非简并吸收)，其机理如图1所示。 图1 单、双光子吸收和发射机理示意图 和单光子吸收和发射相比，双光子吸收和发射有以下本征特点： （1）在材料中高的穿透深度。单光子荧光过程是短波激发长波发射，吸收和发射所涉及的基元光物理过程服从Stark-Einstein定律。而双光子荧光是长波激发短波发射，所用激发光的波长红移近一倍，一般位于600-900nm，远远低于单光子过程紫外辐照光(波长为250-400nm)的光子能量。这一波段的光具有很好的穿透性，Rayleigh散射小，背景光干扰小，便于观测，并且光损伤、光漂白、光毒性都较小。
谷胱甘肽荧光探针的研究进展
第46卷第7期2018年4月广 州 化 工 Guangzhou Chemical Industry Vol.46No.7Apr.2018 谷胱甘肽荧光探针的研究进展 * 石 磊1,2,黄 玲3,龚盛昭1,2 (1广东轻工职业技术学院轻化工技术学院,广东 广州 510300;2广东省绿色日用化工工程技术研究中心,广东 广州 510300;3佛山市安安美容保健品有限公司,广东 佛山 528099) 摘 要:谷胱甘肽在生物体的许多生理过程中发挥着重要作用,所以细胞内谷胱甘肽含量的检测对细胞功能研究和病理分 析都具有重要的意义三以荧光探针为基础的荧光分析法因其操作简便二灵敏度高和专一性强等优点而备受大家关注,并且有机小分子荧光探针还可以应用于活体细胞和生物体的成像技术三本文主要综述了近年来谷胱甘肽荧光探针的研究现状,并按照谷胱甘肽与探针识别基团的识别机理分类阐述,同时对谷胱甘肽荧光探针的未来发展趋势进行了展望三 关键词:谷胱甘肽二荧光探针二识别机理二检测 中图分类号:O657.3 文献标志码:A 文章编号:1001-9677(2018)07-0023-06 * 基金项目:广东轻工职业技术学院人才类项目(项目编号:KYRC2017-0031)三第一作者:石磊(1985-),男,博士,讲师,主要从事荧光探针的合成与应用三通讯作者:龚盛昭三 Research Progress on Fluorescent Probes for Glutathione * SHI Lei 1,2,HUANG Ling 3,GONG Sheng -zhao 1,2 (1School of Chemical Engineering and Technology,Guangdong Industry Polytechnic,Guangdong Guangzhou 510300;2Guangdong Engineering Technical Research Center for Green Household Chemicals,Guangdong Guangzhou 510300; 3Foshan Anan beauty &Health products Co,Ltd,Guangdong Foshan 528099,China)Abstract :Glutathione plays an important role in many physiological processes of life system,and the detection of glutathione in cell is significant for the research of cell function and pathological analysis.Fluorometric analysis based on fluorescent probes has attracted much attention due to its advantages,such as simple operation,high sensitivity and specificity.Moreover,the organic fluorescent probes could also be applied to bioimaging technology for living cells and organisms.The research progress on glutathione fluorescent probes was introduced and classified according to the recognition mechanism between glutathione and recognition groups of probes,and the developing trends of fluorescent probes for glutathione were prospected. Key words :glutathione;fluorescence probe;recognition mechanism;detection 谷胱甘肽(Glutathione,缩写GSH)是一种含有巯基二氨基和γ-酰胺键的三肽,主要由谷氨酸二半胱氨酸和甘氨酸组成三谷胱甘肽是细胞内一种重要的调节代谢物质;它不仅能够清除体内的过氧化物及其他自由基,促进肝脏酶活性二解毒和维持红细胞膜完整性等作用,同时还具有维持DNA 的生物合成和细胞免疫等多种生理功能[1-2]因此,检测生物体中的GSH 含量对于一些疾病的预防二研究和治疗都具有十分重要的作用,故而引起了诸多科研工作者的高度关注[3-4]三 相比于分光光度法二色谱法二毛细管电泳法二电化学法等传统检测方法,以荧光探针为基础的荧光分析法具有测试简单二选择性高二响应时间短等优点三更重要的是,荧光探针还能应用于生物体内的实时监测和生物成像研究,故而被广泛应用于生物医学二分析化学和化学生物学等诸多领域[5-6]三 近年来,基于谷胱甘肽的荧光探针得到了迅猛发展;若按照谷胱甘肽与荧光探针识别基团的识别机理进行分类,可以将 其分为加成反应取代反应和还原反应三本文主要综述了近年来谷胱甘肽荧光探针的设计合成与应用进展,并分类阐述如下三 1 加成反应 加成反应是利用GSH 中具有亲核性的巯基与不饱和双键(主要是碳碳双键)发生加成反应,使得探针的荧光发射光谱发生变化,从而实现对检测对象的识别与检测三 1.1 马来酰亚胺类 自Kanaoka [7]首次报道了以马来酰亚胺作为生物硫醇识别基团的荧光探针以来,基于马来酰亚胺的香豆素二BODIPY二喹啉二萘酐等[8-10]荧光探针陆续涌现出来,并成功应用于生物体内GSH 的选择性识别(图1)三然而,按此原理构建的大部分荧光探针对半胱氨酸(Cys)二同型半胱氨酸(Hcy)和GSH 均有响应,很难对这三者进行区分;仅少许报道是例外三其中,
香豆素类荧光探针研究进展
医药化工化 工 设 计 通 讯 Pharmaceutical and Chemical Chemical Engineering Design Communications ·204· 第44卷第6期2018年6月香豆素又名苯并-α-吡喃酮，广泛存在于自然界中，并且 在许多植物中也存在大量的香豆素类衍生物[1]。香豆素类化合 物不仅在抗肿瘤药物的开发方面进行研究，并且以香豆素为骨架的基团也常作为荧光探针中最优的荧光团之一，其具有荧光强度高、溶解性与细胞渗透性好、易于合成与修饰、良 好的荧光量子产率和好的光稳定性等特点。本文通过以香豆素为骨架的荧光探针对待测物的选择性不同进行分类，对近几年报道的香豆素类荧光探针进行了概述。 1 二氧化硫衍生物荧光探针 二氧化硫溶于水中，形成亚硫酸盐和亚硫酸氢盐之间的 平衡[2]。高浓度的亚硫酸盐会导致过敏反应、哮喘、胃肠疾病及皮肤过敏等疾病[3]。因此，用荧光探针技术来检测细胞中HSO 3-/SO 32-具有重要意义。Zhao 等将香豆素和苯并咪唑通过C —C 双键连接得到荧光探针1[2]，亚硫酸盐与该探针的α，β-不饱和酮之间的发生迈克尔加成反应，导致π共轭被阻断，荧光发生改变。该探针利用单光子荧光成像技术成功的实现了对活细胞中亚硫酸盐的检测。Feng 课题组以氮杂香豆素-半花菁偶联物为母核，设计合成比率型近红外荧光探针2[4]。该探针在条件温和的水溶液中对HSO 3-有好的选择性和高的灵敏度，成功应用于活 细胞中内源性和外源性亚硫酸氢盐的荧光成像研究。Li 课题组设计合成了以香豆素-丙二腈衍生物为骨架，以缺电子的C —C 双键为HSO 3-的反应位点的比率型荧光探针3[5]。该探针对 HSO 3-有高的选择性和敏感性，并且成功应用于对MCF-7细胞中HSO 3-荧光成像的研究。2 活性氧荧光探针活性氧（Reactive Oxygen Species ，ROS ）包括了超氧阴离子（O 2-）、过氧化氢（H 2O 2）、羟基自由基（·OH ）、次氯酸（HOCl ）以及一氧化氮等，这些物质的活性较高，在人类健康和疾病中有着重要的作用[6]。Liu 等以双光子可激发的香 豆素基团为荧光团，苯偶酰为荧光淬灭和H 2O 2的特异性识别基团设计了荧光探针[7]。该探针在H 2O 2的存在下，苯偶酰基团可以通过Baeyer-Villiger 反应转化为苯甲酸酐，然后苯甲酸酐水解得到苯甲酸，并释放荧光团。该探针成功运用单光子和双光子进行了实验，表现出对H 2O 2的选择性要高于其他活性氧分子，具有高灵敏度。运用单光子显微镜和双光子显微镜实现了其在MKN-45细胞中对H 2O 2的成像研究。Yoon 等以香豆素-半花菁染料为骨架，通过C —C 双键连接设计合成了荧光探针[8]。荧光探针中的双键被ONOO -氧化，大的共轭被阻断，从而导致ICT 过程被破坏，并成功应用于细胞中内源性和外源性ONOO -的检测。Zhao 课题组基于FRET 机理以香豆素-苯乙烯基-苯并噻吩为母核设计合成了靶向于线粒体基团的荧光探针[9]。并且该探针可靶向于细胞的 线粒体，成功应用于RAW264.7细胞中内源性和外源性ClO -的检测。Lin 等以苯并吡喃-香豆素为骨架设计合成了选择性检测ClO -的荧光探针[10]。次氯酸盐与该探针的α，β-不饱 和羰基发生反应导致π共轭体系中断从而产生香豆素基团的荧光性质，该探针具有低的细胞毒性及成功应用于Hela 细胞中次氯酸盐的荧光成像研究。3 硫醇化合物荧光探针硫醇类化合物与人类的生活、健康和疾病有着密切的联系。例如，半胱氨酸（Cys ）、高半胱氨酸（Hcy ）和谷胱甘肽（GSH ）等生物小分子硫醇在维持氧化还原稳定、生物催化、结合金属和翻译后的修饰中起着重要的作用[11]；硫化氢（H 2S ）是一氧化氮（NO ）和一氧化碳（CO ）之后的第三种气体信号分子[12]。在血管舒张、血管生成、细胞凋亡、炎症、神经调节和保护缺血再灌注的损伤等生理过程中起重要作用[13]。因此，在生理条件下硫醇化合物进行检测具有重要的意义。 Feng 等以香豆素-TCF 骨架为荧光团，丙烯酸酯为反应基团得到荧光探针[14]，在GSH/Hcy 存在下该探针也可特异性的检测Cys ，该探针的细胞毒性较低且成功用于对HeLa 细胞中 Cys 的检测和荧光成像研究。Guo 等设计了含有氯基团的香豆素-半花青素荧光探针[15]，该探针基于不同的发射波长来检测Cys 和GSH 。Zhang 等以N ，N-二乙基香豆素为荧光团，2，4-二硝基苯磺酰胺为苯硫酚的识别基团和荧光淬灭基团设计 合成了荧光探针10[16]。该结构可以阻断N ，N-二乙氨基的扭曲来增加荧光团的荧光。 4 其他类型荧光探针以香豆素衍生物为骨架的荧光探针在N 2H 4、H +、溶剂极性及金属离子等检测方面也被广泛应用。Y u 等设计了第一个用于 实时监测线粒体pH 的比率型型荧光探针[17]。该探针的酚羟基 是一个pH 敏感的基团，在酸性或中性条件下，羟基是弱的供 电子基团；在碱性条件下羟基去质子化得到O -，是强的供电子基团。因此，酚羟基的质子化和去质子化可导致发射波长的变化。5 结语 以香豆素为骨架的基团作为荧光探针中最优的荧光团之 一，具有荧光强度高、溶解性与细胞渗透性好、易于合成与 修饰、好的荧光量子产率和好的光稳定性。荧光探针对基础 生物学研究以及对疾病的诊断和治疗都具有重要的作用，为 “可视化”提供了可能，因此，对荧光探针的研究受到了越来越多的关注。然而，在荧光探针的研究中也面临着更多的挑战。首先，开发真正高选择性和敏感性的探针仍具有挑战性，例如，摘 要：香豆素类化合物不仅具有广发的生物活性，同时香豆素类化合物具有荧光强度高、溶解性和细胞渗透性好及易于合成的优点。因此，香豆素类化合物也是优良的荧光团之一。综述了近几年利用香豆素片段为荧光团，对待测物进行荧光成像研究的荧光探针，同时对这些荧光探针的设计、机理及特点进行了概述。 关键词：香豆素；荧光探针；荧光成像 中图分类号：O631.3 文献标志码：A 文章编号：1003–6490（2018）06–0204–02 Research Progress of Coumarin Fluorescent Probes Qiu Yang ，Wen Kai ，Wang Zheng-long ，Zhou Xiang Abstract ：Coumarin compounds not only have broad biological activity ，but also have the advantages of high fluorescence intensity ，good solubility and cell permeability ，and easy synthesis.Therefore ，coumarin compounds are also one of the excellent fluorophores.In this paper ，fluorescence probes for fluorescence imaging of analytes using coumarin fragments as fluorophores are reviewed.The design ，mechanism and characteristics of these fluorescent probes are summarized. Key words ：coumarin ；fluorescent probe ；fluorescence imaging 香豆素类荧光探针研究进展 邱?洋，温?锴，王郑龙，周?湘 （中国药科大学有机化学教研室，江苏南京?210009） 收稿日期：2018–04–10 作者简介： 邱洋（1992—），男，山东淄博人，硕士研究生，主要研 究方向为靶向抗肿瘤小分子药物的设计及合成。