生物化学大学教材

生物化学

一、生物化学概述

(一)生物化学研究的基本内容

生物化学是研究生物的化学组成和生命过程中各种化学变化的科学，是研究生命的化学本质的科学。

生物化学的研究内容包括以下三个方面：

研究生命有机体的化学组成、生物分子，特别是生物大分子的结构、相互关系及其功能。研究细胞中的物质代谢与能量代谢。生物大分子的合成降解及代谢途径的调控细胞中进行的化学过程。组织和器官机能的生物化学。

(二)生物化学的发展简史

20世纪初，生物化学作为一个独立学科出现。

生物化学发展史中，有两个重要的突破。一是1897年发现了酶作为生物催化剂的作用；二是1944发现了核酸作为遗传信息载体的作用。

1911 年：Funk 结晶出复合维生素 B，提出“vitamine”一词，现为“vitamin”

1926 年：Sunmer 首次将酶（脲酶）结晶，证明了酶的蛋白质本质（1946 年获Nobel 奖）1944 年：Avery 等人通过细菌的转化试验证实DNA 是遗传信息的载体。（未获Nobel 奖）20 世纪 50 年代后生物学进入分子水平。该领域一大批科学家先后获得诺贝尔奖。

1953年，Watson和Crick推导出了DNA的三维结构。

1958 年（Nobel）：英国化学家 Sanger 测定了胰岛素一级结构。

1962 年（Nobel）：英国物理学家 Kendrew（肌红蛋白）Perutz（血红蛋白）解析了蛋白质的三维结构。

法国生物学家 Jocob, Monod：遗传信息流（1965）

美国生物化学家 Nirenberg：破遗遗传密码（1969）

美国生物化学家 Holly：解析 tRNA结构（1969）

1978 年（Nobel）：Mitchell 提出氧化磷酸化的偶联学说“化学渗透学说”

英国化学家 Sanger : DNA测序（1983）

1989 年（Nobel）：Cech & Altman 分别发现了 ribozyme。等等

其他重要事件

我国科学家在生物化学领域所作的突出工作：

1965年，我国首次人工合成了结晶牛胰岛素。

1973年：X-射线分析出猪胰岛素空间结构

1983 年：结合有机合成和酶促合成，实现了酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工全合合成（tRNA Ala）1981年又成功合成了酵母丙氨酰tRNA。

1999 年：参与人类基因组测序计划（1%）

2000年我国生物化学工作者出色地完成了人类基因组计划中1%的测序工作，为世界人类基因组计划的完成贡献了力量。

2002年，我国的生物化学工作者又率先完成了水稻的基因组精细图，为水稻的育种和防病奠定基因基础

二、蛋白质化学

(一)蛋白质的概念与生物学意义

1、概念：蛋白质是由氨基酸残基以肽键相连组成的不分支的长链生物大分子。

2、意义：蛋白质是构成生物体的基本成分，占细胞干重的 50%。蛋白质是生命过程的执行者，种类繁多，表现出丰富的功能。蛋白质在生物体的生命活动中起着极其重要的作用，已知的生物功能没有一个是离开蛋白质而实现的，生物个体间表现出的差异是由于其体内蛋白质的贡献。

1. 生物体的组成成分-结构蛋白,胶原蛋白

2. 酶-生物催化剂

3. 运输-血红蛋白,肌红蛋白

4. 运动-肌球蛋白,肌动蛋白

5. 抗体-免疫球蛋白

6. 干扰素

7. 遗传信息的控制

8. 细胞膜的通透性

9. 高等动物的记忆、识别机构

3、按形状可将蛋白质分为：

纤维状蛋白质：多为结构蛋白。

球状蛋白质具有广泛的生物学功能。如酶、蛋白类激素等。

4、按结构和功能可将蛋白质分为：

简单蛋白：仅有蛋白质组成的、结构简单的蛋白质。

结合蛋白：在蛋白质分子中除了含有氨基酸成分外，还要有其他的成分的存在，才能保证蛋白质的正常生物活性的蛋白质。即包含蛋白质和非蛋白质两部分，其中非蛋白部分通常称为辅基。

蛋白质中N的平均含量约16%。

每克样品中所含蛋白质的克数= 每克样品中的含氮量（克）× 6.25

(二)氨基酸

1．氨基酸的基本结构和性质

（1）氨基酸具有一级氨基（-NH3+）和羧基（-COOH）结合到α碳原子（Cα），同时结合到（Cα）上的是H原子和各种侧链（R基）。

氨基酸是蛋白质分子的基本组成单位。构成天然蛋白质分子的氨基酸约有20种，除脯氨酸为α-亚氨基酸、甘氨酸不含手性碳原子外，其余氨基酸均为L-α-氨基酸。

20种常见氨基酸中的三个特殊氨基酸Gly不具有手性C原子； Pro为亚氨基酸、Cys

中的巯基可与另一个Cys的巯基形成二硫键。

（2). 氨基酸的性质

①光吸收特性：各种氨基酸在可见区都没有光吸收Tyr, Phe, Trp 因苯环上含共轭双键，在紫外光区芳香族氨基酸在280nm处有最大吸收峰（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的最大吸收波长分别为279、278、259nm ）

②氨基酸的两性解离

氨基酸的等电点：对某一种氨基酸而言，当溶液在某一个特定的pH，氨基酸以两性离子的形式存在，并且其所带的正电荷数与负电荷数相等，即净电荷为零。在直流电场中，它既不向正极，也不向负极移动。此时溶液的pH称为这种氨基酸的等电点（pI）。

氨基酸的等电点计算

1.侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK’1和pK’2的算术平均值：pI = (pK’1 + pK’2)/2

2.对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK’值的算术平均值。酸性氨基酸： pI = (pK’1 + pK3 )/2

3.对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK’值的算术平均值。碱性氨基酸： pI= (pK’2 + pK3 )/2

pH>pI时，AA带负电，电场中向正极移动

pH

pH=pI时，不带电，不移动

在一定pH范围中，溶液的pH离aa等电点愈远，aa带净电荷愈多。

③化学反应：

茚三酮反应：反应试剂茚三酮，氨基酸参与反应基团α-NH2，α-COOH产物蓝紫色复合物产物颜色蓝紫色；Ruhemann 氏紫反应黄色

侧链基团中的氨基、巯基、酚基 2,4-二硝基Sanger反应：2,4-二硝基氟苯 DNFB α-NH

2

苯基氨基酸 DNP-氨基酸黄色

PTH-氨基酸无色

Edman反应：苯异硫氰酸酯 PITC α-NH

2

2、根据R基团极性对构成蛋白质的20种氨基酸进行分类

R基为疏水性或非极性的氨基酸、R基为极性不带电荷的氨基酸、R基为带电荷的氨基酸（包括带正电荷和负电荷的氨基酸）

（1）极性氨基酸：

1）不带电： Gly、 Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys；

2）带正电：His、Lys、Arg (碱性氨基酸)

3）带负电：Asp、Glu (酸性氨基酸)

（2）非极性氨基酸：Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp

3、构成蛋白质的20种氨基酸的三字符

(三)蛋白质的结构与功能

1．肽的概念及理化性质

肽：一个氨基酸分子的α-羧基与另一个氨基酸分子的α-氨基发生酰化反应，脱去一分子水形成肽键，也称为酰胺键。肽就是氨基酸通过肽键连接起来的线性聚合物。

天然活性肽：自然界中还存在着大量的肽类，具有各种特殊的生理活性统称为天然活性肽。肽键：蛋白质分子中，由前一个氨基酸的-COOH和后一个氨基酸的-NH2脱水缩合而成的酰胺

键，是蛋白质结构中的主价键。

在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。氨基酸分子在参与形成肽键之后，由于脱水而结构不完整，称为氨基酸残基。

每条多肽链都有两端：即自由氨基端(N端)与自由羧基端(C端)，肽链的方向是N端→C端。肽平面：肽链主链的肽键C-N具有双键的性质，因而不能自由的旋转，使连接在肽键上的六个原子共处于一个平面上，此平面称为肽平面，又称酰胺平面

二面角：肽平面的连接处为α碳原子。它与相邻的两个参与肽键形成的C和N原子之间的单键可以在一定范围内转动，Cα-N之间称φ角，在Cα-C之间称ψ角，这就是α-碳原子上的一对二面角。这对二面角决定了相邻肽平面的相对位置。

谷胱甘肽、内啡肽的生理作用，谷胱甘肽的结构特点。

2．蛋白质的初级结构

蛋白质的一级结构是指多肽链上各种氨基酸残基的种类和排列顺序，包含了蛋白质结构的全部信息。蛋白质的一级结构由遗传信息决定，其一级结构决定高级结构，一级结构是基本结构。但一级结构并不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。

3．蛋白质的高级结构(二级结构、超二级结构和结构域、三级结构、四级结构)

（1）非共价键氢键离子键范德瓦尔力疏水作用（2） S-S键

（1). 蛋白质的二级结构：指多肽链主链在一级结构的基础上进一步的盘旋或折叠，形成的周期性构象，维系二级结构的力是氢键。

多肽链主链构象的空间限制来自两个方面：1). 肽键不能自由旋转带来的构象限制。肽链中的肽键主要为反式。2). α-C 二面角φ、ψ虽然可以任意旋转，但不是任意二面角所决定的构象都是立体化学所允许的。

二级结构的类型：α螺旋结构、β折叠、β-转角和无规卷曲的结构特点及参数。

α-螺旋在角蛋白中最常见的构象，为右手螺旋。每圈螺旋3.6个氨基酸残基。侧链基团R 在螺旋外侧。主链内部形成H-键，不涉及侧链R。典型的α-螺旋是3.613螺旋，一周螺旋3.6个氨基酸，跨越13个原子。

（2)超二级结构：在蛋白质中经常存在由若干相邻的二级结构单元按一定规律组合在一起，形成有规则的二级结构集合体，充当更高层次结构的构件，超二级结构又称基序或模体

（3)结构域：在较大的蛋白质分子里，一条长的多肽链，在超二级结构的基础上，往往组装成几个相对独立的球状区域，彼此分开，以松散的单条肽链相连。这种相对独立的球状区域，称为结构域。

（4)三级结构：指一条多肽链在二级结构（超二级结构及结构域）的基础上，进一步盘绕、折叠而成的具有特定肽链走向的紧密球状结构, 或者说三级结构是指多肽链中所有原子和基团在三维空间的排布。

三级结构是指蛋白质分子或亚基内所有原子的空间排布，但是不包括亚基间或不同分子间的空间排列关系。

三级结构的特点: 1. 整个分子紧密、结实2. 常含有结构域3.许多在一级结权上相差很远的aa碱基在三级结构上相距很近。肌红蛋白（Mb）是由153个氨基酸残基组成的单一多肽链的蛋白质，含8个 螺旋（A、B、C、D、E、F、G、H），其辅基为血红素。

三级结构的稳定主要靠非共价键作用(氢键、离子键、疏水键、范德华力) 此外还有二硫键。

（5). 四级结构：多个具有三级结构的多肽链的聚合。或者说四级结构指亚基的种类、数目及各个亚基在寡聚蛋白中的空间排布和亚基之间的相互作用。

亚基：有的蛋白质分子由两条以上的肽链通过非共价键相连聚合而成，每条多肽链称为一个亚基。

结构特点：1.分子具有对称性；2.亚基间以非共价键缔合

四级结构的稳定主要靠是疏水作用力，另外还有离子键、氢键、范德华引力等

6). 纤维状蛋白质的结构：

胶原蛋白：含有较多的羟基脯氨酸（Hyp）、羟基赖氨酸（Hly），多肽链一级结构 96%遵守(Gly-X-Y)n。x 多为 Pro；y 多为 Hyp 或 Hly。三股左手螺旋形成的右手超螺旋。

角蛋白：α-角蛋白和β-角蛋白

α-角蛋白：二聚体结构的中央是由两个右手螺旋的多肽链复绕成左手超螺旋棒状结构。

通常含有较多的二硫键。

丝心蛋白及β角蛋白：一种独特的β-折叠片垛叠而成。每个β折叠股的主要结构类型是由 Gly-Ala/Ser 交替形成的长链。

研究蛋白质立体结构的方法(一) X-射线衍射技术（二）核磁共振

4．蛋白质的结构与功能的关系

一级结构与功能的关系，氨基酸组成变化改变其功能。一级结构是空间结构的基础，一级结构决定高级结构。蛋白质的天然结构具有特定空间构象，是其执行特定功能所必需的。

通过具体例子说明结构与功能的关系：

一级结构与功能的关系：一级结构的变异与分子病。（同源蛋白）一级结构的序列比较。

基因突变导致蛋白质一级结构的突变，导致蛋白质生物功能的下降或丧失，就会产生疾病，这种病称为分子病。

空间结构与功能的关系：核糖核酸酶的变性与复性实验；血红蛋白与肌红蛋白的功能比较，血红蛋白的别构效应。

②同功能蛋白质结构的种属差异与保守性：在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质

为同源蛋白质。通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲缘关系和进化，亲缘关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。说明:生物功能是由一级结构决定的;蛋白质一级结构中保守氨基酸对蛋白质的生物功能致关重要.

③蛋白质前体的激活切除C肽段后胰岛素原转变为活性的胰岛素

⑤血红蛋白的变构与输氧功能

变构作用是指对于多亚基的蛋白质或酶，效应剂作用于某个亚基，引发其构象改变，继而引起其他亚基构象的改变，导致蛋白质或酶的生物活性的变化。这样的效应剂也称变构剂。

蛋白质中氨基酸的修饰：这些氨基酸没有遗传密码，是在蛋白质合成后通过有关酶的催化形成的。其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。

(四)蛋白质的理化性质

1．蛋白质的相对分子质量

（一）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS－PAGE 变性电泳

在巯基乙醇存在下，蛋白质亚基分开，多肽链伸展；然后SDS与多肽链以1.4:1的重量比结合成复合物。SDS与蛋白质的结合改变了蛋白质分子的带电情况和分子形状。因此当蛋白质在电场中移动时，其迁移率仅与其分子量有关。

蛋白质分子量M与迁移率μ的关系式 Log M = a - b μ

用已知分子量的标准蛋白在同样条件下电泳，分别测其迁移率，做成标准曲线。

测出未知蛋白质的迁移率，从图上查得蛋白质分子量。

SDS-PAGE测定蛋白质分子量的特点：蛋白质已变性；对多亚基蛋白，测定的是亚基的分子量。

(二)凝胶过滤：凝胶过滤又称分子筛层析，在层析柱内填充惰性的微孔胶粒（如交联葡聚

糖），将蛋白质溶液加入柱上部后，小分子物质通过胶粒的微孔进入胶粒，向下流动的路径加长，移动缓慢；大分子物质不能或很难进入胶粒内部，通过胶粒间的空隙向下流动，其流动的路径短，移动速度较快，从而达到按不同分子量将溶液中各组分分开的目的。

三）沉降速度法利用超速离心机测定蛋白质分子量和分离纯化蛋白质的方法。

蛋白质在离心力作用下发生沉降，沉降速度与蛋白质分子分子量、密度、形状有关。

对特定蛋白质来讲，单位离心力场的沉降速度为一定值，称为沉降系数。

沉降系数通常用Svedberg 单位（S）表示。

一个S等于10-13秒。沉降系数越大分子量越大。

层析法又称为色谱技术，为分离纯化生物大分子的重要技术之一，包括离子交换层析、亲和层析等，其中离子交换层析应用最广。

离子交换层析基本原理:是依赖于共存于一个系统中的固定相和流动相之间的相互作用实现混合物中各个组分的分离。

2．蛋白质的两性电离及等电点

可解离基团：N-端的-NH2、C-端的-COOH以及侧链基团R。

蛋白质所带电荷和其周围包绕的水化膜是维持蛋白质在水溶液中稳定的两大因素。脱水和中和电荷可以导致蛋白质的沉淀。

等电点：当溶液在某一定pH环境中，使蛋白质所带正、负电荷相等，净电荷为零，在电场中不向阳极也不向阴极移动。

酸性氨基酸pI＜7,碱性氨基酸pI ＞7。蛋白质pI与所含氨基酸种类和数量有关，若蛋白质中碱性aa较多,其pI偏碱;如从雄性鱼类精子中提取的鱼精蛋白含Arg多,其pI 约为12,若含酸性aa较多,则pI偏酸。

蛋白质在等电点时其溶解度、导电性、粘度、渗透压最小。

蛋白质等电点性质为电泳分离的依据.

3．蛋白质的胶体性质

要形成稳定的胶体分散系统，需要保证三个条件：（1）分散相质点大小介于1~100nm。（2）分散相质点带有同种电荷，同种电荷相互排斥，使得质点不易沉淀下来；（3）溶剂在分散相质点表面形成溶剂化层，使分散质点间不易靠拢聚集成较大的颗粒而沉淀。蛋白质溶液是胶体溶液。

蛋白质胶体系统稳定的原因：水化层、双电层。

蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团（亲水基团向外翻，疏水基团向内钻），在蛋白质颗粒外面形成一层水膜（水化层）；另外蛋白质颗粒在非等电点状态时带的相同电荷，使蛋白质颗粒间相互排斥，不致相互凝聚沉淀。

中性盐、有机溶剂可以破坏蛋白质胶粒的水化膜，引起沉淀

1．盐析：大量中性盐如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl加入蛋白质溶液中，破坏蛋白质在水溶液中的稳定性因素，使得蛋白质溶解度降低而沉淀析出的现象。各种蛋白质盐析时需盐浓度及pH不同。盐析作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电表层使得蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子和水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度提高，利用不同蛋白质盐溶液的要求不同达到分离纯化蛋白质的目的

2. 透析透析常用于蛋白质溶液的除盐，通过透析，小分子通透透析袋，散布于透析液中，

大分子量的蛋白质不能通透透析袋，留在透析袋内。从而，蛋白质溶液中的小分子物质通过透析被分离除去。

3. 超滤在一定的压力下，使蛋白质溶液在通过一定孔径的超滤膜时，小分子量物质滤过，

而大分子量的蛋白质被截留，从而达到分离纯化的目的。这种方法既可以纯化蛋白质，又可达到浓缩蛋白质溶液的目的。超滤常用于蛋白质溶液的除盐、浓缩

4．蛋白质的紫外吸收特征

由于蛋白质中含有Trp、Tyr和Phe残基，使蛋白质在近紫外区280nm有最大特征吸收峰可作蛋白质定量测定。通过测定蛋白质溶液的A280nm可以测定蛋白质浓度。

5．蛋白质的变性及复性

当受到某些因素影响时，维系天然构象的次级键被破坏，蛋白质失去天然构象，导致生物活性丧失及相关物理、化学性质的改变，这个过程称为蛋白质变性。

蛋白质的变性复性实验可以用于蛋白质的折叠研究、说明空间结构与功能的关系。

变性是指一些理化因素，如热、光、机械力、酸碱、有机溶剂、重金属离子、变性剂（如尿素等），破坏了维持蛋白质空间构象的非共价作用力，导致其生物活性的丧失。变性一般并不引起肽键的断裂，但溶解度降低，可能凝固和沉淀。

变性的实质：次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。变性不汲及一级结构的破坏。变性不一定沉淀沉淀不一定变性凝固均变性并不溶解。

变性后的蛋白质在除去变性因素后，重新恢复天然构象和生物活性的过程称为蛋白质的复性。

蛋白质变性后的特征

生物活性：丧失

分子结构：有序紧密变无序松散

理化性质：溶解度降低，黏度增加，扩散系数降低等

生化性质：易被蛋白酶水解

变性机理:①热变性（往往是不可逆的）多肽链受到过分的热振荡，引起氢链破坏。②酸碱

变性：破坏了盐链。③有机溶剂：破坏水化膜，降低蛋白质溶液介电常数。

变性后的蛋白质在除去变性因素后，重新恢复天然构象和生物活性的过程称为蛋白质的复性

6、蛋白质的呈色反应

⑴茚三酮反应。蓝色常用于氨基酸的定性或定量分析。

⑵双缩脲反应。肽键与双缩脲试剂反应呈紫色。氨基酸无此反应，可用于检测蛋白质水解

程度

⑶与2、4-二硝基氟苯反应黄色可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸.亦称Sanger反应

⑷与苯异硫氰酸酯反应可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸.亦称Edman反应

⑸与丹磺酰氯反应可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨基酸

7、电泳

蛋白质是两性解离物质，在偏酸溶液中带正电荷，在偏碱溶液中带负电荷，通电时带电荷的蛋白质粒子在电场中向带相反方向的电极移动，这种移动现象叫电泳。

在一定的电场和介质中，蛋白质迁移速度与蛋白质分子量、所带电荷及分子形状有关。

根据蛋白质在低于或高于等电点溶液中带电并在电场中向一级移动原理来分离蛋白质。

最常用的电泳法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳、火箭免疫电泳和高效毛细管电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）丙烯酰胺和交联试剂（甲叉双丙烯酰胺）在过硫酸铵催化下聚合而成。可以控制孔径大小

8、蛋白质的沉淀

（1）加中性盐沉淀蛋白质

向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4）2SO4、Na2SO4、Nacl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀

（2）加有机溶剂沉淀蛋白质、破坏水化膜，降低介电常数

（3）加重金属盐沉淀蛋白质、pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，可与重金属离子（Hg2+.

Pb2+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀

（4）加生物碱试剂沉淀蛋白质、pH小于等电时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。

(五)蛋白质的分离与纯化

实质：①蛋白与非蛋白分开，②蛋白质之间分开

原理1. 溶解度差异 PEG沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法2. 热稳定性差异

热处理沉淀法、铜锌SOD（65℃、15分钟、稳定）3. 电荷性质差异离子交换层析法、

泳法4. 分子大小和形状差异凝胶过滤、超滤法、透析法、离心法5. 亲和力的差异和层析法 (某种蛋白质能与一种配基特异而非共价结合

（1）材料来源、来源方便、含量丰富、容易提取、防止变性

（2）分离的一般原则

利用分子大小，如分子筛凝胶过滤；利用电离性质，如电泳；利用溶解性，如等电点；利用生物学特性，如亲和层析等

（3）纯化鉴定；氨基酸组成分析、末段分析、色谱分析、电泳分析、等电聚焦分析、免疫化学分析

（4）序列测定；确定肽链的氨基酸组成、末端和S-S键数目，专一地酶解大的多肽成为较小的片段，蛋白质序列仪，应用肽段序列重叠法确定氨基酸的排序，确定S-S键的位置

1．蛋白质的抽提原理及方法

分离纯化的一般程序可分为：前处理、粗分级和细分级分离三个步骤。

(1) 前处理步骤：将欲分离纯化的目的蛋白质从细胞中溶解出来。胞外蛋白质可以直接用

缓冲液提取，胞内蛋白质的提取涉及破碎细胞等步骤，再通过离心除去大的细胞碎片等，得到上清液即为可溶性总蛋白溶液。

(2) 粗分级：这个阶段主要是除去大量的杂质和杂蛋白。一般采用的方法有中性盐或有机

溶剂的分级沉淀的方法，以及超滤等浓缩的方法。

(3) 细分级：对目的蛋白质进一步的提纯。通常采用各种柱层析的方法，如：离子交换层

析、凝胶过滤层析、吸附层析、疏水相互作用层析、反相层析等，还可以采用制备性电泳的方法。这一阶段常常同时进行生物活性的检测和纯度的鉴定。

2．蛋白质分离与纯化的主要方法：电泳、层析和离心

蛋白质等大分子具有两性解离性质，在溶液中也会带上不同的电荷，置于电场中也会发生电泳现象，因此可以通过电泳对蛋白质进行分离。

层析技术主要有凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析及亲和层析，应掌握这些技术的原理。

离心法分离蛋白质等大分子是基于它们的密度差异。当颗粒的密度大于溶液密度时，颗粒就会在溶液中下沉。

蛋白质是两性解离物质，在偏酸溶液中带正电荷，在偏碱溶液中带负电荷，通电时带电荷的蛋白质粒子在电场中向带相反方向的电极移动，这种移动现象叫电泳

最常用的电泳法有：

聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳、火箭免疫电泳和高效毛细管电泳。基础生化的实验中，重点掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶过滤柱层析（分子筛柱层析）的原理及基本操纵步骤。

常用的分离纯化蛋白质的方法主要有：盐析、丙酮沉淀、透析、电泳、离子交换层析、分子筛层析、超速离心等方法。

盐析是应用中性盐加入蛋白质溶液，破坏蛋白质的水化膜，中和了电荷，使蛋白质聚集而沉淀析出。

丙酮沉淀是向蛋白质溶液中加入丙酮使蛋白质沉淀。

透析法是利用仅能通透小分子化合物的半透膜，使大分子蛋白质和小分子化合物分离，达到浓缩蛋白质或除去小分子化合物目的。

电泳法是根据蛋白质在一定 pH溶液中可带电荷，成为带电颗粒，在电场中向相反的电极方向移动。由于蛋白质的质量和电荷量不同，在电场中的泳动速率也不同，从而将蛋白质

分离成泳动速率快慢不等的条带。

离子交换层法是利用离子交换树脂或离子交换纤维素将蛋白质分离的方法。在某一 pH条件下，蛋白质颗粒带有电荷，可与离子交换树脂颗粒表面的相反电荷吸引，然后用盐溶液洗脱，蛋白质带电多少不同，随洗脱液盐浓度的变化而先后被洗脱，达到分离的目的。

分子筛层析是根据蛋白质颗粒大小不同而进行分离的一种方法。层析柱内填充带网状的凝胶颗粒，小分子蛋白质可进入颗粒内，大分子蛋白质不能进入，因此分子量不同的蛋白质在层析柱内滞留时间不同，流出层析柱先后不同，可将蛋白质按分子量大小而分离。

超速离心法是利用蛋白质的密度和形态不同，在超速离心力作用下沉降速度不同而分离的方法。

3．蛋白质的定量方法凯氏定氮法、紫外吸收法、Folin-酚法及考马斯亮蓝法

第三章核酸化学

(一) 核酸的种类和组成单位

1、核酸是由核苷酸组成的多核苷酸长链分子，有两种类型：核糖核酸（RNA）和脱氧核糖

核酸（DNA）。

2、组成RNA的核苷酸为核糖核苷酸，组成DNA的核苷酸为脱氧核糖核苷酸。碱基和戊糖缩合

形成核苷，核苷中的戊糖羟基被磷酸酯化形成核苷酸。

单核苷酸是组成核酸的基本单位。核酸在核酸酶作用下水解为核苷酸，核苷酸由碱基、戊糖和磷酸组成。

核苷=核糖+碱基；由戊糖和碱基缩合而成，糖环上的C1与嘧啶碱的N1或嘌呤碱的N9相连接，连键性质为 -糖苷键。

嘌呤、嘧啶环上由于有共轭双键，在260nm波长附近对紫外光有较强的吸收。

含氮碱：参与核酸和核苷酸构成的含氮碱主要分为嘌呤碱和嘧啶碱两大类。戊糖：核苷酸中的戊糖主要有两种，即β-D-核糖与β-D-2-脱氧核糖，由此构成的核苷酸也分为核糖核苷酸与脱氧核糖核酸两大类。核苷：核苷是由戊糖与含氮碱基经脱水缩合而生成的化合物。通常是由核糖或脱氧核糖的C1’ β-羟基与嘧啶碱N1或嘌呤碱N9进行缩合，故生成的化学键称为β，N 糖苷键。其中由D-核糖生成者称为核糖核苷，而由脱氧核糖生成者则称为脱氧核糖核苷。由“稀有碱基”所生成的核苷称为“稀有核苷”。假尿苷（ψ）就是由D-核糖的C1’ 与尿嘧啶的C5相连而生成的核苷。

核酸的基本元素组成：C H O N P两个特点：1. 一般不含S； 2. P含量较多，且恒定（9%-10%）。可用定磷法进行核酸的定量分析。（DNA9.9% 、RNA9.5%）

二、核苷酸的结构与命名：

核苷酸是由核苷与磷酸经脱水缩合后生成的磷酸酯类化合物，包括核糖核苷酸和脱氧核糖核酸两大类。最常见的核苷酸为5’-核苷酸（5’ 常被省略）。5’-核苷酸又可按其在5’位缩合的磷酸基的多少，分为一磷酸核苷（核苷酸）、二磷酸核苷和三磷酸核苷。

此外，生物体内还存在一些特殊的环核苷酸，常见的为环一磷酸腺苷（cAMP）和环一磷酸鸟苷（cGMP），它们通常是作为激素作用的第二信使。

核苷酸通常使用缩写符号进行命名。第一位符号用小写字母d代表脱氧，第二位用大写字母代表碱基，第三位用大写字母代表磷酸基的数目，第四位用大写字母P代表磷酸。

三、核酸的一级结构：

核苷酸通过3’,5’-磷酸二酯键连接起来形成的不含侧链的多核苷酸长链化合物就称为核酸。核酸具有方向性，5’-位上具有自由磷酸基的末端称为5’-端，3’-位上具有自由羟

基的末端称为3’-端。

(二) 核酸的分子结构

1．DNA 的分子结构：

1). DNA 的一级结构：指在其多核苷酸链中各个核苷酸之间的连接方式,核苷酸种类,数量以

及核苷酸的排列顺序。核苷酸之间的连接方式是3’，5’-磷酸二酯键。DNA 的书写顺序是5‘——3’ 核酸的一级结构测定的方法

1.由Maxam 和Gilibert 提出的化学降解法；

利用一种多核苷酸激酶在被测DNA 样品的5‘端羟基上标记32P ，然

后根据碱基所在位置分为G 、G+A 、C 和C+T 四组，采用不同

专一性试剂修饰碱基，使得每组样品在其特定碱基位置断裂，即

得到不同长度的核苷酸片断。将这些核苷酸片断同时在聚丙烯酰

胺凝胶上电泳分离，通过放射性自显影，即可以从4个反应的电

泳图谱上推知被测样品的核苷酸顺序。

用2mol/l 的NaCl 加肼，只有C 和肼反应，使得C 断裂分开

C 用肼及哌啶使C 和T 断裂T+C

上述硫酸二甲酯处理不能使A-G 完全分开，加甲酸使A 和G 完全分开，再加哌啶使A 脱落G+A

用硫酸二甲酯（DMS ）使G 的N-7位甲基化，加热及哌啶使G 脱落并使多核苷酸链在G 位发生断裂G

导致核苷酸断裂的试剂和作用碱基

2.由Sanger 等人提出的酶法（双脱氧链终法），

较常用。

Sanger 双脱氧链终止法引入了双脱氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-

ddNTP ）作为链终止剂。2ˊ,3ˊ-ddNTP 脱氧核糖的3ˊ位缺

少羟基，它可以与多核苷酸链的3ˊ羟基形成磷酸二酯键，

但却不能与下一个核苷酸缩合，导致多核苷酸链的延伸终止。

如果在DNA 的合成反应中，加入一种少量的ddNTP ，则多核苷

酸链的延伸将在随机的位点终止，生成一系列长短不一的核

苷酸链。在4组独立的DNA 合成反应中，分别加入4种不同的

ddNTP ，结果生成的4组核苷酸链将分别终止于各个A ，G ，

C ，T 的位置上。对这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电

泳，就可读出序列。

2). DNA 的二级结构：

稳定双螺旋结构的因素主要有三种：氢键、碱基堆积力和离子键。最主要的是碱基堆积力。

DNA 双螺旋结构是DNA 二级结构的一种重要形式，它是Watson 和Crick 两位科学家于1953年提

出来的一种结构模型DNA 分子中四种碱基的摩尔百分比为A=T 、G=C 、A+G=T+C ，以及由Wilkins

研究小组完成的DNA晶体X线衍射图谱分析。

天然DNA的二级结构以B型为主，其结构特征为：①两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。两条链方相反。②主链位于螺旋外侧，碱基位于内侧；③两条链间存在碱基互补，通过氢键连系，且A-T、G-C（碱基互补原则）；④螺旋的稳定因素为氢键和碱基堆砌力；⑤螺旋的螺距为3.4nm，直径为2nm。沿中心轴每旋转一周有10个核苷酸。碱基平面之间之间的垂直距离0.34nm。

双螺旋结构上有两条螺形凹沟。一条大沟，一条小沟。

两条链依靠彼此碱基之间的氢键结合在一起；碱基按互补原则进行特异的碱基配对: A＝T，C G。在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。

3). DNA的三级结构：DNA的三级结构是指DNA双螺旋通过扭曲或折叠所形成的特定构象。DNA双螺旋圈数减少，双螺旋DNA处于拧松状态时形成负超螺旋，负超螺旋DNA为右旋。双螺旋圈数增加，双螺旋DNA处于拧紧状态时形成正超螺旋，正超螺旋DNA为左旋。绝大多数天然存在的DNA形成的是负超螺旋。绝大多数原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋，其三级结构呈麻花状。

1.连锁数（链环数）：指在双螺旋DNA中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数，以L 表示。

2.扭转数（缠绕数），以T表示。扭转数是指DNA分子中Watson-Crick的螺旋数。

3.超螺旋数以W表示L=T+W DNA分子具有相同的结构，但L值不同，所以称它们为拓扑异构体。拓扑异构酶能够催化它们之间的转换。

DNA负超螺旋易于解链，在DNA复制、重组和转录等过程中都需要两条链解开，所以负超螺旋利于这些功能的实施。生物体内大多数DNA分子都处于负超螺旋结构，正超螺旋DNA在自然界还没有发现。

4). 核小体的结构：在真核生物中，双螺旋的DNA分子围绕一蛋白质八聚体进行盘绕，从而形成特殊的串珠状结构，称为核小体。核小体结构属于DNA的三级结构。

核小体是构成染色质的一系列重复结构单位，由双链DNA和组蛋白组成。不同种类核小体

核心结构是完全相同的，为扁平体：110×100×55?。每个核小体只有一个H1，H1 易从

核小体上解离下来。组蛋白富含Lys, Arg，因此是碱性蛋白。组蛋白的H2A、H2B、H3、

H4 各 2 分子形成一个八聚体的核心。146bp的DNA 围绕这个核心 1.75 圈，形成核心颗粒。连接DNA：10~114bp长，连接两个相邻的核小体。H1 结合在核心颗粒上，位于核心

颗粒外侧。平均每个核小体重复单位约占 200bpDNA

染色质：特指真核细胞核内发现的DNA和蛋白质的复合体，其基本单位是核小体。染色质的主要蛋白质成分通称为组蛋白。大多数真核细胞中都含有5种不同的组蛋白，即H1、H2A、H2B、H3和H4。其中H2A、H2B、H3和H4各两分子构成核小体的核心，称为组蛋白八聚体。

2．RNA的分子结构：

1). tRNA的结构：

一级结构：约占细胞中RNA总量的15%。约由75-90个核苷酸组成。蛋白质合成中携带活化的氨基酸 1. 分子较小，为直线型多核苷酸链（25KD, 70-90 nt, 沉降系数4 S）；2. 含有较多的稀有碱基;3. 3’末端都为CpCpAOH，用来接受AA；4. 5’末端多为pG, 也有pC的；

5. 磷酸二酯键，5‘端向3’端延伸。

二级结构：tRNA的二级结构中含有较多的发夹结构，形成四个双链的臂和四个单链的环，使tRNA具有相同的三叶草形结构。可分为五个部分：①氨基酸臂：由tRNA的5’-端和3’-端构成的局部双螺旋，3’-端都带有-CCA-OH顺序，可与氨基酸结合而携带氨基酸。②DHU 臂：含有二氢尿嘧啶核苷，与氨基酰tRNA合成酶的结合有关。③反密码臂：其反密码环中部的三个核苷酸组成三联体，在蛋白质生物合成中，可以用来识别mRNA上相应的密码，故称为反密码。④ TψC臂：含保守的TψC顺序，可以识别核蛋白体上的rRNA，促使tRNA与核蛋白体结合。⑤可变臂：位于TψC臂和反密码臂之间，功能不详。

三级结构：tRNA的三叶草结构通过折叠形成倒L型的三级结构。倒L型的一端为氨基酸臂，另一端为反密码环。

2). mRNA的结构：

占细胞中RNA总量的3%-5%，分子量大小不一，不稳定，代谢活跃，更新迅速，是合成蛋白质的模板。1. 单链，分子大小不均一； 2. 大多数真核细胞mRNA 3’末端有poly(A)结构；poly(A)的作用:(1)与mRNA从细胞核到细胞质的运输有关;(2)与mRNA半衰期有关。

帽子作用:(1)抗5’-核酸外切酶的降解作用(2)有助于核糖体与mRNA的识别与结合

原核生物：

顺反子：mRNA上具有翻译功能的核苷酸顺序。

一个mRNA分子编码一条多肽链，这种mRNA分子被称为单顺反子。绝大多数的细菌mRNA分子可以编码两条或多条不同的多肽链，这种mRNA分子叫做多顺反子。一般认为原核生物mRNA 中不具有帽子和poly(A)结构。

先导区+翻译区（多顺反子）+末端序列

真核生物：真核细胞mRNA为单顺反子,有编码区和非编码区之分, 只编码一条多肽链。

其mRNA5′端具有帽子结构，5′帽子结构由7-甲基鸟苷酸（m7G）经焦磷酸与mRNA5′末端核苷酸相连，形成5′-5′-三磷酸连接。几乎所有的真核mRNA的3′端都具有poly(A)尾。“帽子”（m7G-5′ppp5′-N-3′p）+单顺反子+“尾巴”（Poly A）

3). rRNA的结构：

细胞中含量最多的RNA，约占RNA总量的80%以上,核糖体的组成成分，蛋白质合成的场所。一级结构是由3‘,5’-磷酸二酯键相连的多核苷酸。

原核生物中有三种rRNA：5S，16S，23S。真核生物的rRNA有四种5S，5.8S，18S，28S。这些rRNA与蛋白质结合在一起形成核糖体。

原核生物中，由50S大亚基和30S小亚基组成70S的核糖体。真核生物的核糖体为80S，大亚基为60S，小亚基为40S。

具有自身催化作用的RNA称为核酶，核酶通常具有特殊的分子结构，如锤头结构。

(三) 核酸的理化性质

1．核酸的一般性质：、酸碱水解性、沉降性、

溶解性：DNA微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大,溶于偏碱的溶剂中，但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。（用乙醇从溶液中沉淀核酸）容易受机械作用力而断裂。

粘度：DNA为线性高分子， DNA溶液有高度的黏性。

DNA和RNA含有极性基团，均微溶于水，它们的钠盐在水中溶解度较大。核酸不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂。DNA中的磷酸二酯键对碱不敏感，而RNA很容易被NaOH稀溶液随机水解。DNA溶液粘度非常高；RNA溶液的粘度比DNA溶液小得多。

2．核酸的紫外吸收特征

核酸溶液在260 nm附近有一个最大吸收峰，在230 nm有一个低谷，RNA的吸收光谱与DNA无显著差别。

3．核酸的变性及复性

1). 变性：在一定条件下，受到某些物理和化学因素的作用，DNA的双螺旋结构破坏，氢键断裂，碱基有规律的堆积被破坏，双螺旋松散，双链分离成两条缠绕的无定形的多核苷酸单链的过程称为变性。

引起DNA变性的因素主要有：①高温，②强酸强碱，③有机溶剂等。

核酸变性的因素: 1. 过酸、过碱2. 变性剂 (尿素，甲醛) 3. 热变性特点：爆发式

DNA变性后的性质改变：①增色效应：指DNA变性后对260nm紫外光的光吸收度增加的现象；

②旋光性下降；③粘度降低；④生物功能丧失或改变。沉降系数增加，

2). 复性：变性DNA分开的两条链在适当条件下重新生成双链结构的过程。

退火:热变性的DNA经缓慢冷却后复性的过程。

3). 增色效应与减色效应、熔解温度、分子杂交的概念。

增色效应：核酸分子加热变性时，其在260nm处的紫外吸收急剧增加的现象。

减色效应：变性DNA分子复性重新形成双螺旋结构，其紫外吸收降低的现象。

Tm 熔解温度：加热变性使DNA双螺旋结构丧失一半时的温度。当紫外吸收变化达到最大变化的半数值时，此时所对应的温度称为熔解温度、变性温度或用Tm值表示。Tm 的大小与DNA分子中（G+C）的百分含量成正相关，测定Tm值可推算核酸碱基组成及判断DNA纯度。

核酸的分子杂交：当两条不同来源的DNA（或RNA）链或DNA链与RNA链之间存在互补顺序时，在一定条件下可以发生互补配对形成双螺旋分子，这种分子称为杂交分子。形成杂交分子的过程称为分子杂交。杂交过程可以发生在DNA单链之间、RNA单链之间以及DNA单链与RNA 单链之间凡是能水解核酸的酶都称为核酸酶。凡能从多核苷酸链的末端开始水解核酸的酶称为核酸外切酶，凡能从多核苷酸链中间开始水解核酸的酶称为核酸内切酶。能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶称为限制性核酸内切酶（限制酶）。

(四) 核酸的分离纯化

核酸的分离提取方法依据核酸的性质而进行，如：溶解特性、碱基组成以及分子大小等。从细胞中提取的核酸，仍混杂着蛋白质、多糖和各种分子大小核酸同类物。根据不同的实验要求，采用不同的方法可以对核酸进行进一步的分离纯化，如采用超速离心、柱层析、免疫沉淀、凝胶电泳以及分子杂交等方法。为防止核酸大分子的变性或降解，在核酸的分离纯化时，实验操作通常在低温（0~ 4℃）条件下进行。

核酸在细胞内主要以与蛋白质结合的核蛋白形式存在，除去蛋白质是核酸分离纯化中重要的步骤。常用方法有：（1）加入去污剂。如十二烷基硫酸钠SDS），可以使蛋白质变性，变性蛋白质可经离心除去，DNA样品留在上清液中。（2）交替使用苯酚和氯仿两种不同的蛋白质变性剂，可以提高去除蛋白质的效果。通过苯酚、氯仿抽提，经过离心，核酸进入水相，蛋白质会沉淀于有机相和水相之间的界面。取出水相后，用乙醇等有机溶剂可将核酸沉淀出来。提取DNA时，应避免机械损伤降解DNA。提取RNA的关键因素是尽量减少RNase

的污染。

基础生物化学实验中，重点掌握DNA的提取方法，主要是核DNA及质粒DNA的提取过程。质粒DNA提取往往是复试中实验操作的考察内容。

第四章酶

(一) 酶的基本概念和作用特点

1、酶是活细胞合成的具有高度催化效率和高度特异性的一类生物大分子。

绝大部分酶是蛋白质，还有一些核糖核酸RNA具有催化作用，称为核酶。

2、酶催化剂的特性：

高效性；高度的专一性；反应条件温和；酶容易变性；酶活性的可调节性；催化活性易受外界条件影响；催化活性在细胞内受严格调控；某些酶催化活性与辅助因子有关；酶的蛋白质本质。

酶活性指的是酶的催化能力，用反应速度来衡量，即单位时间里产物的增加或底物的减少。测定方法：吸光度测定、气体分析、电化学分析等。

酶活力国际单位：最适条件下，每秒钟能催化1mol底物转化为产物所需的酶量，定为1Kat=1mol/s

比活性指的是每毫克酶蛋白所具有的酶活性单位数。

3、酶分子可根据其化学组成的不同，可分为单纯酶和结合酶（全酶）两类。

结合酶则是由酶蛋白和辅助因子两部分构成，酶蛋白部分主要与酶的底物特异性有关，辅助因子则与酶的催化活性有关。辅因子包括:有机小分子(辅酶、辅基)和金属离子。

乳酸脱氢酶（辅酶I,NAD）异柠檬酸脱氢酶（辅酶I,NAD）醇脱氢酶（辅酶I,NAD）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（辅酶II,NADP）琥珀酸脱氢酶（FAD）乙酰辅酶A羧化酶（生物素，ATP，Mg++）脂酰辅酶A合成酶（辅酶A,CoA）

(二) 酶的国际分类和命名

1、命名：每一种酶应有一个系统名称和一个习惯名称。

2、国际系统命名法原则：规定每种酶的名称应当标明酶的底物及催化反应的性质。如果一种酶催化两种底物起反应，应在他们的系统名称中包括两种底物的名称，并以“：”将其隔开。

3、分类编号方案：每个酶的分类编号由字母“EC”加上四个数字组成，数字间用“.”分开。

分类编号中：第一个数字表明一个酶属于六大类中的哪一类。第二个数字是该酶的亚

类，指明底物中被作用的基团或键第三个数字是该酶的亚-亚类。第四个数字是该酶在

亚-亚类中的排序。

国际生物化学与分子生物学会酶学委员会根据酶催化的反应类型，将酶分为六大类：

1.氧化还原酶：催化氧化－还原反应。

2.转移酶：催化基团转移反应。

3.水解酶：催化水解反应。这是特殊的一类转移酶，水作为转移的基团的受体。

4.裂解酶：催化非水解和非氧化的底物的消除反应，或裂解，生成一个双键。

5.异构酶：催化异构化反应。

6.合成酶：又称连接酶。催化两个底物的连接反应或称之交联反应。

(三)酶的作用机制

1．酶的活性中心：酶蛋白分子中能与底物特异结合并发挥催化作用，将底物转变为产物的部位称为酶的活性中心。活性中心是酶分子上由催化基团和结合基团构成的一个微区。1). 活性中心包括两个功能位点：

结合位点：保证底物正确结合在酶的催化位点附近，决定了酶的专一性。

催化位点：负责底物键的断裂及新键的形成，决定了酶的催化能力。在含有辅因子的酶中，辅因子或其上的某些基团也参与酶活性中心的组成。

2). 酶活性中心的特点：只占酶分子结构中很小部分(1~2%)；具有特定的三维结构，酶和底物结合的专一性取决于活性中心中原子的精致排列；并不是和底物的形状正好互补，具有柔性；以弱键与底物结合；位于酶分子的一个凹穴中，形成疏水区。

酶的必需基团：酶分子中只有部分基团与酶活性有关，称作酶的必需基团。常见的必需基团有丝氨酸残基的羟基、组氨酸残基的咪唑基、半胱氨酸的巯基、酸性氨基酸残基的羧基如谷氨酸的γ－羧基等。

参与构成酶的活性中心的化学基团，有些是与底物相结合的，称为结合基团，有些是催化底物反应转变成产物的，称为催化基团，这两类基团统称为活性中心内必需基团。在酶的活性中心以外，也存在一些化学基团，主要与维系酶的空间构象有关，称为酶活性中心外必需基团。

酶原：多数酶在细胞合成时即具有活性，但有少数酶在细胞合成时，没有催化活性，需要经一定的加工剪切才有活性。这类无活性的酶的前体。

酶原的激活：在合适的条件下和特定的部位，无活性的酶原向有活性的酶转化的过程。

2．酶的专一性和高效性机制

1). 酶的专一性：指一种酶只能催化某一种或某一类物质发生特定的反应。分为结构专一性和立体异构专一性两类。结构专一性：键专一性、基团专一性立体异构专一性：旋光异构专一性、几何异构专一性、原手性

2). 高效性机制：邻近和定向效应；底物形变；共价催化；酸碱催化；疏水微环境的影响；金属离子催化。

1．邻近效应:在酶促反应中，由于酶和底物分子之间的亲和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趋势，最终结合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效浓度大大增加的效应叫做邻近效应。

定向效应：当专一性底物向酶活性中心靠近时，会诱导酶分子构象发生改变，使酶活性中心的相关基团和底物的反应基团正确定向排列，同时使反应基团之间的分子轨道以正确方向严格定位，使酶促反应易于进行。

以上两种效应使酶具有高效率和专一性特点

2.底物分子形变或扭曲

诱导契合学说认为，酶和底物都有自己特有的构象，在两者相互作用时，一些基团通过相互取向，定位以形成中间复合物。

张力效应：酶-底复合物形成时，酶分子构象发生变化，底物分子也常常受到酶的作用而发生变化，甚至使底物分子发生扭曲变形，从而使底物分子某些键的键能减弱，产生键扭曲，有助于过度态的中间产物形成,从而降低了反应的活化能。

3.酸碱催化：活性中心的一些基团，如His，Asp作为质子的受体或供体，参与传递质子。酸-碱催化可分为狭义的酸-碱催化和广义的酸-碱催化。酶参与的酸-碱催化反应一般都是广义的酸－碱催化方式。

广义酸－碱催化是指通过质子酸提供部分质子,或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程。

4.共价催化：

催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化。

酶中参与共价催化的基团主要包括以下亲核基团： His 的咪唑基，Cys 的硫基，Asp 的羧基，Ser 的羟基等；亲电子基团：H+ 、Mg2+、 Mn2+ 、Fe3+ 某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。

5.活性中心的低介电性(疏水效应)：

活性中心的疏水区域对水分子的排除、排斥，有利于酶与底物的接触。

酶分子表面由亲水基团构成，而内部常为疏水性氨基酸组成，并常形成疏水性“口袋”样结构，酶活性中心多位于此疏水“口袋”中，即底物与酶的反应在酶分子内部疏水环境中进行。

6. 金属离子的催化作用：

１.需要金属的酶分类：

（1）金属酶:含紧密结合的金属离子。如Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+

（2）金属-激活酶:含松散结合的金属离子，如Na+ K+ Mg2+ Ca2+

2.金属离子的催化作用：

许多氧化-还原酶中都含有铜或铁离子，它们作为酶的辅助因子起着传递电子的功能。许多激酶的底物为ATP-Mg2+复合物。金属离子通过水的离子化促进亲核催化。

(四) 影响酶促反应速度的主要因素

底物浓度、酶浓度、温度和pH值、激活剂与抑制剂都对酶促反应速度产生影响。

1．底物浓度对反应速度的影响：

⑴底物对酶促反应的饱和现象：由实验观察到，在酶浓度不变时，不同的底物浓度与反应速度的关系为一矩形双曲线，在其他条件确定的情况下,在低底物浓度时, 反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应.当底物浓度较高时，v也随着[S]的增加而升高，但变得缓慢，表现为混合级反应。当底物浓度达到足够大时，反应速度也达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。

反应速度对于底物浓度的变化呈矩形双曲线,称为米氏双曲线.其数学表达式为米氏方程.

⑵米氏方程及米氏常数：根据上述实验结果，Michaelis & Menten米氏方程：

ν= Vmax[S]/(Km+[S])。其中，Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数。米氏常数Ｋm对于酶是特征性的。

⑶Km和Vmax的意义：

①当ν=Vmax/2时，Km=[S]。因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。

②当k-1>>k+2时，Km=k-1/k+1=Ks。因此，Km可以反映酶与底物亲和力的大小，即Km值越小，则酶与底物的亲和力越大；反之，则越小。

③Km可用于判断反应级数：当[S]<0.01Km时，ν=（Vmax/Km）[S]，反应为一级反应，即反应速度与底物浓度成正比；当[S]>100Km时，ν=Vmax，反应为零级反应，即反应速度与底物浓度无关；当0.01Km<[S]<100Km时，反应处于零级反应和一级反应之间，为混合级反应。

④Km是酶的特征性常数：在一定条件下，某种酶的Km值是恒定的，因而可以通过测定不同酶（特别是一组同工酶）的Km值，来判断是否为不同的酶。

⑤Km可用来判断酶的最适底物：当酶有几种不同的底物存在时，Km值最小者，为该酶的最适底物。

⑥Km可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度：当[S]=10Km时，ν=91%Vmax，为最合适的测定酶活性所需的底物浓度。

⑦Vmax可用于酶的转换数的计算：当酶的总浓度和最大速度已知时，可计算出酶的转换数，即单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。

⑷Km和Vmax的测定：主要采用Lineweaver-Burk双倒数作图法和Hanes作图法。

Lineweaver和Burk将米氏方程作双倒数变换处理，将矩形双曲线变成直线作图，便可较容易地用该直线求得V max和K m。

2．酶浓度对反应速度的影响：当反应系统中底物的浓度足够大时，酶促反应速度与酶浓度成正比，即ν=k[E]。

3．温度对反应速度的影响：一般来说，酶促反应速度随温度的增高而加快，但当温度增加达到某一点后，由于酶蛋白的热变性作用，反应速度迅速下降。酶促反应速度随温度升高而达到一最大值时的温度就称为酶的最适温度。酶的最适温度与实验条件有关，因而它不是酶的特征性常数。低温时由于活化分子数目减少，反应速度降低，但温度升高后，酶活性又可恢复。

4．pH对反应速度的影响：

pH可影响酶分子尤其是活性中心上必需基团和催化基团的解离程度，也可影响底物和辅酶的解离程度，从而影响酶与底物的结合。在特定pH条件下，酶、底物和辅酶的解离情况适宜于相互结合，使酶反应速度达到最大值，这个pH称为最适pH

最适pH不是酶的特征常数，它受底物浓度、缓冲溶液的种类、浓度及酶的纯度影响

5. 抑制剂对酶促反应速度的影响

酶的抑制剂：凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质抑制作用分为可逆和不可逆抑制作用两种。

(一)不可逆抑制

抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，从而抑制酶活性。用透析、超滤等物理方法，不能除去抑制剂使酶活性恢复。

特点：

1.此类抑制剂一般是非生物来源

2.抑制剂与酶的活性中心的必需基团（－OH，－SH）以共价键结合，如低浓度

的重金属离子Hg2+、Ag+、As3+ 可与酶分子SH结合，使酶活抑制。

3. 抑制反应不可逆

例如：有机磷农药中毒

有机磷农药，如敌百虫，敌敌畏，1059等可与胆碱酯酶活性中心的丝氨酸羟基结合，使酶失活，导致乙酰胆碱堆积，造成副交感神经兴奋，临床上可用解磷定（PAM）解除其抑制作用巯基酶的不可逆抑制引起的中毒可用二巯基丙醇（BAL）解除其毒性。巯基酶的不可逆抑制引起的中毒可用二巯基丙醇（BAL）解除其毒性。

（二）可逆抑制作用

抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，结合是可逆的，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析、超滤等物理方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。

特点： 1.一些抑制剂与酶和（或）酶－底物复合物以非共价键结合2.抑制作用可逆

根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制和混合抑制等。

1、竞争性抑制

竞争性抑制剂因具有与底物相似的结构，与底物竞争酶的活性中心，与酶形成可逆的EI复合物，减少的酶与底物结合的机会，使酶的反应速度降低的作用。这种抑制作用可通过增加底物浓度来解除。

竞争性抑制的动力学特点是Vmax不变，而Km增大

特点 : 1. 抑制剂与底物结构相似,与底物结合在酶的同一位点;

2. 酶能够形成ES的比例取决于S和I的相对浓度和酶对它们的亲和性。

3. 抑制作用可被高浓度的底物减低以至消除;

4. Km增大，Vmax不变。丙二酸、苹果酸、草酰乙酸为琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。

其动力学特点：

①无论竞争抑制剂浓度多少，各直线在纵轴截距都相同，即V max不受抑制剂的影响。

②横轴截距表示的K m右移，说明有抑制剂时K m大于无抑制剂的K m值，有抑制剂时的K m称为表观K m（不是酶的真正的K m）。即竞争性抑制剂可使酶的表观K m增大

在可逆的竞争性抑制中，抑制剂通常是酶的天然底物结构上的类似物，两者竞争酶的活性中心。

典型的例子是丙二酸对琥珀酸脱氢酶（底物为琥珀酸）的竞争性抑制和磺胺类药物（对氨基苯磺酰胺）对二氢叶酸合成酶（底物为对氨基苯甲酸）的竞争性抑制。

2、非竞争性抑制

非竞争性抑制剂与酶的活性中心以外的集团结合，形成EI或ESI复合物，不能进一步形成E 和P,使酶反应速度减低的抑制作用。不能通过增加底物浓度的方法来解除

特点：

1.抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合

2.抑制剂既与E结合，也与ES结合，但生成的ESI复合物是死端复合物，不能释放出产物

非竞争性抑制作用的动力学特点是Vmax变小，而Km不变。

在可逆的非竞争性抑制作用中：抑制剂结合在活性中心以外；抑制剂的结合阻断了反应的发生。

非竞争性抑制动力学特点：

①随抑制剂浓度增加各直线在纵轴上的截距增加，说明该酶促反应的Vmax因抑制剂的存在而降低。

②抑制程度与抑制剂浓度有关，增加底物浓度不能使抑制程度减少。

③各直线交于横轴上同一位点，说明非竞争性抑制不改变酶促反应的K m。

3.反竞争性抑制

抑制剂不能与游离的酶结合，必须在酶和底物结合后，与ES结合形成ESI复合物；ESI复合物不能分解为产物使中间产物ES量下降；这类抑制作用较为少见。

特点：

1.抑制剂只与ES复合物结合生成ESI复合物，使中间产物ES量下降。

2.抑制剂不与游离酶结合。

3.不同浓度抑制剂曲线形成多条平行线，V m和K m均下降

6．激活剂对反应速度的影响：能够促使酶促反应速度加快的物质称为酶的激活剂。酶的激活剂大多数是金属离子，如K+、Mg2+、Mn2+等，唾液淀粉酶的激活剂为Cl-。